Nghiên cứu một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV type 1

IH
TR

QU

GI H N I

Ọ

Ọ T

------------------------------

Nguyễn Văn Dũng

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT
NGUỒN GỐC TH C VẬT ỨC CHẾ PROTEASE
CỦA HIV TYPE 1

LUẬN ÁN TIẾ SĨ S

Hà Nội, 2019

ỌC


IH
TR

QU

GI H N I

Ọ

Ọ T

------------------------------

Nguyễn Văn Dũng

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT
NGUỒN GỐC TH C VẬT ỨC CHẾ PROTEASE
CỦA HIV TYPE 1
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116

LUẬN ÁN TIẾ SĨ S

ỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C:

1. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. PGS.TS. Bùi Phương Thuận

Hà Nội, 2019


T i xin a

an

y

ng

nh nghi n ứu

i

hực hiện dưới

sự hướng dẫn của GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa v PGS.TS. Bùi Phương Thuận.
iệu
ng ấ

uả n u
ng

ng uận n

nh n

ung hự v

hưa

ng ư

ai

h .
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Văn Dũng

i

ng


L
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS. Bùi Phương Thuận, những thầy, cô đã tận tình dìu dắt,
hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá
trình làm luận án nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể các thầy, cô trong Bộ môn Hóa sinh
và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban
Giám hiệu - Trường Đại học Tây Bắc, các anh chị bạn bè đồng nghiệp trong Khoa
Sinh Hóa - Trường Đại học Tây Bắc, TS. Nguyễn Thị Hồng Loan và các thành viên
trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp thuộc Ph ng thí nghiệm trọng
điểm ông nghệ n ym v Protein, Trường Đại học hoa học Tự nhiên.
Tôi in gửi ời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Ph ng Sau Đại học, Ban lãnh
đạo Khoa Sinh học v c c Ph ng chức năng của Trường Đại học

hoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều iện cho tôi học tập, ho n th nh c c

thủ t c cần thiết của một nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS. Phương Thiện Thương, ThS. Vũ
Văn Tuấn và các cán bộ nghiên cứu viên - Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện
Dược liệu Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp v chia s thông tin trong
quá trình tinh sạch và phân tích cấu trúc các chất. Tôi xin chân thành cảm ơn đến
PGS.TS. Mạc Đình Hùng - Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã
giúp kiểm tra kết quả đo v giải phổ các chất.
Luận n đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương
trình Độc lập cấp Nh nước mã số ĐTPTNTĐ.2012-G/02 và kinh phí hỗ trợ Nghiên
cứu sinh theo Dự án 911.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới bố, m , vợ, con, gia đình, những
người đã uôn bên tôi, cổ vũ, động viên v tạo điều iện thuận ợi nhất cho tôi có
thời gian học tập, nghiên cứu v ho n th nh uận n.
NCS. Nguyễn Văn Dũng

ii


MỤC LỤC
............................................................................................. i
L

.................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................4
D

Ụ

.........................................................................................6

D

Ụ

.........................................................................................7

MỞ ẦU ...........................................................................................................9
1. Tính cấp thi t của ề tài..............................................................................9
2. Mục tiêu nghiên cứu của ề tài................................................................ 10
3.

i ư ng và nội dung nghiên cứu của ề tài.......................................... 11

4. ịa iểm thực hiện ề tài ......................................................................... 11
5. óng góp

ới của ề tài.......................................................................... 12

6. Ứng dụng thực tiễn của ề tài .................................................................. 12
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 13
1.1. Giới thiệu chung về virus gây suy giảm miễn dịch của người type 1
(HIV-1) và protease của HIV- 1 ............................................................... 13
1.1.1. HIV-1 v hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

người

IDS . 13

1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 ...................................... 17

1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1 .............................................. 27
1.2. Các chất ức chế protease HIV-1 và ứng dụng trong điều trị AIDS ...... 31
1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học.......................... 31
1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên ......................... 32
1.2.3. Chất ức chế protease HIV-1 tổng hợp ............................................... 38
1.2.4.

ng d ng của c c chất ức chế protease HIV-1 trong điều trị IDS

của c c chất ức chế protease HIV IDS ..................................................... 40
1


2. NGUYÊN LIỆU VÀ P

P ÁP

ỨU .... 43

2.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 43
2.1.1. Mẫu thực vật ...................................................................................... 43
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ......................................................... 43
2.2. Máy móc và trang thiết bị .................................................................. 43
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 44
2.3.1. Phân t ch c c hợp chất từ dịch chiết thực vật .................................. 44
2.3.2. X c định cấu trúc của chất được phân t ch ...................................... 45
2.3.3. X c định hoạt tính ức chế pepsin bằng phương ph p huếch tán
trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin ................................................ 45
2.3.4. X c định hoạt tính protease HIV-1 sử d ng cơ chất peptide đặc hiệu ....... 47
2.3.5. X c định hoạt độ của protease HIV-1 bằng cơ chất hu nh quang ... 48

