Nghiên cứu thu nhận Bacteriocin từ vi khuẩn Lactococcus Lactis ứng dụng bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM

LÊ THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN
LACTOCOCCUS LACTIS ỨNG DỤNG
BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2016


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Lại Quốc Đạt
TS. Nguyễn Quốc Bình

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Trịnh Khánh Sơn

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. Huỳnh Ngọc Oanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 11 tháng
07 năm 2016
Thành phần Hội đồng đánh giá luận vẫn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận vãn thạc sĩ)
1. GS.TS. Đống Thị Anh Đào

2. TS. Trịnh Khảnh Sơn
3. TS. Huỳnh Ngọc Oanh
4. PGS.TS. Phạm Văn Hừng
5. TS. TônNữMinhNguyẹt
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trường Khoa quản lý chuyên ngành sau khi
luận văn đã được sửa chữa (nếu cố).
CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Lê Thị Huyền

MSHV: 7140463

Ngày, tháng, năm sinh: 06/02/1990

Nơi sinh: Gia Lai

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm

Mã số: 60540101

I. TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOCOCCUS
LACTIS ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactococcus sp. có khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin
- Thu nhận bacteriocin từ chủng Lactococcus lactis đã phân lập đuợc
- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của bacteriocin thu nhận đuợc trên sữa

III.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016

IV.

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016

V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):

TS. Lại Quốc Đạt
TS. Nguyễn Quốc Bình

Tp. HCM, ngày 11 tháng 07 năm 2016
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực
Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Truờng Đại học Bách Khoa TP. HCM đã dẫn dắt, chỉ dạy,
truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian tôi học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại
trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo hướng dẫn TS. Lại Quốc Đạt và TS. Nguyễn Quốc
Bình đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận này.
Để hoàn thành tốt luận văn, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị đồng nghiệp, nhóm
nghiên cứu phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh học và các bạn
học viên cao học khóa 2014 đã luôn đồng hành, tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM.
TPHCM, ngày ........... tháng ........... năm 2016
Học viên thực hiện

1.1


Tóm tắt luận văn

Bảo quản thực phẩm bằng phương pháp sinh học ngày càng được quan tâm và nghiên
cứu nhiều. Từ các nguồn mẫu thực phẩm lên men, chúng tôi đã tiến hành phân lập, tuyển chọn
và định danh bằng phương pháp sinh học phân tử được 2 chủng vi khuẩn Lactococcus lactis có
khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn từ mẫu nước lên men dưa cải chua. Bacteriocin
thô được thu nhận từ vi khuẩn Lactococcus lactis subsp lactis trên môi trường Complex medium.

Nghiên cứu phương pháp thu nhận hợp chất kháng khuẩn bằng dung môi ethanol với tỷ lệ thích
hợp 7:3, dịch bacteriocin thu được có hoạt tính kháng khuẩn khoảng 3000IƯ/ml, có khả năng
kháng các chủng chỉ thị Lactobacillus plantarum, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus. Dịch
bacteriocin thô thu nhận khá nhạy cảm với enzyme phân hủy protein, bền với pH 4-5, chịu nhiệt
tốt, có khả năng ứng dụng cao trong bảo quản thực phẩm.
Food preservation using biological products are increasingly attracting attendtion and
well-studied. 2 strains of Lactococcus lactis were isolated and identified by molecular biological
methods from fermented food samples showed the capable of antimicrobial compounds
biosynthesis. Bacteriocin production by Lactococcus lactis subsp. lactis was studied in
fermentation using a complex medium. The antimicrobial compounds were obtained by using
ethanol with the appropriate ratio 7:3, bacteriocin obtained showed the antibacterial activity of
2000 IU/ml, and the ability of resistant to Lactobacillus plantarum, Bacillus subtillis, Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus. Further studies showed that the obtained bacteriocin quite
sensitive to proteolytic enzymes, stable at pH 4-5, active at wide range of temperature, promising
the widely application in food preservation.

1.2


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung
thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiêm do tôi bố trí và thực hiện.
Tôi xin cam đoan các thí nghiêm để thu thập số liệu trong luận văn này do tôi thực hiện
tại phòng thí nghiệm của phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh
học TPHCM, với sự hướng dẫn của TS. Lại Quốc Đạt và TS. Nguyễn Quốc Bình, sự giúp đỡ
của các đồng nghiệp, nhóm nghiên cứu của phòng thí nghiệm.
TPHCM, ngày ........... tháng ........... năm 2016
Học viên thực hiện

