Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

NGUYỄN THANH VIỆT

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN
LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 9420107

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ’, ngày … tháng … năm 2019.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng của các bệnh
từ thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có
1 người bị bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng,
đặc biệt là đối với trẻ nhỏ, người già và người suy giảm miễn dịch.
Trong số các bệnh do thực phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất
do sử dụng thực phẩm không an toàn, 550 triệu người bị bệnh này mỗi
năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi. Salmonella là một trong
4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn cầu.
Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên
nhanh chóng và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người.
Salmonella kháng kháng sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm
khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh. Do vậy, việc phân lập và xác định
đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là việc làm
cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella
sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát bệnh
tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng
sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng
sinh của vi khuẩn này.
Ở Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về phân tích

các nhóm gen ở vi khuẩn Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập
được từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Nghiên
cứu các nhóm gen này giúp hiểu biết sâu về dịch tễ học phân tử các
gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát hiện được các
đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng sinh ở
Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng
gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này
1


Theo tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc
gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt gia cầm tăng lên rất nhanh
kể từ năm 1993 trở lại đây và được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong
những năm tiếp theo. Vì vậy, luận án này đã được thực hiện với mục
tiêu và nội dung sau:
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
•

Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò,
và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội.

•

Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella
phân lập được.

•

Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng
sinh.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
•

Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập
được ở các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi
khuẩn Salmonella.

•

Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng
Salmonella đa kháng kháng sinh.

•

Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng
kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan. Xác nhận một
số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, di động, không có vỏ và
không sinh bào tử. Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí, có thể
mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như XLD. Trong
môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ, ở giữa
có màu đen. Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh, tuy nhiên
2


nhạy cảm với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt từ 700C trở lên. Salmonella

có 3 loại kháng nguyên là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông
H, và kháng nguyên Vi.
Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori
và S. enterica. Trong đó, S. enterica được chia thành 6 dưới loài là: I
(enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV
(houtenae) và VI (indica).
1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella
1.2.1. Cấu trúc hệ gen
Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau (3,39-5,59
Mb). Số gen trung bình là 4.742. Salmonella có từ 1 đến 2 plasmid
kích thước từ 2-200 kb. S. enterica cần khoảng 3.499 gen và S. bongori
cần khoảng 3.368 gen để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình
thường. Hệ gen của Salmonella có độ tương đồng từ 65% đến 99%,
có tính bảo thủ cao và sự biến đổi chỉ tập trung vào một số vùng đặc
biệt. Có khoảng 2.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng
số họ gen của tất cả các serovar là khoảng 10.000.
1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella
Salmonella thường đề kháng một số nhóm kháng sinh phổ
biến là aminoglycoside, β- lactam, chloramphenicol, quinolone,
tetracycline, sulfonamide và trimethoprim.
Nhóm Aminoglycoside. Salmonella sử dụng cơ chế biểu hiện
các enzyme để biến đổi aminoglycoside qua trung gian plasmid để đề
kháng aminoglycoside. Các enzyme này được phân loại thành ba
nhóm và được đặt tên dựa trên các phản ứng mà chúng thực hiện là
acetyltransferase, phosphotransferase và nucleotidyltransferase.
Nhóm β-lactam. Ở Salmonella, bài tiết β-lactamase là cơ chế
đề kháng kháng sinh β-lactam phổ biến. Các enzyme này hoạt động
3

bằng cách thủy phân các vòng cấu trúc của β-lactam, tạo ra các β
amino acid không có hoạt tính kháng khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm
ra hơn 340 gen mã hóa enzyme β-lactamase.
Kháng sinh chloramphenicol (C). Chloramphenicol là chất ức
chế tổng hợp protein bằng cách liên kết với trung tâm
peptidyltransferase của đơn vị 50S ribosome. Có hai cơ chế đề kháng
C ở Salmonella là: (i) các enzyme chloramphenicol acetyltransferases
hoặc gen kháng chloramphenicol cm1A và (ii) các kênh bơm thải C.
Nhóm Quinolone. Đề kháng quinolone ở Salmonella được
phân thành 2 cơ chế. Một là do đột biến các gen gyrA, gyrB mã hóa
enzyme DNA gyrase và gen parC mã hóa enzyme topisomerase IV,
và hai là do tăng biểu hiện của kênh bơm thải thuốc AcrAB-TolC. Sự
kết hợp nhiều đột biến sẽ tạo ra khả năng đề kháng quinolon hơn là
một đột biến đơn lẻ.
Kháng sinh tetracycline (TE). Cơ chế chính trong kháng
tetracycline ở Salmonella là do hệ thống các kênh bơm thải thuốc,
kênh này làm giảm nồng độ tetracycline ở trong tế bào. Hiện nay người
ta đã xác định được 46 gen đề kháng TE.
Sulfonamide/trimethoprim (SXT). Những loại kháng sinh này
có hoạt tính kìm khuẩn và cơ chế hoạt động là ức chế cạnh tranh các
enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp tetrahydrofolic acid.
Sulfonamide ức chế enzyme dihyrdropteroate synthetase, trong khi
trimethoprim ức chế reductase dihydrofolate. Khả năng đề kháng của
Salmonella với sulfonamide là do sự hiện diện của gen sul. Ngoài ra
còn do các gen dhfr và dfr.
1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh
ở vi khuẩn