2.3.6. X c định c c hằng số động học

m,

Vmax v của protease HIV-1

khi có và không có chất ức chế .................................................................... 50
2.3.7. Thử độc tính tế bào của các chất ức chế protease HIV-1 trên d ng
tế bào HEK nuôi cấy .................................................................................... 50
3. KẾT QU VÀ TH O LUẬN ............................................... 52
3.1. Sàng lọc các cây thuốc có tác dụng ức chế enzyme tương tự
protease của HIV - 1 .................................................................................. 52
3.1.1. Thiết lập phương ph p thử tác d ng ức chế en yme tương tự protease
HIV-1 ........................................................................................................... 52
3.1.2. Thu nhận dịch chiết thực vật ............................................................. 53
3.1.3. Sàng lọc các dịch chiết thực vật có tác d ng ức pepsin .................... 54
3.2. Tinh sạch chất ức chế protease HIV-1 từ thực vật được sàng lọc . 58
3.2.1. T ch phân đoạn và tinh sạch chất ức chế protease HIV-1
từ lá Gối hạc ................................................................................................ 58
3.2.2. T ch phân đoạn và tinh sạch hợp chất ức chế protease HIV-1
từ Lá cây Hồng ............................................................................................ 65
2


3.2.3. T ch phân đoạn và tinh sạch các chất ức chế protease HIV-1
từ cây Rau gai thối....................................................................................... 72
3.3. Nghiên cứu một số tính chất của các chất ức chế protease HIV-1 ...... 90
3.3.1. X c định gi trị IC50 của các chất ức chế protease HIV-1.............. 90
3.3.2. X c định iểu ức chế protease HIV-1 của 7 chất tinh sạch ............. 91
3.3.3. X c định độc t nh tế b o của c c chất ức chế protease HIV-1 ......... 93

KẾT LUẬN .................................................................................................... 97
KIẾN NGHỊ................................................................................................... 98
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GI LIÊN QUAN
ẾN LUẬN ÁN ............................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KH O .......................................................................... 100

3


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Hội hứng uy giả

iễn dị h

ắ phải

(Acquired immunodefiency syndrome)
ART

Liệu ph p dùng hu

CBB

Coomassie brilliant blue

DABCYL

4 - [4 '- (dimetylamino) phenyl] azo acid-benzoic

DEPT

Detortionless enhancement by polarization transfer

DMSO

Dimethyl sulfoxide

EDANS

5 - [(2'aminoethyl) -amino] acid naphtalenesulfonic

FDA

ụ

h ng e

uản ý thự phẩ

v dư

vi u (Antiretroviral therapy)

phẩ

H aK

(Food and Drug Administration)

HIV

Vi u g y uy giả

iễn dị h ở người

(Human immunodeficiency virus)
HPLC

Sắ

í ỏng hiệu năng a

(High performance liquid chromatography)
IC

Nồng ộ ứ

kDa

kilo Dalton

MS

Kh i phổ (Mass spectrometry)

NMR

Phổ ộng hưởng

hạ nh n (Nu ea magnetic resonance)

13

C-NMR

Phổ ộng hưởng

hạ nh n a

H-NMR

Phổ ộng hưởng

p

1

h (Inhi i

y concentration)

n 13

n

IR

Phổ hồng ng ại (Infrared spectroscopy)

COSY

Phổ ương

2 hiều ồng hạ nh n 1H -1H

(Correlation spectroscopy)
HMBC

Phổ ương

dị hạ nh n ua nhiều i n

xa ủa 1H -13C

(Heteronuclear multiple bond connectivity)
HSQC

Phổ ương

dị hạ nh n ua 1 i n

gần ủa 1H -13C

(Heteronuclear single-quantum coherence)

4


ROESY

Phổ ROESY ương

h ng gian ủa 1H -1H

(Rotating frame nuclear overhauser effect spectroscopy)
PI

hấ ứ

h p

ea e (P

ea e inhibitor)

SDS -PAGE

iện di ge p ya y a ide ó SDS
(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

TMS
UNAIDS

Tetramethyl silan
hương

nh HIV/ IDS ủa Li n h p u

(United Nations Programme on HIV/AIDS)

UPLC

Sắ

í ỏng i u hiệu năng (U a performance liquid chromatography)

5


D

Ụ

Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và
gag-pol ............................................................................................................ 22
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng

h ạ

ộp

ea e HIV-1

dụng

ơ hấ pep ide ặc hiệu L6525 ...................................................................... 48
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng
ơ hấ

h ạ

ộp

ea e HIV-1

dụng

ặc hiệu hu nh uang peptide HF...................................................... 49

Bảng 3.1. Danh sách 48 mẫu dịch chi t có hoạt tính ức ch pepsin .............. 54
Bảng 3.2. S liệu phân tích phổ NMR 1H và 13C của h p chất GH ............... 63
Bảng 3.3. S liệu phân tích phổ NMR 1H và 13C của h p chất LH............... 70
Bảng 3.4. S liệu phân tích phổ NMR 1H và 13C của 3 h p chất RGT1, RGT2
và RGT3 .......................................................................................................... 82
Bảng 3.5. S liệu phân tích phổ NMR 1H và 13C của 2 h p chất RGT4 và
RGT5............................................................................................................... 83

6


D

Ụ

Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 ............................................................ 15
Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 ............................................................... 15
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 ............................................. 19
Hình 1.4. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạ

ộng của protease HIV-1 ......... 20

Hình 1.5. Protease HIV-1 cắt polyprotein thành các protein nhỏ khác nhau .. 24
H nh 1.6.

ng hứ

ấu ạ

ủa n rleucine v ni

pheny a anine ................ 28

Hình 2.1. Hình ảnh ĩa hạch có chứa ơ hấ dùng ể sàng lọc chất
ức ch pepsin.................................................................................................... 46
Hình 2.2. Nguyên tắ x

