Thiết Lập Quy Trình Lên Men Vi Khuẩn Serratia Marcescens Để Sản Xuất Chế Phẩm Diệt Sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH LÊN MEN VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM DIỆT SÂU

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn :T.S NGUYỄN HOÀI HƢƠNG
Sinh viên thực hiện

: CAO THỊ THANH THÚY

MSSV: 1311101044

Lớp: 13DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự

hƣớng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hƣơng.
Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ
nguồn gốc.
TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Cao Thị Thanh Thúy


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho con xin gởi tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ, là
ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, giáo dục, động viên... là chỗ vựa tinh thần vững
chắc cho con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã để con có đƣợc
nhƣ ngày hôm nay.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu
sắc tới tập thể quý thầy cô giáo trong trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM nói
chung và các thầy cô giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi
Trƣờng, bộ môn Công Nghệ Sinh Học nói riêng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt
cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt, em xin đƣợc chân thành biết ơn cô TS. Nguyễn Hoài Hƣơng, ngƣời
thầy đáng kinh, cô đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hƣớng dẫn và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái
Khanh, anh Nguyễn Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ
án tại phòng thí nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng,
trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Cảm ơn tất cả các bạn đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thời gian
học tập tại trƣờng. Cảm ơn chị Vũ Hoàng Minh Ngọc, bạn Trƣơng Hoài Nguyên,
bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, bạn Lê Thị Thu đã đồng hành chia sẻ buồn vui cùng em trong
suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Cao Thị Thanh Thúy


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................ 1
2. Mục đích của nghiên cứu .............................................................................. 1
3. Nhiệm vụ của nghiên cứu.............................................................................. 2
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ................................................................... 2
5. Kết cấu của đồ án .......................................................................................... 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1.

Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............................................. 3

1.1.1.

Hợp chất thứ cấp ..................................................................................... 3

1.1.2.

Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........ 3

1.2.

Giới thiệu về Prodigiosin ........................................................................... 5

1.2.1.

Khái niệm về Prodigiosin ..................................................................... 5

1.2.2.

Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin ................................................. 6

1.2.3.

Hoạt động sinh học của Prodigiosin.................................................... 9

1.2.4.

Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens ..................... 10

1.3.

Giới thiệu về Serratia marcescens .......................................................... 14

1.3.1.

Lịch sử phát hiện ................................................................................ 14

1.3.2.

Phân loại khoa học của Serratia marcescens .................................... 15

1.3.3.

Đặc điểm của Serratia marcescens .................................................... 15

1.4.

Một số hợp chất đƣợc tổng hợp từ Serratia marcescens ........................ 19

1.4.1.

Sắc tố .................................................................................................. 19

1.4.2.

Biosurfactant ...................................................................................... 20

1.4.3.

Acid béo .............................................................................................. 20

1.4.4.

Enzyme................................................................................................ 20

i


Đồ án tốt nghiệp

1.4.5.

Yếu tố động lực của Serratia marcescens .......................................... 21

1.5.

Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ............................................ 22

1.6.

Điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens
24

1.7.

Thu nhận và tinh sạch prodigiosin ......................................................... 27

1.8.

Một số nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 30

1.8.1.

Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ...................................... 30

1.8.2.

Tình hình nghiên cứu prodigiosin ..................................................... 30

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 33
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 34

2.1.1.

Thời gian. ........................................................................................... 34

2.1.2.

Địa điểm.............................................................................................. 34

2.2.

Vật liệu – hóa chất – thiết bị .................................................................... 34

2.2.1.

Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens ................................................ 34

2.2.2.

Môi trường nuôi cấy và hóa chất. ...................................................... 34

2.2.3.

Dụng cụ, thiết bị ................................................................................. 35

2.3.

Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................... 36

2.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................... 41

2.4.1.

Phương pháp chọn lọc chủng Serratie marsescens có khả năng tổng

hợp prodigiosin và enzyme ngoại bào mạnh nhất. ......................................... 41
2.4.2.

Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường nhân giống .................. 44

2.4.3.

Phương pháp khảo sát thiết lập môi trường lên men và chế độ lên

men

44

2.4.4.