4

Mối quan hệ giữa đột biến gen và thay đổi kiểu hình kháng
kháng sinh hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ. Mối quan hệ này không
phải lúc nào cũng đơn giản là quan hệ nhân quả. Thường thì nhiều đột
biến mới tạo ra được một kiểu hình đề kháng một loại kháng sinh.
Nhìn chung, mối quan hệ phức tạp giữa khả năng kháng kháng sinh và
đột biến gen vẫn chưa rõ ràng.
1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc (efflux pumps)
Các kênh bơm thải thuốc không những có khả năng đào thải
một lượng lớn các loại kháng sinh mà còn tạo ra các cơ chế kháng
kháng sinh khác bằng cách làm giảm nồng độ kháng sinh trong tế bào
và thúc đẩy quá trình tích tụ đột biến. Biểu hiện của hệ thống kênh
bơm thải thuốc ở vi khuẩn có liên quan đến tính kháng kháng sinh của
chúng trên lâm sàng.
1.3. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của các Salmonella
trong thực phẩm
1.3.1. Trên thế giới
Đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về tỷ lệ ô nhiễm
Salmonella trong thực phẩm đã được công bố ở khắp nơi trên thế giới.
Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng
Salmonella phân bố khác nhau tùy theo từng khu vực địa lý và theo
nguồn thực phẩm. Các type huyết thanh phổ biến khác nhau theo vùng
địa lý và tỷ lệ đề kháng kháng sinh của chúng tăng lên hàng năm.
1.3.2. Tại Việt Nam
Các công bố gần đây cho thấy rằng các nguồn thực phẩm tại
Việt Nam nhiễm Salmonella với tỷ lệ khác nhau, trong đó có nhiều
loài đa kháng kháng sinh. Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thực phẩm và
tỷ lệ đa kháng kháng sinh ở các loài Salmonella phân lập được tăng
lên hàng năm. Vì vậy việc tiến hành phân lập và xác định đặc điểm
5

kháng kháng sinh của Salmonella ở từng loại thực phẩm ở từng khu
vực địa lý vào từng khoảng thời gian khác nhau là cần thiết..
1.4. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu biểu
hiện gen
Hiện nay người ta thường sử dụng bốn kỹ thuật là Reverse
transcription PCR (RT-PCR), Real-time PCR (qPCR), Microarray, và
giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để nghiên cứu biểu hiện gen. Trong
số các kỹ thuật trên thì giải trình tự thế hệ mới có ưu điểm hơn cả, kỹ
thuật này có thể khắc phục được nhược điểm của ba kỹ thuật còn lại
và là kỹ thuật duy nhất có khả năng phát hiện được các gen mới.
Giải trình tự thế hệ mới
NGS là phương pháp đo trực tiếp trình tự nucleic acid có mặt
trong mẫu nghiên cứu. Số lượng trình tự tuyến tính với nồng độ trình
tự nucleic acid có mặt trong mẫu nghiên cứu. Hơn nữa, NGS không
phụ thuộc vào thông tin của trình tự nucleic acid có thể biểu hiện trong
mẫu nghiên cứu, không phụ thuộc vào các gen tương đồng cao. Do đó
có thể phát hiện được các gen mới.
Trong số các công nghệ giải trình tự thế hệ mới thì công nghệ
Illumina tạo ra dữ liệu có độ chính xác cao nhất, quy trình làm thí
nghiệm đơn giản, và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau. Hiện nay, hơn 90% dữ liệu trình tự trên thế giới được tạo ra bởi
công nghệ Illumina.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Tổng số 90 mẫu thịt, gồm 30 mẫu thịt lợn (được ký hiệu từ
TL-1 đến TL-30), 30 mẫu thịt gà (được ký hiệu từ TG-1 đến TG-30),

6


và 30 mẫu thịt bò (được ký hiệu từ TB-1 đến TB-30), thu thập ngẫu
nhiên tại 10 chợ ở Hà Nội.
2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit
Môi trường nuôi cấy, kháng sinh, các bộ kit sử dụng được
cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị được sử dụng tại các cơ sở nghiên cứu uy tín trong
nước như: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện
Bỏng Quốc Gia, Học viện Quân y.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Các mẫu được lấy theo tiêu chuẩn TCVN 4833-2002. Thời
gian từ 7-8 giờ sáng mùa đông, từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016.
2.2.2. Định danh Salmonella
Định danh Salmonella theo quy trình ISO 6579:2002.
2.2.3. Kháng sinh đồ
Phương pháp khoanh giấy khuếch tán của Kirby-Bauer.
2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới
Lựa chọn một số chủng Salmonella đa kháng để giải trình tự
hệ phiên mã bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới của Illumina.
2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học
Chất lượng trình tự được kiểm tra bằng phần mềm FastQC.
Các trình tự adapter và trình tự xấu được cắt bỏ bằng phần mềm
Trimmomatic 0.32. Trình tự tinh sạch ở điểm chất lượng Q20 được
lắp ráp de novo bằng phần mềm Geneious R11. Trình tự de novo được
chú thích chức năng các gen bằng các cơ sở dữ liệu khác nhau như:
RAST, PATRIC 3.5.2, BASys, và phần mềm Geneious R11. Xác định

gen kháng kháng sinh bằng các cơ sở dữ liệu: ResFinder, ARG7


ANNOT, CARD, và PATRIC 3.5.2. Xác định đột biến gen đề kháng
kháng sinh nhóm quinolone bằng công cụ ResFinder.
2.2.6. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng
phương pháp giải trình tự gen Sanger
Để xác khẳng định kết quả dự đoán về đột biến gen kháng
kháng sinh thu được từ phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, các
đột biến gen mới liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolone sẽ
được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger từ cDNA
của các mẫu nghiên cứu.
2.2.7. Xử lý thống kê
Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để tính các giá trị χ2, Fisher
exact test, giá trị p.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu
3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella
Từ kết quả tăng sinh không chọn lọc, tăng sinh chọn lọc và
khẳng định sinh hóa, chúng tôi đã thu được các chủng Salmonella từ
các mẫu nghiên cứu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên
cứu
Mẫu

