NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ HÌNH THÁI TRÊN CÂY ĐỊA LAN TÍM HỘT (CYMBIDIUM LA BELL “ANNA BELLE”) IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA 60CO
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.39 MB, 106 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN HUỲNH PHƯƠNG UYÊN
NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG BIẾN DỊ HÌNH THÁI TRÊN CÂY
ĐỊA LAN TÍM HỘT (CYMBIDIUM LA BELL “ANNA BELLE”)
IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA 60CO
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số chuyên ngành: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUANG LUÂN
Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2011
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng
Hình 1.2. Sự phát triển của chọn giống đột biến qua các giai đoạn
Hình 1.3. Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2011
Hình 1.4. Tỷ lệ các loại cây đột biến trên thế giới vào năm 2009
Hình 1.5. Một số lồi hoa đột biến trên thế giới
Hình 1.6. Mơ hình gây tạo đột biến tại Malaysia và Nhật Bản
Hình 1.7. Giống hoa cúc đột biến bằng cơng nghệ bức xạ tại Việt Nam
Hình 1.8. Quy trình chọn giống Chimera bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp ni
cấy in vitro
Hình 1.9. Hình ảnh mơ tả cây Địa lan
Hình 1.10. Một số giống Địa lan đang thương phẩm tại Việt Nam
Hình 1.11. Sơ đồ ngun lý kỹ thuật RAPD
Hình 2.1. Cây Địa lan Tím hột dùng trong nghiên cứu
Hình 2.2. Sơ đồ xử lý mẫu Địa lan
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên Địa lan
Hình 2.4. Sơ đồ gây tạo biến dị in vitro cây Địa lan
Hình 3.1. Mẫu Địa lan tái sinh từ chồi đỉnh và cành phát hoa
Hình 3.2. Sự hình thành callus của Địa lan
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên hệ số nhân PLB
Hình 3.4. Sự hình thành protocorm cây Địa lan
viii
Hình 3.5. Ảnh hưởng của chất sự phối hợp BA (2mg/l) với NAA và TDZ lên hệ số
nhân PLB trên mơi trường MS
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi của cây Địa lan
Hình 3.7. Cụm chồi Địa lan được hình thành trên mơi trường MS sau 4 tuần
Hình 3.8. Khả năng tái sinh cây hồn chỉnh của Địa lan trên các mơi trường
Hình 3.9. Cây tái sinh Địa lan hồn chỉnh
Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh in vitro cây Địa lan Tím hột
Hình 3.11. Ảnh hưởng của bức xạ Gamma Co-60 lên các mẫu Địa lan in vitro
Hình 3.12. Mẫu PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều cao
Hình 3.13. Các chồi đỉnh của PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều thấp
Hình 3.14. Sự hình thành phơi của từ mẫu PLB địa lan sau khi chiếu xạ
Hình 3.15. Các dạng biến dị chlorophyll của cây Địa lan
Hình 3.16. Các dạng biến dị lá dài của cây Địa lan
Hình 3.17. Các dạng biến dị lá ngắn của cây Địa lan
Hình 3.18. Các dạng biến dị nhiều lá của cây Địa lan
Hình 3.19. Các dạng biến dị bẹ lá màu tím của cây Địa lan
Hình 3.20. Cây con chiếu xạ đang theo dõi ở nhà lưới
Hình 3.21. Hình ảnh DNA Địa lan trên gel
Hình 3.22. Kết quả RAPD-PCR với primer OPD-07
Hình 3.23. Mối quan hệ di truyền của các dòng nghiên cứu
ix
Danh mục các cơng trình của Tác giả
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
Cơng trình liên quan đến đề tài:
Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, Lê Quang Luân (2011)
Nghiên cứu tạo dịng biến dị hình thái in vitro ở cây địa lan Tím hột (Cymbidium La
Bell “Anna Belle”) bằng phương pháp chiếu xạ γ-co-60, Tuyển tập Hội nghị
KH&CN Hạt nhân Lần thứ IX.
Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn
Thị Thúy Loan, Lê Quang Luân (2009), Nghiên cứu hiệu ứng kích thích tăng
trưởng của β-oligochitosan chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ trên Địa lan (Cymbidium
Labell “Anna Belle”) in vitro, Kỷ yếu Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ VIII,
Nha Trang.