Phương pháp phân tích ...................................................................... 47

Mục đích ........................................................................................................... 47
Nội dung ........................................................................................................... 47
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 48
3.1.

Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme

ngoại bào và prodigiosin cao nhất .................................................................... 48

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.1.1.

Khả năng tiết enzyme ngoại bào ........................................................ 48

3.1.2.

Trích ly thu prodigiosin ...................................................................... 52

3.1.3.

So sánh hình thái, sinh lý, khả năng tiết enzyme ngoại bào của

chủng SH4 với chủng SH1 (ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013) ............ 54
3.2.

Thiết lập môi trƣờng nhân giống ............................................................ 56

3.3.

Thiết lập môi trƣờng lên men và chế độ lên men................................... 58

3.3.1.

Thiết lập môi trường lên men ............................................................ 58

3.3.2.

Thiết lập chế độ lên men .................................................................... 64

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 70
1. Kết luận ........................................................................................................ 70
2. Kiến nghị ...................................................................................................... 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 70
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 76
A.

PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ,

PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................................................... 76
B.

PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH ........................................................................ 82

C.

PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ ...................................................... 87

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
EPN: Entomopathogenic nematodes
OD: mật độ quang (Optical Density)
λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại
LMTL: lên men tiếp liệu
PG: peptone glycerol
PGTL: peptone glycerol tiếp liệu
MT1: môi trƣờng 1
MT2: môi trƣờng 2

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008) .......... 6
Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) ........................................... 7
Hình 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009) ............ 9

Hình 1.4 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ
Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) ................................. 11
Hình 1.5 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. .......... 13
Hình 1.6 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens. ....... 16
Hình 1.7 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi (Gillen và
Gibbs, 2011) ............................................................................................................ 16
Hình 1.8 Cơ chế gây bệnh của enzyme Serralysin metalloprotease của
S.marcescens đối với ấu trùng tằm (K Ishii et al; 2014). ......................................... 23
Hình 1.9 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens đƣợc ghi nhận bởi Sundaramoorthy và cộng sự (2009) .......... 27
Hình 1.10 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodiosin bởi
Serratia sp. BTWJ8 đƣợc ghi nhận bởi Krishna (2008) .......................................... 27
Hình 2.1 Quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm
prodigiosin thô. ....................................................................................................... 37
Hình 2.2 Quy trình chọn lọc chủng vi sinh vật. ....................................................... 38
Hình 2.3 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 ...................................................................................................... 39
Hình 2.4 Quy trình khảo sát thiết lập môi trƣờng lên men vi khuẩn Serratia
marcescens SH4 ...................................................................................................... 40
Hình 2.5. Quy trình trích ly thu prodigiosin từ dịch lên men vi khuẩn .................... 43
Hình 2.6 Quy trình tiếp liệu glycerol ....................................................................... 46
Hình 3.1 Khả năng tiết ezyme protease của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB ........................................................................................................................... 49
Hình 3.2 Khả năng tiết ezyme lipase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB
................................................................................................................................ 50
Hình 3.3 Khả năng tiết ezyme chitinase của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và
HB. .......................................................................................................................... 51
Hình 3.4 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499) và tế bào (OD 620) của các
chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB. ................................................................... 53

Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc của chủng SH4 và SH1 ............................................. 54
Hình 3.6 Kết quả nhuộm Gram hai chủng SH1 và SH4 .......................................... 55
Hình 3.7 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của hai chủng SH4 và SH1 ................... 55
Hình 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 theo thời
gian trên các môi trƣờng nhân giống khác nhau. ..................................................... 57
Hình 3.9 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ....... 60

v


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.10 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 61
Hình 3.11 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 63
Hình 3.12 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc
môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65
Hình 3.13 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh và OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn
S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men peptone glycerol tại các nồng độ tiếp
liệu glycerol theo thời gian. ..................................................................................... 67
Hình 3.14 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD 499 nm) của vi khuẩn
S.marcescens SH4 trên môi trƣờng lên men PG ở các nồng độ tiếp liệu tại 48h. (số
liệu thô xem ở bảng 5 - phụ lục A và hình 9 - phụ lục B) ....................................... 68