Tổng số

Dương tính

Âm tính

mẫu

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Thịt gà

30

11

36,7

19

63,3

Thịt lợn

30

9

30,0

21

70,0

Thịt bò

30

5

16,7

25

83,3

Tổng số

90

25

27,8

65

72,2

χ2 = 3,102; df = 2; p = 0,212

8


Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella từ các nguồn
phân lập được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella
STT

Nguồn mẫu

Tên mẫu

1

Thịt gà (11 mẫu)

TG-1, 2, 3, 4, 5, 6, 14, 25, 28, 29, 30

2

Thịt lợn (9 mẫu)

TL-1, 2, 3, 4, 5, 15, 26, 29, 30

3

Thịt bò (5 mẫu)

TB-1, 2, 3, 15, 29

Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nghiên cứu này là 27,8%, tương
đương với nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thúy và CS (30%). Tuy nhiên tỷ
lệ này thấp hơn các nghiên cứu khác như: Ta và CS (48,7%), Nguyen
và CS (69,7%), Boomar và CS (80%). Theo chúng tôi, nguyên nhân
thấp hơn có thể là do thu thập mẫu vào buổi sáng, lúc thịt còn tươi và
sạch nên hạn chế lây nhiễm vi khuẩn. Hơn nữa thời điểm thu thập mẫu
là vào mùa đông, nhiệt độ và độ ẩm không khí thấp, kết hợp với thời
tiết khô hanh là những điều kiện bất lợi cho vi khuẩn phát triển.
Trong số các mẫu nhiễm Salmonella, mẫu thịt gà nhiễm nhiều
nhất (36,7%), tiếp theo là mẫu thịt lợn (30%), mẫu thịt bò nhiễm thấp
nhất (16,7%). Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc
Thúy và CS, Zhao, Miranda. Tuy nhiên khác so với các nghiên cứu
khác như Phan (lợn, bò, gà), Nguyen (lợn, gà, bò). Tỷ lệ nhiễm khuẩn
ở thịt gà thường cao hơn thịt lợn có thể là do gà được vặt lông và mổ
trực tiếp trên nền xi măng, không có sự cách ly rõ ràng giữa khu vực
làm lông và moi ruột nên vi khuẩn từ phân, môi trường dễ dàng nhiễm
vào thịt. Từ các kết quả nghiên cứu trên có thể thấy rằng, tỷ lệ nhiễm
Salmonella ở các loại thịt bán lẻ là rất khác nhau, phụ thuộc vào khu
vực địa lý thu thập mẫu.

9


3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập
được
Từ các Salmonella thu được, tiến hành định type, chúng tôi
thu được 9 serovar khác nhau. Trong đó S. Typhimurium phổ biến nhất
(11/25 chủng). Tiếp theo là S. Derby (4/25 chủng). Các S. Warragul,
S. Indiana, S. Rissen (2/25 chủng). S. London, S. Meleagridis, S. Give,

S. Assine chiếm tỷ lệ ít nhất (1/25 chủng). Chúng tôi nhận thấy rằng ở
các nghiên cứu khác nhau thì serovar phổ biến cũng khác nhau. Ví dụ,
Moe và CS (S. Albany), Patchanee (S. Rissen). Từ các kết quả nghiên
cứu trên cho thấy rằng, các serovar phổ biến ở các nghiên cứu là khác
nhau, phụ thuộc vào khu vực địa lý và thời gian thu thập mẫu.
3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các Salmonella phân lập được
3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân
lập được
Từ kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi thu được 52% (13/25) số
chủng đề kháng ít nhất một kháng sinh, trong đó tỷ lệ đa kháng là 36%.
Streptomycin (STR) và tetracyclin (TE) bị đề kháng nhiều nhất (44%).
Đây là điều dễ hiểu vì hai kháng sinh này được sử dụng rộng rãi ở Việt
Nam, cả trong điều trị và chăn nuôi. Tất cả Salmonella đều nhạy cảm
với ceftazidime (CAZ), vì thế đây một kháng sinh tốt có thể dùng để
điều trị nhiễm Salmonella, cần phải giám sát tình hình sử dụng kháng
sinh này. Salmonella đề kháng kháng sinh là nguồn lây truyền các gen
kháng thuốc cho sinh vật khác, nguy hiểm hơn là cho người thông qua
việc tiêu thụ thức ăn. Tỷ lệ kháng kháng sinh trong nghiên cứu này
(52%) thấp hơn kết quả của một số nghiên cứu ở Việt Nam (62,2%),
Nhật Bản (89,9%). Tỷ lệ đa kháng (36%) thấp hơn một số kết quả
nghiên cứu khác như Nguyen (41,1%), Katoh (90,2%). Sự khác biệt
này theo một số tác giả thì có thể là do tỷ lệ lạm dụng thuốc kháng
10


sinh trong chăn nuôi và điều trị khác nhau giữa các vùng, điều này làm
tăng áp lực chọn lọc, dẫn tới sự xuất hiện và tồn tại các vi khuẩn kháng
kháng sinh với tỷ lệ khác nhau. Số lượng mẫu trong nghiên cứu này
còn ít (25 mẫu). Vì thế cần tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về tỷ lệ
đề kháng và tỷ lệ đa kháng kháng sinh với số lượng mẫu lớn hơn.