ịnh hoạ

ộ của protease HIV-1 s dụng ơ hất

hu nh quang peptide HF .................................................................................. 49
Hình 3.1. Pepsin phân giải ơ hấ he

g

in

n ĩa hạch ....................... 53

Hình 3.2. Khả năng ức ch pepsin của 156 mẫu dịch chi t thực vật............... 58

Hình 3.3. Sơ ồ chi t xuấ v ph n

ạn ức ch pepsin t lá cây G i hạc ..... 59

Hình 3.4. Khả năng ức ch pepsin của

ph n

ạn dung môi lá

cây G i hạc ...................................................................................................... 60
Hình 3.5. Khả năng ức ch pepsin của các ph n

ạn tách t cao Hx

của cây G i hạc ................................................................................................ 60
Hình 3.6. Sắ
ph n

ý ồ SKLM h p chất GH và khả năng ức ch pepsin

ạn tách t dịch chi t lá cây G i hạc .............................................. 61

Hình 3.7. Khả năng ức ch protease HIV-1 của GH ....................................... 62
Hình 3.8. Công thức cấu tạo axit maslinic....................................................... 64
Hình 3.9. Sơ ồ chi t xuấ v ph n

ạn các chất t lá Hồng ......................... 66

Hình 3.10. Quy trình phân lập các h p chất t cắn dicloromethan của

lá Hồng ............................................................................................................. 67
Hình 3.11. Sắ

ý ồ SKLM và HPLC của h p chất LH................................ 68

Hình 3.12. Khả năng ức ch pepsin của

ph n

ạn tinh sạch t dịch chi t

lá Hồng và Hoạt tính còn lại của protease HIV-1 khi có mặt của LH trong
phản ứng........................................................................................................... 68
7


Hình 3.13. Công thức cấu tạo của axit 24-hydroxyursolic .............................. 71
Hình 3.14. Sơ ồ chi t xuấ v ph n
Hình 3.15. Sơ ồ

ạn các h p chất t cây Rau gai th i .... 73

ước phân lập

ph n

ạn h p chất s t cắn EtOAc

của cây Rau gai th i ......................................................................................... 75
Hình 3.16. Sắ

ý ồ SKLM của 5 chất tách t cây Rau gai th i ................... 76

Hình 3.17. Sắ

ý ồ HPLC của 5 chất tách t cây Rau gai th i .................... 77

Hình 3.18. Khả năng ức ch pepsin của các chất tinh sạch t cây Rau gai th i
và hoạ

ộ còn lại của protease HIV-1 khi có mặt của: RGT1, RGT2, RGT3,

RGT4, RGT5 trong phản ứng ......................................................................... 78
Hình 3.19. Công thức cấu tạo của các h p chất RGT 1-5 phân lập ư c t
thân cây Rau gai th i ....................................................................................... 89
Hình 3.20. Hoạ

ộ ức ch protease HIV-1 của các h p chất axit maslinic,

24-hydroxyursolic, iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic,
pitheduloside G và 21Nonyl-pitheduloside G ................................................. 91
Hình 3.21. ồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của t
HIV-1 v

ộ phản ứng của protease

ơ hất khi không có và có chất ức ch ......................................... 92

Hình 3.22. Ảnh hướng của các chất ức ch protease HIV-1 lên sự inh ưởng
của t bào HEK 293T .......................................................................................... 94

8


MỞ ẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây
suy giảm miễn dịch ở người (HIV).

y

hai type chính là HIV-1 và HIV-2

ng ó type 1 xuất hiện phổ bi n và là

nguy n nh n hính g y a

IDS. h

vi u huộc họ Retroviridae và có
n nay dù

h nh ộng toàn cầu cùng với sự phát triển của
ại dịch của toàn nhân loại. The

AIDS vẫn

Liên hiệp qu c (UNAIDS, 2017) ính
khoảng 36,7 triệu người ang

ó những hương

phương ph p iều trị,
hương

nh HIV/ IDS ủa

n h ng 6 nă

2017 h giới có

ang ăn ệnh HIV/ IDS

ng ó

i

ư ng nhiễm mới là 1,8 triệu người và có khoảng 1 triệu bệnh nh n
IDS

ng nă

nh

h t vì

2016.

Ở Việt Nam, theo s liệu mới nhất của Cục phòng ch ng HIV/AIDS,
Bộ Y t 9 h ng ầu nă

nguời nhiễ

2017 6.883 nguời ph hiẹn

HIV huyển ang giai

v ng. S nguời nhiễ
diện quản í (80 )
(Báo cáo s

HIV

ạn

y i n ang

ẹnh nhan IDS

ới nhiễ

HIV 3.484

IDS 1.260 người nhiễ
n

HIV

ng 208.371 nguời ư c trong

90.943 v 91.840 nguời

v ng

1299/BC-BYT của Cục phòng ch ng HIV/AIDS, ngày

04/12/2017).
HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai s i RNA
(+) ơn

ỗi s i có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15

protein khác nhau. Trên mỗi s i RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env;
ng