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............ 4
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) . 8
Bảng 1.3 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens ................................. 17
Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ..... 25
Bảng 1.5 Một số bằng sáng chế về prodigiosin ....................................................... 32
Bảng 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescens SH4, SH5
và HB. ..................................................................................................................... 51
Bảng 3.2 Giá trị OD hiệu chỉnh của sắc tố (OD499nm) , tế bào (OD620nm) sau xử lý
acid và (OD535nm) sắc tố sau trích ly của các chủng S.marcescens SH4, SH5 và HB.
................................................................................................................................ 53
Bảng 3.3 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng SH4 và SH1......................... 56
Bảng 3.4 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng nhân giống theo thời gian. .................................................................... 57
Bảng 3.5 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống MT2 theo thời gian. ........ 59
Bảng 3.6 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 61
Bảng 3.7 Biến thiên OD499nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên các
môi trƣờng lên men đƣợc cấy từ môi trƣờng nhân giống PG theo thời gian............ 62
Bảng 3.8 Biến thiên OD620nm hiệu chỉnh của vi khuẩn S.marcescens SH4 trên đƣợc
môi trƣờng lên men PG tại các nồng độ tiếp liệu glycerol theo thời gian. ............... 65

vii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Prodigiosin là một sắc tố đỏ có bản chất là một alkaloid, và có hoạt tính kháng
vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều
quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ
thực vật cũng nhƣ hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và
Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng
sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia
và cộng sự, 1997). Prodigiosin đƣợc tìm thấy trong quá trình lên men của một số
loài vi sinh vật nhƣ Alteromonas rubra Moss, 2002 ; Rugamonas rubra Gerber,
1975; Serratia rubidaea Moss, 2002; Streptoverticillium rubrireticuli Gerber, 1975
Vibrio gazogenes Moss, 2002 và một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980,
Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000;
Roberts và cộng sự, 2005). Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng EPN
và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng peptone glycerol, nutrient broth, môi trƣờng đậu
phộng, môi trƣờng hạt mè,.... Một số nghiên cứu thu prodigiosin từ dịch nuôi cấy
Serratia marcescens thông thƣờng cần trích ly lỏng rắn bằng ethanol/methanol, sau
đó trích ly lỏng lỏng bằng dung môi kém phân cực hơn để đƣợc prodigiosin tinh
sạch một phần. Việc thu hồi prodigisin và tinh sạch một phần prodigiosin cho mục
đích sản xuất thuốc trừ sâu rất tốn kém vì vậy một số nghiên cứu đã sử dụng trực
tiếp dịch nuôi cấy (canh trƣờng) Serratia marcescens để sản xuất chế phẩm diệt
sâu.. Với mục tiêu tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và điều kiện để sinh tổng hợp
prodigiosin trong môi trƣờng bằng nuôi cấy lỏng ngƣời thực hiện đề tài đã chọn
hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia
marcescens để sản xuất chế phẩm diệt sâu”.
2. Mục tiêu của nghiên cứu

1

Đồ án tốt nghiệp

Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản xuất chế
phẩm diệt sâu.
3. Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn chủng Serratia marcescens sinh tổng hợp prodigiosin và enzyme
ngoại bào.
Thiết lập môi trƣờng nhân giống để thu đƣợc sinh khối nhiều nhất.
Thiết lập môi trƣờng lên men để thu prodigiosin nhiều nhất.
4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài
Chọn lọc đƣợc chủng S.marcescens sinh tổng hợp prodigiosin, enzyme ngoại
bào protease và lipase cao nhất.
Khảo sát thiết lập môi trƣờng nhân giống thu đƣợc sinh khối nhiều nhất.
Khảo sát thiết lập đƣợc môi trƣờng lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất.
Khảo sát thiết lập đƣợc chế độ lên men thu đƣợc prodigiosin cao nhất.
5. Kết cấu của đồ án
Đồ án “ Thiết lập quy trình lên men vi khuẩn Serratia marcescens để sản
xuất chế phẩm diệt sâu” đƣợc trình bày gồm 3 chƣơng:
1. Tổng quan tài liệu
Giới thiệu về prodigiosin các tính chất đặc trƣng của hợp chất thứ cấp
prodigiosin, phân loại loài cũng nhƣ các đặc trƣng sinh hóa của vi khuẩn Serratia
marcescens.
2. Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm
Giới thiệu về các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong quá trình làm đồ án. Cách
bố trí các nghiệm thức trong từng thí nghiệm.
3. Kết quả và thảo luận
Trình bày chi tiết các kết quả đạt đƣợc của từng thí nghiệm đƣợc tiến hành.

