Nghiên cứu tạo hoạt chất mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa của hoạt chất trên động vật thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOẠT CHẤT
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA HOẠT CHẤT
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN
PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm và lòng biết ơn chân thành tới
TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme thuộc Viện công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng
nghiên cứu hướng dẫn, cũng như tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, hóa chất để tôi
có thể hoàn thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã cho tôi cơ hội thực hiện luận
văn này tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Bộ quốc phòng
“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa phytosome của mangostin chiết xuất từ vỏ quả
măng cụt dùng cho bộ đội làm việc trong điều kiện độc hại” do Thiếu tá, Ths Đoàn
Thanh Huyền chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn tập thể phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ và chia sẻ tận tình cho tôi những kinh nghiệm chuyên
môn trong quá trình làm thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn tới các thầy cô trong Khoa sinh
học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện
cho tôi trong quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tinh thần để tôi hoàn
thành luận văn này.
Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2018
Học viên

Hoàng Mai Linh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
MỤC LỤC..............................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1 Hoạt chất α- mangostin................................................................................ 3
1.1.1 Giới thiệu chung ..................................................................................... 3
1.1.2 Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 3
1.1.3 Hoạt tính sinh học ................................................................................... 4
1.2 Phytosome .................................................................................................... 8
1.2.1 Khái niệm ............................................................................................... 8
1.2.2 Thành phần của phytosome ..................................................................... 8
1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome .................................... 9
1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome .................................................................. 10
1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome............................................... 11
1.2.6. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid
trong phytosome............................................................................................. 11
1.3 Peroxidase .................................................................................................. 12
1.4 Peroxy hóa lipid ......................................................................................... 13
1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời ........................................ 14
1.5.1 Staphylococcus aureus .......................................................................... 14
1.5.2 Candida albicans .................................................................................. 15
1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome ............................................................. 15
1.6.1 Trên thế giới ......................................................................................... 15

1.6.2 Ở Việt Nam........................................................................................... 17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 19
2.1 Nguyên liệu và hóa chất ............................................................................. 19

ii


2.1.1 Nguyên liệu........................................................................................... 19
2.1.2 Hóa chất................................................................................................ 19
2.2 Các thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 21
Các thiết bị sử dụng chính trong các thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng .... 21
2.3 Động vật thí nghiệm ................................................................................... 22
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 23
2.4.1 Tách chiết và tinh sạch α-mangostin ..................................................... 23
2.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC) ........................................... 24
2.4.3 Sắc ký bản mỏng .................................................................................. 25
2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..............................25
2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome ........................................ 26
2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid
...................................................................................................................... 27
2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn ............................................................ 28
2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase ................................................................. 29
2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde ................................................... 30
2.4.10 Xác định hàm lượng protein ................................................................ 31
2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do ............................................................ 31
2.4.12 Xử lý số liệu........................................................................................ 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 33
3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin ............................................. 33
3.2. Điều chế mangostin phytosome ................................................................ 37
3.3. Đánh giá tƣơng tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome ..... 39

3.3.1 Phân tích phổ hồng ngoại IR ................................................................. 39
3.3.2. Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ...................................... 41
3.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phytosome mangostin .................. 42
3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm ................ 43
3.5.1 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase trong gan
...................................................................................................................... 43

iii


3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng MDA trong gan
chuột .............................................................................................................. 45
3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH trong
gan chuột ....................................................................................................... 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 50
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 50
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 51

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của một Chromono ................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone ........................................... 4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của α- mangostin .......................................................... 4
Hình 1.4. Cấu tạo của phytosome ............................................................................ 8
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin ............................................ 10
Hình 1.6. Cấu trúc nhân hem của peroxidase. ........................................................ 13
Hình 1.7. Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus. .......................................... 14