3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn
phân lập
Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella theo nguồn
phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh của chúng
theo từng nguồn thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy Salmonella
phân lập từ thịt lợn đề kháng nhiều kháng sinh nhất, với tỷ lệ 66,7%
(6/9 chủng), trong đó 44,4% (4/9 chủng) đa kháng kháng sinh. Tiếp
theo là các chủng phân lập từ thịt gà với tỷ lệ 36,4% (4/11 chủng) trong
đó 27,3% (3/11 chủng) đa kháng. Chỉ có duy nhất 1 chủng S.
Typhimurium từ thịt bò kháng kháng sinh và là chủng đa kháng. S.
Typhimurium chiếm tỷ lệ lớn ở cả ba nguồn phân lập (11 chủng),
nhưng chỉ có 3 chủng kháng kháng sinh đồng thời là chủng đa kháng.
3.2.3. Số lượng Salmonella đề kháng từng kháng sinh theo nguồn
phân lập
Việc xác định khả năng kháng kháng sinh của Salmonella theo
nguồn phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh của
chúng theo từng nguồn thực phẩm. Theo đó, tất cả Salmonella phân
lập từ thịt gà đều kháng kháng sinh (trừ CAZ). Không có chủng nào
phân lập được từ thịt lợn và thịt bò đề kháng CIP. Salmonella có nguồn
gốc từ ba nguồn thịt đều đề kháng AM, STR, C, TE và SXT, trong đó
các chủng phân lập được từ thịt lợn có tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao
nhất. Toàn bộ các Salmonella phân lập được từ thịt bò đều nhạy cảm
với CAZ, GN và CIP. Salmonella phân lập được từ thịt lợn đề kháng
11


AM, STR, và TE với tỷ lệ lớn nhất. Salmonella từ thịt gà đề kháng C
nhiều nhất, đặc biệt là các chủng kháng CIP chỉ tìm thấy ở thịt gà. Thịt
bò là mẫu ít nhiễm Salmonella nhất và các chủng này nhạy cảm với
nhiều kháng sinh nhất

3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh
Từ kết quả kháng sinh đồ chúng tôi đã xác định được kiểu hình
kháng kháng sinh của Salmonella nghiên cứu. Hai kiểu hình kháng
kháng sinh phổ biến là TE, STR, AM (2/9), và C, TE, SXT, STR, AM
(3/9). Kiểu hình TE, STR, AM chỉ có ở Salmonella phân lập được từ
thịt lợn. Hai kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến trong nghiên cứu
này khác với kiểu hình kháng kháng sinh được công bố trong nghiên
cứu của Miranda và CS, Kim và CS. Từ các kết quả trên có thể nhận
định rằng kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến là khác nhau giữa các
nghiên cứu.
Việc xác định kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên
cứu là quan trọng. Kết quả kiểu hình này kết hợp với kết quả phân tích
hệ gen sẽ cho biết các gen kháng kháng sinh, các đột biến liên quan
đến kháng kháng sinh. Từ kết quả kiểu hình trên, chúng tôi đã thu được
9 Salmonella đa kháng, trong đó S. Typhimurium phổ biến nhất. Thịt
lợn là nguồn phân lập được nhiều Salmonella đa kháng nhất (5
serovar), tiếp theo là thịt gà (3 serovar), ít nhất là thịt bò (1 serovar).
Tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ đa kháng, và kiểu hình kháng
kháng sinh là khác nhau ở các nghiên cứu đã được công bố. Sự khác
biệt này theo một số nhà nghiên cứu thì có thể là do lạm dụng kháng
sinh trong điều trị và chăn nuôi, làm tăng áp lực chọn lọc lên vi khuẩn
dẫn tới xuất hiện nhiều chủng Salmonella đa kháng kháng sinh khác
nhau theo vùng địa lý.

12


3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella
đa kháng kháng sinh
Giải trình tự hệ gen phiên mã hiếm khi được sử dụng để xác

định các gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Thay vào đó, người ta
thường sử dụng giải trình tự DNA toàn bộ hệ gen. Việc giải trình tự
hệ gen phiên mã cho phép nghiên cứu chức năng của các gen tốt hơn
so với giải trình tự DNA. Trong nghiên cứu này chúng tôi muốn tập
trung nghiên cứu hệ gen chức năng của vi khuẩn. Điều này là quan
trọng vì các gen không cần thiết sẽ không biểu hiện và có xu hướng
mất đi hoặc bị thoái biến. Hơn nữa kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ
gen không phân biệt được các gen đã bị bất hoạt trong hệ gen và các
chức năng liên quan khác của gen đó. Ngoài ra, theo chúng tôi thì gen
biểu hiện sẽ có mối liên quan với kiểu hình, cụ thể ở đây là kiểu hình
kháng kháng sinh cao hơn so với gen không biểu hiện.
Chúng tôi đã thực hiện giải trình tự hệ gen phiên mã của
Salmonella đa kháng kháng sinh giống như phương pháp mà tác giả
Marcelino và cộng sự đã công bố (tác giả cũng giải trình tự hệ phiên
mã của vi khuẩn trong ruột chim để xác định các gen kháng kháng
sinh). Một điều hết sức quan trọng là các gen kháng kháng sinh cũng
biểu hiện ở vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh trong điều kiện nuôi
cấy thông thường. Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi không sử
dụng chủng nhạy cảm với kháng sinh để đối chiếu. Thay vào đó chúng
tôi sử dụng chính kiểu hình nhạy cảm và đề kháng với từng loại kháng
sinh ở các chủng để tham chiếu với nhau. Từ đó rút ra dự đoán gen
nào, hoặc đột biến nào có thể liên quan đến kháng kháng sinh ở vi
khuẩn này.
Để phân tích các nhóm gen ở Salmonella đa kháng, một số
serovar đa kháng cần được lựa chọn để giải trình tự toàn bộ hệ gen
13