2

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân
tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ
quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp.
1.1.2. Triển vọng và tiếm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân
tử sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có
sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử
dụng các thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp,
đƣợc xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực
vật hoặc vi sinh vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành
công nghiệp chế biến cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa,
một số hợp chất tự nhiên có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống
oxy hóa. Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh
vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên
phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi
khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lƣợng hợp
chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể
hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009). Các loại hợp chất này
có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền

ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova
và cộng sự, 1997.
Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất
cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia
(Willliams và cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula,

3


Đồ án tốt nghiệp

Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số
lƣợng lớn hợp chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt
chất có khả năng gây chết hoặc kiềm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi
sinh vật (fungi, acmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu
quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có
phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp đƣợc
sản xuất bởi vi sinh vât.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chât thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật
Vi sinh vật

Hợp

chất

thứ

Ứng dụng

Kiểu tác động

ức chế

cấp
Ức chế tụ cầu

Ức chế tạo

notatum,

khuẩn, nhiễm

polymer vách tế

Penicillium

trùng kỵ khí,

bào vi khuẩn, ức

chrysogenum

giang mai, hen

chế hấp thụ

suyễn.

amini acid và

Penicillium

Penicilin

protein, ứ chế
tạo enzyme.
Streptomyces

Streptomycin

griceus

Ức chế vi

Ức chế ghép nối

khuẩn Gram âm

một số amino

và Gram

acid vào

dƣơng. Trị bệnh

protein, tác

lao, bệnh viêm

động lên hệ

màng não, ho

enzyme cả vi

gà.

khuẩn tham gia
chuyển pyruvate
vào chu trình
Creb, ...

Streptomyces

Chloranphenicol

venezuelas

4

Ức chế đối với

Ức chế đặc hiệu

bệnh

sinh tổng hợp

lỵ,

sốt


Đồ án tốt nghiệp

cao, sốt phát

protein vi khuẩn

ban.

liên quan đến
peptidyl
transferase
trong tiểu đơn
vị

Ribosome

50s, ngăn không
cho tạo liên kết
peptide.
Streptomyces

Ức

Tetracilin

aureomycin

chế

phổ

rộng vi khuẩn
Gram

Ức

chế

tổng

hợp protein

âm,

Gram dƣơng
Streptomyces

Erythromycin

erythraeus

Chữa bệnh do

Ức chế vi khuẩn

tụ cầu khuẩn

Gram

Streptococcal

Gram dƣơng

âm

và

gây ra
Sttreptomyces

Neomycin

Tác

fradiae

dụng

vi

Hơi độc

khuẩn Gram âm
và Gram dƣơng

Streptomyces

Kanamycin

kanamycetius

Streptomyces

Cycloserine

lavendulae
1.2.

Giới thiệu về Prodigiosin

1.2.1. Khái niệm về Prodigiosin

5

Điều trị lao, ức

Tác động giống

chế vi khuẩn

nhƣ

Gram

Streptomycin và

âm

và

Gram dƣơng

Neomycin

Điều trị bệnh

Cản

lao

hơp vách tế bào

trở

tổng


Đồ án tốt nghiệp

Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc từ
“prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở dạng
túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết và dạng hạt ở bên trong tế bào
(Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn
Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998). Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:
prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch

có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCl).
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của Prodigiosin
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng
lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolypyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methane (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