Lê Quang Luân, Võ Thị Thu Hà, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Duẩn,
Nguyễn Thị Thúy Loan (2009), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Hài đặc hữu
Việt Nam (Paphiopedilum delenatii), Kỷ yếu Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ
VIII, Nha Trang.
Lê Quang Luân, Nguyễn Huỳnh Phương Uyên, Võ Thị Thu Hà, (2011)
Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro cây lan Hài (Phiopedilum) bằng bức xạ ion
hóa, Tuyển tập Hội nghị KH&CN Hạt nhân Lần thứ IX.
79
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số giống đột biến của một số nước trên thế giới năm 2011
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro Địa lan gần đây trên thế giới
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa lan tại Việt Nam
Bảng 2.1. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tạo callus
Bảng 2.2. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB với nồng độ chất
ĐHST khác nhau
Bảng 2.3. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB dưới sự phối hợp
của các chất ĐHST
Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân chồi
Bảng 2.5. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
Bảng 2.6. Ký hiệu mẫu thực hiện phản ứng RAPD-PCR
Bảng 3.1. Tình trạng mẫu chồi đỉnh Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần
Bảng 3.2. Tình trạng mẫu phát hoa cây Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần
Bảng 3.3. Khả năng tạo callus từ PLB của cây Địa lan
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất ĐHST đến hệ số nhân PLB
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi
Bảng 3.7. Khả năng tái sinh cây hồn chỉnh của Địa lan trên 4 loại mơi trường
Bảng 3.8. Các dạng biến dị in vitro của cây Tím hột sau khi chiếu xạ gamma
Bảng 3.9. Các dịng biến dị qua thời gian theo dõi và nhân dòng đến M1V2
vi
Bảng 3.10. Khả năng biến dị in vitro của chồi cây lan sau khi chiếu xạ gamma
Bảng 3.11. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA Địa lan
Bảng 3.12. Các đoạn mồi thể hiện tính đa hình phản ứng RAPD-PCR
Bảng 3.13. Tổng số phân đoạn DNA của phản ứng RAPD
Bảng 3.14. Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Địa lan biến dị
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4D
2,4-dichlorophenoxyacetic acid
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
BA
Benzynladenine
DNA
Deoxyribonucleic acid
ĐHST
Điều hòa sinh trưởng
IAEA
International Atomic Engnergy Agency
KC
Knudson C
LD50
Lethal Dose 50%
LS
Linsmaier and Skoog
MS
Murashige and Skoog
NAA
α-naphthaleneacetic acid
OD
Optical Density
PCR
Polymerse Chain Reaction
PLB
Protocorm like body
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNAs
RFLP
Retriction Fragment Length Polymorphisms
TBE
Tris-Boric acid-EDTA
TDZ
Thidiazuron
UV
Ultraviolet
VW
Vacine and Went
v
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Mục lục........................................................................................................................ i
Danh mục các chữ viết tắt ..........................................................................................v
Danh mục các bảng ................................................................................................... vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị ................................................................................. viii
Mở đầu ........................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Phương pháp tạo giống cây trồng mới bằng phóng xạ .............................. 3
1.1.1. Các khái niệm chung .................................................................................. 3
1.2.2. Lịch sử chọn giống đột biến ....................................................................... 4
1.1.3. Đột biến và các tác nhân gây đột biến ........................................................ 5
1.1.3.1. Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý ............................... 5
1.1.3.2. Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến ............................ 6
1.1.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ ........................................................ 8
1.1.3.4. Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống .................................... 9
1.1.4. Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới ............ 11
1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới ...................................... 11
1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu đột biến tại Việt Nam..................................... 15
1.1.5. Chọn giống bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro.......... 17
1.2. Tổng quan về cây địa lan (Cymbidium) ...................................................... 19
1.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố ......................................................................... 19
1.2.2. Đặc điểm phân loại học. ........................................................................... 20
i
1.2.3. Đặc điểm hình thái của Địa lan ................................................................ 20
1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Địa lan ............................................................ 22
1.2.5. Giá trị của Địa lan và tình hình sản xuất tại Việt Nam ............................ 25
1.3. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 26
1.3.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô thực vật ........... 26
1.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................. 27
1.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật..................................... 29
1.3.3.1. Ý nghĩa sinh học cơ bản .................................................................... 29
1.3.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 30
1.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc dòng biến dị ...................................... 30
