Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu đầu tôm bằng enzyme alcalase và protamex; đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân

i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, em đã nhận được sự giúp từ nhiều cá nhân, tổ chức
và gia đình. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Cô giáo Ngô Thị Hoài Dương, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ
bảo và hỗ trợ trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.
Quý thầy cô giáo và đặc biệt quý thầy cô trong khoa Chế Biến trường
Đại Học Nha Trang đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm
trong suốt thời gian học tập tại trường.
Ban giám đốc và các anh chị quản lí phòng thí nghiệm viện Công Nghệ
Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nha Trang đã giúp đỡ, tạo mọi
điều kiện thuận lợi để chúng em thực hiện đề tài.
Cảm ơn quý bạn bè đã giúp đỡ trong suốt thời gian cùng thực hiện đề
tài tốt nghiệp.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ, gia đình đã
động viên tinh thần cũng như vật chất lớn nhất, giúp con vượt qua khó khăn
trong suốt bốn năm ngồi trên ghế giảng đường và trong thời gian thực hiện đề
tài tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên
Hoàng Thị Nhạn

ii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1. Khái quát về phế liệu tôm 3
1.1.1. Phân loại nguyên liệu tôm 3
1.1.2. Tôm thẻ chân trắng 4
1.1.2.1. Tình hình phát triển của tôm thẻ chân trắng 4
1.1.2.2. Thành phần của tôm thẻ chân trắng 5
1.1.2.3. Nguồn phế liệu tôm thẻ chân trắng 7
1.1.2.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm thẻ chân trắng 8
1.2. Khái quát về các chất chống oxi hóa 8
1.2.1. Khái niệm chung 8
1.2.2. Ứng dụng của các chất chống oxi hóa 10
1.2.2.1. Trong thực phẩm 10
1.2.2.2. Trong y học 10
1.3. Khái quát về enzyme 11
1.3.1. Bản chất sinh học của enzyme 11
1.3.2. Cơ chế tác dụng của enzyme 12
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 12
1.3.4. Tính chất đặc hiệu của enzyme 13
1.3.5. Hoạt độ Enzyme 14
1.3.6. Khái quát về enzyme protease 14
1.3.6.1. Định nghĩa 15
1.3.6.2. Phân loại 15
1.3.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân protein 17
1.4. Các công trình nghiên cứu và ứng dụng của nguyên liệu còn lại trong

chế biến sản phẩm từ nguyên liệu tôm 20


iii

1.4.1. Các công trình nghiên cứu nước ngoài 20
1.4.2. Các công trình nghiên cứu trong nước 22
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu 25
2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm 25
2.1.2. Enzyme Protease 25
2.1.3. Hóa chất 26
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.2.1. Xác định thành phần hóa học cơ bản phế liệu đầu tôm thẻ chân
trắng. 26
2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lí nguyên liệu (ép, không ép) đến
hiệu quả thủy phân 26
2.2.3. So sánh mức độ thủy phân, khả năng chống oxi hóa của dịch thủy
phân phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng hai loại enzyme Alcalase,
Protamex. 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu và xử lí số liệu 26
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu 28
2.4. Bố trí thí nghiệm 29
2.4.1. Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng
29
2.4.2. Ảnh hưởng của xử lí nguyên liệu 32
2.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme và thời gian khi thủy phân bằng
enzyme Alcalase và Protamex. 33
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1. Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 34


iv

3.2. Ảnh hưởng của xử lí nguyên liệu (ép, không ép) trước khi thủy phân
bằng enzyme Alcalase và Protamex 36
3.3. So sánh hiệu quả của việc sử dụng 2 enzyme Alcalase và Protamex để
thủy phân đầu tôm theo thời gian và tỷ lệ enzyme bổ sung 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47
Kết luận 47
Đề xuất ý kiến 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
PHỤ LỤC 52

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần khối lượng cơ bản của tôm thẻ chân trắng 6
Bảng 1.2: Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng 7
Bảng 1.3: Mức độ ứng dụng của một số enzyme quan trọng trên thế giới 14
Bảng 3.1: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm thẻ chân trắng 34
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của xử lí nguyên liệu đến hàm lượng protein hòa tan
khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 53
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của xử lí nguyên liệu đến khả năng khử gốc DPPH của
dịch thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 53
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan
khi thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 54
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng khử gốc DPPH của dịch
thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 55
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng protein hòa tan khi
thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 56
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến khả năng khử gốc DPPH của dịch
thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 57