Hình 1.8. Hình dạng nấm Candida albicans. ........................................................ 15
Hình 2.1. Quy trình tinh sạch α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia
mangostana L. ...................................................................................... 23
Hình 2.2. Sơ đồ bào chế mangostin phytosome ..................................................... 27
Hình 2.3. Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce ............... 30
Hình 2.4. Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn .................................... 31
Hình 3.1. Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin ............................................ 33
Hình 3.2. Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin .................. 34
Hình 3.3. Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể ...................................................... 36
Hình 3.4. Phổ HPLC của hoạt chất - mangostin ................................................. 36
Hình 3.5. Quá trình bào chế mangostin phytosome ................................................ 39
Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của mẫu - mangostin .................................................. 40
Hình 3.7. Hấp thụ huỳnh quang của phức mangostin phytosome ........................... 41
Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin và mangostin phytosome đối với
nấm Candida albicans (A) và vi khuẩn Staphylococcus aureus (B) ...... 42
Hình 3.9. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của mangostin
phytosome ............................................................................................ 44
Hình 3.10. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác dụng của mangostin
phytosome. ........................................................................................... 46
Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH trong gan dưới tác dụng của
mangostin phytosome ........................................................................... 48

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm...................... 20
Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch .................................................. 20
Bảng 2.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật. ......................................... 21
Bảng 2.4. Các thiết bị thí nghiệm. .......................................................................... 21

Bảng 2.5. Các nhóm chuột xử lí hóa chất. .............................................................. 22
Bảng 3.1. Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô. .................................. 35
Bảng 3.2. Số liệu phân tích phổ HPLC của mẫu - mangostin tinh sạch ................ 37
Bảng 3.3. Hiệu suất của quá trình điều chế mangostin phytosome ......................... 38
Bảng 3.4. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột ....................................................... 44
Bảng 3.5. Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome
mangostin .............................................................................................. 46
Bảng 3.6. Hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome
mangostin ............................................................................................. 48

vi


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DSC

Phân tích nhiệt vi sai

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

EP

Ether petroleum

EtOAC

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

FTIR

Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi

HPLC

High-performance liquid chromatography

HSPC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)

LB

Luria broth

LDL

Low density lipoprotein

MDA

Malondialdehyde

MeOH

Methanol

MIC

Minimum inhibitory concentration

OD

Optical density

PC

Phosphatidylcholin

PDI

Chỉ số phân bố KTTP

Rf

Retention factor

SD

Standard deviation

SDA

Sabouraud dextrose agar

SDS

Sodium dodecyl sulfate

-SH

Nhóm sulfhydryl

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

SKD

Sinh khả dụng

SOD

Superoxide dismutase

vii


TB

Trung bình

TBA

Thiobarbituric acid

TL

Trọng lượng

TLC

Thin layer chromatography

TMB

3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine

TN

Thí nghiệm

TT

Thể trọng

XRD

Nhiễu

viii

xạ

tia

X

(XRay

diffraction)


MỞ ĐẦU
Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) được
biết đến là “nữ hoàng trái cây” ngoài hương vị thơm ngon còn là một dược liệu quý
giá, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học dân gian để chữa bệnh tiêu chảy,
kiết lị…Nghiên cứu hóa thực vật cho thấy măng cụt có chứa nhiều chất hóa học
khác nhau như tannin, chất nhựa (resin), pectin và đặc biệt là các dẫn xuất xanthone,
những chất thuộc nhóm chất phenolic. Các chất xanthone của vỏ quả măng cụt đã

được xác định là: -mangostin, -mangostin, -mangostin, isomangostin,
normangostin, trong đó hoạt chất -mangostin có hàm lượng cao nhất, chiếm
khoảng 0,02- 0,2%. Các mangostin có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính
kháng khuẩn, hoạt tính kháng nấm, hoạt tính chống viêm, hoạt tính chống oxi hóa
nên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay cùng với việc sử dụng công nghệ phytosome đang dần được ứng
dụng rộng rãi do khả năng tăng sinh khả dụng rất lớn các hoạt chất có nguồn gốc từ
tự nhiên, có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ và liều sử dụng nhỏ. Phytosome
có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và thuận lợi hơn
để được vận chuyển vào nội bào. Công nghệ phytosome là công nghệ nghiên cứu
bào chế và ứng dụng phức hợp của các hợp chất tự nhiên với phospholipid có cấu
trúc tương tự màng tế bào nhằm tăng khả năng vận chuyển các hoạt chất từ môi
trường thân nước sang môi trường thân lipid để tăng hấp thu cho các hoạt chất tự
nhiên. Sử dụng các hợp chất mangostin kết hợp với công nghệ phytosome sẽ tạo ra
một dòng sản phẩm mới có nguồn gốc tự nhiên phục vụ trong chăm sóc sức khoẻ
ngày càng phổ biến do tính tự nhiên, sự phong phú, tương hợp sinh học cao. Sử dụng
các phospholipid có nguồn gốc tự nhiên, phát triển thành công dạng bào chế
phytosome cho các sản phẩm tự nhiên đã tạo ra một hướng đột phá mới cho xu hướng
phát triển này.
Các nghiên cứu về tinh sạch và tác dụng sinh học của các mangostin, và đặc
biệt là công nghệ phytosome ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Hơn nữa, cũng vẫn
còn thiếu vắng những nghiên cứu sâu về tính kháng khuẩn, tác dụng chống oxi hóa
của hoạt chất mangostin phytosome trên động vật thực nghiệm làm cơ sở khoa học