1.3

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................... 1
1.2. Ý nghĩa về khoa học và thực tiễn ................................................................................ 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN .................................................................................................... 3
2.1. Hợp chất kháng khuẩn (bacteriocin) ........................................................................... 3
2.1.1. Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin ......................................................................... 5
2.2. Cơ chế tác động của bacteriocin trên tế bào vi khuẩn Gram duơng ......................... 6
2.3. Phuơng pháp thu nhận bacteriocin .............................................................................. 8
2.4. ứng dụng của bacteriocin .......................................................................................... 10
2.5. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin ................................................................. 12
2.6. Một số vi sinh vật gây hu hỏng thục phẩm ............................................................... 14
2.6.1. Staphylococcus aureus ....................................................................................... 14
2.6.2. Bacillus cereus ................................................................................................... 15
2.6.3. Escherichia colỉ .................................................................................................. 15
2.6.4. Listeria monocỵtogens ....................................................................................... 16
CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 17
3.1. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................. 17
3.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 17
3.3. Nguyên vật liệu ........................................................................................................ 17
3.4. Phuơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 18
3.4.1. Phuơng pháp phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactococcus sp. có khả
năng sinh tổng họp chất kháng khuẩn ............................................................................. 18
3.4.2. Phuơng pháp thu nhận thu nhận bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactococcus
lactis phân lập đuợc ....................................................................................................... 24
3.4.3. Điện di SDS-PAGE ........................................................................................... 26
3.4.4. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của bacteriocin thu đuợc trên sữa tuơi .......... 26

3.5. Phuơng pháp xử lý số liệu ......................................................................................... 27
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................................... 28
4.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactococcus sp. có tiềm năng sinh tổng họp
bacteriocin.......................................................................................................................... 28
4.1.1. Kốt quả phân lập và tuyển chọn ......................................................................... 28
4.1.2. Kết quả khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập ............30

1.4


4.1.3. Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn phân
lập ............ ... ........................'. ...............................................................................
31
4.1.4. ................................................................................................................ Kết
quả định danh và giải trình tự bằng phuơng pháp sinh học phân tủ ...............................33
4.2. Kết quả thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn Lactococcus lactis phân lập đuợc ...........34
4.2.1. ................................................................................................................ Kết
quả thu nhận thu nhận bacteriocin bằng phuơng pháp kết tủa ........................................34
4.2.2. Kết quả định luợng protein tổng......................................................................... 35
4.2.3. Kết quả xác định hoạt tính bacteriocin ...............................................................35
4.2.4. Kết quả khảo sát một số tính chất của bacteriocin .............................................35
4.2.5. Kết quả điện di protein ....................................................................................... 41
4.2.6. Quy trình thu nhận bacteriocin đề xuất .............................................................. 41
4.3. Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của bacteriocin trên sữa tuơi .................... 42
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................45
5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 45
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................... 45

1.5

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp ra bacteriocin ........................................................... 3
Hình 2.2. Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin ............................................................................ 6
Hình 2.3. Cơ chế xâm nhập vào tế bào vi khuẩn của bacteriocin ............................................ 7
Hình 2.4. ứng dụng của bacteriocin ........................................................................................ 10
Hình 2.5. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Lactococcus lactis.................................................... 13
Hình 4.1. Một số kết quả kiểm tra sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập ......................... 31
Hình 4.2. Vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin với các chủng chỉ thị................................ 32
Hình 4.3. Kết quả điện di trên gel Agarose 1% sản phẩm PCR vùng lóSrRNA ..................... 33
Hình 4.6. Vòng kháng khuẩn thể hiện độ bền của dịch bacteriocin ở pH 2 - 9 ....................... 36
Hình 4.7. Kết quả điện di SDS - PAGE .................................................................................. 41
Hình 4.8. Quy trình thu nhận bacteriocin ............................................................................... 42

1.6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2-1. Một số bacteriocin được sinh ra từ vi khuẩn lactic .................................................. 4
Bảng 3-1. Một số phản ứng sinh hóa đối với chủng vi khuẩn lactic....................................... 19
Bảng 3-2. Thành phần một phản ứng PCR ............................................................................. 23
Bảng 3-3. Hoạt tính dịch bacteriocin khi bị xử lý kết hợp pH và nhiệt độ ............................. 26
Bảng 3-4. Nồng độ bacteriocin thử nghiệm ............................................................................ 27
Bảng 4-1. Tổng hợp các chủng vi khuẩn lactic phân lập được ............................................... 28
Bảng 4-2. Đặc điểm hình thái của 11/31 chủng Lactococcus sp. đã được tuyển chọn ........... 29
Bảng 4-3. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của 4 chủng đã tuyển chọn ................................... 30
Bảng 4-4. Khả năng kháng khuẩn của 11 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn .............................. 31
Bảng 4-5. Đường kính vòng kháng khuẩn của bacteriocin thu nhận được bằng phương pháp
kết tủa ethanol ......................................................................................................................... 34
Bảng 4-6. Hàm lượng protein thu được từ chủng DTI, DT2 .................................................. 35