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Phản ứng thủy phân protein 17
Hình 2.1: Công thức tạo phức khi cho thuốc thử biuret vào protein 27
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định thành phần hóa học trong đầu tôm 30
Hình 2.3: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 31
Hình 3.1: Ảnh hưởng của xử lý nguyên liệu đến hiệu quả thủy phân bằng
enzyme Alcalase và Protamex 36
Hình 3.2: Ảnh hưởng của xử lí nguyên liệu đến khả năng chống oxi hóa dịch
thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 37
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân bằng enzyme
Protamex và Alcalase 39
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên khả năng chống oxi hóa của
dịch thủy phân bằng enzyme Alcalse và Protamex 41
Hình 3.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hiệu quả thủy phân bằng enzyme
Alcalase và Protamex 44
Hình 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch
thủy phân bằng enzyme Alcalase và Protamex 45

1

MỞ ĐẦU
Ngày nay, ngành công nghiệp chế biến ngày càng phát triển, sản lượng
xuất khẩu ngày càng tăng, đặc biệt là công nghiệp chế biến các sản phẩm thủy
sản, trong đó có các sản phẩm chế biến từ tôm.
Cùng với sự tăng trưởng trong việc sản xuất các mặt hàng từ tôm,
lượng nguyên liệu còn lại: đầu và vỏ tôm ngày càng tăng lên. Trước đây hầu
hết các công ty đều bán lượng phế liệu này với giá rẻ cho các nhà máy chế
biến thức ăn gia súc, khi lượng phế liệu không được sử dụng hết thì gây ô
nhiễm môi trường trầm trọng.
Hiện nay, đầu và vỏ tôm được dùng để sản xuất chitin – chitosan. Việc
này làm tăng giá trị của nguyên liệu còn lại trong chế biến các sản phẩm từ
tôm. Tuy nhiên, với ứng dụng này thì lượng protein và các sắc tố tồn tại trên
nguyên liệu còn lại chưa được tận thu và quan tâm đúng mức gây lãng phí và
ô nhiễm môi trường do hàm lượng protein cao trong nước thải.
Việc kết hợp thu protein và các chất màu bằng cách sử dụng protease
trong quá trình sản xuất chitin – chitosan là rất cần thiết một mặt làm giảm ô
nhiễm môi trường và làm tăng giá trị sử dụng cho nguyên liệu còn lại trong
chế biến các sản phẩm từ tôm. Mặt khác, protein trong tôm là protein hoàn
hảo, các chất màu là những chất có khả năng chống oxi hóa. Việc đánh giá
hoạt tính sinh học của dịch thu được sau thủy phân trong công đoạn khử
protein góp phần đánh giá đúng mức giá trị của protein, đồng thời mở ra
hướng tận thu, ứng dụng cao hơn cho sản phẩm thủy phân này.
Được sự phân công của bộ môn Công Nghệ Chế Biến, khoa Chế Biến

trường Đại Học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cô giáo Ngô Thị Hoài
Dương em đã thực hiện đề tài:


2

“Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu đầu tôm bằng enzyme
Alcalase và Protamex; đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch thủy
phân”.
Đề tài được thực hiện trên phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng được thu
mua từ công ty F17. Kết quả của đề tài sẽ giúp đánh giá hoạt tính sinh học của
dịch thu được khi thủy phân đầu tôm bằng enzyme Protamex so với Alcalase,
một enzyme vẫn thường được dùng để thủy phân đầu tôm hiện nay, từ đó mở
ra hướng sử dụng sản phẩm thủy phân này trong thực phẩm và thực phẩm
chức năng. Đồng thời, đóng góp vào tài liệu nghiên cứu các hướng tận dụng
nguyên liệu còn lại trong chế biến các sản phẩm từ tôm.
Đề tài tốt nghiệp được thực hiện trong thời gian có hạn sẽ không tránh
khỏi những thiếu sót, kính mong sự đóng góp ý kiến quí báu của quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về phế liệu tôm
1.1.1. Phân loại nguyên liệu tôm [2]
Tôm là đối tượng rất quan trọng của ngành thủy sản nước ta hiện nay.
Ở Việt Nam có khoảng 255 loài tôm thuộc 68 giống trong 21 họ. Được phân
bố ở các vùng biển xa bờ, vùng biển ven bờ và các khu vực nội địa.
Giới thiệu một số đối tượng quan trọng:
a. Họ tôm he (Penaeidae)
Tôm Sú (Panaeus monodon): còn gọi là tôm cỏ, có kích thước lớn.
Tôm có chiều dài khai thác 150-250mm với khối lượng từ 50 đến 150g. Tôm
sú phân bố rộng, tập trung nhiều ở độ sâu 10 - 25m. Tôm tự nhiên có quanh
năm tuy nhiên mùa vụ chính vào tháng 2-4 và 7-10 hàng năm. Tôm sú là loài
tôm có thịt chắc, thơm ngon, có giá trị kinh tế cao, đây là đối tượng nuôi chủ
yếu ở nước ta là nguồn nguyên liệu chế biến quanh năm cho các nhà máy chế
biến tôm.
Tôm He mùa (Panaeus merguiensis): còn gọi là tôm bạc hay tôm lớt,
phân bố rộng. mùa vụ khai thác từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau và 5-9. tôm
có chiều dài khai thác 140-200mm với khối lượng 40-145g
Tôm Thẻ (Panaeus semisulcatus): còn gọi là tôm sú vằn. tôm phân bố
từ nông đến sâu nhưng tập trung chủ yếu ở độ sâu 20-40m. Mùa vụ khai thác
từ tháng 2-4 và 7-9. có chiều dài khai thác khoảng 120-250mm với khối
lượng từ 40-145g.
Tôm Rảo (metapennacus ensis): còn gọi là tôm chì. Tôm có nhiều ở