phiên mã. Tuy nhiên, trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi chỉ
lựa chọn 6 chủng theo tiêu chí tỷ lệ nhiễm cao, đề kháng nhiều kháng

sinh và theo nguồn phân lập, gồm S. Derby, S. Give, S. Indiana, S.
Typhimurium S384, S. Typhimurium S360, và S. Typhimurium S181.
Sau khi tách RNA từ 6 mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành
kiểm tra chất lượng bằng đo nồng độ và OD260/280, kết hợp với điện di.
Kết quả cho thấy các mẫu RNA này đều đạt yêu cầu. Mẫu này sau đó
được chuyển thành cDNA và kiểm tra độ toàn vẹn và cho thấy giá trị
RIN (RNA Integrity Number) đều trên 8,0, đạt yêu cầu để giải trình
tự. Kết quả thu được như sau:
3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read)
Từ kết quả trình tự thô chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phần
mềm Trimmomatic: Tổng số có 160.043.486 read, tổng số lượng các
read có điểm Q20 là 146.080.642. Số lượng read nhiều nhất là ở Sal 4
và ít nhất là ở Sal 6. Các trình tự read có điểm chất lượng Q20 sẽ được
sử dụng để lắp ráp de novo và sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
3.3.2. Lắp ráp de novo
Kết quả lắp ráp de novo cho thấy kích thước hệ gen phiên mã
dao động từ 4,69 Mb (Sal 4) đến 5,1 Mb (Sal 11), giá trị GC dao động
quanh 52%, giá trị N50 cao và L50 thấp. Kết quả này tương tự với kết
quả giải trình tự toàn bộ hệ gen của S. Derby 07CR553 công bố bởi
Kérouanton và cộng sự. Từ đó có thể kết luận là trình tự của 6 mẫu
nghiên cứu có chất lượng tốt, đủ điều kiện cho các phân tích tiếp theo.
3.3.3. Chú thích chức năng các gen
Để hạn chế việc bỏ sót các gen, nhiều công cụ phân tích gen
đã được sử dụng. Số lượng các gen phát hiện được ở các công cụ này
là khác nhau. Kết quả phát hiện các gen của các công cụ này khác nhau
là do phương pháp phân tích của chúng khác nhau, và hiện chưa có
14


một phương pháp chuẩn, thống nhất trong việc chú thích các gen được

chấp nhận trên thế giới. Số lượng các trình tự mã hóa tìm được bởi các
cơ sở dữ liệu khác nhau được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu
Số lượng các trình tự mã hóa

Cơ sở dữ liệu
Sal 4

Sal 6 Sal 7

Sal 8 Sal 11 Sal 12

RAST

4.807 4.917

5.154

5.097

5.357

5.000

PATRIC

4.807 4.917

5.154

5.049

5.357

5.000

BASys

4.973 5.100

5.336

5.253

5.566

5.209

Genious R11

4.400 4.513

5.022

5.207

5.304

5.309

Năm 2017, Baek và cộng sự công bố rằng có nhiều gen kích
thước nhỏ, mã hóa cho protein có chiều dài dưới 100 amino acid không
phát hiện được khi chú thích hệ gen của vi khuẩn. Do đó, cần tiến hành
các nghiên cứu sâu hơn về các gen trên trong các mẫu nghiên cứu.
3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu
Ngoài housekeeping gen…Chúng tôi đã xác định được các
nhóm gen quan trọng biểu hiện ở các Salmonella đa kháng như sau:
3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh
Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng
kháng sinh được trình bày trong bảng 3.4. Theo đó, tổng số có 107 gen
kháng kháng sinh (danh sách các gen không được trình bày trong tóm
tắt này). Bao gồm 22 gen kháng kháng sinh nhóm β-lactam, 46 gen
kháng aminoglycoside, 8 gen kháng quinolone, 7 gen kháng phenicol,
6 gen kháng cycline, 3 gen kháng sulfonamide, 3 gen kháng
trimethoprim. Ngoài ra chúng tôi còn phát hiện được 12 gen kháng
kháng sinh nhóm macrolides, rifamycin, fosfomycin, lincosamide,
polymyxin, và peptide. Số lượng và sự đa dạng trong các gen kháng
15


kháng sinh ở nghiên cứu này tương tự như kết quả nghiên cứu của tác
giả Saskia (2018).
Tổng số 42 kiểu hình được tạo ra từ kết quả kháng sinh đồ. Có
29 kiểu hình kháng kháng sinh có biểu hiện của các gen kháng kháng
sinh. Có 12 kiểu hình nhạy cảm kháng sinh có biểu hiện của gen kháng
kháng sinh. Chỉ có duy nhất một kiểu hình nhạy cảm là không có biểu
hiện của gen kháng kháng sinh đó là Sal 6 nhạy cảm với kháng sinh
SXT và không có biểu hiện của gen kháng kháng sinh nào. Như vậy,
sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình là (29+1)/42 = 71,4%. Và sự
không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình kháng kháng sinh là 12/42