cho các nghiên cứu tạo sản phẩm ứng dụng các hoạt chất mangostin phytosome
trong việc chăm sóc sức khỏe con người từ nguồn dược liệu quý trong nước. Xuất
phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo hoạt chất
mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa của hoạt chất trên động
vật thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

(1) Nghiên cứu tách chiết được hoạt chất mangostin sạch;
(2) Nghiên cứu công nghệ tạo hoạt chất mangostin phytosome;
(3) Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất mangostin phytosome trên
động vật thực nghiệm.


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Hoạt chất α- mangostin
1.1.1 Giới thiệu chung
Hoạt chất α- mangostin là một chất được tách chiết từ vỏ quả măng cụt, chiếm
hàm lượng rất cao trong vỏ quả này khoảng 0,02 % đến 0,2 % trọng lượng khô.
Chất được biết đến với danh pháp quốc tế là: 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis
(3-methylbut-2-enyl) xanthen-9-one, có công thức phân tử là C24H26O6 và khối
lượng phân tử 410,46 g /mol. Là tinh thể có màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy
khoảng từ 205-206 0C, chất được coi là gần như không tan trong nước do nồng độ
tan rất thấp chỉ khoảng 2,03x10-4 mg/L ở 250C [58], tuy nhiên lại có thể tan trong
các chất như: ancol, aceton, chloroform, ethyl acetat [4].
1.1.2 Cấu trúc hóa học
Hoạt chất α- mangostin có cấu trúc điển hình của một hợp chất xanthone.
Trong đó các hợp chất xanthone được biết đến như là các chất chống oxi hóa mạnh,
có cấu trúc mạch phẳng gồm các vòng 6 carbon nối với nhau bởi nhóm carboxyl và
nguyên tử oxi tạo thành khung xương chính của phân tử. Cấu trúc này có dạng
giống cấu trúc của chromono (hình 1.1). Tuy nhiên thay vì chỉ có một vòng 6
carbon thì xanthone có hai vòng 6 carbon ở hai bên (hình 1.2). Khung xương chính
được nối với các mạch bên khác nhau tạo thành nhiều loại xanthone có đặc tính vật
lý, hóa học, sinh học khác nhau. Ngày nay, người ta đã tìm được hơn 200 loại dẫn
xuất xanthone khác nhau, với 60 loại xanthone có trong vỏ quả măng cụt [5].

Hình 1.1. Cấu trúc của một Chromono [56]

Hình 1.2. Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone (PubChem CID:7020) [60]
Dựa trên cấu trúc khung xương của hợp chất xanthone, cấu trúc α-mangostin có
thêm một nhóm methoxyl (- O - CH3), hai nhóm isoprenyl (C5H8) và ba nhóm chức
hydroxyl (- OH ) được mô tả trên hình 1.3. Trong đó nhóm isoprenyl đóng vai trò
quan trọng trong việc giúp α- mangostin có hoạt tính kháng khuẩn [28,45]

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của α- mangostin (PubChem CID: 5281650) [58]
1.1.3 Hoạt tính sinh học
Đã từ lâu, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học cổ truyền không chỉ tại
Việt Nam mà còn nhiều nước Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ với tác dụng chữa trị
kiết lỵ, tiêu chảy, chữa đau bụng, làm khô vết thương, chống nhiễm trùng da [6].
Một số nghiên cứu còn cho thấy các hợp chất xanthone có trong vỏ quả măng cụt
còn có khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u ung thư, chống oxi hóa, kháng
viêm, kháng khuẩn…


