Chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát hiệu ứng gia tăng kích thước lá trên cây dâu tây (Fragaria Vesca L.)

Số 31 (56) - Tháng 8/2017

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN

Chế tạo Oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ
Gamma Co-60 dung dịch Chitosan/H2O2 và khảo sát
hiệu ứng gia tăng kích thước lá trên cây dâu tây
(Fragaria Vesca L.)
Preparation of Oligochitosan by Gamma irradiation onto Chitosan/H2O2 solution
and examining effects of increase in the size of leaves on Strawberry
(Fragaria Vesca L.)
TS. Đặng Xn Dự, Trường Đại học Sài Gòn
Dang Xuan Du, Ph.D., Saigon University
ThS. Trần Thị Anh Thư, Trường THPT chun Hùng Vương, Gia Lai
Tran Thi Anh Thu, MSc., Hung Vuong High School, Gia Lai Province
TS. Lê Cơng Nhân, Trường Đại học Sài Gòn
Le Cong Nhan, Ph.D., Saigon University
Tóm tắt
Trong nghiên cứu này, chitosan đã được cắt mạch trong dung dịch chitosan/H2O2 bằng phương pháp
chiếu xạ gamma Co-60. Khối lượng phân tử (Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA) của chitosan lần lượt được xác
định bằng phương pháp sắc ký gel thấm qua (GPC) và phương pháp phổ hồng ngoại (IR). Kết quả cho
thấy oligochitosan khối lượng phân tử Mw ~ 7,5 kDa đã được chế tạo một cách hiệu quả bằng phương
pháp chiếu xạ gamma Co-60 dung dịch chitosan/H2O2 ở liều xạ thấp, khoảng 11 kGy. Oligochitosan chế
tạo được có hiệu ứng gia tăng kích thước lá của cây dâu tây. Nồng độ phù hợp của oligochitosan để
phun lên cây dâu tây là khoảng 50 ppm.
Từ khóa: Oligochitosan, bức xạ Gamma, dâu tây.
Abstract
In this study, the degradation of chitosan in the presence of H2O2 solution by gamma irradiation was
investigated. The molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan were determined by gel
permeation chromatography (GPC) and infrared spectra (IR), respectively. Results showed that
oligochitosan with molecular weight Mw ~7,5 kDa were preparared efficiently by gamma irradiation in

small doses, ~11 kGy. The obtained oligochitosan imposes effects of increase in the size of leaves of
fracaria vesca L. The appropriate concentration of oligochitosan used to spray onto fracaria vesca L.
trees was 50 ppm.
Keywords: Oligochitosan, Gamma irradiation, Fracaria Vesca L.

3


CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH…

1. Mở đầu
Oligochitosan là polyme có nguồn gốc
tự nhiên, là sản phẩm biến tính từ chitosan
bằng phản ứng cắt mạch. Oligochitosan tự
phân hủy sinh học, là prebiotic có độc tính
thấp, có khả năng kháng nấm [6] và kháng
khuẩn [7] [8]. Ngoài ra, oligochitosan còn
làm tăng sinh tế bào, tăng cường miễn dịch
của cơ thể động vật bằng cách kích thích
sản sinh bạch cầu, giảm cholesterol trong
máu và có tác dụng làm lành các vết
thương, vết bỏng [11]. Do có nhiều hoạt
tính sinh học độc đáo, oligochitosan được
ứng dụng khá đa dạng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như làm chất điều hòa sinh
trưởng, phòng trị nấm bệnh thực vật và gia
tăng khả năng miễn dịch trên động vật...
Hoạt tính của oligochitosan thông thường
bị chi phối bởi khối lượng phân tử (KLPT,
Mw) và độ đề axetyl (ĐĐA). Vì vậy, khi

chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu
thì các thông số này rất được quan tâm
trong quá trình phản ứng.
Các phương pháp chế tạo oligochitosan
phổ biến bao gồm: phương pháp hóa học,
phương pháp enzym và phương pháp chiếu
xạ. Phương pháp hóa học có ưu điểm là
điều kiện phản ứng khá đơn giản nên dễ
dàng tiến hành với quy mô lớn. Tuy nhiên,
hạn chế của phương pháp này là hiệu suất
thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm môi
trường. Phương pháp enzym có lợi thế là
cho hiệu suất cao nhưng chi phí lại đắt.
Phương pháp chiếu xạ được xem là thân
thiện với môi trường và có thể tiến hành dễ
dàng với quy mô lớn, tuy nhiên để chế tạo
được oligochitosan thường phải sử dụng
liều xạ cao [2], điều này dẫn đến sản phẩm
tạo thành dễ bị cắt mạch nhóm amin và phá
vỡ vòng glucopyranose [5], làm giảm hoạt
tính của oligochitosan.
Trong bài báo này, chúng tôi trình bày

kết quả chế tạo oligochitosan bằng sự kết
hợp đồng thời giữa bức xạ gamma Co-60
và H2O2 nhằm giảm liều xạ. Oligochitosan
thu được sau phản ứng cắt mạch được ứng
dụng làm chất gia tăng kích thước lá đối
với cây dâu tây (Fragaria vesca L), loại
cây được trồng phổ biến ở cao nguyên Lâm

Đồng, cho hiệu quả kinh tế cao. Kết quả
nghiên cứu là cơ sở để chế tạo các chế
phẩm kích thích tăng trưởng thực vật có
nguồn gốc tự nhiên góp phần phát triển nền
nông nghiệp bền vững.
2. Thực nghiệm
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất
Chitosan ban đầu được chế tạo từ vỏ
tôm có Mw khoảng 50 kDa, ĐĐA khoảng
90%. Dâu tây Labiang (Fragaria vesca L.)
được mua ở tại vườn giống dâu tây xã An
Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Hydro
peroxit (H2O2) là sản phẩm tinh khiết của
Merck, Đức. Các hóa chất axit lactic,
etanol, amoniac… được dùng ở dạng tinh
khiết phân tích. Nước cất một lần được sử
dụng cho toàn bộ thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chế tạo oligochitosan
Hòa tan 5 g chitosan trong dung dịch
axit lactic 3%, thêm một lượng H2O2 30%
và định mức đến 100 mL để thu được dung
dịch chiếu xạ chứa 5% chitosan và 1%
H2O2. Tiến hành chiếu xạ đến 11 kGy [5]
trên nguồn SVST Co-60/B tại trung tâm
Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức
xạ VINAGAMMA, Viện Năng lượng
Nguyên tử Việt Nam với suất liều 1,33
kGy/h. Dung dịch sau khi chiếu xạ được
trung hòa bằng NH4OH 5%, thêm một

lượng cồn bằng 6 lần thể tích dung dịch
mẫu, khuấy đều, sau đó lọc kết tủa và rửa
sạch bằng cồn [1]. Mẫu sau khi rửa sạch,
để khô tự nhiên rồi sấy ở nhiệt độ 60°C
trong 2 giờ.
4


ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN

2.2.2. Xác định khối lượng phân tử và
độ đề axetyl của chitosan
Khối lượng phân tử oligochitosan
được xác định bằng phương pháp sắc kí gel
(GPC), trên máy LC-20AB Shimadzu,
Nhật, sử dụng detector RID - 10A và cột
Ultrahydrogel 250 của hãng Water, Mỹ,
nhiệt độ vận hành cột là 40°C, pha động là
đệm axetat CH3COOH 0,25M/CH3COONa
0,25M, tốc độ dòng là 1mL/phút. Chất
chuẩn được sử dụng là polysacarit Pullulan
có khối lượng phân tử (KLPT) khác nhau
từ 738 đến 380 000 Da [1]. Mẫu
oligochitosan được chuẩn bị bằng cách hòa
tan trong axit axetic 0,25M với nồng độ
0,3% đến khi tan hoàn toàn, thêm muối
CH3COONa 0,25M sau đó lọc dung dịch
qua màng 0,45μm (Millipore filters). Mẫu
oligochitosan này được tiêm vào cột sắc kí
với thể tích khoảng 50 μl. Dựa vào thời