1.4.1. Vai trò của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ............................ 30
1.4.2. Ứng dụng chỉ thị RAPD trong chọn giống ............................................... 31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................35
2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 35
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................... 35
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị.................................................................................... 35
2.1.3. Hóa chất .................................................................................................... 37
2.1.4. Các điều kiện thí nghiệm .......................................................................... 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 38
2.2.1. Nội dung 1. Hoàn thiện quy trình ni cấy in vitro cây Địa lan Tím
hột ............................................................................................................ 39
2.2.1.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống
nghiệm ............................................................................................... 39
ii
2.2.1.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB ............ 40
2.2.1.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB.......................... 41
2.2.1.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan ........... 42
2.2.1.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ
chồi in vitro của cây Địa lan ............................................................. 43
2.2.2. Nội dung 2. Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan...... 43
2.2.2.1. Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh
trưởng và phát triển của mẫu Địa lan ................................................ 43
2.2.2.2. Thí nghiệm 2. Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị ................. 45
2.2.3. Nội dung 3. Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị
bằng kỹ thuật RAPD ................................................................................ 46
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................49
3.1. Hồn thiện quy trình ni cấy in vitro cây Địa lan ................................... 49
3.1.1. Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm....................................... 49
3.1.2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB ........................................... 51
3.1.3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB......................................................... 52
3.1.4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan .......................................... 56
3.1.5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh............................................... 59
3.2. Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan in vitro............................ 62
3.2.1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma 60Co lên sự sinh trưởng và phát triển
của mẫu Địa lan ....................................................................................... 62
3.2.2. Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị ................................................ 65
iii
3.3. Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị bằng
kỹ thuật RAPD .......................................................................................... 71
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA............................................................................ 71
3.3.2. Kết quả phân tích RAPD-PCR ................................................................. 73
3.3.3. Tương quan di truyền của các mẫu Địa lan dựa trên phân tích RAPD .... 75
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................77
4.1. Kết luận......................................................................................................... 77
4.2. Đề nghị .......................................................................................................... 78
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .........................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80
PHỤ LỤC
iv
LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến Tiến sĩ Lê Quang Luân. Thầy là người đã truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm quý báu, những bài học thật bổ ích trong học tập, cơng việc và
nghiên cứu khoa học, là người đã định hướng, giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho
tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin cảm ơn quý Thầy, Cô đang công tác tại trường Đại học Khoa
học Tự nhiên và Thầy, Cô từ các Trường Đại học khác đã giảng dạy tại
trường và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian
qua.
Xin cảm ơn các anh chị, các bạn đang công tác tại Phòng Sinh học
Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tơi hồn
thành luận văn của mình.
Cảm ơn các bạn lớp Di truyền k19, những người đã cùng học tập và
sẵn sàng giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ và các em đã khuyến khích và hỗ trợ tơi có
được ngày hơm nay.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
Nguyễn Huỳnh Phương Uyên
Mở đầu
MỞ ĐẦU
Chọn giống thực vật bằng cách gây đột biến nhân tạo là một phương pháp đã
được chứng minh là có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng quý của
cây trồng. Kỹ thuật này hiện nay là một trong những phương pháp tạo và chọn
giống có nhiều ưu điểm và đã được sử dụng rộng rãi trên khoảng 60 quốc gia từ
khắp các Châu lục. Theo nguồn dữ liệu thống kê các giống đột biến của IAEA
(mutation variaties database) đến năm 2011 toàn thế giới đã tạo ra 3112 giống đột
biến trên nhiều đối tượng cây trồng từ 170 loài thực vật mà chủ yếu là các loại Ngũ
cốc [16], [23], [40], [42], Khoai [48], Mè [11], Cam [24] v.v. trong đó các giống tạo
ra bởi phóng xạ gamma chiếm khoảng 60% [36], [53].