ó gag

ó nghĩa “g up-an igen” (kháng nguyên nhóm), pol là

“p y e a e” v env

“enve pe” vỏ. Các gen gag và env mã hóa cho

nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme:
reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif,
vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007).
Protease của HIV-1 là enzyme không thể thi u trong chu trình s ng của
virus. Enzyme này cắt các chuỗi polypeptide gag, gag-pol tại những vị trí nhất
9

ịnh ể tạo thành các protein cấu trúc và enzyme cần thi t cho virus hoàn chỉnh.
ột bi n iểm làm bất hoạt protease dẫn

n tạo ra các dòng virus HIV-1

không hoàn chỉnh không có khả năng nhiễm vào t bào chủ. Vì có vai trò quan
trọng trong quá trình nhân lên của HIV-1 n n p

ea e ư

xe

như

ột trong

í h uan ọng nhất cho việc phát triển thu c ức ch protease ch ng HIV1/AIDS. Thu c ức ch protease có tác dụng làm giả
u ăng

h

ư ng HIV-1 trong

ư ng t bào lympho T CD4 và mang lại nhiều ơ hội s ng ó hơn

cho bệnh nhân HIV-1. Tuy vậy, tỷ lệ ột bi n axit amin của protease và khả
năng ạo các chủng mới của HIV-1 là rất cao dẫn
ch protease của HIV-1. Ở mứ
ảnh hưởng quan trọng
trị

n tình trạng kháng thu c ức

ộ in vitro, những ột bi n axit amin này không

n các chất ức ch p

ea e nhưng

ột bi n này lại ảnh hưởng t 50-90

n sự ăng h

ng iệu ph p iều
ư ng thu c ức

ch protease (Bossi và tập thể, 1999). Vì vậy, việc nghiên cứu các chất ức ch
protease của HIV-1 làm ơ ở phát triển thu c mới iều trị thích h p cho bệnh
nhân là cần thi t.
Xuấ ph

hự

n

húng

i

i n h nh ề

i “Nghiên cứu

một số chất nguồn gốc thực vật ức chế protease của HIV type 1” nhằm tách
chi t, tinh sạ h x

ịnh cấu ú v x

ịnh một s tính chất của một s h p

chất thực vật có khả năng ức ch protease HIV-1
phát triển các thu c ức ch protease mới

óng góp ơ ở cho việc

ng iều trị bệnh nhân HIV/AIDS.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- iều a ư c sự có mặt của các chất ức ch protease HIV-1 t nguồn
thực vật Việt Nam thông qua khả năng ức ch pepsin, một protease aspartyl
mang những ặ

iể

ương ồng trong cấu ú

ng như ơ h xúc tác với

protease HIV-1.
- Thu nhận và tinh sạ h ư c một s chất ức ch protease HIV-1 t

nguồn thực vật.
-X

ịnh ư c cấu trúc, tính chấ v

của một s chất ức ch protease HIV-1
10

nh gi

hu nhận ư c.

ư

ơ h tác dụng


3. ối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Các thực vật có tiề

năng chứa chất

ức ch protease HIV-1.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Sàng lọc các dịch chi t thực vật có tác dụng ức ch enzy e ương ự
protease HIV- 1 (pepsin): thi t lập iều kiện phân tích hoạt tính ức ch pepsin,
thu nhận các mẫu thực vật có khả năng ức ch protease HIV-1, chuẩn bị các
dịch chi t thực vậ

nh gi

hả năng ức ch pepsin.

- Phân lập, tinh sạch, nghiên cứu cấu trúc một s
HIV-1

hực vậ

ư

ng ọ : ph n

h

hất ức ch p

ea e

hất bằng dung môi khác

nhau, tinh sạch các chất bằng sắc ký cột, sắc ký bản mỏng x

ịnh cấu trúc

bằng phân tích phổ UV, IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC,
HSQC và phổ ROESY ánh giá khả năng ức ch pepsin và protease HIV-1.
- Nghiên cứu một s tính chất của các chất ức ch protease HIV-1
thu nhận ư : x

ịnh giá trị IC50, kiểu ức ch v

nh gi

ộc tính t bào.

4. ịa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận n ư c thực hiện chủ y u tại Phòng thí
nghiệm trọng iểm Công nghệ Enzy
Tự nhi n

v P

ein T ường

ại học Khoa học

ại học Qu c gia Hà Nội.

Phần tinh sạ h hấ ức ch p

ea e HIV-1

thực vật ư c thực hiện

với sự hỗ tr , h p tác của Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dư c liệu
T ung ương.
Phần

phổ cộng hưởng t hạ nh n ư c thực hiện tại Trung tâm các

phương ph p phổ ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
a ộc lập k t quả phổ ư c thực hiện

nghệ Việt Nam. Phần giải phổ và kiể

tại Khoa Hóa học, T ường ại học Khoa học Tự nhiên.
11


5. óng góp mới của đề tài
-

ã sàng lọ

ư c 156 dịch chi t thực vật thuộc 92 loài khác nhau về

khả năng ức ch enzy e ương ự protease HIV-1 (pepsin) bằng phương ph p
khu h n

n ĩa hạch có chứa ơ hất hemoglobin.
inh ạ h ư c 7 chất ức ch protease HIV-1 t thực vật, bao gồm:

-

axit maslinic t cây G i hạc, axit 24-hydroxyursolic t lá Hồng 21β-O-[(2E)6-hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl]

pitheduloside

G

(gọi

tắt

là

21Nonyl-pithethuloside G), iricariside E5, ginsenoside Rg1, axit rotungenic
và pitheduloside G t cây Rau gai th i. T ng ó ần ầu tiên phát hiện và
tinh sạ h ư c axit maslinic có hoạt tính ức ch protease HIV-1 t cây G i
hạc, lần ầu tiên phát hiện, tinh sạch, nghiên cứu cấu ú

ịnh danh một h p

chất saponin mới 21β-O-[(2E)-6-hydroxyl-2,6-dimethyl-2,7-octadienoyl]
pitheduloside G t cây Rau gai th i.

ồng thời lần ầu tiên phát hiện hoạt

tính ức ch protease HIV-1 của các h p chất 24-hydroxyursolic, iricariside E5,
ginsenoside Rg1, axit rotungenic và pitheduloside G.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
-K
hả
hấ ứ

uả nghi n ứu ủa ề
h việ

h p

ng ọ

i uận n

ph n ập

h hi

ea e HIV-1 ó nguồn g

h nh h ặ

i iệu ha

v nghi n ứu ính hấ

hự vậ .

- Thành công của ề tài về việc tách, tinh sạch và nghiên cứu tính chất
của 7 hấ ứ

h p

ea e HIV-1 ó nguồn g

phát triển các thu c ức ch protease HIV-1.

12

hự vậ sẽ là tiền ề cho việc

1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về virus gây suy giảm miễn dịch của người type 1
(HIV-1) và protease của HIV-1
1.1.1.

-

Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
ng

(Acquired immunodeficiency syndrome - AIDS). Theo các tài liệu
có ít nhấ hai ype HIV g y n n

IDS ó

,

HIV ype 1 (HIV-1) và HIV type

2 (HIV-2) (Tomasselli và tập thể, 1990; Tözsér và tập thể, 1991; Rose và tập
thể, 1993) nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn th giới
và là một trong s những virus gây bệnh nghiêm trọng nhất hiện nay.
Virus gây suy giảm miễn dịch ở người lần ầu i n ư c Montagnier và
tập thể ở Viện Pasteur Paris phân lập v
virus liên quan tới viêm hạ h (L V). Nă

nă

1983 với tên gọi an ầu là

1986 vi u n y ư c Ủy ban Qu c

t th ng nhất gọi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thời iể
phân lập ư c một virus mới ở T y Phi v

ó người a

ặt tên là HIV- ype 2

y

vi u

g c của HIV-type 1. Hai loại vi u n y ều làm suy giảm hệ th ng miễn dịch
của người v

ặt tên chung là HIV. Mặc dù, HIV-type 2 có một s

iểm gi ng

với HIV- ype 1 như về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh ơ
hội v phương ph p iều trị nhưng người nhiễm HIV-type 2 ít phát sinh bệnh
hơn

với nhiễm HIV-type 1 và HIV-type 2 thấy chủ y u ở các vùng của

Châu Phi (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, HIV-type 1 (HIV-1) ư c

xe

như

nguy n nh n hính g y n n ệnh AIDS.

HIV thuộc họ Retroviridae, là họ g y ung hư h người v

ộng vật.

HIV-1 có 3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier) ) (Plantier và tập
thể, 2009). Có tới 90% sự lây nhiễm HIV trên toàn th giới thuộc nhóm M;
13


nhó

n y ó 9 ph n ype ư c ký hiệu bằng các chữ cái A-D, F-H, J, K và

nhiều dạng tái tổ h p h

ư c gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating

recombinant forms) (Liu và tập thể, 2017). Sự khác nhau giữa phân nhóm
này với phân nhóm khác là ở trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vư t
quá 30%. Phân nhóm B phổ bi n ở Mỹ, Tây Âu và Australia; trong khi các
phân nhóm không phải nhóm B lại phân b ở
h uÁv
Ở Việ Na

h u Phi nơi
v

nướ

ang ph

phần lớn những người bị nhiễ

nướ

ng Na

Á ph n nhó

iển của

ang inh

ng.

HIV-1 phân lập t các

bệnh nhân nhiễm HIV-1 chủ y u thuộc nhóm CRF01_AE, bên cạnh ó còn
có một s ít các phân nhóm B, C và các dạng tái tổ h p khác (UNAIDS,
2010; Nguyen và tập thể, 2003; Ishizaki và tập thể, 2009; Liao và tập thể,
2009; Phan và tập thể, 2010).
Các nghiên cứu ể tìm ra thu

iều trị bệnh d HIV g y n n ều chủ

y u dựa trên phân nhóm B. Tuy nhiên gần
amin giữa
nh gi

ph n nhó

ư

xe

y ự a dạng về trình tự axit

như hướng nghiên cứu quan trọng ể

n ường kháng thu c PI (Bandaranayake và tập thể, 2008).

HIV-1 ó í h hước khoảng 120 nm, dạng cầu (Hình 1.1). Vỏ ngoài của
virus là lớp lipid kép với nhiều protein gắn v
Protein Env có phần chỏ

v nh

n ư c ký hiện là Env.

ư c tạo thành t 3 phân t glycoprotein có kh i

ư ng phân t là 120 kDa (gp120) và phần h n ư c tạo thành bởi 3 phân t
gp41 gắn với nhau tạo thành các phân t gp160 ính v
gp160 có thể ư c phát hiện trong huy

hanh

ớp vỏ ngoài của virus;

ng như

ạch huy t của

bệnh nhân HIV. Trong quá trình nảy chồi, virus có thể gắn thêm các protein t
màng của t bào vật chủ vào lớp lipoprotein của virus, ví dụ các protein HLA lớp
I và II, hoặc các protein k
P

dính như I

M-1 giúp virus gắn vào t

í h.

ein p17 ư c gắn vào mặt trong của màng lipoprotein. Lõi có dạng hình trụ

ư c bao bọc bởi lớp capsid tạo thành t 2.000 bản sao của protein p24 (Hare,
2006; Hoffmann và tập thể, 2007).

14


Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus, bao gồm hai s i RNA
(+) ơn

ỗi s i có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15

protein khác nhau (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

So với các virus khác thuộc họ retrovirus thì hệ gen của HIV-1 phức
tạp hơn. T n

ỗi s i RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env;

ng ó gag

bắt nguồn t

“group-antigen” ( h ng nguy n nhó ) pol bắt nguồn t

“poly e a e” v env bắt nguồn t “enve pe” (vỏ). Cấu ú “ ổ iển” ủa bộ
gen e

vi u

5’LTR-gag-pol-env-LTR 3’. T ng ó vùng LTR (long

terminal repea hay

ạn lặp d i ầu cùng) n i với DNA t bào vật chủ sau

khi tích h p và không mã hóa cho bất cứ protein nào của virus. Các gen gag
và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra,
HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb
(Hoffmann và tập thể, 2007).
15


Trong phòng ch ng nhiễm HIV-1, phát triển va ine he phương ph p
truyền th ng gặp rất nhiều hó hăn d

ột s nguy n nh n như hời gian ủ

bệnh của HIV-1 d i hường xuyên xảy a ột bi n ở vùng gen mã hóa cho
kháng nguyên, hưa ó

h nh nhiễm HIV-1

n ộng vật và tần suấ phơi

nhiễm HIV-1 cao. Nguời nhiễm HIV-1 mu n kéo dài cuộc s ng chỉ có con
ường duy nhất là u ng thu c ức ch sự sao chép và nhân lên của HIV-1.
iều trị HIV/AIDS có thể hướng

Các thu

n

í h hác nhau dựa

n ơ ở hiểu bi t về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong t

như:

ức ch quá trình hòa màng và xâm nhập của HIV-1, ức ch quá trình nảy chồi
h ng e

vi u ( RT) ư c áp

1987 bao gồm thu c ức ch

reverse transcriptase,

và phổ bi n nhất là liệu pháp dùng thu
dụng t
p

những nă

ea e v in eg a e. T ng ó

hất ức ch protease (PI) là các chất có

tác dụng cản trở sự nhân lên của HIV-1 ở giai
của virus, khi n cho HIV-1 không thể tạ

ạn muộn hơn

ng v ng ời

a ầy ủ các protein cấu trúc của

mình và vì vậy không có khả năng g y nhiễm. PI là một thành phần quan
trọng và không thể thi u của ART. Tuy nhiên, bệnh nh n iều trị bằng PI
hường phải u ng thu c nhiều lần trong mộ ng y v

iều trị kéo dài gây ra

một s tác dụng phụ hường gặp như: ệnh dạ dày, ruột, giảm chứ năng gan
r i loạn lipid máu, loạn nhịp tim. Các thu c trong nhóm gồm saquinavir,
ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir.
T nă

1995 trị liệu kháng retrovirus hiệu lực cao (highly active anti-

retroviral therapy-H

RT) ư c áp dụng bổ ung

bộ vư t bậc về giảm tỷ lệ t vong do HIV-1

ng

ạo ra những ti n

ng như giảm rõ rệt các nhiễm

ùng ơ hội và kh i u (Hoffmann và tập thể, 2007).
T ng ph

ồ iều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS, các thu

hường

ư c dùng ph i h p ể ăng hiệu quả và hạn ch tác dụng phụ. Tuy nhiên,
HIV-1 nhân lên nhanh và reverse transcriptase phiên mã ngư c với tỉ lệ sai sót
khá cao nên t

ộ ột bi n HIV-1 lớn và HIV-1 luôn tạo ra các chủng mới dẫn
16


n sự hay ổi trong cấu trúc và giúp cho HIV có khả năng h ng hu .
là thách thức và nhiều khi dẫn

y

ng iều trị HIV-1 bằng

n hiệu quả thấp

ART (Patick và tập thể, 1998). Mặc dù HIV-1 là một tác nhân gây bệnh truyền
nhiễm rất nguy hiểm với những bi n ổi phức tạp, các nhà khoa học vẫn ang
không ng ng nghiên cứu ể tìm ra thu c mới hiệu quả.
1.1.2. Cấu trúc và ch

ă

ủa protease HIV-1

Protease của HIV type 1 (protease HIV-1) ư c mã hóa bởi gen pol của
HIV-1 và là một protease aspartyl, họ e

pep in

2

ư c tạo ra trong quá

trình HIV nhiễm vào t bào chủ, có chứ năng hủy phân các polypeptide gag,
gag-pol và env của virus HIV thành cá p

ein ưởng thành có hoạt tính cần

thi t cho chu trình s ng của virus. Cụ thể là protease của HIV-1 nhận bi t 9
trình tự pep ide h

nhau

n p ypep ide gag ể tạo ra các protein cấu trúc:

matrix, capsid, nucleocapsid và P6 của HIV; thủy phân polypeptide gag-pol tạo
thành 3 enzyme là protease, reverse transcriptase và intergrase cần thi t cho
quá trình sao chép của HIV và thủy phân polypeptide env thành các protein vỏ
gp120 và gp41 của HIV (Darke và tập thể, 1989). Các thí nghiệm in vitro với
HIV-1 protease tinh sạ h

ng hẳng ịnh enzyme có khả năng ắt polypeptide

gag tiền thân (Kohl và tập thể, 1988). Khi ức ch hoạt tính của protease hoặc
g y ột bi n trên gen mã hóa cho protease, virus HIV không có khả năng x
nhiễm vào t bào vật chủ. Khi ức ch hoạt tính của protease hoặ g y ột bi n
trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn h nh h nh nhưng h ng ư c
óng gói phù h p ể tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng không có khả năng
xâm nhiễm vào t bào vật chủ (Da e v
1994). Với vai

ập hể 1989; Mildner và tập thể,

ặc biệt quan trọng như vậy, protease của HIV-1

ư c

nhiều nhà khoa học trên th giới quan tâm nghiên cứu.
Về cấu trúc, protease của HIV là một homodimer, mỗi monomer có kh i
ư ng 11 kDa gồm 99 g c axit amin v

ư c sắp x p gần như he

iểu

xứng. Trong mỗi một monomer, có các cấu trúc gấp n p  với mộ
xoắn ngắn gần ầu C (Rozzelle và tập thể, 2000; Tie và tập thể, 2006).
17

i
ạn

ộng của protease nằm tại mặt phân giới của di e

Trung tâm hoạ
x

ư c

ịnh là chứa bộ ba xúc tác có tính bảo thủ cao: Asp-Thr-Gly (Asp 25, Thr

26 và Gly 27). Tr ng ó

ỗi

n

e

ều có một bộ ba Asp-Thr-Gly và vị trí

axi a in ương ứng như au: 25 (25’) - 26 (26’) - 27 (27’) v

p ần thi t cho

cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease (Mana và tập thể, 2001). Protease
HIV-1 cắ ơ hấ

ặc hiệu protein gag 55 của HIV tại vị trí Tyr-Pro hoặc các

ơ hất tổng h p dựa trên cấu ú

ặc hiệu của HIV. Hoạt tính của protease

HIV-1 bị ức ch bởi pepstatin A (Krauslicht và tập thể, 1989).
Dựa v

ấu ú

loại huộ nhó

p

h ạ

ộng p

ea e HIV-1 ư c phân

ea e a pa y (tức là nhóm protease có chứa g c Asp

trong trung tâm hoạ
Nă

ủa ung

ộng) (Partaledis và tập thể, 1995).

1989 Navia v

ập thể tại phòng thí nghiệ

Me

tiên công b về cấu trúc tinh thể của protease HIV-1. T
protease HIV-1 h

nhau

ó

nhó

ầu

n nay, nhiều

ư c nghiên cứu về cấu trúc, chứ năng ính

ặc hiệu ơ hất và vị trí gắn của các chất ức ch . Cấu trúc của một s phức
h p protease HIV-1 kháng thu c với các chất ức ch

ặc hiệu

ng

ư c

làm sáng tỏ (King v ập hể 2000).
Như ư c chỉ ra ở H nh 1.3

ầu N của protease HIV-1 với các g c axit

amin 1-4 hình thành nên chuỗi β a là phần bên ngoài của bề mặt phi n gấp β.
Các g c axit amin 9-15 hình thành chuỗi β b qua một xoắn vòng, ti p tụ
chuỗi β c

nơi

t thúc vị trí bộ ba hoạ

theo cấu trúc xoắn vòng của vị trí hoạ

n

ộng (Asp25-Thr26-Gly27). Ti p

ộng là chuỗi β d gồm các g c axit

amin t 30-35. Một cấu trúc xoắn vòng rộng (gồm các g c axit amin 36-42)
liên k t với chuỗi β a’ hình thành bởi các axit amin 43-49. Các g c axit amin
52-66 và 69-78 lần ư t hình thành nên chuỗi β b’ và chuỗi β c’. Sau một cấu
trúc xoắn vòng tạo ra bởi các g c axit amin 79-82, một chuỗi ngắn d’ (gồm
các g c axit amin 83-85) dẫn trực ti p
axit amin 86-94).

n mộ

ạn xoắn α h (gồm các g c

ạn xoắn h theo sau bởi một chuỗi q thẳng tận cùng bằng

ầu C (gồm các g c axit amin 95-99) hình thành nên phần bên trong của bề
18


mặt nhị phân. B n chuỗi β trong phân t lõi tổ chức thành phi n ψ

ặc

ưng ủa tất cả các protease aspartyl. Các g c axit amin 44-57 trong mỗi tiểu
phần hình thành nên mộ “

” gồm một cặp chuỗi

ng

ng ngư c nhau (a’

và một phần của b’) (W dawe v tập thể, 1998; Tie, 2006).

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 (Tie, 2006)
A: Cấu trúc bậc hai của protease với chất ức ch (hoặ ơ hất), B: Cấu trúc của
protease khi có/không có chất ức ch ( ơ hấ ). M u ỏ thể hiện protease khi liên k t với
chất ức ch ( ơ hất) và màu xanh thể hiện protease khi không có chất ức ch ( ơ hất).

Cấu tạo protease HIV-1 còn có thể ư c chia thành ba vùng (domain)
chính: vùng cu i hoặc vùng dimer hóa, vùng

và vùng lõi. Vùng dimer hóa

bao gồm 4 phần cu i của phi n β (các g c axit amin 1-4 và 95-99 của mỗi

monomer), vòng xoắn quay quanh axit amin 4-9 và một chuỗi xoắn ngắn α h
(các g c axit amin 86-94 của mỗi monomer). Vùng này có vai trò thi t y u
trong hình thành cấu trúc dimer và ổn ịnh hoạt tính protease HIV-1. Cấu trúc
di e

ư c hình thành nhờ ương

h ng í h iện giữa 4 s i của phi n 

t các g c axit amin 1-4 (vùng N ầu cùng), 96-99 (vùng C tận cùng) và các
g c axit amin trong trung tâm hoạ

ộng 24-29. Tương

và Gly51; Asp29, Arg87 và Arg88

ng ảnh hưởng
19

giữa các g c Ile50

n sự ổn ịnh của dimer.


Việc gắn thêm chất ức ch hoặ

ơ hất có tác dụng ăng ường hơn sự ổn

ịnh của cấu trúc dimer. Vùng lõi gồm 4 phần ầu s i β (các g c axit amin
10-32 và 63-85 của mỗi monomer) có vai trò quan trọng trong ổn ịnh dimer

và hoạt tính. Bộ ba xúc tác Asp25-Thr26-Gly27 có tính bảo thủ trên mỗi
n

e

ng nằm trong cấu trúc của vùng õi. Vùng

a gồm các g c

axit amin t 33-43 và 44-63 bao quanh trung tâm hoạ

ộng. Phần ầu của

vùng này giàu Gly tạo nên tính mềm dẻo của vùng cần thi t cho việc gắn ơ
chất, giải phóng sản phẩm có vai trò quan trọng
N u ột bi n xuất hiện ở vị

í

i với hoạt tính của enzyme.

ó hể làm giảm mạnh hoạt tính của

enzyme (Wlodawe v ập thể, 1998; Tie, 2006).
Trung tâm hoạ

ộng của protease chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27 nằm

tại mặt phân giới của di e

ư c làm ổn ịnh nhờ mạng ưới các liên k t

hydro gi ng với các enzyme ở sinh vật nhân chuẩn (Rao và tập thể, 1998)
(Hình 1.4).

Hình 1.4. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1
(g c cacboxyl của Asp25 tạo liên k t hydro với g c -NH của Gly27. G c -OH của
Thr tạo liên k t hydro với hai iể
xanh) với g c - O (

u ỏ) của g

n vùng

i diện, liên k t giữa NH của Thr (màu

phía ước Asp (W dawe v tập thể, 1998).

20


h
của nhó

n nay, hầu h t các nghiên cứu về cấu trúc protease HIV-1 ều
B

ng hi ó he Banda anaya e v

ập hể (2008) h ự khác

nhau về trình tự axit amin giữa các phân nhóm HIV-1 gần
ng ó vai

uan ọng

Các tác giả n y

x

ng

y ư c xem là

ơ h kháng thu c ở protease HIV-1.

ịnh cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm

CRF01_AE và so sánh với phân nhóm B. Bằng cách sắp x p các nguyên t
C chồng lên nhau, các tác giả cho thấy có sự ương ồng cao giữa cấu trúc
của protease HIV-1 phân nhóm B với ph n nhó

RF01_ E

ộ lệch chỉ có

0,37 Å. Tuy nhiên, trong cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE
có sự sắp x p lại t g c axit amin 33-39 và gần vùng lõi (g c axit amin 1622). Nghiên cứu

ng h

trúc chặt chẽ hơn

ng ấu tạo protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE so với

phân nhóm B, dẫn

hấy sự é

inh ộng hơn ủa vùng

ấu

n ính ặc hiệu và hiệu quả xúc tác của protease phân

nhóm CRF01_AE thấp hơn

với p

ea e ph n nhó

B. Hơn nữa, sự a

hình xảy ra bên trong những vùng n y ư c xem ảnh hưởng
với PI v

d

hay ổi mứ

n ái lực gắn

ộ kháng thu c với một s chất ức ch nhấ

ịnh

so với protease phân nhóm B.
Protease HIV-1 có hoạt tính phân cắt các polyprotein tiền thân gag và
gag-pol của virus, ngoại tr liên k t giữa gp120 và gp41 là của convertase
furin hoặ p

ea e như furin (furin-like protease) của t bào chủ. N u ột

bi n xảy ra tại Asp25 trong trung tâm h ạ

ộng ủa p

mất hoạt tính của enzyme. Protease HIV-1

ng ó h ạt tính tự cắt xảy ra sau

khi protein gag-p

h nh h nh di e hóa

ea e HIV-1 dẫn

n

ua ó h phép giải phóng chính

nó ra khỏi polyprotein tiền thân. Hoạt tính của protease HIV-1 là tuyệ
thi t cho quá trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn

i cần

n vai trò quan trọng của

protease trong liệu pháp dùng thu c ch ng HIV-1. Một trong các chất ức ch
hoạt tính protease HIV-1 ư c phát hiện sớm nhất là pepstatin A - chất ức ch
21