1.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt chất α-mangostin cùng với các dẫn xuất xanthone được biết đến có khả
năng kháng khuẩn mạnh. Theo nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2009) cho
thấy α-mangostin có khả năng kháng lại vi khuẩn gram dương Propionibacterium
acnes, một loại vi khuẩn có trên bề mặt da của con người gây nên các bệnh như
mụn trứng cá với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1,95 µg/ml [41]. Ngoài ra αmangostin còn chống lại các vi khuẩn kháng lại kháng sinh, những vi khuẩn này có
nguy cơ gây bệnh không thể kiểm soát với người đã được điều trị bằng kháng sinh
trong dài hạn, Iinuna và cộng sự (1996) đã đề cập đến khả năng hạn chế sự phát
triển của Staphylococcus aureus kháng methicillin của α- mangostin, khả năng này
tăng lên khi kết hợp với hoạt động của kháng sinh vancomynine [25]. Ở một nghiên
cứu khác Sakagami và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng α-mangostin có khả năng
chống lại các vi khuẩn Enterococci kháng vancomycine ở nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) là 6,25 µg/ml và kháng lại S.aureus kháng methicillin ở nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) 6,25-12,5 µg/ml [42]. Nhờ hoạt tính này mà mà α- mangostin góp phần
kiểm soát sự nhiễm trùng do vi khuẩn Enterococci và S.aureus gây ra.
Jun và cộng sự (2013) đã dùng năm hoạt chất xanthone khác nhau thử nghiệm
kháng lại vi khuẩn S.aureus kháng methicillin, kết quả cho thấy α- mangostin có
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tốt nhất 0,78-1,56 µg/ml, đồng thời nhóm ông cho
rằng α-mangostin có khả năng diệt S.aureus kháng methicillin nhanh là do sự tương
tác trực tiếp của nhóm isoprenyl trong α- mangostin với lớp lipid kép của màng tế
bào vi khuẩn dẫn đến màng này bị vỡ và làm tăng tính thẩm thấu của màng [28].
Như vậy, α-mangostin và các dẫn xuất xanthone từ quả măng cụt có khả năng giúp
kháng lại một số loại bệnh do vi khuẩn gây nên, đồng thời cũng có thể ngăn chặn
nguy cơ bùng phát dịch bệnh do các vi khuẩn kháng kháng sinh gây ra.
Pimchan và cộng sự (2017) đã nghiên cứu kết hợp α- mangostin và kháng sinh
ceftazidime chống lại vi khuẩn Acinetobacter baumannii kháng ceftazidime kết quả
cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả tốt khi làm mỏng các màng peptidoglycan, tăng
tính thấm của màng tế bào của khuẩn A.baumannii đồng thời α- mangostin cho thấy
khả năng ức chế enzyme β-lactamase loại IV của khuẩn này gây ra kìm hãm và tiêu


diệt chúng. Từ nghiên cứu này, cho thấy có thể phát triển sử dụng α- mangostin như
một dược phẩm bổ sung, có thể phối hợp với kháng sinh ceftazidime để tăng cường
khả năng tiêu diệt A.baumannii kháng kháng ceftazidime [39]. Một nghiên cứu
khác, Sivaranjani và cộng sự (2017) đã sử dụng α- mangostin để tiêu diệt khuẩn
Staphylococcus epidermidis RP62A, thu được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và
nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của α-mangostin với khuẩn S.epidermidis
RP62A lần lượt là 1,25 và 5 μg / mL. Trong đó α- mangostin thể hiện khả năng diệt
khuẩn rất tốt khi nhanh chóng làm giảm lượng vi khuẩn S.epidermidis RP62A chỉ
trong vòng năm phút. Cơ chế diệt khuẩn S.epidermidis của α-mangostin được giải
thích do nó có thể ức chế và diệt trừ màng sinh học (biofilm) của loài khuẩn này. Từ
đó, cho thấy tiềm năng của α-mangostin có thể sử dụng hỗ trợ điều trị nhiễm trùng
do vi khuẩn S.epidermidis gây ra [47].

1.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm
Các hợp chất xanthone nói chung và α- mangostin được tách chiết từ vỏ quả
măng cụt có khả năng kháng một số loại nấm gây bệnh ở thực vật, là nguyên nhân
gây thiệt hại mùa màng như Fusarium oxysporum, Aliciella tenuis, Aspergillus
oryzae [22]. Ngoài ra α- mangostin còn có khả năng chống lại nấm Candida
albicans, một loại nấm gây bệnh nhiễm trùng đường sinh dục, miệng da và máu.
Người ta dự đoán rằng cơ chế kháng nấm của α- mangostin và các dẫn xuất
xanthone là do chúng tấn công vào cấu trúc và chức năng của tế bào nấm, đặc biệt
là ergosterol, một loại lipid qua trọng trong màng tế bào nấm, mà không có ở tế bào
động vật [16]. Vậy nên điều này có ý nghĩa sử dụng α- mangostin như chất diệt
bệnh nấm trên động vật, mà không sợ ảnh hưởng đến tế bào của chúng.
1.1.3.3 Hoạt tính kháng viêm
Trong nghiên cứu của mình Nakatani và cộng sự (2002), đã chứng minh rằng
cao chiết xanthone từ vỏ quả măng cụt có khả năng ức chế quá trình giải phóng
histamine và tổng hợp prostaglandin E2. Do đó, các chất tách chiết từ vỏ quả măng
cụt chống dị ứng và kháng viêm [37]. Ngoài ra năm 2010, Bumrungpert và cộng sự
đã chứng minh được rằng α- mangostin và γ-mangostin có thể ức chế hoạt động của
LPS (lipopolisaccharide có trong plasma ở người béo phì) lên sự biểu hiện của các


gen quy định protein-enzyme liên quan đến phản ứng viêm và kháng insulin ở đại
thực bào. Hai dẫn xuất xanthone có từ vỏ quả măng cụt này có thể làm suy giảm
khả năng cảm ứng biểu hiện interleukin-6, yếu tố gây lên hoại tử (TFNα) [17]
1.1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa
Các gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý hóa trong cơ
thể. Sự tăng quá mức các gốc tự do làm cho hệ thống chống oxi hóa của các tế bào
không đáp ứng được gây ra sự phá hủy Protein, DNA, chất béo, gây tổn thương tế bào
và quá trình trao đổi chất đẩy nhanh quá trình lão hóa [5]. Williams và cộng sự (1995)
đã chứng minh rằng mangostin có khả năng hoạt động như một chất thu dọn các gốc tự
do để ngăn chặn sự phá của các gốc tự do lên LDL (Low density lipoprotein) [53].

Trong một nghiên cứu khác, Sun và các cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng mangostin có thể
trung hòa được các gốc hydroxyl tự do, superoxin anion, ức chế sự hình thành MDA
(malondialdehyde) trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu [48]
1.1.3.5 Hoạt tính chống ung thư
Đặc biệt hoạt chất α- mangostin còn được vẫn được nghiên cứu ứng dụng chữa
nhiều bệnh cho đến ngày nay tiêu biểu là ung thư. Shibata cùng cộng sự (2011) đã
chứng minh rằng mangostin từ quả măng cụt có thể gây chết một số dạng tế bào ung
thư trong cơ thể. Nhóm ông đã cho thử nghiệm hoạt tính diệt ung thư của αmangostin trên chuột được gây ung thư vú. Sau khi điều trị bằng α- mangostin cho
thấy số chuột có khả năng sống sót cao hơn so với chuột không được điều trị, đồng
thời khối u ung thư trên chuột cũng được ức chế đáng kể [44]. Tiếp đó, Han và cộng
sự (2017) đã chỉ ra rằng α-mangostin có thể ức chế LSD1 (Lysine-specific
demethylase 1) chống lại sự di căn của các khối u ung thư [23]. Cùng năm này,
Wang và cộng sự (2017) đã chứng minh rằng α-mangostin có thể chống lại ung thư
da gây ra bởi anthracene 9,10-dimetylbenzan (DMBA) / TPA thử nghiệm trên
chuột. Trong đó, ung thư da được biết là dạng ung thư phổ biến có thể gây ra tử
vong ở người, tuy nhiên cho đến ngày nay tiến trình điều trị bệnh này vẫn còn chưa
được hiệu quả. Nhóm ông cho rằng sở dĩ α- mangostin ức chế sự hình thành ung thư
da thử nghiệm trên chuột gây ra bởi DMBA / TPA là do chúng có thể ức chế sự
viêm, đồng thời ức chế thúc đẩy sự tự phát và quá trình apoptosis [51]. Tóm lại,


hoạt chất α- mangostin có thể diệt được ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau, theo
đó chúng chủ yếu tác động lên tế bào ung thư và gây ra quá trình chết theo chu trình
của các tế bào này.
1.2 Phytosome
1.2.1 Khái niệm