= 28,6%. Tỷ lệ phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình này tương tự với
kết quả nghiên cứu của tác giả Owen và cộng sự, 2017 (72,7%). Kết
quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với các kết quả nghiên cứu
của một số tác giả khác như McDermott và CS, 2016 (99%), Zankari
và CS 2013 (99,74%). Sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình
trong nghiên cứu này có thể giải thích là do các gen kháng kháng sinh
biểu hiện ở mức độ chưa đủ, do có nhiều cơ chế kháng kháng sinh
cùng tham gia kháng một loại kháng sinh, do các cơ chế kháng kháng
sinh khác chưa được tìm ra.

16


Bảng 3.4. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu
KS

Mẫu nghiên cứu (Kiểu hình kháng kháng sinh/gen kháng kháng sinh)
Sal 4
(R)
blaOXA-1
blaTEM family, PBPE**
(R)
aac family*
aph family*
ant family*, kdpE

Sal 6
(R)
blaTEM
family

(S)
aac(6')-Iy
kdpE

Sal 7
(R)
blaTEM family
PBPE**
(S)
aac (6')-Iy, aac6-Iy,
aadA8, aadA17;
kdpE

Sal 8
(R)
blaTEM family

(R)
aac family*
aph family*
ant family*, kdpE
(R)
aac(6')Ib-cr,
gyrA,
gyrB, parC

(R)
aac(6')-Iy
kdpE

(R)
aac (6')-Iaa, aac3-IIa
aadA17, aadA8b
aph3-IIa, kdpE
(S)
qnrS1, qnr-S3, qnr-S5,
gyrB, parC

(R)
aac family*
aph family*
kdpE
(S)
gyrA, gyrB, parC

(S)
floR, cmlA1

(S)
cmlA1

(R)
sul1, sul2, dfrA12

(R)
tet(A),
tet(B),
tet(C), tet(R)
(R)
sul2, dfrA14, dfrA5

(R)
tet(A)

SXT

(R)
floR, cmlA1, cmlA5,
cat2
(R)
tet(A), tet(B), tet(C),
tet(M), tet(R), tet(S)
(R)
sul2, sul3, dfrA12

(R)
floR, cmlA1

TE

(R)
floR, cmlA1,
catB4, catB8
(R)
tet(A), tet(R)

(R)
aac (6')-Iy, aac6-Iy
aadA8, aadA17
kdpE

(S)
qnr-S1,
qnr-S3,
gyrA, gyrB, parC,
parE
(R)
floR, cmlA1, cmlA5,
cat2
(R)
tet(A),
tet(M),
tet(R), tet(S)
(R)
sul2, sul3, dfrA12

Sal 12
(R)
blaTEM family
PBPE**
(S)
aac(6')-Iaa,
aac6Iaa,
aph(6)-Id,
aph(3'')-Ib
strA, strB, kdpE
(R)
aac(6')-Iaa, aac6-Iaa
aph(6)-Id, aph(3'')-Ib
strA, strB, kdpE
(S)

gyrA, gyrB, parC

AM

GN

STR

CIP
C

catB3,

(S)
gyrA, gyrB,
parC

(R)
tet(A),
et(M), tet(S)
(S)

(S)
aac (6')-Iaa, aac3-IIa,
aadA17, aadA8b
aph3-IIa, kdpE

Sal 11
(R)
blaTEM family

PBPE**
(R)
aac family*
aph family*
kdpE

(S)
sul2

Chú thích: *Aac (Acetylation) family; Aph (Phosphorylation) family; Ant (Adenylylation) family; ** Penicillin Binding
Protein E. coli. KS (kháng sinh), AM (ampicillin), GN (gentamycin), STR (streptomycin), CIP (ciprofloxacin), C
(chloramphenicol), TE (tetracyclin), SXT (sulfamethoxazol/trimetoprim).
17


3.3.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone
Kháng sinh nhóm quinolone được sử dụng phổ biến trong điều
trị nhiễm Salmonella ở người. Đối với Salmonella có nguồn gốc thực
phẩm, đề kháng quinolone được quan tâm nhất và đã được đề cập đến
trong danh sách các kháng sinh quan trọng nhất của WHO trong lĩnh
vực y học năm 2016. Một trong những cơ chế đề kháng quinolone ở
Salmonella là do đột biến các gen gyrA, gyrB và parC. Dó đó, chúng
tôi tiến hành tìm đột biến của các gen trên, kết quả được trình bày
trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm
quinolone
Đột biến gen