gian lưu và so sánh với đường chuẩn xác
định được KLPT của oligochitosan.
Độ đề axetyl (ĐĐA) của oligochitosan
được xác định bằng phương pháp hồng
ngoại trên máy FT – IR 8400S, Shimadzu,
Nhật. ĐĐA được tính dựa theo phương
trình [3]:
ĐĐA, % = 100 – ([31,92 × (A1320/A1420)]
-12,00). Trong đó, A1320 và A1420 lần lượt là
mật độ quang tương ứng tại các đỉnh 1320
và 1420 cm-1.
2.2.3. Khảo sát hiệu ứng gia tăng kích
thước lá của oligochitosan đối với dâu tây
Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm được đánh số
từ 1 đến 4 mỗi lô gồm có 40 cây. Tiến hành
phun oligochitosan có KLPT khoảng 7,5
kDa với các nồng độ 50 ppm, 100 ppm,
150 ppm từ lô 2 đến lô 4. Lô 1 không phun
oligochitosan để làm đối chứng. Thời điểm
bắt đầu phun oligochitosan là sau khi cây
giống được trồng khoảng 1 tuần. Sau đó,
oligochitosan được phun bổ sung vào ngày
thứ 30 và 60 kể từ lần phun đầu tiên. Cây

được chăm sóc theo quy trình thông
thường được canh tác tại địa phương, xã
An Phú, thành phố Pleiku, Gia Lai. Kích
thước lá của dâu tây được theo đo theo thời
gian đến 120 ngày tuổi. Sau 120 ngày tuổi,
mỗi lô thí nghiệm được chia làm 5 nhóm,

mỗi nhóm 8 cây được đo kích thước lặp lại
để phân tích thống kê bằng chương trình
SPSS 16.0 và đánh giá sự khác biệt giữa
các lô nghiên cứu.
3. Kết quả và thảo luận
Mẫu Oligochitosan thu được ở liều xạ
~11 kGy có KLPT Mw ~7,5 kDa. Như vậy,
KLPT của chitosan đã giảm 85% ở liều xạ
khá thấp khi có mặt H2O2 1%. Nguyễn
Quốc Hiến và cộng sự đã cắt mạch
chitosan bằng kỹ thuật chiếu xạ. Kết quả
thu được oligochitosan có KLPT ~ 10 kDa
cần liều xạ lên đến 100 kGy [2]. Điều này
chứng tỏ sự có mặt H2O2 1% trong nghiên
cứu của chúng tôi đã làm giảm đáng kể liều
xạ cần thiết để chế tạo oligochitosan. Hiện
tượng này được giải thích bằng hiệu ứng
đồng vận (synergistic effect) của H2O2 và
tia γ trong quá trình cắt mạch. Theo đó, gốc
tự do hydroxyl (•OH) được hình thành nhờ
quá trình phân ly bức xạ nước và H2O2 đã
đóng vai trò như là tác nhân oxy hóa mạnh
cắt mạch chitosan [12]:
γ ray
H 2O 
 eaq
, H • , • OH, H 2O2 , H 2 , H 3O+

(1)
(2)

Ngoài ra, sản phẩm của quá trình phân
ly bức xạ là e-aq và H• cũng có thể phản ứng
với H2O2 để gia tăng gốc hydroxyl •OH [9]:
e-aq + H 2O2  • OH + OH (3)
(4)
H • + H 2O2  • OH + H 2O
γ ray
H 2O2 
 2 • OH

Gốc •OH đóng vai trò là tác nhân bắt
hydro, làm đứt liên kết C – H hình thành
gốc cacbohydrat R•, dẫn đến quá trình
chuyển vị và cuối cùng liên kết glycoside
bị cắt, tạo thành phân tử chitosan có KLPT
thấp hơn hay oligochitosan [12].
5


CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH…

Hình 1. Phổ FT - IR của chitosan ban đầu (a) và oligochitosan (b)
dao động kéo giãn của C–O–C trong vòng
glucopyranose và các dao động của liên kết
β – 1,4 glycoside [10]. Các đỉnh ở 1320 và
1420 cm-1 tương ứng đặc trưng cho dao
động kéo giãn của liên kết C–N trong nhóm
CH3CONH– (amide III) và dao động biến
dạng của liên kết C–H, đây là hai đỉnh đặc
trưng được sử dụng để tính toán sự thay đổi

ĐĐA của chitosan [3]. Từ phổ FT-IR DĐA
của oligochitosan được xác định dựa vào
phương trình ở mục 2.2.2 cho giá trị 86%,
giảm khoảng 4% so với chitosan ban đầu.
Như vậy, kết hợp đồng thời tia γ với H2O2
ở nồng độ thấp khoảng 1% có thể chế tạo
oligochitosan ở liều xạ khá thấp khoảng 11
kGy. Oligochitosan thu được có ĐĐA giảm
không đáng kể và cấu trúc hầu như không
thay đổi so với chitosan ban đầu.

Phổ FT - IR của oligochitosan và
chitosan ban đầu được thể hiện trên hình 1.
Kết quả cho thấy cấu trúc chính của
oligochitosan thu được (hình 1b) hầu như
không khác biệt so với chitosan ban đầu
(hình 1a). Phổ FT-IR của oligochitosan
xuất hiện hầu hết các đỉnh đặc trưng tiêu
biểu cho các nhóm liên kết có trong
chitosan ban đầu. Đỉnh ở 1655 và 1595 cm1
đặc trưng cho dao động kéo giãn của liên
kết C=O trong nhóm –CONH– (amide I)
và dao động uốn của –NH trong nhóm –
CONH– (amide II). Đỉnh phổ nằm trong
vùng 3200 – 3500 cm-1 đặc trưng cho dao
động kéo giãn của liên kết N–H trong nhóm
amine và liên kết O–H. Các đỉnh ở 1072,
1028, 1153 và 893 cm-1 lần lượt đặc trưng
cho dao động kéo giãn của liên kết C–O,

Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chiều dài lá
6


ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN

Hình 3. Chiều dài của lá dâu tây 120 ngày tuổi ở lô đối chứng (a) và lô 2 (b)
Hình 2 mô tả sự thay đổi kích thước của
lá dâu tây từ 75 đến 120 ngày tuổi. Kết quả
cho thấy ở nồng độ 50 ppm của
oligochitosan (lô 1), kích thước lá dâu tây có
sự phát triển theo thời gian tương đối tốt hơn

so với các lô còn lại. Kết quả quan sát sơ bộ
cũng cho thấy kích thước lá dâu tây sau 120
ngày tuổi ở lô 2 được phun oligochitosan với
nồng độ 50 ppm cũng tương đối lớn hơn so
với lô đối chứng (hình 3).

Bảng 1. Chiều dài trung bình của lá dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi ở các lô khác nhau
Nhóm
(8 cây/nhóm)

Lô đối chứng 1

Lô 2
(50 ppm)

Lô 3
(100 ppm)

Lô 4
(150 ppm)

1
2
3
4
5
Trung bình

7,7
7,4
7,8
7,7
7,6
7,6 ± 0,2 a

8,4
8,3
8,5
7,9
8,0
8,2 ± 0,3 b

7,4
7,5
7,2
7,5
7,3

7,4 ± 0,1 c

7,9
8,0
7,5
7,6
7,8
7,8 ± 0,2 a

Kết quả phân tích ANOVA số liệu
trên bảng 1 cho thấy kích thước lá ở các lô
khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,00).
Trong đó, lô 4 tương ứng với nồng độ 150
ppm của oligochitosan có giá trị không
khác biệt so với lô đối chứng (p = 0,342).