Hình 1.4. Cấu tạo của phytosome
Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa
gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh

học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng
[33]. Thuật ngữ "Phyto" nghĩa là “thực vật” trong khi “some” có nghĩa là “giống
như tế bào”, thường được gọi là herbosome trong nhiều tài liệu khác. Thế hệ
phytosome đầu tiên được ra đời bằng việc kết hợp giữa hợp chất polyphenol với
phospholipid trong dung môi không phân cực [18].
1.2.2 Thành phần của phytosome
Phytosome là phức hợp được tổng hợp bởi một phân tử phospholipid tự
nhiên

hay

tổng

hợp

(phosphatidylcholin,

phosphatidylethanolamin

hay

phosphatidyiserin) phản ứng với một hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết từ dược
liệu [14]. Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan q
nước và phospholipid. Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác
với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp
xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [18].


Phospholipid là các phân tử lipid nhỏ cấu tạo bởi một glycerol trong đó, hai
gốc rượu gắn với hai acid béo, gốc còn lại gắn với nhóm phosphat [14].

Dược chất: Hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành
bộ phận cấu tạo của màng và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol
của hoạt chất và nhóm phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất.
1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome
1.2.3.1 Phân loại
Phospholipid gồm 3 loại:
Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin từ lecithin của
trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin,
phosphatidylglycerol…
Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa,
disteroyl

phosphatidylcholin,

dioleyl

phosphatidylcholin,

dioleyl

phosphatidylethanolamin…ngoài ra còn có một số loạiphospholipid khác như:
sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin…).
Phospholipid được sử dụng chủ yếu là từ đậu nành và trứng, đặc biệt là
phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào.
1.2.3.2 Vai trò của phospholipid trong phytosome
Do phospholipid là hợp chất hai chức có chứa một nửa phosphatidyl ưa dầu
và một nửa cholin ưa nước nên có khả năng cải thiện sinh khả dụng của các hợp
chất tự nhiên. Phần nửa ưa nước (nhóm cholin) gắn với hợp chất tự nhiên, trong khi
nửa phần phosphatidyl tan trong lipid dạng đuôi và bao bọc các thành phần liên kết
cholin [11]. Ngoài vai trò là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành

phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein
và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế
bào trong cơ thể.


Hình 1.5 Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin [11]
Đồng thời, phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với
dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô,
thành tế bào trong cơ thể [14,38,40].
1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome
1.2.4.1 Ưu điểm
Phytosome dễ tan trong dung môi dầu và nước nên tăng khả năng hấp thụ
dược chất, gia tăng sinh khả dụng, dẫn đến giảm liều dùng và tăng được hiệu quả
điều trị. Phospholipid vừa là chất mang, vừa có tác dụng bảo vệ gan. Cholin có
trong phospholipid giúp bổ sung cholin cho gan, bảo vệ gan khỏi nhiễm mỡ. Do
phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng
của thuốc tại gan. Giữa các phân tử phosphatidylcholin và các hoạt chất có hình
thành các liên kết hóa học nên dạng bào chế phytosome có ổn định cao. Hướng hoạt
chất đến mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào.
Bên cạnh đó, phytosome giúp tăng tính thấm, hấp thu qua da nên được dùng
nhiều trong mỹ phẩm. Đặc biệt, do phytosome có đặc tính thân dầu nên hoạt chất dễ
vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid. Phytosome giúp tăng thời gian bán hủy của
một số hoạt chất nên tăng thời gian tác dụng của hoạt chất trong cơ thể, tăng tác
dụng sinh học của hợp chất [33].


