Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2 oxoindolin tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ MAI DUNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC
MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC
MÃ SỐ:

62720403

HÀ NỘI, 2020


Công trình được hoàn thành tại:
Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội.
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Hải Nam
Phản biện 1: ........................................................................
Phản biện 2: ........................................................................
Phản biện 3: ........................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá cấp Trường
họp tại:.................................................................................
Vào hồi.........giờ.......ngày.......tháng.......năm..........

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Đại học Dược Hà Nội


I. MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Trong những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đã trở thành
các tác nhân chống ung thƣ đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic
(SAHA) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã đƣợc FDA cấp phép trong
điều trị u lympho tế bào T dƣới da. Sau đó, belinostat, panobinosat cũng đã
đƣợc phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thƣ. Bên cạnh đó, rất
nhiều chất ức chế enzym HDAC, đặc biệt các dẫn chất kiểu propenamid,
cũng đƣợc nghiên cứu và đang đƣa vào thử nghiệm lâm sàng nhƣ NVPLAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228…. Luận án đƣợc thực hiện
theo hƣớng nghiên cứu nhằm tìm kiếm ra các chất ức chế HDAC mới có
hoạt tính kháng tế bào ung thƣ. Đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh
học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” đƣợc tiến
hành với 2 mục tiêu chính.
2. Mục tiêu luận án
1. Tổng hợp đƣợc khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mới mang khung
2-oxoindolin.
2. Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng kháng một số
dòng tế bào ung thƣ của các dẫn chất tổng hợp đƣợc.
3. Những đóng góp mới của luận án
Về thiết kế tổng hợp các acid hydroxamic
Luận án đã thiết kế và tổng hợp đƣợc 62 acid hydroxamic mới, những cấu
trúc này chƣa đƣợc công bố trong các tài liệu trƣớc đó.
Về thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng ức chế enzym: 21 chất dãy I-III đƣợc thử tác dụng ức chế
HDAC bằng phƣơng pháp Wesstern blot ở nồng độ 3 µg/ml, có 18/21 chất

thể hiện tác dụng ức chế HDAC. 41 chất dãy IV-X đƣợc định lƣợng nồng
độ ức chế HDAC2 bằng phƣơng pháp định lƣợng huỳnh quang, có 6 chất
có IC50 nhỏ hơn SAHA, đa số các chất có IC50 < 6,5 µM. Cả 62 chất đều
đƣợc thử độc tính tế bào trên 3-4 dòng tế bào ung thƣ. Kết quả, 20 chất bao
gồm Ia-g, IIa-e, Ve, Vf, VIIIe, IXc, IXg, Xa-c có độc tính mạnh hơn
SAHA ở các dòng tế bào thử nghiệm. Trong đó, chất Xc thể hiện tác dụng
mạnh nhất và đƣợc tiến hành thêm một số thử nghiệm gồm đánh giá tác
1


dụng ức chế HDAC1, 6, 8 và cùng với IXg, Xa, Xb đƣợc đánh giá độc tính
trên tế bào phổi thƣờng MRC-9. Kết quả, Xc có khả năng ức chế các
HDAC tƣơng đƣơng SAHA và có xu hƣớng chọn lọc HDAC1 và 6 hơn
HDAC2 và 8. Các chất thử nghiệm đều thể hiện khả năng gây độc chọn lọc
tế bào ung thƣ hơn so với tế bào thƣờng và mức độ chọn lọc cao hơn
SAHA.
4. Bố cục luận án
Luận án có 149 trang, 16 bảng, 66 hình, 15 sơ đồ. Bố cục gồm các phần:
Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (41 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung và
phƣơng pháp nghiên cứu (11 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận
(36 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các bài báo đã công bố
liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 172 tài liệu tham khảo (14
trang) và 281 phụ lục (148 trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
Chƣơng tổng quan đã trình bày về:
- Enzym HDAC: Khái niệm, phân loại và cấu trúc các HDAC nhóm I, II, IV.
- Các chất ức chế HDAC đã đƣợc công bố theo các nhóm chất: acid
hydroxamic, benzamid, peptid vòng, ceton, acid béo mạch ngắn và các
nhóm chất khác.

- Phƣơng pháp tổng hợp vòng triazol: cơ chế, xúc tác, phối tử.
- Phƣơng pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester
- Định hƣớng thiết kế cấu trúc các chất trong luận án.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
- Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam.
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thƣờng dùng trong tổng hợp hữu cơ.
- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân. Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di.
- Các dòng tế bào ung thƣ ngƣời thử nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tổng hợp 62 dẫn chất acid hydroxamic.
- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ
khối, phổ hồng ngoại và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ( 1H, 13C-NMR)
2


- Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc
- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro của các chất tổng hợp đƣợc.
Chương 3. KẾT QUẢ
3.1. Tổng hợp và kết quả phân tích phổ
Các chất đƣợc tổng hợp theo các quy trình dƣới đây:
* Nhóm các acid hydroxamic không chứa vòng triazol
Gồm 3 dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g đƣợc tổng hợp theo các sơ đồ dƣới đây,
và đƣợc khẳng định có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến dựa vào kết quả phân tích
các phổ.
+ Dãy Ia-g

+ Dãy IIa-g

+ Dãy IIIa-g

3


+ Dãy IV - VIII

+ Dãy IXa-g

+ Dãy Xa-c

4


Bảng 3.1: Tóm tắt các kết quả tổng hợp
Chất
Ia
Ib
Ic
Id
Ie
If
Ig
H (%) 74,0
72,0
69,3
67,0
71,0
75,0

75,0
Chất
IIa
IIb
IIc
IId
IIe
IIf
IIg
H (%) 76,0
67,0
70,0
65,0
68,0
71,0
75,0
Chất
IIIa
IIIb
IIIc
IIId
IIIe
IIIf
IIIg
H (%) 40,0
64,0
65,0
70,0
62,0
45,0

67,0
Chất
IVa
IVb
IVc
H (%) 64,0
63,0
63,0
Chất
Va
Vb
Vc
Vd
Ve
Vf
Vg
H (%) 68,0
72,0
64,0
68,0
71,0
60,0
70,0
Chất
VIa
VIb
VIc
VId
VIe
VIf

VIg
H (%) 68,0
69,0
69,0
74,0
75,0
64,0
73,0
Chất
VIIa
VIIb
VIIc
VIId
VIIe
VIIf
VIIg
H (%) 67,0
65,0
64,0
62,0
67,0
57,0
64,0
Chất
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf
VIIIg
H (%) 69,0
72,0
75,0
75,0

68,0
64,0
76,0
Chất
IXa
IXb
IXc
IXd
IXe
IXf
IXg
H (%) 50,0
54,0
51,0
55,0
52,0
53,0
52,0
Chất
Xa
Xb
Xc
H (%) 64,0
62,0
60,0
Bảng 3.2. Kết quả dự đoán năng lượng liên kết bằng phương pháp docking
Chất
Ia
Ib
Ic

Id
Ie
If
Ig
-9,40
-9,00
-9,00
-9,10
-8,30
-9,00
-8,90
Chất
IIa
IIb
IIc
IId
IIe
IIf
IIg
-8,60
-8,60
-8,40
-8,30
-8,60
-8,30
-8,40
Chất
IIa
IIb
IIc

IId
IIe
IIf
IIg
-9,80
-9,90
-9,90
-9,90
-9,70
-9,90
-9,60
Chất
IVa
IVb
IVc
-7,40
-7,60
-7,70
Chất
Va
Vb
Vc
Vd
Ve
Vf
Vg
-7,50
-7,70
-7,80
-7,80

-7,10
-7,40
-7,90
Chất
VIa
VIb
VIc
VId
VIe
VIf
VIg
-6,70
-7,00
-7,10
-7,00
-7,40
-7,40
-7,20
Chất
VIIa
VIIb
VIIc
VIId
VIIe
VIIf
VIIg
-7,10
-7,20
-7,30
-7,20