Bảng 4-7. Hoạt tính bacteriocin của 2 chủng DT1 và DT2 .................................................... 35
Bảng 4-8. Sự nhạy cảm của bacteriocin với enzyme .............................................................. 35
Bảng 4-9. Khảo sát độ bền pH của dịch bacteriocin thu được từ 2 chủng DTI, DT2 ............. 37
Bảng 4-10. Hoạt tính của dịch bacteriocin sau khi bị xử lý kết hợp pH và nhiệt độ .............. 37
Bảng 4-11. Mật độ tế bào vi khuẩn 5. aureus trong sữa sau khi bổ sung dịch bacteriocin.43

1.7


DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4-2. Mối liên hệ tuyến tính giữa AOD và nồng độ albumine ............................ Error!
Bookmark not defined.
Đồ thị 4-1. Mối liên hệ tuyến tính giữa AD và nồng độ nisin chuẩn.................................... 62
Đồ thị 4-3. Hoạt tính của bacteriocin bền ở các giá trị pH2-9 .............................................. 36
Đồ thị 4-4. Độ bền của bacteriocin khi bị xử lý kết hợp tác nhân nhiệt và pH khác
nhau ....................................................................................................................................... 40

Đồ thị 4-5. Mật độ tế bào vi khuẩn 5. aureus trong sữa sau khi bổ sung dịch
bacteriocin sau 24-72 giờ ....................................................................................................... 43

1.8


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thực tế cho thấy, để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, mọi người thường sử dụng các
hóa chất bảo quản là những hợp chất hóa học tổng hợp, những hóa chất độc hại. Các chất bảo
quản tổng hợp có giá thành thấp, có những ưu điểm nổi trội như lưu giữ thực phẩm lâu, giúp cho
việc kinh doanh trở nên dễ dàng và thu lại được nhiều lợi nhuận, những hóa chất này cũng có
những tác hại nhất định nên chúng chỉ được phép thêm vào ở một nồng độ hạn chế cho phép.

Thực trạng vì mục tiêu lợi nhuận mà những người buôn bán sử dụng hóa chất bảo quản tràn lan,
vượt nồng độ cho phép, dùng hóa chất trong danh mục đã bị cấm, hàng ngày những chất độc
theo các bữa ăn xâm nhập vào cơ thể con người, đã dẫn đến những hệ lụy cho sức khỏe con
người, gây ngộ độc thực phẩm, ung thư và có thể gây tử vong.
Việc sử dụng những hóa chất tự nhiên ngoài việc bảo quản tốt thực phẩm còn có tác dụng
lưu giữ hương vị, màu sắc, dưỡng chất..., ít ảnh hưởng đến sức khỏe con người nên được các
chuyên gia dinh dưỡng khuyên dùng. Một số chất bảo quản sinh học được phép lưu hành rộng
rãi như chất catechin trích ly từ trà xanh, bacteriocin, ..., nhưng do giá thành cao nên ít được sử
dụng.
Vì vậy, XU hướng hiện nay tập trung nghiên cứu, phát triển, sản xuất các chất bảo quản thực
phẩm tự nhiên, có nguồn gốc sinh học, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là cần thiết. Phương
pháp bảo quản sinh học trong thực phẩm bằng cách sử dụng các vi sinh vật đối kháng hay các
sản phẩm trao đổi của chúng để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm là
giải pháp đang được nhiều người quan tâm. Bacteriocin sinh ra từ vi khuẩn lactic được xem như
một chất bảo quản tự nhiên hay chất bảo quản sinh học từ lâu đã được nghiên cứu, điển hình là
nisin.
Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin có hoạt tính mạnh và được
WHO công nhận an toàn là Lactococcus ỉactis. Với khả năng kháng khuẩn tốt, khi bổ sung vào
thực phẩm bacteriocin không làm ảnh hưởng đến các giá trị dinh dưỡng cũng như chất lượng
cảm quan của thực phẩm, đồng thời đảm bảo an toàn sức khỏe người sử dụng nên bacteriocin từ
vi khuẩn Lactococcus lactis được


xem là bacteriocin duy nhất được sử dụng rộng rãi như một phụ gia bảo quản thực phẩm.
Hiện nay chế phẩm nisin trên thị trường Việt Nam có giá thành khá cao, chủ yếu là
ngoại nhập. Vì vậy, việc thu nhận hợp chất kháng khuẩn này cần được thực hiện để ứng dụng
vào bảo quản một số thực phẩm tươi sống, tôi tiến hành thực hiện đề tài “nghiên cứu thu nhận
bacteriocin từ vì khuẩn Lactococcus lacứs ứng dụng bảo quản thực phẩm”

Mục tiêu của đề tài:

Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và bước đầu xây dựng
quy trình thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn phân lập được, ứng dụng bảo quản thực phẩm.

1.2. Ý nghĩa về khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Đề tài xây dựng cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về tổng hợp chất
bảo quản sinh học, cung cấp chủng vi khuẩn Lactococcus lactis cho bộ sưu tập giống vi sinh
thực phẩm.

Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ tạo ra một hợp chất bảo quản sinh học có khả năng thay thế các chất bảo
quản hóa học để ứng dụng bảo quản một số đối tượng thực phẩm.