Hình 1.1 Cấu trúc hình học phẳng của hợp chất Prodigiosin (Krishna, 2008)

6


Đồ án tốt nghiệp

Các sắc tố màu đỏ của S.marcescens đã đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902). Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin tổng hợp bởi S.marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962).
Do sự tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ trong những năm
tiếp theo prodigiosin trở nên rõ ràng hơn (Hesse, 2000), có một loạt các chất đều
mang cùng pyrrolypyrromethene (prodigionine) với nhóm thế alkyl khác nhau
(Wasserman và cộng sự, 1969). Những nhóm thế thƣờng gắn trở lại để tạo thành
vòng tròn hoặc macrocycles, nhƣ thể hiện trong hình 1.4, Furstner (2003) cho rằng
danh pháp truyền thống là rất phù hợp và do đó khuyến khích sử dụng “prodigiosin”
để chỉ tất cả. Đƣợc phân lập và đặt tên là “prodigiosine” bởi Kraft (1902).

Hình 1.2 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan trong nƣớc. Prodigiosin có
thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform,

7

Đồ án tốt nghiệp

methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafar và cộng sự,
2006). Hầu hết các sắc tố này hấp thụ ánh sáng ở một bƣớc sóng nhất định và sự
biểu hiện sắc tố có thể dễ dàng theo dõi bằng quang phổ.
Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams,
1973)
Trọng lƣợng
Loài

Serratia

Tên sắc tố

Prodigiosine

phân tử và công

prodigiosin

thức

2-Methyl-

marcescens

Serratia

Danh pháp

Norprodigiosin

marcescens

3-

amyl-6-methoxy-

323,4 Da

prodigiosene

C20H25N3O

2-Methyl-3-amyl6-hydroxy-

309,4 Da

prodigiosene

C10H23N3O

Serratia

Dipyrrolyl-

2-(2-pyrryl)-4-6-

marcescens

dipyrromelhenr

dimethoxypy-

334,4 Da

prodigiosin

prodigiosene

C19H18N4O2

Nonylprodigiosin

2-Nonly-6-

363,5 Da

(Actinomadura)

methoxy-

C23H31N3O

madurae

prodigiosene

Nocardia

Nocardia

Cyclononyl-

2,10-Nonano-6-

265,5 Da

(Actinomadura)

prodigiosin

melhoxy-

C23H33N3O

madurae

prodigiosene

Nocadia

Methylcyclodccyl- 2,10-Nonano-6-

(Actinomadura)

prodigiosin

pellctieri

Methoxy-

391,5 Da

prodigiosene

C25H33N3O

Streptomyces

Undccyl-

2-Undecyl-6-

393,6 Da

longisporusruber

prodigiosin

Rnethoxy-

C25H35N3O

và

Nocardia

prodigiosene

8


Đồ án tốt nghiệp

(Actonomadura)
pelletieri
Streptomyces

Metacyclo-

2,4-(9-

391,6 Da

longisporusber

prodigiosin

Ethylnonano)-6-

C25H33N3O

methoxyprodigiosene
1.2.3. Hoạt động sinh học của Prodigiosin
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loại vi khuẩn
(Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả
năng thấm qua màng ngoài tế bào và khả năng tổng hợp các enzyme nhƣ DNA

gyrase, topoisomerase IV,... dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira, 2009).

Hình 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin (Ramina và Samira, 2009)
A. Đối kháng với Staphylococcus aureus B. Đối kháng với Echerichia Ecoli
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus
mirabilis, Klebsielpneumoniae, Bacillus cereus. (Ramina và Samira, 2009; Chandni
và cộng sự, 2012).