-7,60
-7,00
-7,40
Chất
VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf VIIIg
-7,80
-7,10
-7,80
-7,20
-7,50
-7,90
-7,30
Chất
IXa
IXb
IXc
IXd
IXe
IXf
IXg
-9,70
-9,90
-9,80
-9,50
-9,90
-9,60
-9,10
Chất
Xa
Xb

Xc
SAHA
-9,40
-9,60
-9,48
-7,40
Ghi chú: Năng lượng liên kết được dự đoán tính bằng kcal/mol
5


Năng lƣợng tƣơng tác của các chất đều nhỏ hơn SAHA cho thấy tiềm
năng ức chế HDAC2 của các chất có thể so sánh với SAHA. Ngoài ra, hình
ảnh tƣơng tác của các chất ở mô hình trung tâm hoạt động của HDAC2
(Hình 3.1) cũng cho thấy, các chất đều có phần cầu nối nằm trọn trong lòng
kênh enzym, nhóm chức acid hydroxamic tiếp cận đƣợc tới ion kẽm ở
khoảng cách đủ gần để có thể tạo đƣợc phức chelat. Ngoài ra, những chất
có vòng thơm trong phần cầu nối, đặc biệt là vòng benzen, tạo đƣợc các
tƣơng tác van der Waals kiểu xếp chồng π-π với Phe155 và Phe210. Đây
đƣợc dự đoán là yếu tố quan trọng tạo nên ái lực liên kết tốt.

Hình 3.1: Hình ảnh docking của dãy chất IIIa-g
3.3. Tác dụng sinh học
Các kết quả cụ thể về tác dụng sinh học của các chất đƣợc trình bày cụ thể
trong phần bàn luận sau đây.
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. TỔNG HỢP HOÁ HỌC
Phản ứng alkyl hoá: Cơ chế phản ứng là phản ứng thế nucleophil, đƣợc
minh hoạ trong Sơ đồ 4.1.

Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng alkyl hoá

6


Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng N-alkyl hoá khung indolin đều
đƣợc tiến hành trong môi trƣờng base với tác nhân alkyl hoá là các dẫn xuất
halogen. Một số loại base thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình gắn mạch
alkyl vào nguyên tử N trên khung indolin có thể kể đến nhƣ: Na 2CO3,
K2CO3, Cs2CO3, LiH, NaH, CaH2, TEA, LiOH, NMP, NaOEt. Các loại
dung môi có thể sử dụng trong phản ứng này gồm: DMF, DMA, HMPT,
MeCN, DMSO, NMP, EtOH, MeOH, Me2CO. So sánh các xúc tác base và
dung môi về sự thuận lợi cho thao tác, sự sẵn có cũng nhƣ giá thành của
nguyên liệu luận án đã lựa chọn sử dụng chất xúc tiến là K2CO3, dung môi
DMF và xúc tác KI. Sự có mặt của KI giúp tăng tốc độ phản ứng, do xảy
phản ứng trao đổi nhóm khó bị thế -Br bằng nhóm dễ bị thế hơn -I theo
phản ứng Finkelstein. Kết quả thu đƣợc các phản ứng N-alkyl hoá đều có
thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện này với hiệu suất tƣơng đối cao từ
khoảng 75,0–96,0%.
Phản ứng azid hoá: dùng trong các giai đoạn tổng hợp các chất trung
gian azid. Đây là phản ứng theo cơ chế thế nucleophil (Sơ đồ 4.2):

Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng azid hoá
Trong trƣờng hợp này, muối azid natri là một tác nhân nucleophil rất
mạnh nên quá trình phản ứng có thể diễn ra trực tiếp mà không cần giai
đoạn hoạt hoá. Phản ứng azid hoá là phản ứng thế SN2 nên thƣờng đƣợc tiến
hành trong dung môi phân cực không proton nhƣ acetonitril,
dimethylsulfoxid, dimethylformamid. Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần
đây cho thấy phản ứng azid hóa cũng có khả năng phản ứng tốt trong môi
trƣờng nƣớc có sử dụng sóng siêu âm hỗ trợ hay hỗn hợp dung môi nƣớcTHF. Trong giai đoạn khảo sát lựa chọn dung môi, luận án đã thử tiến hành
phản ứng tổng hợp chất 3.9 trong nƣớc và hỗn hợp nƣớc-THF. Nhƣng do
nguyên liệu ban đầu methyl 3-bromopropanoat (chất 3.8) là chất lỏng

không màu, có tính phân cực kém, không đồng tan trong nƣớc và có tỷ
trọng nặng hơn nƣớc nên thƣờng tách lớp nằm phía dƣới đáy bình cầu. Dù
7


đã sử dụng khuấy từ cũng nhƣ đun hồi lƣu để hỗ trợ quá trình khuấy trộn
trong bình cầu nhƣng phản ứng vẫn diễn ra rất khó khăn. Do đó, phản ứng
đƣợc khảo sát tiếp theo với dung môi methanol, dung môi này ít phân cực
hơn nƣớc, có khả năng hoà tan đƣợc cả ester 3.8 và NaN3. Kết quả khảo sát
cho thấy sau khoảng 6 h ở điều kiện nhiệt độ phòng phản ứng diễn ra hoàn
toàn. Quá trình tổng hợp các dẫn xuất alkyl azid khác gồm 3.12, 3.15, 3.18,
3.21, 3.24 cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự với dung môi methanol và điều
kiện nhiệt độ phòng. Nhìn chung, các phản ứng tổng hợp các dẫn chất azid
diễn ra tƣơng đối thuận lợi, nhƣng quá trình xử lý phản ứng phải trải qua giai
đoạn tách chiết nên hiệu suất thu không cao chỉ khoảng từ 48,5% đến 68,4%.
Phản ứng đóng vòng Click: phản ứng dùng để tạo thành cấu trúc 1,2,3triazol trong cấu tạo của các dãy chất từ IV đến X. Để phản ứng diễn ra
theo hƣớng tạo một sản phẩm duy nhất mang khung 1,2,3-triazol xúc tác
đƣợc lựa chọn là muối đồng (I): CuI. Muối CuI có ƣu điểm là độ phân cực
khác biệt nhiều so với các sản phẩm tạo ra nên giai đoạn xử lý phản ứng
loại xúc tác tồn dƣ diễn ra thuận lợi hơn so với các muối đồng khác thƣờng
đƣợc dùng làm xúc tác nhƣ CuOTf.C6H6 hay CuSO4.5H2O/Natri ascorbat.
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Yan Z.Y. và cộng sự và một số nghiên cứu
khác một số dung môi đã đƣợc lựa chọn để khảo sát phản ứng đóng vòng
Click gồm: nƣớc, aceton, t-BuOH, acetonitril, DMF. Các alkyn và nitril
không tan hoặc ít tan trong nƣớc, aceton và t-BuOH nên phản ứng hầu nhƣ
không diễn ra trong các dung môi này. Ngƣợc lại, phản ứng diễn ra khá tốt
trong dung môi DMF và acetonitril. Khi sử dụng dung môi DMF, phản ứng
đóng vòng có thể tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng và thời gian phản
ứng khá nhanh từ 3-5 h. Do nhiêt độ sôi của DMF khá cao (153 oC) nên
không thể loại dung môi bằng phƣơng pháp cất quay chân không. Hƣớng

xử lý phản ứng trong trƣờng hợp này sẽ là tạo kết tủa sản phẩm trong môi
trƣờng nƣớc, kết tủa thu đƣợc sẽ bao gồm sản phẩm và lƣợng CuI dùng làm
xúc tác. Quá trình xử lý buộc phải tiến hành tinh chế thêm một bƣớc nữa.
Vì vậy, thời gian xử lý phản ứng khá dài và lƣợng sản phẩm tinh khiết thu
đƣợc với hiệu suất khá thấp (dƣới 40%). Trong khi đó, nếu sử dụng dung
môi acetonitril thì sau khi kết thúc phản ứng có thể dễ dàng loại bỏ dung
môi bằng phƣơng pháp cất quay và tinh chế sản phẩm chỉ cần qua một
bƣớc, lƣợng sản phẩm tinh khiết thu đƣợc với hiệu suất tƣơng đối cao
8


khoảng trên 60%. Vì vậy, dung môi acetonitril là dung môi đƣợc lựa chọn
để tiến hành các phản ứng đóng vòng để tạo khung 1,2,3-triazol. Nhìn
chung, phản ứng Click là một phản ứng tƣơng đối dễ thực hiện, tiến hành
trong điều kiện đơn gian và có hiệu suất cao từ 58,2% đến 89,0%.
Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic: phản ứng cuối cùng của mỗi
chuỗi phản ứng để tạo ra các acid hydroxamic theo thiết kế ban đầu. Cơ chế
phản ứng đƣợc minh hoạ trong Sơ đồ 4.3 nhƣ sau:

Sơ đồ 4.3. Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester
Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin là một
phản ứng N-acyl hoá theo cơ chế thế nucleophil. Phản ứng chỉ có thể diễn
ra trong môi trƣờng kiềm mạnh pH > 10. Nguyên liệu hydroxylamin tham
gia phản ứng thƣờng đƣợc dùng dƣ khá nhiều so với ester để đảm bảo thu
đƣợc tối đa sản phẩm acid hydroxamic từ một lƣợng ester ban đầu. Theo
các tài liệu tham khảo, hydroxylamin có thể dùng dƣới dạng muối NH2OH.
HCl và khi tham gia phản ứng cần sự có mặt của các chất kiềm mạnh để
chuyển hoàn toàn thành dạng base. Do đó, các phản ứng tạo acid
hydroxamic trong luận án đều sử dụng NaOH thêm vào hỗn hợp phản ứng
với tỷ lệ gấp đôi số mol NH2OH.HCl. Lƣợng NaOH dùng dƣ để chuyển

hoàn toàn hydroxylamin thành dạng base, đồng thời tạo đƣợc pH môi
trƣờng đủ cao để phản ứng có thể diễn ra. Ngoài ra, do cấu trúc của các acid
hydroxamic đƣợc thiết kế khá cồng kềnh, không có nhiều nhóm chức thân
nƣớc nên khả năng tan trong nƣớc có thể dự đoán là rất thấp (thực tế là các
chất đều không tan trong nƣớc) nên khi đƣợc tạo thành có thể kết tủa ngay
trong bình phản ứng, cản trở sự tƣơng tác của các ester với hydroxylamin.
Do đó, một lƣợng dƣ NaOH là cần thiết để chuyển dạng acid sang dạng
muối hydroxamat tan đƣợc trong hỗn hợp dung môi phản ứng. Và sau khi
kết thúc phản ứng cần acid hoá dung dịch về pH = 3 – 4 để thu đƣợc sản
phẩm acid hydroxamic dạng kết tủa. Phản ứng tạo acid hydroxamic của các
chất trong luận án có hiệu suất phản ứng dao động từ 45,0 đến 82,5%.
9


4.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC
Tất cả các chất sau khi tổng hợp và tinh chế đƣợc đo phổ IR, MS, 1HNMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc. Ngoài ra, các chất trung gian đƣợc
tạo thành trong quá trình tổng hợp chất Ia là 3.2a, chất trung gian trong quá
trình tổng hợp IXa gồm chất 3.7, 3.24, 3.25a cũng đƣợc tiến hành đo phổ
MS, 1H-NMR và 13C-NMR. Các chất Ia, VIIa và IXa đƣợc chọn làm chất
đại diện để đo phổ 2D NMR HMBC và HSQC.
4.2.1. Phổ hồng ngoại
Căn cứ các kết quả trên phổ đồ và các giá trị tham khảo trong tài liệu có
thể biện luận một số nhóm chức nhƣ sau:
- Trong vùng 3400 – 3100 của các chất đều có từ 1 đến 3 đỉnh hấp thụ
mạnh và rộng. Các đỉnh này đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết NH (xuất hiện trên phổ với số sóng khoảng 3474 –3307) và O-H (xuất hiện
trên phổ với số sóng khoảng 3296 - 3137). Sự có mặt của các dao động hóa
trị N-H, O-H kết hợp với sự có mặt của dao động hóa trị của liên kết C=O
là chứng minh cho sự hiện diện của nhóm chức acid hydroxamic ở tất cả
các chất mục tiêu tổng hợp đƣợc.
- Các vòng benzen có dao động hóa trị C-H vòng thơm xuất hiện trong

khoảng 3089 – 3004 cm-1 và dao động hóa trị C=C vòng thơm xuất hiện
trong khoảng 1615 – 1456 cm-1.
- Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt
trên phổ đồ với dao động hóa trị bất đối xứng CH 2 từ 2998 – 2903 cm-1 và
dao động hóa trị đối xứng CH2 từ 2895 – 2834 cm-1. Vị trí xuất hiện của hai
đỉnh hập thụ này tƣơng đối cố định trong mỗi dãy dẫn chất.
- Trong vùng khoảng 1660 –1820 cm-1 của hầu hết các chất đều có hai
đỉnh hấp thụ với cƣờng độ mạnh và độ rộng trung bình. Đây là dải phổ đặc
trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C=O. Tƣơng ứng với hai nhóm chức
carbonyl trong cấu trúc của các chất mục tiêu gồm nhóm C=O ở vị trí số 2
trên khung indolin và nhóm C=O của chức acid hydroxamic. Giá trị của 2
đỉnh hấp thụ dao động trong khoảng 1685-1638 và 1735-1703 cm-1.
4.2.2. Phổ khối lượng
Phổ khối lƣợng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc các
chất tổng hợp và thƣờng đƣợc dùng để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng
đƣợc tạo thành có khối lƣợng phân tử đúng nhƣ công thức dự kiến hay không.
Sau khi phân tích ion phân tử thu đƣợc trên phổ khối lƣợng, kết quả
cho thấy tất cả các chất đều có sự phù hợp giữa kết quả đo khối phổ với
công thức phân tử dự kiến. Một số chất trên phổ đồ xuất hiện pic M+23
tƣơng ứng với ion [M+Na]+ thay vì pic [M+H]+ trên phổ ESI(+). Đây là
hiện tƣợng thƣờng gặp trong phƣơng pháp đo ESI vì dòng khí mang hoặc
10


bên trong thiết bị có thể chứa ion H+, Na+, K+... Nhƣ vậy, phổ khối lƣợng là cơ sở
để khẳng định các chất tổng hợp đƣợc có công thức phân tử đúng nhƣ dự kiến.
4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR:
4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất Ia-g, IIa-g và IIIa-g
- Proton vị trí 4” (H-4”) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,03 –