vùng biển nam trung bộ. Mùa vụ khai thác từ tháng 12 đến tháng 2 năm sau
và từ tháng 6-8. Tôm Rảo có kích thước trung bình, chiều dài khai thác
khoảng 100-180mm với khối lượng 20-50g.
Ngoài ra còn một số tôm He có giá trị kinh tế khác.


4

b. Họ tôm vỗ (Scyllaridae)
Tôm Vỗ (Ibacus ciliatus): tôm vỗ phân bố khá rộng. Trữ lượng khai
thác ở Việt Nam khá lớn. Chiều dài khai thác 140-210 và khối lượng khoảng
80-300g. Tôm Vỗ là loài tôm có thịt chắc, thơm ngon, có giá trị kinh tế.
c. Họ tôm Hùm (Homaridae) và họ tôm Rồng (Palinurdae)
Tôm Hùm sao (Panulirus ornatus): có kích thước lớn, phân bố rộng,
xuất hiện quanh năm. Chiều dài khai thác trung bình 250-450mm với khối
lượng 1230-2320g.
Tôm Hùm đỏ (Panulirus longipes): phân bố từ Quảng Bình đến Bình
thuận, tập trung nhiều ở Cam Ranh. Mùa vụ khai thác từ tháng 7-9. chiều dài
khai thác 160-280mm với khối lượng 245-495g.
Tôm Hùm sỏi (Panulirus stimpsoni): còn gọi là tôm Hùm đá. Phân bố
rộng, xuất hiện quanh năm nhưng tập trung vào các tháng 11,12 và tháng 1
năm sau. Chiều dài khai thác 165-350mm với khối lượng 275-585g
d. Họ tôm Càng (Palaemonidae)
Tôm Càng xanh (Macrobrachium rosenbergii): là đối tượng nuôi và
khai thác tự nhiên lớn trong sông ngòi, kênh rạch, đầm đìa và ao vùng đồng
bằng Nam Bộ. mùa vụ khai thác quanh năm nhưng tập trung từ tháng 10 đến
tháng 12. Tôm có chiều dài khai thác trung bình 110-200mm và khối lượng
30-120g.
1.1.2. Tôm thẻ chân trắng
Tên tiếng Anh: White Leg shrimp

Tên khoa học: Penaeus vannamei
1.1.2.1. Tình hình phát triển của tôm thẻ chân trắng
Với nhu cầu ngày càng cao của con người, công nghiệp chế biến ngày
càng phát triển, sản lượng chế biến thủy sản ngày càng tăng lên, đặc biệt là
các sản phẩm chế biến từ tôm. Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu


5

của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản
lượng chế biến [22]. Năm 2010, ước tính cả nước xuất khẩu được 240.000 tấn
tôm với giá trị khoảng 2,08 tỷ USD (năm 2009: 209.567 tấn, 1,675 tỷ USD).
Xuất khẩu tôm 2010 sang 92 thị trường, tăng hơn 10 thị trường so với năm
2009. Năm 2010, xuất khẩu tôm sang phần lớn các thị trường đều tăng trưởng
với giá tôm xuất khẩu trung bình 8,7 USD/kg, tăng 8,8% so năm 2009. Năm
2010, tôm Việt Nam xuất sang 92 thị trường, tăng mười thị trường so với năm
trước. Cả nước xuất khẩu khoảng 240 nghìn tấn tôm, kim ngạch đạt khoảng
2,08 tỷ USD. Ðây là lần đầu tiên kim ngạch xuất khẩu tôm vượt ngưỡng hai
tỷ USD [23].
Nguồn lợi thủy sản tự nhiên ngày càng cạn kiệt. Vì vậy, nguyên liệu
tôm chế biến chủ yếu được cung cấp từ nguồn nuôi trồng. Trong hội thảo tổ
chức gần đây tại Kuala Lumpur thuộc Malaysia, Liên minh người nuôi trồng
thủy sản toàn cầu (Global Aquaculture Alliance), Ngành nuôi tôm của Việt
Nam dự báo sẽ cho ra sản lượng là 403600 tấn tính đến cuối năm, tăng 12,8%
và năm 2012 tăng trưởng hơn 10% [24].
Từ năm 2006, tôm thẻ chân trắng trở thành đối tượng nuôi chủ yếu ở
tỉnh Khánh Hòa. Khoảng nửa diện tích ao, đìa ở Khánh Hòa đang được người
dân thả nuôi tôm thẻ chân trắng, đến năm 2008 toàn tỉnh đã có 870 ha nuôi
tôm thẻ chân trắng và diện tích thả nuôi đang có chiều hướng gia tăng. Và đây
là nguồn nguyên liệu chính cung cấp cho các nhà máy chế biến tôm, đặc biệt

ở các tỉnh miền trung [25].
Công nghệ chế biến tôm tạo ra một lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu
tôm và vỏ tôm. Việc xử lí lượng phế liệu tôm tiêu tốn chi phí không nhỏ, nếu
không được xử lí triệt để sẽ gây ảnh hưởng trầm trọng đến môi trường.
1.1.2.2. Thành phần của tôm thẻ chân trắng


6

Hiện nay, tôm thẻ chân trắng thương phẩm là đối tượng nuôi chủ yếu ở
Khánh Hòa, nó cung cấp nguyên liệu quanh năm cho các nhà máy chế biến.
Vì vậy đây là đối tượng được hướng đến trong nghiên cứu.
a. Thành phần hóa học[2]
Thành phần cơ bản của nguyên liệu thủy sản gồm có protein, lipit,
glucid, vitamin, nước, khoáng, sắc tố, đồng thời còn chứa đựng hệ enzyme, vi
sinh vật và các chất hoạt động sinh học khác.
Thành phần hóa học thường khác nhau theo giống, loài, môi trường
sống, trạng thái sinh lý, mùa vụ, thời tiết.
Thành phần protein trong tôm tương đối cao, protein là protein quý, có
đầy đủ các axit amin cần thiết cho cơ thể.
b. Thành phần khối lượng
Thành phần khối lượng hay thành phần trọng lượng của nguyên liệu là
tỷ lệ phần trăm về khối lượng các thành phần trong cơ thể so với toàn bộ cơ
thể nguyên liệu [2].
Thành phần khối lượng nguyên liệu thủy sản có ý nghĩa lớn trong công
nghiệp thực phẩm và tiêu dùng.
Đối với nguyên liệu tôm, tùy vào tình trạng nguyên liệu mà chế biến
các sản phẩm khác nhau, phế liệu trong quá trình chế biến thường là đầu, vỏ
và đuôi tôm. Trong đó, đầu và vỏ có khối lượng đáng kể (bảng 1.1).
Bảng 1.1: Thành phần khối lượng cơ bản của tôm thẻ chân trắng

(Dựa vào định mức bóc vỏ, bỏ đầu ở công ty F17)
Thành phần Khối lượng (%)
Đầu 30,06 - 32,43
Vỏ 10,70 - 13,04