Mẫu

Kết quả
KSĐ

gyrA

Sal 4

Đề kháng

S83F;D87G

Sal 6

Nhạy cảm

T57S; T255S; N395S

Sal 7

Nhạy cảm S83Y

T57S; T255S; A352V S592N

Sal 8

Nhạy cảm

T255S; N395S; S469A; A620T

Sal 11 Nhạy cảm

T255S; N395S; S469A; A620T

Sal 12 Nhạy cảm

T255S; N395S; S469A; A620T

parC

parE

T57S; S80R; T255S; A628S

Chú thích: A (Alanine), N (Asparagine), R (Arginine), S (Serine), T
(Threonine), V (Valine), KSĐ (Kháng sinh đồ).
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, đã xác định được các đột biến:
S83F, S83Y, D87G, S80R, T57S, T255S, N395S, S469A, A620T,
A628S, S592N. Tính đến thời điểm hiện tại, chưa có công bố nào về
các đột biến A628S, T255S, N395S, S469A, và A620T. Tuy nhiên,
các đột biến T255S, N395S, S469A, A620T lại xuất hiện ở các chủng
nhạy cảm với CIP là Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, và Sal 12 chứng tỏ các
18


đột biến này không có vai trò trong kháng CIP ở các mẫu nghiên cứu.
Đột biến parC (A628S) có thể có vai trò trong đề kháng CIP vì chỉ
xuất hiện ở Sal 4, là chủng duy nhất đề kháng CIP. Kết quả này không
những có tính mới mà còn có ý nghĩa khoa học cao, mở đường cho các
nghiên cứu tiếp theo về cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella.
3.3.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc

Chúng tôi xác định được biểu hiện của 41 gen liên quan, bao
gồm 37 gen ở S. Typhimurium S181, 25 gen ở S. Typhimurium S384,
27 gen ở S. Typhimurium S360, 27 gen ở S. Give, 23 gen ở S. Derby,
26 gen ở S. Indiana. Các kênh bơm thải thuốc phát hiện được ở các
mẫu nghiên cứu thuộc 3 họ là MFS (MefB, EmrAB, tetA, tetB, MdtD),
SMR (QacE), và RND (AcrAB-TolC, AcrAD-TolC, AcrEF-TolC,
MdtABC-TolC, MexPQ-OpmE). Sự hiểu biết về các kênh bơm thải
thuốc là rất cần thiết cho việc phát triển của các biện pháp can thiệp
để hạn chế khả năng kháng kháng sinh ở Salmonella.
Một số chủng Salmonella nhạy cảm với kháng sinh nhưng vẫn
có biểu hiện của kênh bơm thải thuốc như biểu hiện của cả ba kênh
AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, và MdfA ở chủng nhạy cảm với
chloramphenicol. AcrD ở chủng nhạy cảm với gentamycin. MexPQOpmE ở chủng nhạy cảm với ciprofloxacin và chloramphenicol. Do
đó các kênh này không có vai trò trong việc kháng các kháng sinh trên.
Một số chủng kháng kháng sinh có biểu hiện của kênh bơm
thải thuốc như AcrD với đề kháng ampicillin, streptomycin, MexPQOpmE với đề kháng tetracycline, EmrAB với đề kháng tetracycline,
streptomycin và ampicillin. Vì vậy chúng tôi dự đoán rằng các kênh
này có thể liên quan đến đề kháng các kháng sinh tương ứng. Các
nghiên cứu sâu hơn về hệ thống kênh bơm thải thuốc ở Salmonella cần
được tiến hành trong tương lai.
19


Nhận định về vai trò của của các kênh bơm thải thuốc trên với
đề kháng kháng sinh là tính mới của luận án.
3.3.4.4. Kết quả phân tích một số nhóm gen khác
Ngoài nhóm gen kh-áng kháng sinh và nhóm gen liên quan
đến kênh bơm thải thuốc, chúng tôi xác định được nhiều nhóm gen
khác liên quan đến kháng kháng sinh và độc tố của vi khuẩn. Số lượng
các gen ở từng nhóm chức năng này được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Biểu hiện của các nhóm gen liên quan.
Số lượng gen
Nhóm gen
Sal 4 Sal 6 Sal 7 Sal 8 Sal 11
Độc lực
118 124 125
130
131
Tổng hợp flagellar
38
38
38
38
38
Tổng hợp LPS và thành
52
39
48
52
51
tế bào
Đáp ứng với Selenium
2
2
2
2
2
Đáp ứng với Tellurite
3
3

3
3
3
Đáp ứng với
2
2
2
2
2
Formaldehyde
Di truyền vận động,
12
24
22
27
26
phage và prophage
Kênh vận chuyển ABC
21
21
21
21
21

Sal 12
133
38
51
2
3

2
26
21

Chú thích: Sal 4 (S. Indiana), Sal 6 (S. Derby), Sal 7 (S. Give), Sal 8
(S. Typhimurium S360), Sal 11 (S. Typhimurium S384), Sal 12 (S.
Typhimurium S181).
Nhóm gen độc lực
Có khoảng 200 gen liên quan đến độc tố của Salmonella đã
được phát hiện, tuy nhiên, chức năng và cơ chế hoạt động của phần
lớn các gen này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Trong nghiên cứu
này, có tất cả 134 gen độc tố được xác định. Số lượng và sự đa dạng
20


của các gen này tương tự như một số công bố khác, ví dụ tác giả
Figueiredo (114 gen), Card (105 gen). Sự có mặt của gen độc chứng
tỏ tất cả 6 chủng Salmonella đa kháng đều là chủng độc. Các gen này
có vai trò trong quá trình gây bệnh, và có thể có vai trò đối với kháng
kháng sinh ở Salmonella. Đây là nghiên cứu đầu tiên xác định biểu
hiện của toàn bộ gen độc lực ở các chủng Salmonlla đa kháng kháng
sinh tại Việt Nam.
Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar
Flagellar có vai trò quan trọng trong việc tạo ra độc tố của vi
khuẩn, đây là thành phần thường lẫn vào các túi màng ngoài khi người
ta phân lập kháng nguyên để chế tạo vaccine Salmonella. Việc hiểu
biết về các gen biểu hiện liên quan đến flagellar sẽ rất hữu ích cho việc
tinh sạch thành phần này. Chẳng hạn như bất hoạt các gen trên sẽ tạo
ra các túi màng ngoài tinh sạch, làm kháng nguyên để chế tạo vaccine.
Đây cũng là một trong những đóng góp mới của đề tài.

Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp LPS và thành tế bào
Ngoài S. Typhi, LPS của các Salmonella khác còn chưa được
nghiên cứu đầy đủ. Các gen tổng hợp lipidA, một thành phần quan
trọng của vỏ LPS, liên quan đến khả năng kháng kháng sinh polymixin
cũng biểu hiện ở cả 6 mẫu nghiên cứu. LPS và protein màng ngoài tạo
thành các túi màng ngoài, túi này có khả năng kích thích miễn dịch và
được xem là thành phần quan trọng để chế tạo vaccine. Kết quả của
nghiên cứu này đóng góp một phần kiến thức về các gen mã hóa LPS,
là nguồn tham khảo cho các nghiên cứu sâu hơn.
Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc
Ngoài selenium, tellurit là nguyên tố với độc tính rất cao, và
formaldehyde cũng được tìm thấy trong 6 mẫu Salmonella, đây là một
thực tế đáng báo động. Kết quả nghiên cứu này cho thấy cần phải có
21


những nghiên cứu sâu rộng để làm sáng tỏ các nguồn của các chất trên
và mức độ nhiễm hợp chất này ở thực phẩm tại Hà Nội. Do đó, việc
kiểm soát nguồn gốc và quá trình chế biến thực phẩm là cần thiết.
Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage
Các thực khuẩn thể thường mang các gen độc, tạo nên độc tố
của Salmonella. Một số thực khuẩn thể tồn tại ở Salmonella có thể sử
dụng như là một marker chẩn đoán nhanh. Chúng tôi xác định được
thực khuẩn thể Gifsy-2 ở tất cả các mẫu nghiên cứu, do đó đây có thể
là marker để chẩn đoán nhanh Salmonella. Tuy nhiên, số mẫu nghiên
cứu là ít (6 mẫu), vì vậy cần phải tiến hành nghiên cứu trên số lượng
mẫu lớn hơn để khẳng định vấn đề trên.
Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC
Kênh vận chuyển ABC tạo ra độc tố ở nhiều vi khuẩn. Khả
năng vận chuyển của chúng liên quan đến kháng kháng sinh điều trị.

Tuy nhiên, ở đa số các loài Salmonella, chức năng của một số thành
phần trong kênh vận chuyển này như sapABCDF còn chưa được mô
tả đẩy đủ. Ở S. Typhimurium, sapABCDF tạo độc tố giúp vi khuẩn
kháng lại kháng sinh nhóm peptide.
3.4. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger
Từ kết quả dự đoán bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ
mới về điểm đột biến mới ở gen parC (A628S) có khả năng liên quan
đến kháng kháng sinh nhóm quinolone, chúng tôi đã tiến hành giải
trình tự một phần gen parC có chứa điểm đột biến trên bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger để khẳng định kết quả.
Kết quả giải trình tự gen Sanger cho thấy chỉ duy nhất mẫu
Sal 4 ở vị trí 1882 của gen parC có xuất hiện đột biến làm thay đổi
nucleotide G→T, đột biến này làm thay đổi amino acid A628S, kết
22


quả này phù hợp với kết quả phân tích bằng phương pháp giải trình tự
gen thế hệ mới. Đột biến A628S có thể là yếu tố làm thay đổi chức
năng của gen parC làm cho gen này có khả năng đề kháng kháng sinh
ở Sal 4. Hiện chúng tôi chưa thấy có công bố nào về điểm đột biến
trên. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn đột biến gen parC (A628S)
có liên quan đến đề kháng kháng sinh nhóm quinolone hay không thì
cần có những nghiên cứu sâu hơn tiếp theo.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đã phân lập, định danh được các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt
bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở Hà Nội. Các mẫu nghiên cứu
nhiễm Salmonella với tỷ lệ 27,8%, bao gồm 9 serovar khác nhau,
trong đó phổ biến nhất là S. Typhimurium.

2. Đã xác định được đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng
Salmonella phân lập được. Salmonella phân lập được có tỷ lệ đề
kháng kháng sinh hay sử dụng là 52%, tỷ lệ Salmonella đa kháng
kháng sinh là 36%. Các kháng sinh bị đề kháng cao là STR và TE
(44%). Ngược lại, 100% số chủng nhạy cảm với CAZ. Kiểu hình
kháng kháng sinh phổ biến là TE, STR, AM, và C, TE, SXT, STR,
AM.
3. Đã phân tích được các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng
kháng sinh. Bao gồm các nhóm gen liên quan đến kháng kháng
sinh và các nhóm gen liên quan đến độc tố của vi khuẩn. Từ đó đã
xác định được:
• Đột biến mới ở gen parC (A628S) có khả năng liên quan đến đề
kháng kháng sinh nhóm quinolone ở Salmonella.
• Đã phân tích được các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc có
thể có vai trò trong đề kháng một số kháng sinh ở Salmonella
23