8,01 ppm. Tín hiệu cộng hƣởng của proton H-4” có thể có dạng singlet,
doublet hoặc doublet-doublet, do có tƣơng tác ghép cặp với proton H-5”,
JH4”-H5”(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz, tƣơng tác với proton H-6”, JH4”-H6”(meta) = 2,0 –
2,5 Hz hoặc tƣơng tác với F, JH4”-F(ortho) = 6,5 – 8,5 Hz.
- Proton vị trí 5” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,07–7,15 ppm,
tín hiệu cộng hƣởng có dạng triplet do có tƣơng tác ghép cặp với proton H4” và H-6” ở các chất không có nhóm thế hoặc các chất mang nhóm thế 7”Cl. Hằng số ghép cặp của proton H-5” với hai proton bên cạnh là JH5”-4”(ortho) =
JH5”-6”(ortho)= 7,5–8,5 Hz.
- Proton vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 6,94 – 7,56 ppm.
Tín hiệu cộng hƣởng của proton H-6” có các dạng là doublet, triplet,
doublet-doublet hoặc doublet-triplet. Dạng tín hiệu cộng hƣởng doublet và
doublet-doublet của proton H-6” có thể xuất hiện ở phổ đồ của các chất
mang nhóm thế không phải F ở vị trí 5”, 7” do tƣơng tác với các proton H5”, 7” và 4”. Dạng tín hiệu cộng hƣởng triplet hoặc doublet-triplet xuất hiện
trên phổ đồ của các chất không mang nhóm thế hoặc mang nhóm thế F ở vị
trí 5” do tƣơng tác với H-4”, 5”, 7” và nguyên tử F.
- Proton vị trí 7” có độ dịch chuyển hóa học tƣơng đối ổn định, ít bị ảnh
hƣởng bởi các nhóm thế hút hay đẩy electron, chỉ thay đổi trong một
khoảng hẹp 6,82 – 7,02 ppm. Dạng tín hiệu cộng hƣởng của proton H-7” đa
số trƣờng hợp là doublet do có tƣơng tác ghép cặp với H-6”, JH7”-6”(ortho) =
7,5 – 8,5 Hz. Riêng với hai chất có nhóm thế 5”-F (Ib, IIIb), tín hiệu cộng
hƣởng có dạng doublet-doublets do H-7” ngoài tƣơng tác với H-6” còn có
tƣơng tác ghép cặp với nguyên tử F, JH7”-F(meta) = 4,0 Hz.
- Hai proton của cầu nối methylen cũng có độ dịch chuyển hóa học tƣơng
đối ổn định, nằm trong khoảng 4,82 – 4,95 ppm. Ngoại trừ, các dẫn xuất có
nhóm thế 7”-Cl, pic của proton methylen bị dịch chuyển về vùng trƣờng
thấp nằm trong khoảng 5,21 – 5,30 ppm.
- Khung benzen trong phần cầu nối có dạng thế di-para, có 4 proton tạo
thành hai cặp đối xứng là cặp 2’, 6’ và 3’, 5’. Vị trí cộng hƣởng của các cặp
tƣơng đối cố định với δH3’-H5’ = 7,19 – 7,35 ppm, δH2’-H6’ = 7,51 – 7,54 ppm.
Tín hiệu cộng hƣởng của cả hai cặp proton luôn là doublet có hằng số ghép
cặp JH2’-H3’(ortho) = JH5’-H6’(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz.

- Cầu nối –CH2=CH2- có hai proton có giá trị nằm trong khoảng δ H-2 = 6,42
11


– 6,49 ppm, δH-3 = 7,41 – 7,43 ppm. Hằng số ghép cặp qua lại giữa hai
proton này có giá trị JH2-H3 = JH3-H2 = 15,5 -16,0 Hz, đây là hằng số ghép cặp
đặc trƣng cho cấu hình trans ở nối đôi. Do đó, có thể khẳng định cấu hình
của các acid hydroxamic tổng hợp đƣợc là cấu hình E.
- Cấu trúc của các chất còn có 2 đến 3 proton rất linh động của các nhóm
chức -CO-NH-OH và =NOH. Do tính linh động nên tín hiệu cộng hƣởng
của các proton này có hình dạng singlet giãn rộng và đôi khi có thể không
xuất hiện trên phổ đồ. Proton của nhóm oxim (-NOH) chỉ có mặt trong cấu
trúc của các chất dãy I, có giá trị độ dịch chuyển hóa học khoảng 13,50 –
13,90 ppm. Về hai proton của nhóm chức acid hydroxamic, nhóm NH nằm
gần nhóm C=O hơn so với nhóm OH nên bị ảnh hƣởng nhiều hơn của hiệu
ứng hút điện tử của nhóm carbonyl. Do đó nên proton của –NH cộng hƣởng
ở trƣờng yếu hơn (H(NH) = 10,73 – 10,80 ppm) và proton của –OH cộng
hƣởng ở vùng trƣờng mạnh hơn (H(OH) = 9,01 – 9,05 ppm).
- Ngoài các proton trên khung cấu trúc chung phổ đồ cũng xuất hiện đủ và
có hình dạng tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng cho các nhóm thế. Cụ thể,
proton nhóm –CH3 trong các chất Ie, IIe, IIIe luôn xuất hiện tại vị trí cộng
hƣởng 2,24 – 2,26 ppm với hình dạng singlet và độ lớn 3 proton. Proton
nhóm –OCH3 trong các chất If, IIf, IIIf luôn xuất hiện tại vị trí cộng hƣởng
3,72 – 3,74 ppm với hình dạng singlet và độ lớn 3 proton. Bốn proton của
vòng dioxolan chia làm hai vân cộng hƣởng multiplet nằm trong khoảng
4,37 – 4,44 ppm và khoảng 4,30 – 4,39 ppm. Ba proton của nhóm =NOCH3
của các chất dãy IIIa-g có vị trí cộng hƣởng nằm trong khoảng 4,23 – 4,27
ppm với hình dạng singlet và độ lớn là 3 proton.
4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất IVa-c, Va-g, VIa-g,
VIIa-g, VIIIa-g

Các proton phần khung chung và các proton đặc trƣng cho các nhóm chức
của các chất đều thể hiện trên phổ đồ phù hợp với công thức dự kiến.
- Các dẫn chất trong năm dãy gồm IV - VIII đều có phần khung indolin và
các nhóm thế trên khung tƣơng tự nhau. Các proton đặc trƣng trên khung
indolin của các chất có các vị trí cộng hƣởng tƣơng tự nhau giữa các dãy và
khá tƣơng đồng với các proton khung indolin đã đƣợc biện luận ở dãy I.
- Proton của khung triazol H-5’ trong các dẫn chất đƣợc đặc trƣng bởi một
tín hiệu cộng hƣởng singlet và có độ dịch chuyển hóa học khá cố định trong
khoảng 8,02 – 8,10 ppm. Thêm vào đó, trên phổ cộng hƣởng từ dị hạt nhân
HMBC của chất VIIa cũng cho thấy C-5’ có tƣơng tác ghép cặp với hai
nhóm methylen bên cạnh ở vị trí 6, 6’. Nhƣ vậy, quá trình đóng vòng Click
để tổng hợp các dẫn chất này cũng chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất là
vòng triazol thế ở vị trí 1,4.
12


- Hai proton của nhóm methylen cầu nối vị trí 6’ có độ dịch chuyển hóa học
khoảng δH-6’ = 4,95 - 4,98 ppm, ngoại trừ các dẫn xuất có nhóm thế 7”-Cl có δH6’ = 5,31 ppm do ảnh hƣởng hiệu ứng hút electron của nhóm -Cl.
- Các proton của phần mạch alkyl đƣợc đặc trƣng bởi các tín hiệu cộng
hƣởng triplet hoặc multiplet nằm trong khoảng 4,28 - 1,17 ppm.
- Các proton của nhóm thế -CH3 và -OCH3 cũng xuất hiện đầy đủ trên các phổ
đồ của các dẫn chất tƣơng ứng với δH(CH3) = 2,27 ppm và δH(OCH3) = 3,72 ppm.
- Ba proton của hai nhóm -NOH và -NHOH đều là các proton rất linh động,
xuất hiện trên phổ ở vùng trƣờng thấp và có dạng phổ singlet giãn rộng khá
giống nhau. Căn cứ theo tài liệu tham khảo và sự biến mất của các pic vùng
trên 13 ppm ở những chất không có -NOH, các proton này đƣợc xác định có
độ dịch chuyển hóa học là δH(NOH) = 13,43 - 13,84 ppm, δH(NH) = 10,34 10,48 ppm, δH(OH) = 8,63 - 8,82 ppm. Thêm vào đó, phổ HMBC của chất
VIIa cũng cho thấy proton ở vị trí 13,47 ppm (NOH) có tƣơng tác ghép cặp
với C-3” trên khung indolin và proton ở vị trí 10,31 ppm (NH) có tƣơng tác
ghép cặp với C-1 ở phần nhóm chức acid hydroxamic.