Bên cạnh đó, phương pháp tạo giống bằng tác nhân phóng xạ cũng đã tạo ra
nhiều giống hoa đa dạng từ các giống mẹ ban đầu bao gồm: Cúc [39], [53], Cát
tường [4], Anh thảo [50], Hồng môn [46], Phong lan [21], v.v. với nhiều màu sắc đa
dạng. Riêng giống Địa lan hiện nay chỉ có 2 giống đột biến được cơng bố trong đó
có một giống do các nhà tạo giống Nhật Bản và Hàn Quốc tạo ra bằng phương pháp
chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro [53].
Mặc dù bắt đầu chậm hơn so với một số nước trên thế giới, tuy nhiên Việt
Nam là nước đứng thứ 8 trên thế giới và thứ 3 trong khu vực Châu Á Thái Bình
Dương về số lượng giống đột biến năm 2011 với 55 giống được cơng bố chính thức
và được IAEA cơng nhận [53]. Chính vì vậy, hiện nay hướng nghiên cứu này đang
được Bộ Khoa học Công nghệ tăng cường đầu tư với quy mô lớn và hiện đại. Nhằm
mục tiêu tăng cường nghiên cứu giống đột biến nói riêng và ứng dụng Cơng nghệ
Bức xạ trong Nơng nghiệp nói chung Thủ tướng Chính phủ đã ký quyết định “Quy
hoạch chi tiết phát triển ứng dụng bức xạ trong nông nghiệp đến năm 2020” trong
đó có mục tiêu sẽ tạo ra và đưa vào sản xuất 3-4 giống đột biến cây trồng mới hàng
năm.
1
Mở đầu
Mặc khác, Cymbidium đã từ lâu được tôn vinh là “Nữ hồng của các lồi hoa”.
Đây khơng những là lồi hoa đẹp mà cịn có giá trị về khoa học và mỹ thuật. Hiện
nay, Địa lan đang rất được ưu chuộng trong nước cũng như trên Thế giới. Ở nước
ta, loài cây này chủ yếu được trồng ở Đà Lạt và được xuất khẩu với số lượng lớn
sang thị trường các nước khác như Mỹ, Nhật, Singapore, v.v. và đã mang lại nguồn
thu nhập tương đối lớn cho người trồng hoa.
Mặc dù vậy, hiện nay tình hình xuất khẩu loại hoa này đang gặp khó khăn vì
rào cản về bản quyền giống cây trồng mà nguyên nhân chính là hầu hết các giống
Địa lan thương phẩm đang được trồng trong nước chủ yếu là các giống nhập nội.
Chính vì vậy, việc tạo ra các giống hoa Địa lan mang thương hiệu “Việt” là yêu cầu
cấp bách đối với các nhà chọn giống trong giai đoạn hiện nay.
Từ yêu cầu đặt ra là cần phải tạo ra những giống Địa Lan để cung cấp cho thị
trường trong nước cũng như đáp ứng mục tiêu xuất khẩu. Đề tài “Nghiên cứu tạo
dịng biến dị hình thái trên cây địa lan Tím hột (Cymbidium La Bell “Anna
Belle”) in vitro bằng phương pháp chiếu xạ gamma 60Co” được tiến hành. Mục
đích của nghiên cứu này là là gây tạo và chọn lọc các dịng Địa Lan Tím hột biến dị
hình thái in vitro để làm nguyên liệu cho quá trình chọn tạo các giống Địa lan đột
biến mới có tính ưu việt mang thương hiệu “Việt” bằng phương pháp chiếu xạ
gamma 60Co.
2
Tổng quan tài liệu
Chương 1-TỔNG QUAN
1.1. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG MỚI BẰNG PHĨNG XẠ
1.1.1. Các khái niệm chung
Phóng xạ: Phóng xạ là hiện tượng một hạt nhân tự động phóng ra những bức
xạ gọi là tia phóng xạ và biến thành hạt nhân khác. Quá trình này phát ra năng
lượng. Hiện tượng phóng xạ do các nguyên nhân bên trong hạt nhân gây ra và hồn
tồn khơng phụ thuộc vào các tác động bên ngoài (áp suất, nhiệt độ, v.v.).