CHƯƠNG 2. TỒNG QUAN
2.1. Hợp chất kháng khuẩn (bacteriocỉn)
Bacteriocin là những phân tử peptide do vỉ khuẩn lactic sinh tổng hợp cố hoạt tính kìm hãm
đặc hiệu, ức chế sụ sinh trưởng và phát triển của một số vỉ khuẩn gây hư hỏng thực phẩm và các
vỉ khuẩn khác cố quan hệ họ hàng với chủng sỉnh ra (Hikmate Abriouel, 2007).
Nguón dinh

2


Hỉnh 2.1. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp ra bacteriocm (Lucy H. Deegan và cộng sự, 2006)
Bacteriocin được sinh tồng hợp ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacteriocin từ vi
khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều nhất do tính hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng ứng dụng
làm chất bảo quản tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm của nó. Sự sinh tồng hợp bacteriocin
chịu ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy như pH môỉ trường, nhiệt độ, thời gian.
Ưu điểm của bacteriocỉn là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khỉ ở nồng độ rất thấp nhưng
bacteriocin thường cỏ phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh.

3


Bacteriocm sinh ra từ vỉ khuẩn lactic được xác định là các peptide mang điện tích dương, có
kích thước nhò, được tổng hợp tại ribosome và cố khả năng thấm qua màng tế bào (Klaenhammer,
1993). Bacteriocm thường nhạy cảm với các enzyme phân hủy protein như proteinase K, trypsin,
pepsin, papain, a- chemotrypsin (De Vuyst và Vandamme, 1994).

Bảng 2-1. Một sổ bacteriocỉn được sinh ra từ vỉ khuẩn lactic
Kích thước
Bacteriocin

Chủng vi sinh vật

Phổ tác dụng

(KDa)

Nhổm I: Lantibỉotics
Nisin A và nisin z

Lactococcus ỉactis

Rộng

3,4

Lacticin 481

Lactococcus ỉactis

Rộng

2,7

Lactocin s

Lactococcus sake

Rộng

3,7

Camocin U149

Camobacterium pisicoỉa

Rộng

3,7

Variacin

Micrococcus varians

Rộng

2,5

4

Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocỉn
Hầu hết các bacteriocin được tỏng hợp dưới dạng tiền peptide bất hoạt có mang một trình tự
leader peptide ở đầu bám và trình tự ờ đầu c của propeptide. Trong trường hợp lantibiotic, các
phân tử serine, threonine và cysteine trong phần propeptide trải qua những biến đổi sau dich mã
để hình thành Lan/MeLan. Con đường sinh tồng hợp lantibỉotỉc gồm những bước sau:
-

Sinh tổng hợp phân tử tiền bacteriocin.

-

Phân tử tiền bacteriocm bị biến đổi bởi Lan B, Lan c sau đố được vận chuyển qua màng bởi
hệ thống vận chuyển ABC Lan T, đồng thời được biến đổi bởi LanC để phóng thích phân tử
bacteriocin trưởng thành. Tuy nhiên quá trình cắt trình tự leader peptide có thề xảy ra trước,
trong hoặc sau bước xuất bào.

-

Histidine protein kinase (HPK) cảm ứng sự hiện diện của bacteriocỉn và tự phosphoryl hóa.

-

Nhóm phosphoryl hóa (p) được chuyển qua nhân tố đáp ứng điều hòa (response regulator RR)

-

Nhân tố RR hoạt hóa sự phiên mã của các gen được điều hòa.

-

Sự hiện diện của bacteriocin cảm ứng hoạt động tự miễn của tế bào sản xuất. Sự tự miễn
được điều khiển bởi các protein miễn dịch, Lanl, protein vận chuyển ABC và Lan FEG.

5


Hình 2.2. Cơ chế sinh tồng hợp bacteriocin (Davies EA, et al, 1997)
2.2. Cơ chế tác động của bacteriocin trên tế bào vi khuẩn Gram dương
Hiện nay, đã cỏ khoảng 200 loại bacteriocin được xác định nhưng chưa được phân loại rõ
ràng. Các bacterỉocin thường cố khả năng ức chế nhóm vỉ khuẩn Gram dương như Bacillus,
Listeria monocytogenes, Samonella, các bacteriocin thường được kết hợp vớỉ nhau để ức chế
nhóm vỉ khuẩn Gram âm.
Bacteriocin thuộc nhóm I và n cố cơ chế hoạt động giống nhau, các peptide ỉỉên kết màng
huyết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với lớp phospholipid tích điện âm, hình thành nên
lỗ hỗng làm thất thoát các ỉon, sự vận chuyển các chất qua màng không chọn lọc gây rối loạn
cấu trúc tế bào, dẫn đến chết tế bào (Bruno và Montvỉlle, 1993). Cảc bacteriocin hoạt động phụ
thuộc vào hoạt động của enzyme, pH, sự nảy mầm của bào tử.