1.2.4.2 Nhược điểm
Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu
cơ độc hại như: dichlomethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức
khỏe con người và môi trường. Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn

có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu
áp suất cao 3000-4500 psi [20].
1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome
Các phương pháp bào chế phytosome là:
(1). Phương pháp bốc hơi dung môi.
(2). Phương pháp kết tủa trong dung môi.
(3). Phương pháp siêu tới hạn.
Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi được
sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ
thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô.
Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung
môi hữu cơ thích hợp. Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan
tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi. Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có
mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay; tiến hành khuấy trộn, cách thủy hồi lưu
trong một khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để hình thành liên kết trong phức
hợp. Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách
bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome. Từ lớp màng phytosome này, có thể
hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo
hỗn dịch phytosome thô hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột
khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay.
1.2.6. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong
phytosome
Để xác định cấu trúc của phytosome cũng như đánh giá tương tác phân tử
giữa hoạt chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ như phổ cộng hưởng từ
hạt nhân (H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phương
pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS.


1.3 Peroxidase
Gốc tự do nội sinh là một sản phẩm tất yếu của quá trình sinh lý và sinh hóa

tế bào. Gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể. Tuy
nhiên, số lượng gốc tự do nội sinh tăng lên một cách bất thường, vượt qua sự kiểm
soát của hệ thống chống oxi hóa của cơ thể sẽ dẫn đến một số bệnh nghiêm trọng.
Khi đó, các gốc tự do nội sinh sẽ tấn công, gây phá vỡ cấu trúc các protein, DNA
của tế bào, làm rối loạn sự kiểm soát quá trình phiên mã, dịch mã, và chết theo chu
trình tế bào, có thể dẫn đến căn bệnh ung thư. Đối với gốc O2 được sinh ra từ O2
trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, tuy nhiên quá trình phân giải
này lại tạo ra nhiều phân tử H2O2 mà nó cũng là chất độc đối với tế bào. Vì vậy,
việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo các hoạt động nội bào diễn ra bình
thường. Peroxidase sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều
phản ứng oxy hóa khử khác nhau trong đó H 2O2 bị khử thành H2O. Peroxidase là
một nhóm enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa khử :
AH2

+

H2 O 2

A

+ H2 O

Hầu hết các peroxidase có cùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H 2O2.
Peroxidase bị oxi hóa bởi các peroxide (H2O2) tạo thành phức hợp PorFe4+=O (Phức
hợp I), giải phóng ra một phân tử H2O. Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme trong sự
tạo thành phức hợp I rất cao. Các peroxide như H2O2, methyl hydrogen peroxide,
ethyl hydrogen peroxide chỉ có thể tương tác với peroxidase mới tạo thành phức
hợp hoạt động (phức hợp I). Tính đặc hiệu của các phức hợp cơ chất-enzyme này
đối với chất cho hydrogen ở giai đoạn 2 và 3 là khá thấp nên chúng có thể phản ứng
với nhiều cơ chất hữu cơ (AH 2) khác như ferrocyanide, indophenol, aminophenol,

4-aminoantipyrine, leucodye, cytochrome C và một số amino acid tạo thành phức
hợp II, sau đó giải phóng enzyme về dạng ban đầu [43]. Những peroxidase khác
nhau có mức độ oligomer khác nhau, như myeloperoxidase (MPO),
lactoperoxidase (LPO) là homodimer, horseradish peroxidase (HRP) là
homoheptamer. Tuy nhiên hầu hết các monomer của peroxidase có 10 dải xoắn 
đối song và chứa một nhân hem nằm giữa đầu N và đầu C tận cùng. Đầu C tận
cùng mang phối tử thứ 5 liên kết với ion Fe là gốc histidine chứa vòng imidazol


nằm vuông góc với mặt phẳng porphyrin heme, vòng này còn có một nguyên tử N
khác tham gia hình thành liên kết hydrogen với nhóm cacboxyl của gốc aspartate
(Hình 1.5).