4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất IXa-g và Xa-c
Phổ cộng hƣởng từ proton 1H-NMR:
- Các dẫn chất trong năm dãy gồm IX - X đều có phần khung indolin và
các nhóm thế trên khung tƣơng tự nhau. Các proton đặc trƣng trên khung
indolin của các chất có các vị trí cộng hƣởng tƣơng tự nhau giữa các dãy và
khá tƣơng đồng với các proton khung indolin đã đƣợc biện luận ở dãy I, II.
- Khung benzen trong phần cầu nối của dãy chất IX và X tƣơng tự nhƣ
phần cầu nối của các chất dãy I, II, III. Và vị trí cộng hƣởng cũng nhƣ hình
dạng tín hiệu cộng hƣởng của các cặp proton 2’, 6’ và 3’, 5’ cũng tƣơng
tƣơng giữa các dãy chất. Độ dịch chuyển hóa học của proton 2’, 6’ và 3’, 5’
nằm trong các khoảng lần lƣợt là 7,52 – 7,54 và 7,25 – 7,29 ppm. Tín hiệu
cộng hƣởng của hai cặp proton đều có dạng doublet với JH2’-H3’(ortho) = JH3’H2’(ortho) = 7,5 – 8,5 Hz.
- Hai proton của vùng cầu nối -CH=CH- có vị trí cộng hƣởng nằm trong
các khoảng là δH2 = 6,44 – 6,45 ppm, δH3 = 7,41 – 7,43 ppm. Hằng số ghép
cặp giữa H-2 và H-3 có giá trị khoảng 15,5 – 16,0 Hz, đặc trƣng cho cấu
hình trans của nối đôi.
- Cấu trúc của các chất dãy IX, X có hai cầu nối methylen và do ảnh
hƣởng khác nhau bởi các nhóm thế bên cạnh nên hai cụm proton methylen
có vị trí cộng hƣởng rất khác nhau. Hai proton của methylen vị trí 7’ có độ
dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 5,56 – 5,57 ppm. Hai proton của
methylen vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 4,98 – 5,32
ppm. Hai proton của mỗi nhóm methylen đều tƣơng đƣơng nên tín hiệu
cộng hƣởng có dạng singlet.
13


- Vòng triazol có một proton luôn xuất hiện ở dạng một tín hiệu cộng hƣởng
singlet và có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 8,11 – 8,15 ppm. Trên
phổ HMBC của chất IXa, carbon vị trí 5” trên vòng triazol (C-5”) thể hiện
tƣơng tác rõ ràng với hai cặp proton của hai cầu nối bên cạnh H-6” và H-7’. Dữ

liệu này kết hợp với 1 tín hiệu cộng hƣởng duy nhất của H-5” là cơ sở để khẳng
định phản ứng đóng vòng Click chỉ tạo ra 1 sản phẩm duy nhất theo hƣớng các
mạch nhánh gắn vào vị trí 1,4 của vòng triazol.
- Bên cạnh đó, các proton của nhóm -CH3, -OCH3 và -NOCH3 cũng xuất
hiện đầy đủ trên các phổ đồ của các dẫn chất ở các khoảng tƣơng ứng là
2,26 - 2,27 ppm 3,84 ppm và 4,20 - 4,23 ppm. Các proton của nhóm chức
acid hydroxamic có vị trí hấp thụ lần lƣợt trong các khoảng δH(NH) = 10,7510,77 ppm, δH(OH) = 9,04 - 9,05 ppm.
Phổ cộng hưởng từ carbon 13C-NMR:
- Cấu trúc của các chất có hai nguyên tử carbon của nhóm carbonyl, có vị
trí cộng hƣởng ở vùng trƣờng thấp nhất trên phổ đồ, độ dịch chuyển hóa
học nằm trong khoảng 158,72 - 172,82 ppm.
- Các carbon của khung indolin, vòng benzen, cầu nối -CH=CH- có vị trí
cộng hƣởng nằm ở khoảng giữa từ 109,92 - 156,82 ppm.
- Carbon của các cầu nối methylen và mạch nhánh alkyl có độ dịch chuyển
hóa học nằm trong khoảng 22,01 - 49,33 ppm.. Dãy II, III, X có thêm
nhóm =NOCH3 và vòng dioxolan với độ dịch chuyển hóa học của các
carbon khoảng 64,48 - 66,83 ppm.
- Phổ đồ các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hƣởng của các carbon có trên
nhóm thế -CH3 ( = 20,46 – 20,97 ppm), -OCH3 ( = 55,63 – 55,68 ppm).
Riêng các chất có nhóm thế F còn xuất hiện thêm tƣơng tác từ của F với các
carbon lân cận trên khung indolin làm tách đôi một số pic.
4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC
4.3.1. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy dẫn chất Ia-g và IIa-g
Hình 4.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g

14


Trong thứ nghiệm Western blot (Hình 4.1), khi nồng độ acetyl-histon H3
và H4 xuất hiện rõ ràng khi có mặt các chất Ia, Ib, Id-f, IIa-c, IIe-f gợi ý

rằng các chất này có khả năng ức chế HDAC mạnh. Khi có mặt chất Ic, IId,
acetyl-histon H3 và H4 cũng xuất hiện nhƣng mức độ thấp hơn nhiều. Gợi ý
rằng chất Ic, IId cũng có khả năng ức chế HDAC nhƣng yếu hơn các chất
kể trên. Riêng với vị trí trên Hình 4.1 tƣơng ứng với thí nghiệm có mặt Ig
và IIg, hầu nhƣ không thấy sự xuất hiện của acetyl-histon H3 và H4. Chứng
tỏ HDAC không bị ức chế và quá trình deacetyl hoá vẫn diễn ra ở nồng độ
thử nghiệm. Kết quả thí nghiệm Western blot nhìn chung cho thấy sự ảnh
hƣởng khác nhau của các nhóm thế trên vòng indolin đối với hoạt tính ức
chế enzym, các chất có nhóm thể Cl ở vị trí số 7 có thể không có hoạt tính
ức chế enzym tốt bằng các dẫn xuất khác.
Bảng 4.1: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất Ia-g và IIa-g
Độc tính trên tế bào ung thư
Kết quả
(IC50, M)
docking
Chất
R
LogP
SW620
PC3
AsPC-1 (kcal/mol)
Ia
H
2,11
2,26
1,33
0,95
-9,40
Ib
5-F

2,27
0,91
1,29
1,46
-9,00
Ic
5-Cl
2,67
0,90
0,47
0,81
-9,00
Id
5-Br
2,94
1,41
0,91
0,63
-9,10
Ie
5-CH3
2,60
1,93
1,20
0,83
-8,30
If
5-OCH3 1,98
2,46
1,13

0,68
-9,00
7-Cl
Ig
-8,90
2,67
2,24
1,94
1,68
H
IIa
2,37
1,96
1,14
1,23
-8,60
5-F
IIb
2,53
0,71
0,93
0,56
-8,60
5-Cl
IIc
2,93
1,10
0,88
0,82
-8,40

5-Br
IId
3,20
0,80
0,81
1,11
-8,30
5-CH3
IIe
2,86
1,23
1,37
1,79
-8,60
5-OCH3 2,25
IIf
5,25
4,31
4,55
-8,30
7-Cl
IIg
2,93
3,15
4,54
3,58
-8,40
SAHA
1,44
3,26

1,75
3,19
-7,40
Dữ liệu trong Bảng 4.1 chỉ ra rằng trừ chất IIf, IIg, các chất còn lại đều
có độc tính tế bào tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào
thử nghiệm. Chất Ia và IIa có độc tính tế bào tƣơng đƣơng nhau, cho thấy
việc methyl hoá nhóm oxim trên indolin vẫn duy trì đƣợc hoạt tính sinh học
tốt. Các nhóm thế hút electron (-F, -Cl, -Br) đƣợc thế vào vị trí 5 trên vòng
15