7

Theo xu hướng gia tăng của sản lượng tôm xuất khẩu, khối lượng đầu
và vỏ thải ra trong chế biến ngày càng lớn. nếu tận dụng hết nguồn phế liệu
này sẽ mang lại lợi nhuận không nhỏ cho doanh nghiệp và giải quyết được
vấn đề về môi trường.
Trong quy trình chế biến hiện nay, đầu và vỏ sẽ được tách riêng biệt
trên 2 công đoạn khác nhau. Trong phần đầu lượng thịt tôm còn lại rất lớn,
ngược lại trong phần vỏ phần lớn là chitin. Vì vậy, cần nghiên phân riêng 2
đối tượng này trong quá trình nghiên cứu để đạt hiệu quả thu hồi cao nhất.
1.1.2.3. Nguồn phế liệu tôm thẻ chân trắng
Cùng với sự tăng trưởng xuất khẩu tôm sang các thị trường, phế liệu
tôm ngày càng tăng lên.
Lượng nguyên liệu còn lại có khi đạt đến mức 80% so với nguyên liệu
ban đầu trong quá trình chế biến các sản phẩm từ tôm (Shahidi, Synowiecki,
&Naczk, 1992) [18]. Trong đó đầu chiếm 71,6% và vỏ chiếm 28,6% và
lượng nguyên liệu còn lại này rất dễ bị hư hỏng (Meyers, 1986) [14]. Như vậy
việc tận dụng nguồn phế liệu này như một nguồn nguyên liệu để chế biến các
sản phẩm khác là rất cần thiết.
Phế liệu tôm ngày càng nhiều và ngày càng có nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm đến phế liệu này. Thành phần trong phế liệu đã được nghiên cứu bởi
Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007 (bảng 1.2).
Bảng 1.2: Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng

Chỉ tiêu phân tích Giá trị
Hàm lượng khoáng (%) 24,6 ± 0,8
Hàm lượng chitin 18,3 ± 0,9
Hàm lượng protein 47,4 ± 1,8
Hàm lượng lipit 4,7 ± 0,3
Hàm lượng astaxanthin (ppm) 130 ±13,9


8

Từ kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein trong phế liệu rất lớn.
Protein tôm là protein hoàn hảo. Vì vậy việc tận thu protein này là cần thiết.
1.1.2.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm thẻ chân trắng
Trước đây, nguồn phế liệu tôm trong chế biến chủ yếu được cung cấp
cho các nhà máy chế biến thức ăn gia súc nhỏ lẻ, khi nguồn phế liệu không
được tận dụng hết thì gây ảnh hưởng trầm trọng đến môi trường.
Những năm gần đây, sản lượng tôm thẻ ngày càng tăng nên nguồn phế
liệu tôm thẻ trở thành nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin-chitosan
nhất là ở các tỉnh miền trung đã mở ra một hướng tận dụng cho nguồn phế
liệu này. Tuy nhiên việc sản xuất chitin-chitosan bằng phương pháp hóa học
vừa không tận thu hết sắc tố và protein trên phế liệu vừa ảnh hưởng đến môi
trường do hàm lượng protein và hóa chất cao trong nước thải. Việc sử dụng
phương pháp sinh học để sản xuất chitin-chitosan đã và đang được quan tâm
và nghiên cứu, thông qua việc sử dụng enzyme protease để tách protein giúp
thu được một lúc hai sản phẩm là protein thủy phân, các sắc tố trong dịch
thủy phân và chitin-chitosan.
Nguồn protein trong dịch thủy phân thường được tận thu bằng ba
phương pháp chủ yếu là dùng nhiệt, pH, và các chất trợ lắng. Sản phẩm
protein thu được thường được tận dụng bổ sung vào thức ăn gia súc. Tuy
nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy dịch thủy phân thu được khi thủy

phân phế liệu bằng các enzyme khác nhau có hoạt tính sinh học. Điều này mở
ra hướng tận dụng cao hơn cho sản phẩm thủy phân, có thể ứng dụng sản
phẩm thủy phân này trong thực phẩm chức năng và y dược.
1.2. Khái quát về các chất chống oxi hóa
1.2.1. Khái niệm chung
Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm
quá trình oxi hóa chất khác. Phản ứng oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong


9

đó electron được chuyển sang các chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do
sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxi hóa
ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi
hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. Để làm vậy người ta hay dùng các chất
khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa [26].
Dù phản ứng oxi hóa thuộc loại cơ bản trong đời sống nhưng có thể
ngăn chặn nó, chẳng hạn động thực vật duy trì hệ thống rất nhiều loại chất
chống oxi hóa như glutathione, vitamin C, vitamin E, enzyme catalase,
superoxide dismutase, Axít citric, v.v. đây là những chất chống oxi hóa vẫn
thường được dùng trong thực phẩm và y học [27].
Chất chống oxi hóa liên quan đến công nghiệp thực phẩm, ngoài ra nó
còn liên quan đến sinh học và y học bởi vì nó bảo vệ con người trước những
tác hại của phản ứng oxi hóa. Trong thực phẩm, khi nhắc đến “chất chống oxi
hóa” thường được hiểu là chất ngăn chặn các gốc tự do gây ra phản ứng oxi
hóa lipit. Tuy nhiên gốc tự do không những gây tác hại đến lipit mà còn cả
protein, AND, và các chất có phân tử lượng nhỏ khác. Vì vậy chất chống oxi
hóa được định nghĩa rộng hơn là tất cả những chất mà khi ta bổ sung chúng
với hàm lượng nhỏ vào những đối tượng dễ bị oxi hóa thì sẽ ngăn chặn đáng
kể phản ứng oxi hóa xảy ra (Halliwell, 1990; Halliwell and Gutteridge,