6


Bacteriocin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn
Gram (+), đối với bào tử, bacteriocin có khả năng ức chế sự nảy mầm của chúng. Mặc dù không
có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-) nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài
yếu tố khác như nhiệt độ, axit... thì bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của các loại vi
khuẩn này (Blackbum và cộng sự.,1989; Stevens và cộng sự., 1991).
Bacteriocin chứa các phân tử mang điện tích liên kết với phân tử tích điện như protein
glucolipid, protein, lipid trên thành tế bào vi khuẩn, tạo các lỗ trên màng làm phá hủy năng

lượng hữu ích của tế bào sống, thay đổi cấu trúc, biến đổi cấu hình không gian trên bề mặt màng,
tạo lỗ hỗng không còn chức năng lựa chọn. Việc tạo ra các lỗ làm giảm sự hiện diện của các ion
dương Mg2+, Ca2+ do chúng trưng hòa điện tích âm với phospholipid, làm giảm sự linh động của
màng. Các lỗ trên màng tạo bởi bacteriocin làm các ion K+, Mg2+, acid amin Lisyne và ATP
thoát ra ngoài nhưng các protein lớn trong tế bào chất không qua được. Vì vậy, tạo thế mất cân
bằng trên màng, làm mất động lực proton nên sẽ gây chết tế bào. Ngoài ra, nisin tác dụng tương
tác đặc hiệu với Lipid II tiền tố peptidoglucan, tạo thành các lỗ để phá thủng màng tế bào đích.
Lipid n đóng vai trò như những phân tử cắt cụt cho các liên kết đặc hiệu với màng tế bào vi
khuẩn.
A

xa c n »
I rrtn»n •>*«

Hình 2.3. Cơ chế xâm nhập vào tế bào vi khuẩn của bacteriocin A: Bacteriocin tương tác với
đầu ưa nước của phospholipid làm vỡ cầu trúc lớp đôi B: Đầu N của nisin liên kết với lipid II.
C: Đầu c của bacteriocin chuyển vị xuyên qua màng. Mỗi lỗ trên màng chứa khoảng 5-8 phức
hợp bacteriocin -lipid II.

7


2.3. Phương pháp thu nhận bacteriocin
Hiện nay trên thế giới sản xuất bacteriocin theo công nghệ lên men theo mẻ và thu hồi, đã
có nhiều nghiên cứu về phương pháp thu nhận bacteriocin như kết tủa bằng ethanol hoặc muối
ammonium sulfate, phương pháp hấp phụ, sắc ký, màng thẩm tích, ...
Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulfate, khi dung dịch protein có pH bằng điểm
đẳng điện của protein, lớp màng nước không được tạo thành sẽ làm cho các phân tử protein
không tích điện kết chùm lại với nhau. Màng nước cũng có thể bị mất do một tác nhân nào đó
như nhiệt độ cao, acid đậm đặc, nồng độ dung môi cao, ... các phân tử protein không được bảo

vệ bởi màng nước. Do đó các phân tử protein không còn lực đẩy tĩnh điện, có khuynh hướng
liên kết lại với nhau tạo thành các phân tử có kích thước lớn hơn và tạo ra sự kết tủa. Có nhiều
tác nhân gây nên hiện tượng kết tủa của phân tử protein như pH, các muối vô cơ, các acid hữu
cơ, acid vô cơ, dung môi, nhiệt độ ... Sự kết tủa protein do muối (NHịhSOHà thuận nghịch bởi
khi không còn tác nhân muối gây kết tủa thì protein trở lại trạng thái hoà tan. Bề mặt phân tử
protein có các nhóm phân cực, khi hoà tan vào nước các phân tử nước lưỡng cực cao được hấp
phụ bởi các nhóm này tạo ra lớp vỏ hyđrat bao quanh. Các kết quả nghiên cứu của tác giả Phan
thị Khánh Hoa (2003), cho thấy phần lớn bacteriocin được kết tủa ở nồng độ (NH4)2SŨ4 bão
hoà 50% và ở pH trung tính. Phương pháp này đơn giản, chi phí thấp, hiệu suất thu hồi cao
99,8% bacteriocin plantaricin c của Lactobacillus plantarum, ở nồng độ (NĨỈ4)2SO4 bão hòa
55% (Davey, Richardson, 1981), nhưng độ tinh sạch thấp. Để loại bỏ muối là các tạp chất có
phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối
các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau:
cho dung dịch vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt
hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH
= 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các
chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán,
còn lại trong màng là các chat protein có phân tử lớn.
Phương pháp kết tủa bằng dung môi ethanol được thực hiện như tủa ammonium sulfate,
phương pháp đơn giản, chi phí thấp, tiết kiệm thời gian, độ tinh sạch cao, hiệu suất thu hồi
khoảng 80%, phương pháp này được sử dụng khá nhiều (Schilinger, 1989 và Venema, 1997).
Phương pháp thu hồi bằng hấp phụ bởi chính bề mặt tế bào chủng sản sinh ra nó và phản