indolin (chất Ib-d, IIb-d) dƣờng nhƣ làm tăng độc tính tế bào, trong khi đó
thế nhóm hút electron (-Cl) vào vị trí 7 (chất Ig, IIg) làm giảm rõ rệt hoạt
tính kháng tế bào ung thƣ. Ngƣợc lại, với hai nhóm đẩy electron methyl và
methoxy, nhóm thế methyl có tác dụng làm tăng nhẹ hoạt tính sinh học (so
sánh Ie, IIe với chất Ia, IIa), nhƣng nhóm thế methoxy không thể hiện tác
dụng này, thậm chí nhóm thế methoxy gắn trên khung 3-methoxim-2oxoindolin còn làm giảm độc tính đáng kể so với chất không nhóm thế.
Nhìn chung, với kết quả thu đƣợc có thể khẳng định rằng các acid
hydroxamic mang khung 3-oxim/methoxim-2-oxoindilin là những chất có
tiềm năng ức chế HDAC tốt và tác dụng độc tính tế bào rất khả quan. Độc
tính của các chất đa số tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn so với SAHA, hứa hẹn
khả năng phát triển khung cầu trúc này nhằm tìm kiếm các chất ức chế
HDAC tiếp theo.
4.3.2. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy chất IIIa-g
Trong thử nghiệm Western blot có 6 trong 7 chất thể hiện tác dụng ức
chế HDAC dẫn đến xuất hiện các vết acetyl-H3 và H-4. Chất IIIg với nhóm
thế -Cl ở vị trí số 7 trên khung indolin không thể hiện tác dụng ức chế
HDAC ở nồng độ thử nghiệm. Trong khi đó, chất IIIc cũng mang nhóm thế
-Cl nhƣng ở vị trí số 5 vẫn có tác dụng ức chế enzym rõ rệt. Nhƣ vậy, vị trí
nhóm thế có thể là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến tác dụng sinh học của các chất

và vị trí số 7 trên khung indolin có thể không phù hợp để gắn các nhóm thế.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả thử độc tính tế bào. Trong đó, trên cả
3 dòng tế bào chất IIIg đều có tác dụng yếu nhất trong cả dãy chất và nồng
độ cần để gây độc tính đƣợc trên 50% các tế bào ung thƣ cũng khá cao. Với
dãy dẫn chất này, kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào
cũng khá tƣơng đồng ở cả các chất còn lại. Kết quả thử Weston blot cho
thấy vết acetyl-H3 và acetyl-H4 của SAHA xuất hiện rõ nét hơn cả 7 chất
IIIa-g. Giá trị IC50 khi thử nghiệm trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và
PC3 của SAHA cũng tƣơng ứng thấp hơn tất cả các chất IIIa-g, thể hiện
độc tính của SAHA mạnh hơn cả 7 chất dãy IIIa-g. Khi so sánh giữa các
chất với nhau không nhận thấy có xu hƣớng khác biệt rõ ràng giữa các
nhóm thế hút và đẩy electron, hay kích thƣớc nhóm thế. Khi so sánh kết quả
16


thử độc tính tế bào của dãy IIIa-g với hai dãy Ia-g, IIa-g có thể thấy rõ sự
suy giảm độc tính. Tất cả các chất của dãy IIIa-g đều yếu hơn các chất của
dãy Ia-g, IIa-g. Vị trí số 3 trên khung indolin có thể không phù hợp với
khung vòng lớn nhƣ spiro[1,3]-dioxolan.
Bảng 4.2: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất IIIa-g
Độc tính trên tế bào ung
Kết quả
thư,
(IC
,
M)
docking
Chất
R
LogP

50
(kcal/mol)
SW620
PC3 AsPC-1
IIIa
H
2,36
3,60
18,89
18,45
-9,80
IIIb
5-F
2,51
3,30
11,50
7,28
-9,90
IIIc
5-Cl
2,91
3,42
17,44
22,35
-9,90
IIId
5-Br
3,18
3,05
7,30

6,83
-9,90
IIIe
5-CH3
2,84
3,44
12,25
7,47
-9,70
IIIf 5-OCH3
2,23
4,62
22,70
27,25
-9,90
IIIg
7-Cl
2,91
38,35
>100
69,51
-9,60
SAHA
1,44
1,44
5,30
7,04
-7,40
4.3.3. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g
Các dãy dẫn chất này đƣợc tạo từ hai phần cấu trúc chính là khung 3(hydroxyimino)-2-oxoindolin đóng vai trò nhóm nhận diện bề mặt và cầu

nối mang vòng triazol và mạch carbon no với độ dài thay đổi từ 2C-4C.
Dựa vào chiều dài cầu nối 6C của SAHA, đầu tiên luận án thiết kế khoảng
cách giữa vòng triazol và nhóm chức acid hydroxamic là 2C. Nhƣng do liên
kết C=N và C-N có độ dài ngắn hơn liên kết C-C nên cầu nối có thể cần dài
hơn 2C. Do đó, luận án thiết kế thêm dãy dẫn chất Va-g với khoảng cách
tăng lên là 3C, đây là dãy chất mục tiêu nghiên cứu. Cùng với đó, dãy chất
VIa-g với khoảng cách 4C cũng đƣợc thiết kể để so sánh kết quả với dãy
Va-g. Nhìn chung dãy chất Va-g có hoạt tính ức chế enzym cao hơn dãy
VIa-g. Một xu hƣớng tƣơng tự cũng đƣợc nhận thấy với khả năng gây độc
tế bào khi so sánh giữa hai dãy chất Va-g và VIa-g. Độc tính tế bào của dãy
IVa-c đặc biệt yếu hơn hẳn so với cả hai dãy Va-g và VIa-g. Nhƣ vậy, từ
kết quả thực nghiệm cho thấy, khi khung 4-methyl-1H-1,2,3-triazol đóng
vai trò là một phần cấu trúc của cầu nối thì một mạch alkyl dài 3C là phù
hợp nhất cho hoạt tính sinh học.

17


Bảng 4.3: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào
của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g
Độc tính trên tế bào ung Tác dụng Kết quả
ức chế docking
thư, IC50 (µM)
Chất
R
LogP
HDAC2 (kcal/mol)
SW620 PC3 AsPC-1 (IC , M)
5i0

IVa
H
0,41
29,0
>30
>30
1,70
-7,40
IVb
5-F
0,61
>30
>30
>30
6,24
-7,60
IVc
5-Cl
1,05
>30
>30
>30
2,80
-7,70
Va
H
0,90
26,26
>30
26,87

6,16
-7,50
Vb
5-F
1,10
23,64
>30
>30
8,27
-7,70
Vc
5-Cl
1,54
13,46 16,28 11,60
1,72
-7,80
Vd
5-Br
1,79
2,93
6,08
3,01
3,53
-7,80
Ve
5-CH3 1,44
0,73
0,76
0,49
1,28

-8,10
Vf
5-OCH3 0,98
1,61
1,74
1,49
0,91
-7,40
Vg
7-Cl
1,54
10,58
9,27
12,90
5,08
-7,90
VIa
H
1,39
>30
>30
>30
4,87
-6,70
VIb
5-F
1,59
>30
>30
>30

26,64
-7,00
VIc
5-Cl
2,03
9,16
4,69
4,51
2,65
-7,10
VId
5-Br
2,28
5,64
3,42
4,43
2,16
-7,00
VIe
5-CH3 1,94
>30
>30
>30
3,52
-7,40
VIf 5-OCH3 1,47
>30
>30
>30
4,15

-7,40
VIg
7-Cl
2,03
>30
>30
>30
4,77
-7,20
SAHA
1,44
3,20
3,70
3,75
1,06
-7,40
4.3.4. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất VIIa-g và VIIIa-g
Khả năng ức chế HDAC2 của đa số các chất dãy VIIa-g và VIIIa-g
tƣơng đƣơng với SAHA. Dãy các chất VIIIa-g có tác dụng ức chế enzym
mạnh hơn so với dãy các dẫn chất VIIa-g. Về khía cạnh độc tính tế bào, các
chất mang cầu nối giữa acid hydroxamic và hợp phần 1-((1H-1,2,3-triazol4-yl)methyl)-3-hydroxyimino-2-oxoindolin có độ dài 6C (VIIIa-g) có độc
tính tế bào cao hơn hẳn so với các chất có cầu nối 5C (VIIa-g). Khi so sánh
tác dụng sinh học của hai dãy VIIa-g, VIIIa-g với ba dãy IVa-c, Va-g,
VIa-g có thể thấy rõ sự cải thiện cả về khả năng ức chế HDAC2 cũng nhƣ
độc tính tế bào. Tuy nhiên, so với kết quả tác dụng sinh học của những dãy
18


dẫn chất khác trong luận án, hai dãy dẫn chất này không phải là các chất có
tiềm năng ức chế tế bào ung thƣ mạnh. Trong 14 chất của hai dãy VIIa-g và