1989)[8]. Những đối tượng dễ bị oxi hóa ở đây bao gồm thực phẩm, các tế
bào sống, protein, lipit và cacbonhydrate, AND. Định nghĩa này nhấn mạnh
hơn tầm quan trọng của các chất chống oxi hóa.
Các chất chống oxi hóa thường được nhắc đến trong cơ thể sống và
trong thực phẩm từ

- carotene và metallothionein đến các histidine - chứa
dipeptid (carnosine, homocarnosine, anserine), axit phytic, taurine, bilirubin,
ostrogen, creatinine, polyamine và melatonin. Trong thực vật, các chất chống


10

oxi hóa là các phenol như là quercetin, carnosol, thymol, axit carnosic,
hydroxytyrosol, tannins, catechins, rutin, morin, axit ellagic…[8]
1.2.2. Ứng dụng của các chất chống oxi hóa
1.2.2.1. Trong thực phẩm
Oxi hóa ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng thực phẩm. Nó ảnh hưởng
đến mùi vị và cấu trúc của thực phẩm. Vì vậy ngăn cản phản ứng oxi hóa lipit
là một việc rất quan trọng đối với ngành công nghiệp thực phẩm. Chất chống
oxi hóa là các chất có khả năng ngăn cản các phản ứng oxi hóa lipit, một
trong những nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm. Trước đây người ta thường
sử dụng chất chống oxi hóa tổng hợp, độ an toàn của chúng luôn là câu hỏi
đặt ra cho người tiêu dùng, một số chất được cho là có nguy cơ gây ung thư
và các bệnh về tim mạch. Ngày nay người ta hướng đến việc sử dụng các chất
chống oxi hóa có trong tự nhiên, các chất này tốt hơn rất nhiều so với các chất
tổng hợp.
1.2.2.2. Trong y học
Trong cơ thể, phản ứng oxy hóa tạo ra những gốc tự do. Năm 1954, bác
sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học gia đầu

tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những
tổn thương cho tế bào. Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất
thoát, tế bào không tăng trưởng, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới
da tạo thành những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc
ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế
bào. Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA. Nó làm
chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp
cứng nhắc.
Các chất chống oxi hóa cộng tác với nhau để loại trừ gốc tự do:
Vitamin C là chất chống oxy hóa căn bản ở trong huyết tương, nó phá hủy


11

gốc tự do và ngăn không cho gốc này xâm nhập các phân tử cholesterol LDH,
nó tăng cường sự bền bỉ của mao mạch, ngăn không cho gốc tự do xâm nhập
qua màng tế bào, giúp mau lành vết thương, kích thích sản xuất kích thích tố,
kháng thể, acetylcholine, ngăn chặn tác dụng có hại của oxygen. Beta-
carotene, được khám phá ra cách đây hơn 150 năm từ lớp mầu cam ở củ cà rốt,
beta-carotene hiện giờ là loại chống oxy hóa được tiêu thụ rất nhiều trên thị
trường, chất này cần cho sự tăng trưởng và cho chức năng của các mô, của
xương, tăng cường tính miễn dịch, giảm nguy cơ gây ung thư, giúp thị lực tốt
hơn, nó có thể biến đổi thành sinh tố A. Kết quả nhiều nghiên cứu khoa học
cho thấy sinh tố E chặn phản ứng của gốc tự do, ngăn sự oxy hóa
cholesterol và các chất mỡ khác, nâng cao tính miễn dịch, vì chặn sự oxy hóa
cholesterol, sinh tố E làm giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu
não sinh tố E là chất chống oxy hóa hòa tan căn bản trong mỡ của cơ thể, vì
nó ngăn chặn sự oxy hóa chất béo trong thực phẩm chiên rán chúng vẫn
thường được dùng hàng ngày. Các chất chống oxi hóa khác gồm có: selenium,
bioflavonoids, lutein, lycopene, coenzyme Q 10, alpha-lipoic acid và

ubiquinone cũng được quảng cáo chống lão hóa, nhưng không phổ thông như
sinh tố C, E và Beta Caroten [28].
Ngoài ra chất chống oxi hóa còn được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực
khác.
1.3. Khái quát về enzyme
1.3.1. Bản chất sinh học của enzyme
Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và tham gia
vào các phản ứng sinh học.
Các loại enzyme đều có đặc tính sinh học như sau:
- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật.