8


hấp phụ bằng tách chiết bởi dung dịch axit loãng cho phép thu hồi được bacteriocin có độ tinh
sạch cao nhưng hiệu suất không cao, khoảng 10-30% (Phan Thị Khánh Hoa và cộng sự, 2003).
Cơ sở của phương pháp dựa trên đặc tính của bacteriocin là tại một giá trị pH xác định thì
có thể hấp phụ lên bề mặt tế bào của chủng nhạy cảm hoặc của chính chủng sản sinh ra nó, còn

tại một pH xác định khác thì nó lại có khả năng phản hấp phụ ra khỏi tế bào. Bacteriocin có khả
năng tương tác một cách đặc hiệu với tế bào vi khuẩn lactic, sự tương tác này phụ thuộc chủ yếu
vào liên kết tĩnh điện giữa bacteriocin với các thành phần cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn, pH
chính là yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến tương tác này do sự thay đổi pH có thể dẫn tới
sự biến đổi điện tích của thành tế bào. Do đó, ta có thể điều chỉnh pH một cách thích hợp với
từng loài để tách chiết được bacteriocin ra khỏi dung dịch. Phương pháp này có tính hấp phụ
chọn lọc nên bacteriocin thu được có độ tinh sạch cao, tuy nhiên hiệu suất thu hồi không cao
(Coventry, 1996).
Phương pháp thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic
cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu,
màng BC có thể tái sử dụng 9-10 lần, có thể bảo quản thịt tươi đến 3 ngày bằng màng BC hấp
phụ dịch bacteriocin 200AU/ml vẫn đảm bảo chất lượng thịt theo TCVN 7046:2002 (Nguyễn
Thúy Hương và cộng sự, 2008).

9


Thu nhận bacteriocm từ Lactococcus ỉactis trong môi trường bột sữa whey bằng sắc ký
tương tác ky nước, bỏ qua bước tủa ammonium sulphate làm giảm chi phí, thu được bacteriocin
cố hoạt tính cao và hàm lượng muối thấp, cố thề ứng dụng cho nhiều lĩnh vực (Angela Faustino
Jozala và cộng sự, 2015).

2.4. ứng dụng của bacteriocin
Bacteriocin thu nhận từ vỉ khuẩn lactic là chất bảo quản sinh học, đảm bảo an toàn cho sức
khỏe người tiêu dùng, không làm thay đổi tính chất cảm quan của sản phẩm (Ruiz-Larrea, 2005),
không gây ảnh hưởng đến môi trường. Tuy nhiên, chúng có phổ hoạt động khá hẹp, nhạy cảm
với enzyme phân hủy protein và giá thành sản phẩm cao nên ít được sử dụng rộng rãi.
Bacteriocm cố thể sử dụng trực tiếp bỏ sung vào thực phẩm lên men hoặc sấy khô thành bột rồi
bổ sung vào thực phẩm lên men hoặc thục phẩm không lên men (Lucy H. Deegan và cộng sự,
2006).

Bacterioĩiíi daiỉg lóíig

Thtrc plLắiiL íãi ILK31

BacteLÌociiidạiig bộl

TJ'in. phầm khùng lẽn IL1C11

Hình 2.4. ứng dụng của bacteriocin (Lucy H. Deegan và cộng sự, 2006)
Bacteriocỉn điển hình là nisỉn, lần đầu tiên được tìm thấy trong sữa bởi Roger (1928). Nisin
có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên và không thể tỏng
hợp nhân tạo. Trong công nghiệp, nỉsin được thu nhận bằng cách nuôi Lactococcus lactis trong
sữa hoặc trong dung dịch đường dextrose. Quá trình sản xuất phải đảm bảo các yêu cầu vi sinh
và vệ sinh an toàn thục phẩm. Năm 1969, tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm (gọi tắt là FAO)
và tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công nhận nisin là một phụ gia thực phẩm an toàn và được
phép sử dụng cho người ở 50 quốc gia trên thế giới bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu
và một số nước ở Châu Á, Châu Phi. Nisin có hiệu quả trong việc kiểm soát một loạt các vi
10


khuẩn gram dương, ức chế tế bào sinh dưỡng và cả bào tử của chúng bao gồm: Listeria,
Enterococcus, Sporothermodurans, và Clostridium. Khi sử dụng riêng lẻ, nisin không có hiệu
quả trên vi khuẩn gram âm (như E.coỉí), nấm men và nấm mốc; các vỉ khuẩn gram âm có khả
năng kháng nỉsỉn chủ yếu là do màng không thấm nước bên ngoài của chúng. Tuy nhiên, khi sử
dụng kết hợp nisin với các tác nhân gây mất ổn định màng tế bào bên ngoài như khi xử lý ở các
điều kiện làm lạnh, nhiệt độ cao, trong môi trường pH thấp (pH 2-6), hay khi sử dụng kết hợp
với chất bảo quản khác như lysozyme (từ lòng trắng trứng), enterocin (một chất kháng khuẩn
mới được phân lập từ Enterococcus faecium), .. .Với khả năng kháng khuẩn tốt và có thể bổ
sung trực tiếp vào thực phẩm, nỉsin không làm ảnh hưởng đến các chất lượng dinh dưỡng cũng
như giá trị cảm quan của thực phẩm nên nỉsin được sử dụng rộng rãi như một phụ gia bảo quản.

Nisin được phân hủy trong quá trình tiêu hóa trong ruột và không gây ra ảnh hưởng cho sức
khỏe. Thêm vào đó, các công trình nghiên cứu ứng dụng nỉsỉn cho thấy nỉsin có khả năng tiêu
diệt một số loại vi khuẩn bằng cách tấn công vào thành tế bào của vỉ khuẩn có hại nhưng lại
không gây ảnh hưởng đến nhiều loại vi khuẩn có lợi dùng trong công nghệ lên men và trong hệ
tiêu hóa của người và không gây độc đối với người.
Cho đến nay, các bacteriocin sản xuất thương mại chỉ có nisin (hoặc nhóm Ninhibitory),
được sản xuất bởi Lactoccocus ỉactỉs và pediocin PA-1, được sản xuất bởi Pediococcus
acidiỉactici, sản phẩm thương mại như NisaplinTM (sản phẩm mô tả-PD45003-7EN; Danisco,
Copenhagen, Đan Mạch) và ALTATM 2431 (Kerry Bioscience, Carrigaline, Công ty Cork,
Ireland). Nisin được sử dụng tại hơn 48 quốc gia, công nhận NỉsaplỉnTM được sử dựng như là
một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên. Nisin đã được chứng minh là có hiệu quả trong một số
loại thực phẩm, ức chế sự tăng trưởng của một loạt các vi khuẩn Gram dương, trong đó có nhiều
tác nhân gây hư hỏng thực phẩm quan trọng như vi khuẩn Listeria monocytogenes. Nó được sữ
dụng chủ yếu trong các loại thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa và đặc biệt hiệu quả
khỉ sử dụng trong sản xuất pho mát. Bacteriocin đã được nghiên cứu là cực kỳ hiệu quả như một
chất phụ gia để ngăn chặn sự hư hỏng và làm tăng thời hạn sử dựng của một số loại thực phẩm
(Chen & Hoover, 2003; Choi & Park, 2000; Cutter & Sừagusa, 1995;. Davies et al, 1999).
Trong công nghiệp chế biến đồ hộp, chế biến sữa và sản phẩm từ sữa, nisin có khả năng làm
giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn bền nhiệt như c. perfrigens, c. thermocacharoỉytium hay
Bacillus stearothermophilus để cải thiện hiệu quả quá trình thanh trùng, ngăn ngừa quá trình

11


thối rửa xảy ra khi các bào tử còn sống sót, thường áp dựng đối với sản phẩm cà chua nghiền,
đậu quả,... (D.G. Hoover, 1992).
Trong công nghiệp chế biến thịt và các sản phẩm từ thịt, nisin đóng vai trò là chất bảo quản
hữu hỉệu với khả năng kháng khuẩn, ngăn cản sự phát triển của bào tử Clostridium Botulinum
(Chen, H. Và D. Hoover ,2003). Nisin ứng dụng trong các sản phẩm thủy sản. Nykamen và cộng
sự (2000) đã nghiên cứu sử dụng kết hợp nisin và sodium lactate trên thịt cá hồi xông khói giúp

làm giảm số lượng vỉ khuẩn L. monocytogenes, ứng dụng nisin trong một số đối tượng như bánh
phở và rau, khảo sát nồng độ nisin thích hợp ở các mức 0, 3, 6.5, 13ml/kg thịt quả nhuyễn, ở
nồng độ ố.5ml/kg thịt quả nhuyễn đã kéo dài thời gian bảo quản lên 60 ngày, vi sinh vật hiếu
khí trong thịt quả đã bị tiêu diệt hết (Đỗ Thị Huyền, 2009).