9


Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, hoạt chất prodigiosin còn có khả chống ung thƣ (Pandey và cộng sự,
2009; Pe1rez – Tomás và Vias, 2010) và ức chế miễn dịch (Pandey và cộng sự,
2007).
1.2.4. Cơ chế tổng hợp Prodigiosin của Serratia marcescens
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn.
Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC
39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens ATCC 274 (Sma 274)
đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Nhiều chủng Serrtia marcescens sản xuất sắc tố thông qua con đƣờng ngƣng
tụ enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và enzyme 4-methoxy-2, 2’-bipyrrile-5caboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl6-methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980). Dauenhauer và
cộng sự (1984) đã phân lập đƣợc một chủng Serratia marcescens có khả năng tạo
MAP và MBC, để hình thành prodigiosin. Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình
tự của dòng tế bào này đƣợc báo cáo.
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện

trong Erwinia carotovora subsp. Carotovora (ECC; 25 chủng trong số 36 chủng thử
nghiệm). trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi
nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR,
SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là
việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lacton
(OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong ECC, mặc dù sau này, việc sản xuất một
phân tử tính hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự,
2000).
Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và
Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí từ pigA đến pigN, trong đó có năm gene
tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở
hình 1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn
lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp.

10


Đồ án tốt nghiệp

Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện
kích thƣớc và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno et al, 2001).

Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC
39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001)
Các cụm gene giữa Streptomyces coelicolor và Serratia có những vị trí tƣơng
đồng. Gene quy định của các cụm màu đỏ đƣợc hiển thị trong màu đen, chịu trách
nhiệm tổng hợp phân nữa bipyrrole là màu đỏ và chịu trách nhiệm tổng hợp phân
nửa monopyrrole là màu xanh lam. Các gene không có chức năng tổng hợp đƣợc
thể hiện qua màu trắng và những gene không nằm trong cụm gene sinh tổng hợp
đƣợc thể hiện qua màu xám. Các mũi tên đen chỉ đơn vị phiên mã của các cụm màu

đỏ.
Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là
PigO. RT-PCR với primer extension sẽ nhận thấy có sự phiên mã qua lại giữa hai
gene pigN và pigO (Slater và cộng sự, 2003), điều này phù hợp với pigO là một op-

11


Đồ án tốt nghiệp

eron trong chủng. Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đƣợc sao chép
dƣới dạng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater er al.,
2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 274 cũng đƣợc sao chép dƣới dạng
polycistronic thông tin. Có một khoảng cách đáng kể giữa hai cụm sắc tố pigC và
pigD. Khoảng cách 184 bp giữa pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho
thấy khả năng chứa hai đơn vị phiên mã. Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene
ở hai bên của khoảng cách này đã chứng minh là tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu
dùng lacZ hợp vời pigA và pigH (Crow, 2001). Cụm pig trong Sma 274 có khoảng
cách 64 bp giữa pigC và pigD, nhỏ hơn so với Serratia ATCC 39.006, khoảng cách
này không có ý nghĩa. Cụm màu đỏ (gồm 23 gene) lớn hơn cụm pig (14-15 gene),
có thể phản ánh sự phức tạp hơn về các sản phẩm undecylprodigiosin đƣợc tổng
hợp bởi Streptomyses coelicolor (Harris và cộng sự, 2004).
Mƣời hai gene đƣợc lƣu giữ giữa ba cụm, có thể mong đợi con đƣờng tổng
hợp cho ra các sản phẩm tƣơng tự. Tuy nhiên, định hƣớng và điều tiết của nó có sự
thay đổi rõ rệt (Slater và cộng sự, 2003). Việc bố trí không giống nhau của các gene
tƣơng đồng trong cụm sản xuất các sản phẩm hóa học tƣơng tự đặt ra câu hỏi về
nguồn gốc và sự tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn
Gram dƣơng và Gram âm. Vẫn chƣa rõ liệu các loài trong cùng một họ có
vai trò quan trọng ảnh hƣởng đến sự sắp xếp không giống nhau của các gene hay sự
khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Sự khác biệt ở các gene hiện diện trong những operon có thể giải thích sự khác
biệt trong phƣơng thức sản xuất và con đƣờng tổng hợp sinh hóa. PigD và pig E là
hai pig gene không có sự tƣơng đồng trong cụm màu đỏ. Tƣơng tự nhƣ vậy, pdtorfL
và pdtorf thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng hợp các chất khử clo (carbon tetrachloride) nhƣ pyridine-2-6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri
(Lewis và cộng sự, 2000). PigE tƣơng tự aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ
Streptomyces coelicolor A3(2), đƣợc mã hóa bởi một gene không liên kết với cụm
màu đỏ (38% giống với PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống với PigE từ
Sma 274; cả hai đều là 50% tƣơng đƣơng 460 aa). Thật vậy, nó có thể là gene mã

12


Đồ án tốt nghiệp

hóa protein tham gia vào quá trình tổng hợp prodigiosin và undecylprodigiosin có
thể không đƣợc liên kết với các cụm gene. RedR, RedQ và RedP không đƣợc mã
hóa tƣơng đồng bởi cụm pig, nhƣng chúng đƣợc cho là chỉ đạo tổng hợp acetate từ
ba nguyên tử carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecylprodigiosin (Cerdeno và
cộng sự, 2001). Các gene mã hóa tƣơng đồng tƣơng ứng có thể có mặt tại một vị trí
trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể thực hiện vai trò xúc tác
cần thiết trong sinh trong sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia.
Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng hợp trong sự tái tổ hợp giữa Escherichia
coli và Erwinia, điều này đòi hỏi hoạt động chức năng tƣơng ứng của Escherichia
coli và enzyme Erwinia để bổ sung cho các hoạt động của enzyme đƣợc mã hóa bởi
các nhóm sắc tố (Harris và cộng sự, 2004).

Hình 1.4 Con đƣờng đƣợc đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin.

13

Đồ án tốt nghiệp

Đề xuất này cũng tƣơng tự nhƣ đề xuất đối với undercylprodigiosin (Cerdeno
và cộng sự, 2001). Mƣời hai Red protein với sự mã hóa trong cụm pig (“lõi” là enzyme prodigiosin) có kích thƣớc tƣơng tự nhau trong bản sao của Pig. Một ngoại lệ
là PigB (670 aa) tƣơng đồng với RedS (Sc3f7.05c), là một protein nhỏ hơn nhiều
(146 aa) và tƣơng tự gắn vào cuối đầu N của PigB. Phần còn lại của PigB gắn với
các amine oxidase. Các protein PigI và PigJ đều nhỏ hơn RedM và tƣơng đồng với
RedX (Harris và cộng sự, 2004). PigA là trình tự tổng hợp một loạt các actyl-CoA
dehydrogenase. Chuỗi liên kết với human isovaleryl-CoA dehydrogenase, cấu trúc
tinh thể trong đó đã đƣợc xác định, cho thấy rằng phần lớn các acid amin xung
quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA đƣợc bảo vệ nhƣng các acid
amin tham gia vào liên kết nhóm adenisyl của CoA không đƣợc bảo vệ (Tiffany và
cộng sự, 1997). Điều này hỗ trợ cho rằng PigA là một PCP prolyl hơn là prolylCoA.
1.3.

Giới thiệu về Serratia marcescens

1.3.1. Lịch sử phát hiện
Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ
6 trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh
mì.
Sau đó vào năm 332 trƣớc công nguyên những ngƣời lính trong quân đội
Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có
“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy
máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander giành chiến thắng.
Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất
hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran
(1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự
cố nhƣ vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.

Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc
sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcrscens, tuy nhiên điều

14


Đồ án tốt nghiệp

này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một
phép lạ (Gillen và Girbbs, 2011).
Bizio một dƣợc sĩ ở padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu
đỏ máu.
Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để nơi khô
ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi sinh vật
màu đỏ.
Sau 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà
vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serratia, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân
hủy rất nhanh bánh mì và polenta.
Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy
những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà
khoa học đã phân loại Serratia marsescens là vi khuẩn.
1.3.2. Phân loại khoa học của Serratia marcescens
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae là một nhóm vi khuẩn có liên quan
với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia
marcescens.
Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:
 Giới:

Bacteria

 Ngành:

Proteobacteria

 Lớp:

Gramma proteobacteria

 Bộ:

Enterobacteria

 Họ:

Enterobacteriaceae

 Chi:

Serratia

 Loài:

Serratia marcescens

1.3.3. Đặc điểm của Serratia marcescens

15