12

- Enzyme tham gia phản ứng trong cả tế bào sống và cả khi enzyme được
tách khỏi tế bào sống.
- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa.
- Enzyme có thể tham gia các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai
đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong
các hợp chất hóa học.
- Enzyme có thể được thực hiện một phản ứng.
- Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít.
- Enzyme chịu sự điều khiển của gen và các điều kiện phản ứng.
1.3.2. Cơ chế tác dụng của enzyme
Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của
các enzyme, các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất
hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra các sản phẩm của phản
ứng. Dưới tác dụng của enzyme cơ chất có thể thay đổi không chỉ về cấu trúc
hóa học, mà còn thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy
ra qua ba giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết
yếu, nhờ đó sẽ tạo phức enzyme-cơ chất. Phức hệ này thường không bền.
Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme-cơ chất xảy ra rất nhanh và cần một ít năng
lượng.
Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả
cấu trúc không gian, cả về mức độ bền vững của liên kết. kết quả là các liên
kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình
phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme.
E + S  ES  E + P
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme


13

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme: nhiệt độ ảnh hưởng rất
lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng
tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. tốc độ phản ứng chỉ tăng lên đến một giới
hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ
giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng cao
nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào sự có
mặt của cơ chất, kim loại, pH và các chất bảo vệ.
Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme: pH của môi trường thường
ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng
đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản
ứng enzyme.
Ảnh hưởng của chất kìm hãm: các chất kìm hãm trong phản ứng
enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính
enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo
hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm hoạt động của các

enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: các chất có khả năng làm tăng hoạt tính
của enzyme gọi là các chất hoạt hóa. Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất
hóa học rất khác nhau, chúng có thể là các kim loại, các chất hữu cơ có cấu
trúc phức tạp.
1.3.4. Tính chất đặc hiệu của enzyme
Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ
chất nhất định. Enzyme có tính đặc hiệu cao, tính chất đặc hiệu của enzyme
cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác.
Đặc hiệu phản ứng: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một phản ứng chuyển
hóa nhất định.


14

Đặc hiệu cơ chất: đặc hiệu tuyệt đối, đặc hiệu tương đối, và đặc hiệu
quang học.
1.3.5. Hoạt độ Enzyme
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/1mg
protein (UI/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme.
Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng nhiều phương
pháp. Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân
tử.
Công thức tính hoạt độ:

a : nồng độ tyrosine (

mol/ml)
b : độ pha loãng của dịch enzyme
c : thể tích của dịch thu được để đo

t : thời gian xảy ra phản ứng (phút)
1.3.6. Khái quát về enzyme protease
Từ khi phát hiện ra enzyme protease và khả năng chuyển hóa của nó,
người ta đã ứng dụng nó vào nhiều trong công nghiệp và sản xuất.
Bảng 1.3: Mức độ ứng dụng của một số enzyme quan trọng trên thế giới
(theo Nguyễn Đức Lượng, 2004) [6]
STT

Loại enzyme Tỷ lệ sử dụng
1 Protease 59
2 Cacbohydrase 28
3 Lipase 3
4 Các enzyme sử dụng trong phân tích và y học 10

a*b*c

X =
t


15

Qua số liệu bảng 1.3 cho thấy, protease là enzyme được sử dụng nhiều
trên thế giới, đây là một hướng cải tiến chất lượng sản phẩm thủy phân từ
protein. Tính chất và chất lượng của các sản phẩm thủy phân được xác định
thông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành. Điều này phụ
thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng
cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt độ,
pH… nó sẽ làm giảm các phụ phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện các
tính chất của sản phẩm thủy phân này. Giá trị dinh dưỡng của protein được

giữ nguyên hay tăng lên khi thủy phân bằng enzyme, protein bị cắt mạch tạo
thành các peptid hay các axit amin.
1.3.6.1. Định nghĩa
Protease hay peptidase (EC.3.4 ) là nhóm enzyme thủy phân có khả
năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide,
protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các
peptide phân tử thấp [29].
1.3.6.2. Phân loại
Việc phân loại enzyme protease có thể căn cứ vào nhiều tiêu chí khác
nhau
* Căn cứ vào cơ chế phản ứng của enzyme tham gia.
* Căn cứ vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid,
protease kiềm, protease trung tính.
* Nguồn thu các enzyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản:
- Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột của nội tạng
của một số động vật thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin,
chymotrypsin, cathepsin.
- Từ thực vật có thể thu được papain (từ đu đủ), bromelain (từ thân, lá,
vỏ dứa)