VIIIa-g, chỉ có 3 chất bao gồm VIIIc, VIIId và VIIIe thể hiện tác dụng
độc tính trên các dòng tế bào thử nghiệm ở mức dƣới micro mol, nhƣng các
giá trị này cũng chỉ tƣơng đƣơng với chất đối chứng dƣơng tính là SAHA.
Bảng 4.4: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào
của các dãy dẫn chất VIIa-g, VIIIa-g
Ký
hiệu
chất

R

LogP

Độc tính trên tế bào ung thư
Ức chế Kết quả
IC50 (µM)
HDAC2 docking
SW620 PC3 AsPC-1 NCI-H23 (IC50, M) (kcal/mol)

H
1,88
VIIa
9,80 7,49 5,72 10,47
1,77 -7-7,100
2,08 11,40 9,04 7,12
VIIb 5-F
8,40
1,87
-7,20
5-Cl

2,52
VIIc
7,03 3,74 7,99 12,49
1,06
-7,30
2,77 19,74 10,50 14,87 13,74
VIId 5-Br
0,93
-7,30
VIIe 5-CH3 2,43 14,13 7,94 9,13
8,67
1,06
-7,60
VIIf 5-OCH3 2,77 13,87 8,47 6,01 13,69
1,96
-7,00
7-Cl
2,52
VIIg
43,31 15,68 16,59 32,20
6,15
-7,40
H
2,37
VIIIa
9,19 6,23 5,43 11,07
0,93
-7,80
2,57
VIIIb 5-F

7,47 10,21 7,42 13,60
1,41
-7,10
3,02
VIIIc 5-Cl
3,64 4,15 3,25
5,06
1,09
-7,80
3,26
VIIId 5-Br
3,00 2,47 2,62
3,61
1,23
-7,20
VIIIe 5-CH3 2,92
2,52 1,95 3,15
2,10
0,75
-7,50
VIIIf 5-OCH3 2,45
7,71 4,54 3,67
5,67
1,42
-7,90
3,02
VIIIg 7-Cl
9,15 7,87 5,54
5,61
1,14

-7,30
SAHA
1,44
3,20
3,70
3,75
3,18
1,06
-7,40
4.3.5. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c
So sánh với kết quả hoạt tính sinh học của hai dãy VIIa-g và VIIIa-g,
hai dãy dẫn chất IXa-g, Xa-c có độc tính tế bào mạnh hơn trên cả 3 dòng tế
bào ung thƣ SW620, PC-3 và AsPC-1. Trong hai dãy chất này, có 5 chất
(IXc, g, Xa-c) thể hiện độc tính mạnh hơn SAHA, 2 chất (IXd, f) thể hiện
độc tính tƣơng đƣơng SAHA, các chất còn lại chỉ thể hiện độc tính yếu hơn
SAHA không quá nhiều. Đáng chú ý, với dãy dẫn chất này bản chất nhóm
thế là hút hay đẩy electron và vị trí nhóm thế đều ảnh hƣởng ít nhiều đến
hoạt tính kháng ung thƣ của các chất (khi so sánh IXb-g với IXa, so sánh
Xb-c với Xa). Có sự khác biệt về ảnh hƣởng của vị trí nhóm thế trong dãy
các chất IXa-g so với dãy VIIa-g, VIIIa-g. Trong dãy dẫn chất này nhóm
19


Cl (chất IXg) gắn ở vị trí số 7 giúp gia tăng hoạt tính sinh học nhiều hơn
khi gắn ở vị trí số 5. Chất IXg là chất có độc tính tế bào mạnh nhất trong
dãy, mạnh hơn 5-6 lần so với SAHA trên bốn dòng tế bào thử nghiệm (IC 50
= 0,62 đến 0,83 µM so với IC50 của SAHA là từ 3,18 đến 3,75 µM).
Bảng 4.5: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của các
dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c
Độc tính trên tế bào ung thư Tác dụng

IC50 (µM)
ức chế Kết quả
Chất
R LogP
HDAC2 docking
NCISW620 PC3 AsPC-1 H23 IC , M kcal/mol
50
H
2,45 7,59 8,01
IXa
4,39
6,21
1,33
-9,70
2,65 7,28 5,68
IXb 5-F
5,39
5,30
1,30
-9,90
5-Cl
3,09
IXc
2,31 2,40
2,44
2,14
5,53
-9,80
3,34 3,46 5,64
IXd 5-Br

4,54
3,65
2,42
-9,50
5-CH
2,99
IXe
3
5,19 3,37
4,09
4,23
1,79
-9,70
IXf 5-OCH3 2,53 3,04 3,74
4,48
3,78
2,26
-9,60
7-Cl
3,09
IXg
0,65 0,83
0,59
0,62
1,29
-9,10
H
2,42 1,02 1,39
Xa
1,30

1,85
0,81
-9,40
2,62 1,58 1,22
Xb 5-F
1,51
1,20
0,60
-9,60
3,07 0,34 0,41
Xc 5-Cl
0,62
1,11
1,86
-9,48
SAHA
1,44 3,20 3,70
3,75
3,18
1,06
-7,40
Trong dãy Xa-c, chất Xc mang nhóm thế Cl ở vị trí 5, cũng thể hiện
hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tƣơng đƣơng với IXg. Đặc biệt chất Xc thể
hiện độc tính mạnh gấp khoảng 10 lần so với SAHA và là chất mạnh nhất
trong tất cả các dãy chất tổng hợp đƣợc. Tổng hợp các kết quả thu đƣợc của
các dãy đã tổng hợp chƣa đủ để phác thảo về mối liên hệ giữa độc tính tế
bào của các chất và khả năng ức chế enzym HDAC2 của chúng, một vài
yếu tố vẫn còn đang đƣợc tìm hiểu. Tuy nhiên, đa số kết quả đều ủng hộ
cho giả thiết là ức chế HDAC2 là cơ chế nổi bật trong khả năng gây độc tế
bào của các chất và gợi ý rằng ức chế một số HDAC khác cũng có đóng

góp quan trọng trong độc tính tế bào tổng của các chất. Để kiểm tra giả thiết
này, luận án chọn một chất đại diện là Xc để tiếp tục nghiên cứu đánh giá
khả năng ức chế 3 loại HDAC khác gồm HDAC1, 6 và 8. Kết quả cho thấy,
khả năng ức chế HDAC1 của Xc cao gấp khoảng 10 lần so với khả năng ức
chế HDAC2 (IC50 với HDAC1 là 0,19 µM so với HDAC2 có IC 50 là 1,86
µM). SAHA ức chế HDAC1 yếu hơn Xc khoảng 2 lần (IC50 là 0,35 µM).
20


Trong khi đó, khả năng ức chế HDAC6 và HDAC8 của Xc và SAHA là
tƣơng đƣơng nhau (IC50 của Xc lần lƣợt là 0,25 và 1,21 µM, IC50 của
SAHA là 0,41 và 1,65 µM). Chất IXg có cấu trúc tƣơng tự chất Xc và độc
tính tế bào trên các tế bào ung thƣ cũng tƣơng đƣơng, là cơ sở để giả thiết là
khả năng ức chế các HDAC khác nhau của IXg cũng tƣơng tự Xc.
Bảng 4.6: Kết quả thử tác dụng ức chế các loại enzym HDAC khác nhau của Xc
Tác dụng ức chế enzym (IC50, M)
Chất
HDAC1 HDAC2 HDAC6 HDAC8
0,19
1,86
0,25
1,21
Xc
SAHA 0,35
1,06
0,41
1,65
Nhằm thăm dò khả năng phát triển tiếp theo của các chất, luận án tiến
hành đánh giá độc tính trên tế bào thƣờng của 4 chất đại diện là IXg, Xa-c.
Thử nghiệm độc tính trên tế bào thƣờng cũng đƣợc tiến hành theo phƣơng