Công nghệ bức xạ: Công nghệ bức xạ là công nghệ sử dụng bức xạ làm
nguồn năng lượng. Công nghệ bức xạ hiện tại chủ yếu là sử dụng nguồn bức xạ là
60
Co, dòng điện tử gia tốc (electron beam- EB) và ion beam.
Liều hấp thụ: Nếu cùng một liều chiếu của cùng một bức xạ ion hóa thì các
môi trường khác nhau hấp thụ những lượng năng lượng khác nhau. Liều hấp thụ
nhằm mục đích nói lên năng lượng hấp thụ bởi môi trường vật chất bị chiếu bức xạ
ion hóa.
Đơn vị của liều hấp thụ là rad (radiation absorption dose) là liều bức xạ của
bất kỳ loại bức xạ nào tạo ra trong môi trường vật chất mà nó truyền qua với mức
hấp thụ năng lượng 100erg/g.
Đơn vị SI của liều hấp thụ là Gy (Gray) là liều bức xạ của bất kỳ loại bức xạ
nào tạo ra trong mơi trường vật chất mà nó truyền qua với mức hấp thụ năng lượng
là 1J/kg.
Có thể quy đổi như sau: 1rad = 10-2 J/kg = 10-2 Gy, 1Gy = 100rad
Từ liều hấp thụ người ta đưa ra khái niệm suất liều hấp thụ hay còn gọi là suất
liều. Suất liều là liều hấp thụ trên một đơn vị thời gian, ký hiệu là r/s hoặc Gy/s.
3
Tổng quan tài liệu
1.2.2. Lịch sử chọn giống đột biến
Chọn giống cây trồng hay thực vật nói chung (plant breeding) là một lĩnh vực
quan trọng của sản xuất nông nghiệp; mục đích của nó là tạo ra ngày càng nhiều
giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu được các điều kiện
bất thuận (như sâu bệnh, hạn, úng, nóng, rét, v.v). Về thực chất, đó là sự tiến hoá
của thực vật do con người điều khiển, được hình thành từ trong thực tiễn trồng trọt
qua hàng ngàn năm kể từ khi con người bắt đầu mò mẫm "thuần hoá" cây trồng dựa
theo kinh nghiệm.
Cùng với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, đặc biệt là sự phát triển của
di truyền học trong suốt một thế kỷ qua, công tác chọn tạo giống cây trồng đã xây
dựng được một nền tảng khoa học vững chắc và khơng ngừng được hồn thiện. Nhờ
đó đã tạo ra hàng loạt các giống cây trồng mới, nhất là các giống ngũ cốc, góp phần
xố đói giảm nghèo mang lại cuộc sống ấm no và cải thiện sức khoẻ cho con người.
Vào năm 1895-1896, Becquerel đã phát hiện ra hiện tượng phóng xạ làm cơ sở
cho các nghiên cứu nhằm ứng dụng phóng xạ trong lĩnh vực sinh học và nơng
nghiệp. Cùng năm đó, Hugo De Vries đã đề xuất việc sử dụng phóng xạ nhằm mục
đích gây đột biến.
Năm 1901, Hugo De Vries cơng bố cơng trình nghiên cứu đột biến trên cây
Oenothera lamarckiana và đưa ra "thuyết đột biến". Đến năm 1904, cũng chính tác
giả này lại đề nghị sử dụng tia X để tạo ra các đột biến.
Năm 1927, Herman Muller đưa ra được bằng chứng xác thực đầu tiên về chiếu
xạ ion hoá gây ra các đột biến ở ruồi giấm Drosophila. Cũng trong thời gian đó
Natxon và Philipop phát hiện ra tia X có khả năng gây ra biến dị di truyền ở vi nấm.
Năm 1928, Lewis Stadler tiến hành gây đột biến ở lúa đại mạch và ngô bằng
tia X và tia gamma đồng thời đã chỉ rõ tần số đột biến cảm ứng phụ thuộc vào liều
xạ tổng số của tác nhân gây đột biến.
Từ năm 1938-1948, hàng loạt các cơng trình phát hiện ra các chất đột biến
4
Tổng quan tài liệu
của Sakharov (1938-1939), Rapoport (1940-1948), Gustafson (1940-1948), v.v.
được cơng bố. Đó là những chất hóa học như Ethylenimine (EI), Diethylsulfate
(DES), dimethylsulfate (DMS), Nitrosomethylurea (NMU), Nitrosoethylurea
(NEU), v.v. trên các động vật, vi sinh vật và thực vật.
Từ năm 1953-1965: Kể từ khi James Watson và Francis Crick khám phá ra
mơ hình cấu trúc phân tử DNA, các nhà di truyền học và hoá sinh tập trung chủ yếu
vào nghiên cứu thành phần, cấu trúc hoá học của nucleic acid, cơ chế phân tử của
quá trình phát sinh đột biến. Các tác giả đều đi đến kết luận rằng các quá trình biến
đổi trên phân tử DNA đều liên quan đến quá trình sao chép, tự phục hồi và xuất
hiện các đột biến.
Từ năm 1965 đến nay: Hàng loạt cơng trình nghiên cứu về đột biến ở động
vật, thực vật và vi sinh vật với các tác nhân vật lý và hoá học khác nhau như tia X,
tia gamma, chùm neutron, tia laser, v.v. cùng các hợp chất alkyl hố, các hợp chất
nitroso, v.v. đã được cơng bố.
1.1.3. Đột biến và các tác nhân gây đột biến
1.1.3.1. Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý
Hiện nay, nguồn gene của các giống cây trồng trong nông nghiệp đang nghèo
nàn, không đáp ứng đủ nhu cầu và đang bị thái hóa dần. Nguồn gene này khơng thể
thỏa mãn một cách đầy đủ trước nền nông nghiệp hiện tại và tương lai, trước nguy
cơ biến đổi khí hậu, nền kinh tế, xã hội và nhu cầu công nghiệp. Yêu cầu của các
nước đang phát triển về nguồn giống cây mới và năng suất cao đang trở nên cấp
bách.
Trước yêu cầu trên, giống cây trồng cần phải thay đổi một hoặc một vài đặc
điểm của nguồn gene bằng phương pháp gây tạo đột biến nhằm mục đích cải tiến,
tạo ra nguồn gene mới phù hợp với các vấn đề của xã hội hiện đại. Thực ra, 30 năm
sau khi Gregor Mendel chứng minh rằng các nhân tố có tính di truyền được gọi là
gene đã truyền lại một cách nguyên vẹn từ thế hệ này sang thế hệ khác thì phóng xạ
5
Tổng quan tài liệu
ion hóa đã được khám phá. 30 năm sau đó, phóng xạ ion hóa được minh chứng rằng
có thể gây ra đột biến, thay đổi các gene mà trước đó được tin rằng ổn định, khơng
bị biến đổi. Từ đó, cơng nghệ tạo giống đột biến phát triển mạnh mẽ và mở ra
những lĩnh vực mới trong nghiên cứu di truyền dựa trên nền tảng của di truyền phân
tử hiện đại. Các tia X, tia gamma, chùm neutron và các phóng xạ ion hóa khác đã
được sử dụng như là một tác nhân vật lý bổ sung thêm vào cơng nghệ tạo giống đột
biến mà trước đó thường sử dụng tác nhân hóa học.
Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến tự sinh từ 1×10-8 đến 1×10-5 trong khi đó, phóng
xạ có thể làm thay đổi tính di truyền của sinh vật và gia tăng tần số đột biến lên từ
1×10-5 đến 1×10-2. Mặt khác, các biến dị thu được không phải là GMO (sinh vật
chuyển gen) bởi vì phương pháp này khơng đưa yếu tố lạ vào bộ gene của sinh vật
chủ mà chỉ làm biến đổi những đặc tính sẵn có trong gene.
Ưu điểm chính của phương pháp này là các kiểu di truyền cơ bản của giống
được giữ lại trong khi những đặc tính cải tiến được thêm. Giống cải tiến được tạo ra
trong một thời gian ngắn nếu so với phương pháp chọn giống truyền thống nhưng
lại cho kết quả tương đương. Với phương pháp chọn giống bằng phóng xạ, những
chủng loại cây từ nguồn nguyên liệu ban đầu được tạo ra vô cùng phong phú với
các đặc tính như: Năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh,
có khả năng đề kháng với những yếu tố bất lợi của mơi trường. Đặc biệt trong tình
hình biến đổi khí hậu như hiện nay, yêu cầu tạo ra các giống cây chịu phèn, chịu
mặn và chịu hạn đang cấp thiết.
1.1.3.2. Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến
Tác nhân đột biến là nguồn gốc căn bản cho tất cả các biến đổi trong cơ thể
sinh vật. Các biến đổi này chính là nguyên nhân gây ra hiện tượng đột biến khơng
chỉ cần thiết trong q trình tiến hóa mà cịn là phương pháp được sử dụng nhằm
mục tiêu gây tạo đột biến trong chọn giống thực vật tạo ra các dạng biến dị mới bổ
sung thêm vào nguồn giống cây trồng.
6
Tổng quan tài liệu
Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố sinh học, hoá học và vật lý.
Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần.
Các loại tác nhân thường dùng bao gồm:
− Tác nhân hóa học là các hóa chất: DES, EMS, iPMS, EI, NEU, MNU,
NaM3, 1,4-Biadiazo-acetyl Butane, v.v.
− Tác nhân vật lý bao gồm: Tia X (từ đèn UV), phóng xạ điện từ (tia X từ
máy X-quang, tia gamma từ nguồn
60
Co và
137
Cs, phóng xạ hạt (chùm
neutron nóng hoặc chậm từ lị phản ứng, chùm neutron nhanh từ lị phản
ứng, các hạt beta phóng ra từ 32P và 35S), ion beam và electron beam [tr. 5,
29]. Các tác nhân vật lý tạo ra số lượng giống đột biến khoảng 87% trong
tổng số giống đột biến.
Hình 1.1. Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng
Theo thống kê của IAEA (International Atomic Energy Agency) năm 2005,
nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác nhân đột biến khác
nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7% (xem Hình 1.1). Trong
đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo giống đột
7
Tổng quan tài liệu
biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng ni cấy in vitro
đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5%. Tác nhân hóa học mặc dù được sử
dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia ion mới được
sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỷ lệ 5,8%.
1.1.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ
Các phóng xạ gây ra q trình ion hóa tạo ra những biến đổi về mặt hóa học,
phá hủy cấu trúc nguyên vẹn của nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, tạo ra các biến
đổi về mặt di truyền, là nguyên nhân gây đột biến.
Sự tương tác của các tia phóng xạ lên hệ thống gây nên sự biến đổi cấu trúc
DNA làm cơ thể bị đột biến. Có hai giả thuyết chính để giải thích hiện tượng này là
thuyết Bia và thuyết gốc tự do.
Thuyết Bia: Sự xuất hiện các sai lệnh ở DNA xảy ra một các tức thời với xác
xuất phụ thuộc vào cơ hội bắn trúng “bia” của tia phóng xạ. Dựa vào thuyết này,
người ta giải thích được mối liên quan giữa liều chiếu xạ và tần số xuất hiện đột
biến. Thuyết này cũng là nền tảng xây dựng các nguyên tắc của di truyền phóng xạ.
Tuy nhiên, các nghiên cứu sau này đã chứng minh thuyết “bia” chưa đầy đủ do nó
chưa giải thích được các yếu tố của điều kiện mơi trường và điều kiện sinh lý của cơ
thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả của quá trình xử lý phóng xạ.
Thuyết gốc tự do: Thuyết này cho rằng tác động gây đột biến trên tế bào sống
của tia phóng xạ là tác động gián tiếp. Thoạt đầu, tia phóng xạ ion hóa nước, vốn là
thành phần vật chất chủ yếu trong mọi tế bào sống. Nước bị ion hóa tạo thành các
gốc tự do, các gốc tự do có thể tương tác với nhau tạo thành chất chất oxy hóa mạnh
đồng thời tương tác với các phân tử sinh học trong tế bào. Các tương tác này nếu đủ
mạnh và số lượng đủ nhiều thì sẽ gây ra các biến đổi trong thành phần và số lượng
của các nucleotide của phân tử DNA. Tùy theo nguồn năng lượng dự trữ của gốc tự
do mà có thể gây ra các biến đổi lớn trong cấu trúc của phân tử DNA hoặc các đột
biến nhỏ trong thành phần nucleotide của gene (còn gọi là đột biến điểm). Như vậy,
8