Lô 1 tương ứng với nồng độ 50 ppm cho
giá trị trung bình khác biệt có ý nghĩa so
với lô đối chứng (p = 0,00). Điều này
chứng tỏ nồng độ 50 ppm cho hiệu quả gia
tăng kích thước lá tốt hơn so với các lô
còn lại.
7


CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH…

Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chiều rộng lá dâu tây

Hình 5. Chiều rộng của lá dâu tây 120 ngày tuổi ở lô đối chứng (a) và lô 2 (b)

Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan
đến sự gia tăng chiều rộng kích thước lá
được thể hiện trên hình 4. Kết quả cho
thấy độ rộng kích thước lá của lô 1 lớn
hơn đáng kể so với các lô còn lại. Quan
sát sơ bộ cũng cho thấy lô 2 tương ứng với
nồng độ 50 ppm cho chiều rộng kích
thước lá lớn hơn so với lô đối chứng (hình
5). Trong khi đó, lô 4 tương ứng với nồng

độ 150 ppm cho chiều rộng kích thước lá
thấp hơn so với lô đối chứng. Nguyên
nhân của vấn đề này vẫn chưa rõ cần được
nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, theo nhận
định của chúng tôi có thể do oligochitosan
là kháng sinh thực vật [9] khi được sử
dụng ở liều cao (150 ppm) có thể gây ngộ
độc cho cây dẫn đến ức chế sự phát triển
lá của dâu tây.
8


ĐẶNG XUÂN DỰ - TRẦN THỊ ANH THƯ - LÊ CÔNG NHÂN

Bảng 2. Chiều rộng trung bình của lá dâu tây (cm) sau 120 ngày tuổi ở các lô khác nhau
Nhóm
(8 cây/nhóm)

Lô đối chứng 1

Lô 2
(50 ppm)

Lô 3
(100 ppm)

Lô 4
(150 ppm)

1

7,7

8,4

7,4

7,9

2

7,4

8,3

7,5

8,0

3

7,8

8,5

7,2

7,5

4

7,7

7,9

7,5

7,6

5

7,6

8,0

7,3

7,8

Trung bình

6,2 ± 0,2 a

6,9 ± 0,3 b

6,4 ± 0,3 a

5,9 ± 0,2 a

Kết quả phân tích ANOVA số liệu ở
bảng 2 cho thấy chiều rộng kích thước lá
trên lô khác nhau có ý nghĩa (p = 0,00).
Kiểm định LSD (least significant
difference) cho thấy chiều rộng của lá trên
lô 2 và các lô còn lại khác nhau có ý nghĩa
(p = 0,00). Trong khi đó, chiều rộng của lá
trên lô đối chứng so với lô 3 (p = 0,164) và
lô 4 (p = 0,064) là không khác nhau.
Ngoài ra, chiều rộng của lá trên lô 2 và lô
3 là khác nhau (p = 0,003). Điều này
chứng tỏ nồng độ 50 ppm của
oligochitosan có khả năng gia tăng chiều
rộng kích thước lá hiệu quả hơn so với ở
100 ppm.
Từ kết quả phân tích ảnh hưởng của
nồng độ oligochitosan đến hiệu quả gia
tăng kích thước lá dâu tây chúng tôi nhận
thấy ở nồng độ phù hợp, khoảng 50 ppm,
oligochitosan có khả năng gia tăng kích
thước lá đối với dâu tây. Ở những nồng độ

lớn hơn, hiệu quả gia tăng kích thước lá
giảm. Cơ chế kích thích và ức chế khả năng
gia tăng kích thước lá của oligochitosan lên
dâu tây vẫn cần được nghiên cứu thêm. Tuy
nhiên, việc sử dụng oligochitosan phun
cho dâu tây theo chúng tôi nên tiến hành ở
liều thấp, với nồng độ nhỏ hơn 100 ppm.