Hình 1.6. Cấu trúc nhân hem của peroxidase.
Cũng như catalase và superoxide dismutase, peroxidase là enzyme chống oxy
hóa quan trọng trong hệ thống sinh học. Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào
bằng cách chuyển hóa H2O2 thành H2O. Peroxidase còn tham gia vào những phản
ứng sinh hóa quan trọng khác trong cơ thể như chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh
tổng hợp thành tế bào và một số hormone như PG (prostaglandin), thyroxine,
ethylene, tham gia vào quá trình trao đổi IAA (indole-3-acetic acid), quá trình phân
hủy auxin. Ngoài ra, peroxidase còn có vai trò chống lại các tác nhân gây bệnh xâm
nhiễm vào tế bào và mô, đáp ứng bảo vệ những tổn thương [3].
1.4 Peroxy hóa lipid
Peroxy hóa lipid là quá trình oxy hóa các phân tử lipid có chứa nối đôi trong
mạch carbon. Lipid peroxide là những sản phẩm không chứa gốc tự do được dẫn
xuất từ acid béo, phospholipid, glycolipid, cholesterol có chứa nối đôi trong mạch
carbon. Sự hình thành các sản phẩm này xảy ra trong các phản ứng oxy hóa do
enzyme xúc tác hoặc phản ứng quang oxy hóa và tự oxy hóa mà không cần enzyme
xúc tác, nhưng đều có liên quan đến các gốc tự do. Sản phẩm peroxy hóa sơ cấp là
những phân tử peroxide chứa nối đôi có thể chuyển thành dạng liên hợp. Các sản

phẩm này có thể bị biến đổi thành phân tử lớn hơn nhờ quá trình dimer hóa. Quá


trình peroxy hóa lipid bị ức chế bởi các chất chống oxy hóa: -tocopherol,
ascorbate, formate, β-caroten, manitol, vitamin E, cấu trúc phân tử sẽ chuyển hóa
thành sản phẩm peroxy hóa thứ cấp, hoặc là những phân tử nhỏ hơn bởi sự phân cắt
liên kết C-C (hydrocarbon, aldehyde, epoxide).
MDA cũng có thể được tạo ra từ tiền chất PG (prostaglandin) bằng phản ứng
xúc tác enzyme như thromboxane synthetase tổng hợp MDA từ PG endoperoxide.
MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay
với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi
đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng. Hiện
nay MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và tốc
độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể xác định được
hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của những tác
nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật.
1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời
1.5.1 Staphylococcus aureus

Hình 1.7. Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus.
()
Staphylococcus aureus hay tụ cầu vàng là chủng vi khuẩn bắt màu gram (+),
đứng thành đám như chùm nho, không sinh bào tử, thường không có vỏ (Hình 1.7).
Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở 10-45C và nồng độ muối cao
tới 10%. Sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trên môi trường
thạch thường, tụ cầu vàng phát triển thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn.
Sau 24 giờ ở 37C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. S. aureus thường gây ra


mưng mủ ở da và nhiễm trùng mô mềm. Sự nhiễm trùng mô mềm do loài vi khuẩn

này gây ra có thể dẫn đến sự xâm nhiễm và gây bệnh nhiễm trùng huyết. Sự nhiễm
trùng của loài này đối với người và động vật không kích thích sự đáp ứng miễn dịch
của hệ thống miễn dịch [36]. Hội chứng nhiễm trùng do S. aureus gây ra là một vấn
đề đáng lo ngại trong bệnh viện, đặc biệt là nhiễm trùng hậu phẫu, khi xuất hiện một
số chủng có hiện tượng kháng lại kháng sinh.
1.5.2 Candida albicans

Hình 1.8. Hình dạng nấm C. albicans.
(; )
Chủng C. albicans là loại nấm lưỡng bội, sinh trưởng chủ yếu ở 37-40C, pH 7
(Hình 1.8). Kiểu hình nảy chồi chiếm ưu thế ở nhiệt độ hoặc pH thấp, trong khi đó
kiểu hình dạng sợi chiếm ưu thế ở nhiệt độ và pH cao. Nấm C. albicans có thể sinh
trưởng và gây nhiễm trùng trên bền mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu
hóa. Dạng nhiễm trùng do C. albicans gây ra có hai dạng: nhiễm trùng bề mặt như
bệnh tưa miệng, nhiễm nấm ở bề mặt âm đạo; nhiễm trùng sâu như bệnh viêm cơ
tim và nhiễm trùng huyết [28]. Cũng như S. aureus và P. aeruginosa, C. albicans là
một trong những nguyên nhân chính gây ra chứng nhiễm trùng, đặc biệt và nhiễm
trùng hậu phẫu.
1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome
1.6.1 Trên thế giới
Năm 2014, Das và cộng sự đã tiến hành nghiên bào chế phytosome rutin bằng
phương pháp bốc hơi dung môi. Nghiên cứu đã sử dụng rutin và phospholipid theo
nhiều tỷ lệ mol khác nhau, trong dung môi là methanol và diclomethan. Phytosome