pháp SRB trên tế bào phổi MRC-9. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 4.7
là giá trị IC50 của 4 chất thử nghiệm trên dòng tế bào thƣờng MRC-9 và tỷ
lệ đánh giá độ chọn lọc tế bào ung thƣ (SW620, PC3, AsPC-1, NCI-H23) so
với tế bào thƣờng MRC-9. Kết quả cho thấy trên ba dòng tế bào ung thƣ
(SW620, PC3, AsPC-1), cả bốn chất đều thể hiện độc tính trên tế bào ung
thƣ nhiều hơn trên tế bào thƣờng với độ chọn lọc từ 1,32 đến 3,79 lần. Trên
dòng tế bào ung thƣ phổi MRC-9, IXg và Xb đều ít độc trên tế bào thƣờng
hơn trên tế bào ung thƣ từ 2 đến 3 lần. Chỉ có 2 chất là Xa và Xc là thể hiện
độc tính trên tế bào ung thƣ MCR-9 tƣơng đƣơng với độc tính trên tế bào
thƣờng. Trong khi đó, SAHA thể hiện mức độ độc tính chọn lọc với các
dòng tế bào ung thƣ so với tế bào phổ thƣờng cũng tƣơng đối hạn chế, giá
trị về độ chọn lọc dao động từ 1,19 đến 1,40 lần.
Bảng 4.7: Kết quả thử tác dụng độc tính trên tế bào thường của một số chất
Ký
Độc tính trên
Chỉ số so sánh độc tính trên tế
hiệu
R
MRC-9
bào ung thư với tế bào thường *
SW620
PC3
AsPC-1 NCI-H23
chất
(IC50, µM)
7-Cl
1,79
2,76
2,17
3,03

2,89
IXg
H
1,83
1,79
1,32
1,40
1,00
Xa
5-F
2,44
1,54
2,00
1,62
2,03
Xb
5-Cl
0,92
2,71
2,24
1,48
0,83
Xc
4,46
1,39
1,21
1,19
1,40
SAHA
Ghi chú: * Chỉ số so sánh được tính bằng tỷ lệ giữa IC50 trên tế bào MRC-9 và IC50 trên tế

bào ung thư (SW620, PC3, AsPC-1, NCI-H23) của mỗi chất.

21


Từ các kết quả sinh học thu đƣợc, chất IXg và Xc cho thấy có nhiều
tiềm năng nhất với khả năng ức chế HDAC mạnh, độc tính tế bào cao và độ
chọn lọc tế bào ung thƣ so với tế bào thƣờng cao. Đặc biệt, Xc có độc tính
tế bào trên dòng tế bào SW620 gấp khoảng 10 lần so với SAHA. Nhận định
rằng sự thay đổi cấu trúc là một yếu tố lớn quyết định đến việc mở rộng
hoạt tính sinh học của các chất. Luận án quyết định nghiên cứu mô hình
liên kết của hai chất đại diện là IXg và Xc với cả 4 HDAC khác nhau đã
đƣợc đánh giá khả năng ức chế trƣớc đó là HDAC1, 2, 6 và 8.
Luận án đã tổng hợp đƣợc 10 dẫn chất acid hydroxamic dãy IXa-g và
Xa-c có tác dụng ức chế HDAC2 mạnh và độc tính tốt trên các dòng tế bào
ung thƣ thử nghiệm. Kết quả thu đƣợc, một lần nữa khẳng định rằng khung
3-hydroxyimino/methoxyimino-2-oxoindolin là một nhóm nhận diện bề mặt
tốt cho các acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC. Cùng với đó, các nhóm
thế khác nhau trên vòng benzen của khung 3-hydroxyimino/ methoxyimino2-oxoindolin và vị trí nhóm thế cũng có ảnh hƣởng để hoạt tính ức chế
enzym cũng nhƣ độc tính tế bào của các chất tổng hợp đƣợc. Bằng phƣơng
pháp áp dụng các hƣớng tiếp cận mới trong nghiên cứu phát triển thuốc
hiện đại cũng nhƣ thử nghiệm tính ức chế chọn lọc, chất Xc đƣợc xác định
là có khả năng ức chế HDAC1, HDAC2, HDAC8 (nhóm I) và HDAC6
(nhóm IIb) tƣơng đƣơng hoặc tốt hơn SAHA. Cuối cùng nghiên cứu ADME
in silico dự đoán cả hai chất đại diện IXg và Xc có độ hấp thụ và phân bố
phù hợp. Tuy nhiên, các chỉ số dự đoán về chuyển hoá và độc tính vẫn
nhiều vấn đề cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu tối ƣu hoá.
KẾT LUẬN:
a. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
Đã tổng hợp đƣợc 62 chất acid hydroxamic mới, cả 62 chất đều chƣa

đƣợc công bố trong bất kỳ tài liệu nào trƣớc đó. Các chất tổng hợp đƣợc có
cấu trúc đƣợc chia làm 3 nhóm chính:
+ Nhóm thứ nhất gồm 21 chất dãy Ia-g, IIa-g, IIIa-g: các chất này có
cấu trúc 2-oxoindolin là hợp phần chính của nhóm nhận diện bề mặt và
phần cầu nối giống nhau đều là khung cinnamamid.
+ Nhóm thứ hai gồm 31 chất dãy IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g:
các chất này có nhóm nhận diện bề mặt là khung 3-hydroxyimino-2oxoindolin và phần cầu nối mang khung 1,2,3-triazol kết hợp với một mạch
22


alkyl có độ dài thay đổi từ 2C đến 6C.
+ Nhóm thứ ba gồm 10 chất dãy IXa-g, Xa-c: các chất này có nhóm
nhận diện là khung 2-oxoindolin kết hợp với vòng 1,2,3-triazol qua một
nhóm methylen và phần cầu nối là khung cinnamamid.
Tất cả các chất tổng hợp đƣợc đều có cấu trúc đúng nhƣ thiết kế, đƣợc
chứng minh bằng các phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và HSQC.
b. Về tác dụng sinh học
Các chất đƣợc đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC bằng phƣơng
pháp Western blot (dãy I-III) hoặc xác định nồng độ ức chế 50% hoạt tính
của HDAC2 bằng phƣơng pháp định lƣợng huỳnh quang. Ngoại trừ chất
IIg, IIIg (không thể hiện tác dụng ức chế ở nồng độ 3 µg/ml), chất Ic, Ig,
IId, IIe, IIIf (thể hiện tác dụng yếu) và chất IVb, Va, Vb, Vd, Vg, VIa-b,
VIe-g, IXc có giá trị IC50/HDAC2 > 3 µM, 43 chất còn lại đều có tác dụng
ức chế enzym tƣơng đƣơng với SAHA.
Tất cả các chất đều đƣợc thử độc tính tế bào theo phƣơng pháp SRB
trên 3 - 4 dòng tế bào ung thƣ. Kết quả cho thấy ngoại trừ dãy IVa-g và
VIa-g có độc tính tế bào yếu, các dãy chất còn lại đều có độc tính tế bào tốt.
Dãy chất Ia-g và Xa-c có độc tính tế bào của tất cả các chất trong dãy đều
mạnh hơn SAHA. Chất Xc thể hiện khả năng kháng tế bào ung thƣ mạnh
nhất, có IC50 thấp hơn SAHA từ 3 đến 9 lần trên các dòng tế bào khác nhau.

Chất Xc có tác dụng nổi bật nên đƣợc lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn
bằng cách các định nồng độ ức chế 50% hoạt tính của các loại HDAC khác
là HDAC1, 6 và 8. Sau đó, chất Xc cùng với 3 chất là IXg, Xa, Xb đƣợc
thử nghiệm độc tính trên tế bào thƣờng. Kết quả cho thấy, cả 4 chất đều có
xu hƣớng gây độc chọn lọc tế bào ung thƣ hơn tế bào thƣờng.
Tóm lại, luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và đóng góp những
kết quả mới trong lĩnh vực nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thƣ
theo hƣớng ức chế enzym HDAC. Các kết quả thu đƣợc đều chứng minh
khung 2-oxoindolin phù hợp để làm nhóm nhận diện bề mặt và có tiềm
năng phát triển để tạo ra những chất ức chế HDAC có hoạt tính mạnh.

23