4. Kết luận
Oligochitosan có KLPT ~ 7,5 kDa đã
được chế tạo hiệu quả bằng phương pháp
chiếu xạ dung dịch chitosan 5%, H2O2 1%
ở liều xạ khá thấp, khoảng 11 kGy. Cấu
trúc chính của oligochitosan thu được hầu
như không khác biệt so với chitosan ban
đầu. ĐĐA của oligochitosan giảm khoảng
4%. Oligochitosan KLPT khoảng 7,5 kDa
có hiệu ứng gia tăng kích thước lá đối với
dâu tây. Nồng độ phù hợp của
oligochitosan để phun lên cây dâu tây là
khoảng 50 ppm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Xuân Dự, Đinh Quang Khiếu, Diệp
Khanh, Nguyễn Quốc Hiến. “Nghiên cứu
hiệu ứng đồng vận dung Co – 60 và H2O2 cắt
mạch chitosan chế tạo oligochitosan”, Tạp
chí Hóa Học, 51(2C), 627-631 (2003).
2. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân,
Trương Thị Hạnh, Phạm Thị Lệ Hà. “Nghiên
cứu chế tạo oligochitosan bằng kỹ thuật bức

xạ”, Tạp chí Hóa học, 38(2), 22-44 (2000).
3. J. Brugnerotto, J. Lizardi, F. M. Goycoolea,
W. Arguelles – Monal, J. Desbrieres, M.
Rinaudo. “An infrared investigation in
relation
with
chitin
and
chitosan
characterization”, Polymer, 42, 3569-3580
(2001).

9


CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA CO-60 DUNG DỊCH…
“Antimicrobial effect of chitooligosaccharides
produced by bioreactor”, Carbohydrate
Polymers, 44, 71-76 (2001).

4. G. V. Buxton, C. L. Greenstock, W. P.
Helman, A. B. Ross. “Critical review of rate
constants for hydrated electron, hydrogen
atoms and hydroxyl radical (OH/O-) in
aqueous”, Journal of Physical and Chemical
Reference Data, 17(2), 513-886 (1988).

9. S. K. Kim, N. Rajapakse. “Enzymatic
production and biological activities of
chitosan oligosaccharides (COS): A review”,

Carbohydrate Polymers, 62, 357-368 (2005).

5. N. N. Duy, D. V. Phu, N. T. Anh, N. Q.
Hien. “Synergistic degradation to prepare
oligochitosan by  - irradiation of chitosan
solution in the presence of hydrogen
peroxide”, Radiation Physical Chemistry, 80,
848-853 (2011).

10. J. Kumirstra, M. Czerwicka, Z. Kaczynski,
A. Bychowska, K. Brozowski, J. Thoming, P.
Stepnowski. “Application of spectroscopic
methods for structural analysis of chitin and
chitosan”, Marine Drugs, 8, 1567-1636
(2010).

6. S. Hirano, N. Nagao. “Effects of chitosan,
pectic acid, lysozyme and chitinase on the
growth
of
several
phytopathogens”.
Agricultural and Biological Chemistry, 53,
3065-3066 (1989).

11. J. Shao, Y. Yang, Q. Zhong. “Study on
preparation of oligoglucosamine by oxidative
degradation under microwave”, Polymer
Degradation and Stability, 82, 395-398
(2003).

7. Y. J Jeon, S. K. Kim. “Effect of antimicrobial
activity by chitosan oligosaccharides Nconjugated with asparagines”, Journal of
Microbiology and Biotechnology, 11, 281286 (2001).

12. P. Ulanski, C. von Sontag. “OH – radical
induced chain scission of chitosan in the
absence and present of dioxygen”, Journal of
the Chemical Society, Perkin Transactions, 2,
2022-2028 (2000).

8. Y. J. Jeon, P. J. Park, S. K. Kim.

Ngày nhận bài: 09/7/2017

Biên tập xong: 15/8/2017

10

Duyệt đăng: 20/8/2017