2.5. Vỉ khuẩn lactic sinh tổng họp bacteriocin
Đến nay, bacteriocin đã được phát hiện ở một số loài thuộc chi Lactococcus, Lactobacillus,
Camobacterium, Enterococcus và Pediococcus. Bacteriocin có hoạt tính mạnh thường được tìm
thấy ở các vi khuẩn lactic thuộc chi Lactococcus, các loài thuộc chi Lactococcus được xem là
an toàn và bacteriocin có hoạt tính mạnh nhất nên đã có nhiều nghiên cứu, sản xuất bacteriocin
từ vi khuẩn Lactococcus.
Lactococcus lactis
Theo khóa phân loại của Bergey (1994), vi khuẩn Lactococcus lactis thuộc:
Lớp Lactobacillaceae
Họ Sreptococceae
Giống Lactococcus
Loài Lactococcus lactis

12


Hình 2.5. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Lactococcus lactis
Tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis có dạng hình cầu, có kích thuớc 0,5 - l,5pm tùy thuộc
vào điều kiện sinh truởng. Các tế bào của Lactococcus lactis sắp xếp thành cặp hay chuỗi ngắn
trong môi truờng dịch thể. Lactococcus lactis là một loại vi khuẩn lên men đường trong sữa cho
ra sản phẩm là acid lactic, lên men lactic đồng hình một số nguồn carbon tạo sản phẩm chủ yếu
là L(+) lactic acid từ glucose, là vi khuẩn Gram dương, không di động, không có khả năng tạo
bào tử, vi hiếu khí, phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase âm tính.
Lactococcus lactis phát triển ở nhiệt độ thích hợp 30°C, ở pH 6.5, nồng độ NaCl thấp hơn
6.5%. Một số chủng Lactococcus ỉactís có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh CŨ2. Các chủng

thuộc loài Lactococcus ỉactis là vi sinh vật quan trọng ứng dụng ttong sản xuất thực phẩm lên
men. Nó có khả năng sinh tổng hợp rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, các hợp
chất này là sản phẩm của cuối của quá trình biến dưỡng (Andreja và Irena Rogelj, 2007).
Nhiều chủng vi khuẩn lactic sản xuất được bacteriocin, nhưng chỉ có nisin từ chủng
Lactococcus ỉactis đã được WHO cấp phép là an toàn và cho phép sử dụng, nó được coi như
một phụ gia bền acid, được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm thông qua việc ức
chế hệ vi sinh vật Gram dương trong thực phẩm.
Lactococcus lactỉs được phân lập nhiều trong các loại thực phẩm lên men, tác giả Chan-Ick
Cheigh và cộng sự (2002) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các thông số quá trình lên men
Lactococcus lactis subsp. ỉactỉs AI 64 được phân lập từ kim chi để thu nhận nisin, kết quả cho
thấy việc sản xuất bacteriocm ảnh hưởng bởi nguồn cacbon và nitơ, điều kiện tối ưu cho sản
xuất bacteriocin ở nhiệt độ 30°C, pH 6.0, môi trường M17 bổ sung 3% lactose, thời gian lên
men 20 giờ.
Nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Bình và cộng sự (2000), đã nghiên cứu “Sự đa dạng của
vi khuẩn lactic có khả năng sinh tồng hợp bacteriocin”, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã phân
lập được chủng Tn 143 có khả năng ức chế sự phát triển của B. subtìỉis, B. cereus, Samoneỉỉa.
Sữa tươi cũng là một nguồn phân lập Lactococcus lactis tốt, tác giả ậanlibaba p. và cộng sự,
(2009) đã nghiên cứu phân lập được chủng Lactococcus lactỉs subsp.ỉactis LL27 từ sữa tươi có
khả năng sản xuất bacteriocin có hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dương, có khả năng ức chế vi
khuẩn Gram âm khi kết hợp với tác nhân nhiệt hoặc lạnh đông. Bacteriocin thu được từ LL27

13


có thể ứng dụng bảo quản nhiều loại thực phẩm chế biến. Trong năm này, tác giả Hoa Thị Minh
Tú và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
bacteriocin, đã phân lập được 3 chủng PD14, PD2.9, BV20 có khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin cao, có phổ kháng khuẩn rộng, nhạy cảm với enzyme phân hủy protein là trypsin, có
khả năng kháng các kháng sinh như streptomycin, chloramphenicol ở nồng nộ cao.

2.6. Một số vi sinh vật gây hư hỏng thụt phẩm
2.6.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, Gram dương, đường
kính 0,5-1,5 pm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động. Thành tế bào kháng với
lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu.
Đa số các dòng s. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong môi trường có
nhiệt độ trên 15°c, nhiều nhất khi chúng tăng trường ở nhiệt độ 35-37°C (Trần Linh Thước,
2002).
Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thục phẩm không
tốt, tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến bị trầy xước hay do ho,
hắt hơi. Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực
phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng
nhiệt độ rất lớn, từ 7-48°C. Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển
của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý
(Mary K. s. và cộng sự, 2002).

2.6.2. Bacillus cereus
B. cereus là trực khuẩn, Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng trong khoảng
nhiệt độ từ 5-50°C, tối ưu ở 35-40°C; pH dao động từ 4.5 - 9.3, dễ dàng tạo bào tử và bào tử nảy
mầm rất dễ dàng.
Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị,
sản phẩm khô). Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và
emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn
bị mà không bảo quản trong điệu kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng thực phẩm chứa mật
độ tế bào trên 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng phổ biến gây ra bởi B. cereus là đau
bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu từ 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm và kéo dài 12-24 giờ. Một
14