16

- Vi sinh vật cũng là một nguồn rất phong phú để thu enzym, thường từ
các loài Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm
men.
* Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme gồm: endopeptidase hay (endopeptit
hydrolase, hay proteinase) và exopeptidase hay (peptidase), amino peptidase,
cacboxyl peptidase, dipeptidase.
* Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:

- Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu
nitơ của mạch polypeptit.
- Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon
của mạch polypeptit.
- Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit.
- Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch.
* Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là
nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
Nhóm 1: Endopeptidase hay (endopeptit hydrolase, hay proteinase) là các
enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch polypeptit, các enzyme nhóm
này gồm có bốn phân nhóm:
Phân nhóm 1: Proteinase – serine là những protease mà trong trung tâm
hoạt động của nó có nhóm (- OH) của axit amin serine. Phân nhóm này
gồm các enzyme như : trypsin, chymotrypsin.
Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt
động của nó có nhóm thiol (-SH) của axit amin xistein. Nhóm này gồm
các enzyme cathepsin.
Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease trong trung tâm
hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspactic như enzyme
pepsin.


17

Phân nhóm 4: Protease – kim loại. Đây là những protease trong trung
tâm hoạt động của nó có ion kim loại. Enzyme này hoạt động trong môi
trường trung tính. Ví dụ như colagenase.
Nhóm 2: Exopeptidase hay (peptidase). Các enzyme thuộc nhóm này gồm:
Cacboxypeptidase, amino peptidase, dipeptidase. Các exopeptidase không có
khả năng thủy phân liên kết peptit ngoài cùng của chuỗi polypeptit hoặc đầu

amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acidamin ra khỏi chuỗi polypeptit.
1.3.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân protein
Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với
nhau bởi các liên kết peptid. Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi các
nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn trong môi trường nước được
gọi là sự thủy phân protein.
H
2
N – CH – CO – NH – CH – CO – … – NH – CH – COOH + (n -1) H
2
O

R
1
R
2
R
n

enzyme H
2
N – CH – COOH + H
2
N – CH – COOH + …+ H
2
N – CH –
COOH

R
1

R
2
R
n

Trong môi trường nước sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.1
R
1
H R
2
R
1
H R
2
- C - C – N – C - + H- O- H - C – C – OH + H – N – C -
H O H H O H

Protein Nước Axitcacboxylic Amino

Hình 1.1: Phản ứng thủy phân protein
Nucleo
philic


18

Qúa trình thủy phân protein diễn ra:
Trong môi trường nước sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.1

Protein polypeptide peptid axit amin

Do vậy, tùy mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà người ta có thể
thu được peptid hay axitamin.
Trong quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng protease có nhiều yếu tố
ảnh hưởng tới tốc độ thủy phân như:
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay
giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể
hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường đối
với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 50
0
C

và nhiệt
độ lớn hơn 70
0
C đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy nhiệt độ 70
0
C gọi là
nhiệt độ tới hạn của enzyme.
Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng
10
0
C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 – 2 lần. Nhiệt độ thích hợp
đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất.
b. Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH. Mỗi
enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích. pH tối
thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu,
chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm. Phế liệu tôm có
thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta
phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình
thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế

ảnh hưởng của các enzyme khác.
c. Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hiệu quả của
quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm thu được. Hoạt tính sinh học
enzyme enzyme
enzyme


19

của sản phẩm thủy phân phụ thuộc lớn vào độ dài của các mạch peptid trong
sản phẩm thủy phân. Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để
cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Nhưng nếu kéo dài
thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm
sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH
3
, H
2
S, indol, scaptol, …đồng
thời làm giảm hoạt tính sinh học của dịch thủy phân. Nhưng khi rút ngắn thời
gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân
kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch
protein. Vì vậy, tùy vào mục đích của quá trình thủy phân mà có thời gian
thủy phân thích hợp.
d. Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa
enzyme và cơ chất cũng ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân. Để tạo điều kiện
cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm. Khi
diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình
thủy phân càng dễ dàng và ngược lại.
e. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng
tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt.

Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme
bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi.
f. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất
là phế liệu tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất. Khi cơ chất
đầu tôm tạo phức với enzyme protease sẽ bị thay đổi cả cấu trúc không gian,
cả về mức độ bền vững của liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra
sản phẩm thủy phân và giải phóng enzyme. Qúa trình này cứ tiếp tục xảy ra
đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm
cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng.