Nghiên Cứu Quá Trình Tách Chiết Và Tinh Sạch Protein Trong Rong Bún Enteromorpha Spp.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ
TINH SẠCH PROTEIN TRONG RONG BÚN
ENTEROMORPHA SPP.

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
SVTH: TRẦN LƯƠNG HỒNG YẾN
MSSV: 0851110311

Tp. Hồ Chí Minh, năm 2012


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống,
về mặt số lượng, protein chiếm không dưới 50 % trọng lượng khô của tế bào, về
thành phần cấu trúc, protein được tạo thành chủ yếu từ các amino acid vốn được nối
với nhau bằng liên kết peptide. Đối với động vật thủy sản thì nhu cầu protein cao
hơn so với động vật trên cạn. Hàm lượng protein trong thức ăn thuỷ sản khoảng từ
18 - 20 % đối với tôm biển, 28 - 32 % cho cá da trơn, 22 - 30 % đối với cá rô phi,
38 - 40 % đối với cá hồi vân. Protein là một trong các chất dinh dưỡng thiết yếu

trong việc duy trì hoạt động sống, sự trao đổi chất trong cơ thể, sự tăng trưởng cũng
như các chứa năng quan trọng khác. Tuy nhiên trong 20 loại acid amin thì có 10
loại acid amin không thay thế mà động vật thủy sản (ĐVTS) không có khả năng tự
tổng hợp. Bên cạnh đó protein cũng là nguồn dinh dưỡng có giá thành rất cao trong
khẩu phần thức ăn thủy sản. Nước ta phải nhập khẩu 20 % nguyên liệu giàu năng
lượng, 80 % các loại thức ăn bổ sung, 80 - 90 % thức ăn giàu đạm và hơn 90 % chất
phụ gia. Vì thế cần tìm ra một nguồn nguyên liệu vừa rẽ tiền vừa đáp ứng được nhu
cầu protein đặc biệt là thành phần acid amin (AA) không thay thế.
Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, với chiều dài
bờ biển hơn 3.260 km và có nhiều nhánh sông, vùng triều, các vùng vịnh, đậm
phá…đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của các sinh vật biển.
Một trong những loài góp phần vào sự đa dạng này là rong biển. Có đến 800 loài
rong biển đã được xác định ở Việt Nam. Trong đó nhiều chi có sản lượng tự nhiên
lớn Sargassum, Hormophysa, Hydroclathrus (Rong Nâu); Gracilaria, Hydropuntia,
Hypnea (Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục) và một số loài
khác đang được nuôi trồng trong ao đìa, vịnh, bãi triều ven biển. Ước tính diện tích
mặt nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010 - 2015
là 900.000 ha với sản lượng 600 – 700.000 tấn khô / năm. Nhiều loài có giá trị kinh
tế cao, khoảng 121 loài đang được người dân ven biển khai thác. Trong đó có 65

Trang 1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

loài dùng làm thực phẩm và 56 loài dùng trong công nghiệp chế biến hoặc sản xuất
các chất như: agar, carrageenan, alginat…
Ngành rong lục (Chlorophyta) được xem là một ngành lớn, có nhiều loài, đến
nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8.000 loài. Phần lớn chúng sống trong
nước ngọt gần 90 %, còn lại ở biển và đại dương khoảng 10 %. Trong các biển và

đại dương thế giới đã biết 948 loài thuộc 112 chi, 18 họ và 8 bộ. Ở nước ta, hầu hết
các loài thuộc bộ Ulvales, Siphonales, đều sống ở biển, hải đảo, vùng cửa sông và
các đầm, phá nước lợ ven biển.
Trong nước và trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về rong biển
được công bố, sản phẩm chính của các công trình là tạo ra đường có thể lên men
(ethanol và n - butanol là những phụ gia nguyên liệu cao cấp). Bên cạnh việc phục
vụ cho mục tiêu sản xuất ethanol và butanol, thì rong biển còn được dùng để tách
protein từ sinh khối có khả năng sử dụng làm thức ăn thương mại cho tôm và cá.
Trong đó thì Enteromorpha spp. có chứa khoảng 15 - 20 % protein trong thành
phần với tỷ lệ AA thiết yếu rất giống với nhu cầu AA của tôm sú. Việc sản xuất
thành công sản phẩm protein thực vật từ rong Enteromorpha spp. để sử dụng trong
thức ăn gia súc sẽ góp phần đa dạng hóa các sản phẩm nông nghiệp, giảm phụ thuộc
vào nhập khẩu, giảm chi phí chăn nuôi cho nông dân và tăng tính cạnh tranh cho
doanh nghiệp.
Việc sử dụng rong biển làm thức ăn gia súc đã giải quyết được một phần khó
khăn trong nguyên liệu đầu vào của ngành chăn nuôi mà còn làm giảm thiểu nguy
cơ ô nhiễm môi trường bởi các đặc tính sinh học của rong biển.
Với những lý do trên, đối với nước ta việc thu nhận các nguồn lợi từ rong biển
có ý nghĩa to lớn về khoa học cũng như thực tiễn, đặc biệt là protein từ rong biển
Enteromorpha spp. Do đó cần nghiên cứu để tiến tới sản xuất protein ở quy mô
công nghiệp phù hợp với nền kinh tế quốc dân.
1.2 Tình hình nghiên cứu rong biển
1.2.1 Tình hình nghiên cứu rong biển trên thế giới
Trang 2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nhiều công trình nghiên cứu về rong biển đã được thực hiện trên các khía
cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi chế biến, nuôi trồng và tạo giống rong biển. Các

nghiên cứu cho kết quả tốt trong việc khai thác và sử dụng tiềm năng của loài thực
vật thủy sinh quan trọng này.
Các tác giả Brzeski (1997), Chopin et al. (2001) và Neori et al (2004) cho rằng
xu hướng tiến tới quản lý nuôi thủy sản tốt hơn, việc kết hợp nuôi các loài thủy sản
có cho ăn (tôm, cá) với nuôi các loài thủy sản hấp thụ dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ
(rong biển, động vật hai vỏ), sẽ là cách tiếp cận hệ sinh thái quan trọng giúp tái sử
dụng dinh dưỡng, có lợi chung cho các đối tượng nuôi trồng, đa dạng hóa nguồn thu
nhập từ nhiều đối tượng.
Nghiên cứu của Amir Neori (2007) xác nhận việc nuôi rong biển trong các hệ
thống ao nuôi kết hợp với thủy sản là mô hình quan trọng cho phát triển bền vững ở
các vùng ven bờ [20]. Theo Elizabeth (2008), nuôi kết hợp rong và tôm sẽ làm tăng
năng suất và chất lượng tôm nuôi.
Theo Akiko Isa et al., 2009 “Rong biển đã được nghiên cứu sử dụng trong
thực phẩm, công nghiệp và dược phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Các thành phần
chiết xuất từ rong có giá trị sinh học như beta caroten, các chất chống oxy hóa cũng
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Rong biển rất giàu protein và khoáng chất,
có thể tận dụng để sử dụng trong thực phẩm và thức ăn gia súc”.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Đối với loài rong Bún (Enteromorpha spp.và Ulva) những nghiên cứu đầu tiên
về sinh hóa và tiềm năng ứng dụng của chúng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu
của Viện Sinh Học Nhiệt Đới trong khuôn khổ dự án FSPS II/SUDA 3.3.4 năm
2009 (do DANIDA tài trợ). Các loài rong này mọc tự nhiên nhiều trong ao nuôi tôm
nước lợ quãng canh, người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của rong này trong ao
nuôi tôm so với các loài rong khác và cho rằng rong xuất hiện nhiều sẽ giúp cải
thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm và cải thiện năng suất của tôm.[4]
1.3 Mục đích nghiên cứu
Trang 3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch protein từ rong Enteromorpha
spp. để bổ sung vào thành phần thức ăn cho tôm và cá.
1.4 Nội dung nghiên cứu
- Xác định chỉ tiêu sinh hóa trong rong Enteromorpha spp.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách chiết protein trong rong
Enteromorpha spp.
+ Xác định tỷ lệ nước cần ngâm rong (w/v).
+ Xác định thời gian cần nghiền rong.
+ Xác định thời gian, nhiệt độ, % NaOH ủ rong.
- Thu nhận được protein thông qua dịch chiết thu từ rong Bún Enteromorpha
spp.
+ Xác định tỷ lệ cồn tối ưu để tủa protein trong dịch chiết.
+ Xác định % TCA tối ưu để tủa protein trong dịch chiết.
+ Xác định pH HCl tối ưu để tủa protein trong dịch chiết.
- Tinh sạch protein qua sắc ký lọc gel Biogel P - 100.
- Xác định các thành phần AA trong protein của rong.
1.5 Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết.
+ Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu.
+Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù
hợp.
+Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định
giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm.
- Nghiên cứu thực nghiệm.

Trang 4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

+ Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm. Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm
Stapraphics.
1.6 Giới hạn đề tài
Vì lý do giới hạn về thời gian đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu quá tình tách
chiết, tinh sạch protein trên gel Biogel P - 100, xác định thành phần AA trong
protein của rong.
1.7 Tính cấp thiết của đề tài
Đề tài là một phần nghiên cứu nằm trong “dự án phát triển nhiên liệu sinh học
từ rong biển tại Việt Nam” (Hợp tác giữa Viện Sinh Học Nhiệt Đới (ITB) và
SenterNovem với Algen Sustainables ) nhằm mục đích sử dụng nguồn sinh khối
rong biển bền vững tách protein sử dụng làm thức ăn thương mại cho tôm và cá.
Công nghiệp thức ăn gia súc đang chật vật với việc đưa protein vào thành
phần thức ăn với giá thành hợp lý. Việc sản xuất thành công sản phẩm protein thực
vật từ rong để sử dụng trong thức ăn gia súc sẽ góp phần đa dạng hóa các sản phẩm
nông nghiệp, giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, giảm chí phí chăn nuôi cho nông dân
và tăng tính cạnh tranh cho doanh nghiệp. Phù hợp với nền kinh tế quốc dân. Đồng
thời giảm được ô nhiễm môi trường nước (hiện tượng phú dưỡng hóa) do sự phát
triển ồ ạt không kiểm soát được của rong.

Trang 5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về rong bún Enteromorpha spp.
Enteromorpha spp. là chi thuộc họ Ulvaceae phân bố trên toàn thế giới, trong
nhiều loại môi trường khác nhau. Trên các biển thế giới thống kê 35 loài. Việt Nam
có 11 loài và 1 thứ. Chi này được phổ biến rộng rãi ở phía tây bắc Châu Âu,

Enteromorpha spp. được biết đến là một loài chiếm ưu thế trong vùng đất ngập
nước mặn ven biển. Tất cả các loài Enteromorpha spp. nổi hoặc "di chuyển" lơ
lửng. Enteromorpha spp. cũng có thể phát triển trên nhiều loại chất nền, trên cát,
bùn, đá, và thậm chí cả bê tông, gỗ hoặc kim loại. Enteromorpha spp. cũng có thể
phát triển mà không cần đến giá thể.
Ở nước ta loại rong này được tìm thấy nhiều ở các ao hồ nuôi tôm huyện Cần
Giờ, Bạc Liêu, chúng phân bố ở vùng nước cạn có đáy mềm (cát, cát bùn, bùn cát...)
trong các đầm, phá, vịnh và cả trong các ao nuôi tôm bỏ hoang, có tốc độ phát triển
rất nhanh nơi vùng biển ấm và các vùng nước lợ ĐBSCl.
1.1.1 Đặc điểm sinh học của rong Enteromorpha spp.
1.1.1.1 Hệ thống phân loại của rong Enteromorpha spp.
Rong Bún Enteromorpha spp. nằm trong ngành rong lục (Chlorophyta), tên
thường gọi là Gutweed.
Giới: Plantae
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Ulvophycea
Bộ: Ulvales
Họ: Ulvaceae

Hình 1.1:Rong Bún Enteromorpha spp.

Chi: Enteromorpha spp.

(Nguồn: Beachwatchers.wsu.edu)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo

Trang 6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình thái
Thân có dạng trụ tròn hình ống, dạng túi hay phiến dẹp, có xoan từ gốc đến
ngọn ở giữa hoặc hai bên hay chỉ một phần ở gốc, bàn bám dạng đĩa, chia nhiều
nhánh hoặc không phân nhánh có một hay nhiều hàng tế bào. Nhìn từ bề mặt, tế bào
hình chữ nhật hay hình vuông, sắp xếp thành hàng dọc hoặc không có quy luật, một
hạt, một thể sắc tố dạng bản, một hoặc nhiều hạt tạo bột. Chiều dài thân chính từ 5 10 cm và có thể lên đến 70 cm tùy thuộc vào các loài trong chi và đường kính thân
có thể đạt tới 25 mm.
Màu xanh lá cây hay màu nâu nhạt.
Cấu tạo tế bào
Vỏ tế bào do nguyên sinh chất phân hóa tạo ra, gồm có cellulose ở phía trong
và pectin ở phía ngoài. Chất nguyên sinh tạo thành lớp mỏng ở sát thành vỏ tế bào :
ở giữa tế bào là một không bào lớn chứa đầy dịch tế bào. Thể sắc tố có các dạng
phiến , đai vành móng ngựa, hình sao nhiều cạnh, hình xoắn lò xo, mắt lưới dạng
hạt nhỏ…. Sắc tố chủ yếu là chlorophyll a, chlorophyll b làm cho rong có màu
xanh. Trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ giàu protit. Hạt tế bào
thường nằm giữa khoang túi dịch bào hay sát thành lớp nguyên sinh. Thể nhiễm sắt
hình que ngắn hay hạt nhỏ, số lượng ít. Sản phẩm đồng hóa là tinh bột hoặc đôi khi
là chất bơ. Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là đường,
tannin, canxi sunfat và các chất có màu antocyan.

Trang 7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.2: Cấu tạo tế bào của rong Enteromorpha spp.
Bắt đầu khi phát triển, các tế bào của chúng tạo thành một hàng duy nhất, cấu
trúc này là monosiphonous. Ngay sau khi các sợi monosiphonous được hình thành,

sau đó sợi sẽ phân chia dọc theo các tế bào tạo ra một sợi hai lớp. Cuối cùng, sau
qua trình phân chia tế bào nhiều hơn hai lớp tế bào riêng biệt tạo nên hình ống, cũng
là hình thái học khi chúng trưởng thành.
Các tế bào bên trong Enteromorpha spp. có thể khác nhau về kích thước và
hình dạng từ loài này sang loại khác. Mỗi tế bào chứa duy nhất một lục lạp, các lục
lạp này có kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào kích thước của tế bào.
1.1.1.3 Hình thức sinh sản và dạng sống
Sinh sản
Giống như nhiều loại rong khác, Enteromorpha spp. có sự luân phiên giữa các
giai đoạn sống vô tính và sinh sản. Cả hai giai đoạn sống tương tự nhau về hình
thái. Tuy nhiên, thể bào tử có hai bộ nhiễm sắc thể, ký hiệu là (2N), trong khi thể
giao tử chỉ có một bộ nhiễm sắc thể (1N).
Sinh sản vô tính bằng bào tử động, có 2 - 4 roi; mỗi tế bào dinh dưỡng có 4 - 8
- 16 bào tử động. Sinh sản hữu tính bằng giao tử đẳng hình hay dị hình, 2 roi hình
thành giống như bào tử động. Giao tử có thể nảy mầm đơn tính không có sự giao
phối. Giao tử và bào tử động phát sinh thành những dạng sợi một hàng tế bào, sợi
này chia cắt ngay thành các chồi hình ống thẳng đứng hoặc hình thành bàn bám một
Trang 8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

lớp tế bào, trên bàn bám xuất hiện chồi thẳng đứng một hàng tế bào, sau đó tế bào
chia cắt ngang và dọc tạo ra nhiều hàng tế bào.
Trong sơ đồ sau đây, thông qua quá trình nguyên phân, giao tử được sản xuất
bởi thể giao tử, sau đó chúng cùng tham gia và phát triển thành một thể bào tử. Các
thể bào tử sau đó sẽ trải qua quá trình giảm phân, sản suất bào tử động (sinh sản vô
tính tế bào), và mỗi bào tử phát triển thành một thể giao tử. Thể giao tử sau đó sản
xuất nhiều giao tử và chu kỳ được tiếp tục.

Hình 1.3 : Sơ đồ vòng đời của rong Enteromorpha spp.
Dạng sống
Chúng phát sinh, nảy mầm từ những bào tử lúc còn non bám vào vật bám,
phát triển đến một giai đoạn nào đó tự rời vật bám sống tự do tạo thành bè mảng.
Mặc khác những loài sinh sản dinh dưỡng bằng hình thức nảy mầm tái sinh những
đoạn thân đứt gãy cũng tạo nên dạng sống tự do.
1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rong
Enteromorpha spp.
Nghiên cứu của Anna I. Sousa (2007) [21] cho kết quả nồng độ muối, ánh
sáng và dinh dưỡng có tác động lớn đến sự nảy mầm và sinh trưởng của bào tử
Enteromorpha spp.

Trang 9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Độ mặn
Enteromorpha spp. có thể chịu được độ mặn thay đổi từ nước ngọt đến nước
biển từ 34 - 8 ‰và các báo cáo trước đây cho thấy sự có mặt của Enteromorpha
spp. trong các suối nước muối và muối mỏ [30]. Ngoài ra Enteromorpha spp. có thể
phát triển trên bờ biển đại dương, trong vùng nước lợ, và nội địa trong nước ngọt.
Dòng chảy và lưu thông nước
Rong phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển (tạo ra
dòng chảy, dòng triều hay sóng gió bề mặt). Nước bị tù hay di chuyển kém làm cho
tốc độ phát triển của rong Enteromorpha spp. chậm lại, đặc biệt nếu kết hợp với
nhiệt độ cao, chất huyền phù trong nước lớn, hàm lượng các muối dinh dưỡng thấp
sẽ dẫn đến sự tàn lụi của rong một cách nhanh chóng.
Nhiệt độ
Rong bún Enteromorpha spp. sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 17 oC trở lên. Nhiệt

độ tối ưu thích hợp cho rong sinh trưởng và phát triển nằm trong khoảng 25 - 30 oC,
nhiệt độ cao hơn 30 oC hay thấp hơn 17 oC sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển
của rong.
Cường độ ánh sáng
Yêu cầu ánh sáng của rong sụn không cao, thích hợp nhất là khoảng 30.000 50.000 lux, ánh sáng cao quá hay thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát
triển rong.
1.1.3 Thành phần hóa học và polysaccharide của rong Enteromorpha spp.
1.1.3.1 Thành phần hóa học.
Thành phần hóa học trong rong Enteromorpha spp. luôn luôn thay đổi phụ
thuộc vào trạng thái sinh lý, thời gian sinh trưởng và điều kiện sinh sống (nhiệt độ,
địa lý, dinh dưỡng, độ mặn).

Trang 10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trong rong Enteromorpha spp. hàm lượng nước chiếm 80 - 90 % còn lại vài
phần trăm chất là khô.
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rong bún Enteromorpha spp.
Thành phần hóa học trong chất khô

% khối lượng khô

Protein

15 - 20 %

Cacbonhydrate

25 - 29 %

Lipid

3,47 - 4,36 %

Glucide

37 - 44 %

Thành phần hóa học khác

15- 32 %

a. Protein
Hàm lượng protein thay đổi theo mùa và địa lý, trung bình giá trị dao động từ
9,42 - 20,60 % trọng lượng khô. Điều này được suy ra từ thực tế hàm lượng protein
cao nhất trong mùa xuân (vào đầu mùa sinh trưởng) và mùa thu (vào cuối mùa sinh
trưởng). Hàm lượng protein lại thấp nhất vào mùa hè. Theo báo cáo của Munda
Gubensek (1976, 1986), Owens & Stewart (1983), Tkachenko & Koval (1990) [31],
[32], [33], [36].
b. Carbohydrate
Carbohydrate là thành phần quan trọng nhất trong quá trình trao đổi chất vì nó
cung cấp năng lượng cần thiết cho tế bào hô hấp và trao đổi chất khác. Trong thời
gian mùa hè, sau giai đoạn tăng trưởng tối đa đã xảy ra ở mùa xuân, hàm lượng
carbohydrate lúc này cao hơn lúc đầu và cho thấy xu hướng dao động thành phần
cacbonhydrat trong rong. Thực tế là nhiệt độ nước cao nhất trong mùa hè, cùng với

Trang 11

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bức xạ mặt trời cao trong thời gian đó, làm cho quá trình quang hợp xảy ra mạnh
nhất. Quá trình này cũng có thể dẫn đến tăng nồng độ carbohydrate.
Các thành phần carbohydrate hòa tan có thể chiếm tới 29 % tổng lượng chất
khô của rong [23].
c. Lipid
So với protein và carbohydrate, lipid chiếm tỷ lệ tương đối nhỏ trong
Enteromorpha spp. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất nhiều lên sự hình thành lipid của
thực vật, làm chậm cả hai quá trình trao đổi chất và vận chuyển (Jones & Harwood
1993) [28]. Hàm lượng lipid trong Enteromorpha spp. sẽ đạt giá trị tối đa vào đầu
mùa xuân và khi nhiệt độ tăng lên thì hàm lượng lipid gần như ổn định cho đến khi
kết thúc mùa sinh trưởng, dao động từ 3,47 - 4,36 % khối lượng khô.
d.

Sắc tố

Trong rong Enteromorpha spp. có chứa một số sắc tố như sắc tố xanh lục, sắc
tố nâu, dẫn đến việc rong thường có màu nâu nhạt và xanh đậm.
e.

Chất khoáng

Hàm lượng khoáng phụ thuộc vào điều kiện sống giai đoạn sinh trưởng. Trong
Enteromorpha spp. thành phần khoáng chủ yếu là Ca, K, Mg và các nguyên tố khác
như Fe, Al, Si, Ba,....
1.1.3.2 Thành phần polysaccharide của rong Enteromorpha spp.
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào của Enteromorpha spp. không chứa
thành phần polysaccharide có tính ”nhầy - mucilaginnous” như agar và alginic acid.

Hàm lượng lignin trong thành tế bào và thành phần tinh bột pyrenoid cũng rất thấp
(Akiko Asa at el.,2009). Cấu trúc tế bào và thành phần tế bào là yếu tố quan trọng
làm cơ sở để lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào, giải phóng protein.
Thành phần các polysaccharide của thành tế bào rong Enteromorpha
spp.(Bimalendu Ray, 2006) [23]. thường chứa các thành phần cellulose và

Trang 12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hemicellulose có cấu trúc phân nhánh khá phức tạp với các đường monosaccharide
như rhamnose, xylose, glucose, glactose, glucuronic acid, iduronic acid chiếm tỷ lệ
chính và một lượng protein khá cao.
1.2 Giới thiệu về Protein
1.2.1 Kết cấu đơn vị
Protein là polymer của các amino acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hóa
trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thủy phân tạo thành các amino acid tự do
bằng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 AA
trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống.
Amino acid là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl
(COOH) và ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có các nhóm NH. Trong
phân tử amino acid đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon
1.2.2 Thành phần cấu tạo
Cacbon 50 - 55 %, nito 15 - 18 %, hydro 6,5 - 7,3 %, oxy 21 - 23,5 %, lưu
huỳnh 0 - 0,24 %, phosphore 0 - 0,9 %. Một số phân tử protein còn chứa các
nguyên tố khác như: Ca, Mn, Zn, Fe, Cu…gọi là nguyên tố vi lượng.
1.2.3

Tính chất của protein

1.2.3.1 Tính chất hóa lý
Màu sắc và mùi vị của amino acid: thường không màu, nhiều loại có vị ngọt,
vị đắng.
1.2.3.2 Độ hòa tan
Dễ tan trong nước trong acid và kiềm loãng khó tan trong alcohol và ether.
Trạng thái keo của protein bền vững là nhờ có lớp vỏ thủy hóa bao bọc bên
ngoài các hạt keo và các điện tích làm cho các phân tử protein ngăn cách và không
dính vào nhau. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tính tan protein: pH, nồng độ muối,
nhiệt độ,…

Trang 13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.3.3 Lưỡng tính và điểm đẳng điện
Do thành phần protein là các phân tử AA, mà AA là chất lưỡng tính nên
protein cũng là phân tử lưỡng tính.
Ngoài ra, do trong thành phần AA của protein có 2 nhóm:
- Các AA acid: trong cấu tạo có 2 nhóm COOH, trong đó 1 nhóm dùng để tạo
liên kết peptid còn 1 nhóm hình thành ion COO-.
- Các AA kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó có một nhóm tạo liên
kết peptid còn 1 nhóm hình thành NH3+.
Như vậy, phân tử protein vừa có khả năng phân ly như 1 acid tạo COO- vừa
có khả năng phân ly như một chất kiềm tạo NH3+.
1.2.3 Protein trong chăn nuôi thủy sản.
Protein là thành phần chất hữu cơ chính của cơ thể ĐVTS, chiếm khoảng 60 75 % trọng lượng khô của cơ thể (Halver, 1988). Protein có cấu trúc rất phức
tạp. Trong thành phần hóa học của protein có chứa: carbon (50 - 55 %); oxy (22 26 %); nitơ (12 - 19 %); hydro (6 - 8 %); và lưu huỳnh (0 - 2 %). Mặc dù chúng rất
khác nhau về cấu trúc, chức năng, thành phần hóa học, kích thước...nhưng khi bị

thủy phân chúng đều phân hủy thành các AA.
Nhiệm vụ chính của protein là xây dựng nên cấu trúc của cơ thể. Protein trong
thức ăn cung cấp các amino acid nhờ quá trình tiêu hóa và thủy phân. Trong ống
tiêu hóa, các amino acid được hấp thu vào máu và đi đến các mô, cơ quan, tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể, phục vụ cho quá trình sinh trưởng,
sinh sản và duy trì cơ thể. Do đó, nếu thức ăn không cung cấp đủ nhu cầu protein
cho cá sẽ dẫn đến cá chậm lớn, hoặc ngừng tăng trưởng, thậm chí có thể giảm trọng
lượng. Mặt khác, nếu lượng protein trong thức ăn vượt quá nhu cầu thì chỉ một phần
được sử dụng để tạo protein mới, phần còn lại sẽ được chuyển sang dạng năng
lượng, điều này sẽ làm tăng giá thành thức ăn không cần thiết. Chính vì vậy, các
nhà khoa học rất chú ý và đã nghiên cứu nhu cầu protein và amino acid của cá, bắt

Trang 14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

đầu từ những năm 50, đến nay, phần lớn các đối tượng nuôi quan trọng và phân bố
rộng trên toàn thế giới đã được nghiên cứu về lĩnh vực này.
1.2.4.1 Vai trò protein
- Là thành phần chủ yếu tham gia cấu tạo cơ thể, thay tổ chức cũ xây dựng
tổ chức mới.
- Các AA sẽ tham gia vào các sản phẩm protein đặc biệt có hoạt tính sinh
học cao (hormon, enzyme).
- AA sẽ tham gia quá trình tạo thành năng lượng ở dạng trực tiếp hay tích
lũy ở dạng glucogen hay lipid.
Với những chức năng quan trọng trên, không có vật chất nào có khả năng thay
thế protein trong cơ thể. Khi thức ăn thiếu protein thì động vật chậm sinh trưởng,
chậm phát dục, sức sinh sản giảm. Do đó, protein là chất dinh dưỡng được đặc biệt
chú ý trong thức ăn. Mục đích của nuôi động vật thủy sản là biến đổi protein từ thức

ăn (tự nhiên và nhân tạo) thành protein cấu tạo cơ thể động vật thủy sản có chất
lượng cao.
1.2.4.2 Nhu cầu protein
Nhu cầu protein của động vật thủy sản thường lớn hơn động vật trên cạn. Nhu
cầu protein của cá dao động trong khoảng từ 25 - 55 %, trung bình 30 %, giáp xác
từ 30 - 60 %. Nhu cầu protein tối ưu của một loài nào đó phụ thuộc nguồn nguyên
liệu làm thức ăn (tỉ lệ protein và năng lượng, thành phần amino acid và độ tiêu hóa
protein), giai đoạn phát triển của cơ thể, các yếu tố bên ngoài khác. Khi động vật
thủy sản sử dụng thức ăn không có protein thì cơ thể giảm khối lượng, bởi vì chúng
sẽ sử dụng protein của cơ thể để duy trì các chức năng hoạt động tối thiểu của cơ
thể để tồn tại. Trái lại nếu thức ăn được cung cấp quá nhiều protein thì protein dư
không được cơ thể hấp thu để tổng protein mới mà sử dụng để chuyển hóa thành
năng lượng hoặc thải ra ngoài. Thêm vào đó cơ thể còn phải tốn năng lượng cho quá
trình tiêu hóa protein dư thừa, vì thế sinh trưởng của cơ thể giảm.

Trang 15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.3.3 Nhu cầu AA
Khi nói đến protein, người ta không chỉ quan tâm đến hàm lượng của nó trong
thức ăn mà còn chú ý đến các AA tham gia cấu tạo nên protein (đặc biệt là thành
phần và tỷ lệ các AA thiết yếu trong protein). Nhu cầu protein nói một cách chính
xác hơn đó chính là nhu cầu amino acid. Ngoài nhiệm vụ chính là cấu tạo nên
protein, chúng còn là tiền chất của một số sản phẩm trao đổi chất khác. Có hai loại
amino acid: thiết yếu và không thiết yếu.
AA không thiết yếu: AA không thiết yếu là những AA mà cơ thể sinh vật tự
tổng hợp được từ thức ăn. Chúng bao gồm: Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin,
Cystein, Cystin.

AA thiết yếu: nhu cầu về amino acid thiết yếu được nghiên cứu nhiều bởi vì cá
không thể tổng hợp được chúng mà phải lấy từ thức ăn. Cũng như động vật bậc cao,
các loài động vật thủy sản nói chung cần 10 loại amino acid, gồm: arginin, histidin,
isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenillalanin, threonin, tryptophan và valin.
Cá không thể dự trữ AA tự do. Nếu như có một AA nào đó chưa được dùng
ngay để tổng hợp protein thì sẽ được chuyển thành AA khác hoặc cung cấp năng
lượng. Trường hợp này (chuyển AA này thành AA khác hoặc cung cấp năng
lượng), nếu xảy ra ở AA thiết yếu thành AA không thiết yếu hoặc cung cấp năng
lượng thì rất lãng phí.
Do đó sự mất cân đối AA sẽ dẫn đến lãng phí AA. Thiếu cũng như thừa bất
kỳ AA nào thì đều làm giảm hiệu quả sự dụng protein.
Ngoài ra, giữa các AA có cấu tạo giống nhau còn có tương tác đối kháng
(antagonism). Đó là khi hàm lượng một AA nào đó trong thức ăn vượt quá mức nhu
cầu sẽ kéo theo nhu cầu của amino acid có cấu tạo hóa học tương tự tăng lên. Ví dụ
như tương tác giữa leucine và isoleucine được quan sát trên cá nheo Mỹ. Ngược lại,
nếu thiếu loại nào đó thì cũng ảnh hưởng đến các acid amin khác (acid amin giới
hạn). AA thường bị coi giới hạn là methionin, lysine vì các nguồn nguyên liệu có

Trang 16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

nguồn gốc thực vật có hàm lượng các AA này thường không đủ theo nhu cầu của
ĐVTS.
1.2.5 Các phương pháp tủa protein
1.2.5.1 Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc
vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của
muối…

Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở
nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang
điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm
các phân tử protein không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong
dung môi. Giả thuyết của Debye - Huckel cho rằng: “tính tan của protein được biểu
diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion
trong dung dịch”.
Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích
bởi Kirkwood: “sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình
Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa”.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B – KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có
trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Trang 17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.4: Tỷ lệ protein tủa theo nồng độ muối
(Nguồn: />1.2.5.2 Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả
năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu
cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm
biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung

môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như: 2 - methyl - 2,4 pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol có thể được sử dụng ở
nồng độ cao.
1.2.5.3 Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện
Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH
thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá
trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất
đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không

Trang 18


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng
tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường.

Hình 1.5: Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo
pH.
(Nguồn: />1.2.5.4 Tủa protein bằng các non – ionic polymer
Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong
dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được
với protein giảm xuống. Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols.
Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng
điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein.
Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy
thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó. Cũng tương tự như tủa protein bằng
phương pháp điểm đẳng điện. Tại một giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic
polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống. Các ion non – ionic
polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các
dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein.

Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein.

Trang 19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nồng độ ion: 0,05 - 0,2.
Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho
quá trình tủa càng ít.
Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ
giảm vì sự hiện diện của protein kia.
Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non - ionic polymers là
protein sản phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng.
1.2.5.5 Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử
protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung
dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+,
Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có
chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb 2+ sẽ gắn với nhóm chức acid
carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb 2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu
huỳnh.
1.3 Giới thiệu về kỹ thuật sắc ký lọc gel
Các đại phân tử sinh học được tinh sạch bằng cách sử dụng các kỹ thuật sắc
ký, kỹ thuật này phân tách chúng theo sự khác biệt về các đặc tính của chúng.
Bảng 1.2: Đặc tính và kỹ thuật của một số phương pháp tinh sạch protein
Đặc tính

Kỹ thuật
Lọc gel, còn được gọi là phân tách

Kích thước

theo kích thước
Sắc ký tương tác kỵ nước

Kỵ nước
Sắc ký đảo phase

Trang 20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu
của ligand)
Điện tích

Sắc ký ái lực

Sắc ký trao đổi ion

Hình 1.6: Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại
Saphadex, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh
sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Lọc gel là kỹ thuật sắc ký đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Lọc gel
phân tách các phân tử dựa trên sự khác biệt về kích thước và trọng lượng phân tử.
Kỹ thuật này có thể áp dụng theo 2 cách:
1. Phân tách nhóm: các thành phần của một mẫu được phân tách thành 2

nhóm chính theo phạm vi kích thước. Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các
phân tử lớn hoặc các phân tử tạp chất nhỏ (như bỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc
để loại muối hoặc trao đổi đệm.

Trang 21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2. Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao: các thành phần
của một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích thước phân tử của chúng.
Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập một hoặc nhiều thành
phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lượng
phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử.
Sắc ký lọc gel cũng có thể được dùng để thực hiện việc gấp cuộn lại các
protein biến tính dễ dàng hơn bằng việc kiểm soát cẩn thận sự thay đổi điều kiện
của dung dịch đệm.
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật không tinh vi, phù hợp để thực hiện trên các
phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các
chất đồng tác động và các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Sự phân tách có thể
được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các co - factor thiết yếu, các
chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC hoặc
trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Sắc ký lọc gel phân tách
các phân tử dựa theo sự khác biệt về kích thước khi chúng di chuyển qua môi
trường lọc gel được nhồi trong cột, không giống như sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký
ái lực, các phân tử không liên kết với môi trường sắc ký do đó thành phần đệm
không ảnh hưởng trực tiếp đến độ phân giải (mức độphân tách giữa các peak). Do
đó, thuận lợi chủ yếu của sắc ký lọc gel là các điều kiện có thể thay đổi để phù hợp
theo loại mẫu hoặc theo những yêu cầu cho quá trình tinh sạch sau này, theo sự
phân tích hoặc theo quá trình bảo quản mà không làm thay đổi sự phân tách.

Sắc ký lọc gel khá phù hợp cho các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi
của pH, nồng độ ion kim loại hoặc các aco – factor và các điều kiện khắc nghiệt. Sự
phân tách có thể được thực hiện khi có mặt các ion hoặc các co - factor cần thiết,
các chất tẩy, urea, guanidine hydrochloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37 oC
hoặc ở trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Protein tinh sạch
có thể được thu nhận trong bất kỳ loại dung dịch đệm nào.
1.3.1 Phân tách bằng sắc ký lọc gel

Trang 22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi
trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính
ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp thụ và
phản ứng). Nền nhồi được cân bằng bỡi dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các
lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi
được xem như phase tĩnh và chất lỏng ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài
các hạt, được xem như phase động. Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách
đồng nhất, nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân
tách. Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời
điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào
còn lưu trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.

Hình 1.7: Quá trình lọc gel
Hình 1.7 được giải thích như sau:
1. Các hạt hình cầu của môi trường lọc gel được nhồi trong cột.

Trang 23

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2. Mẫu được nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch
tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng được miêu tả như quá trình phân đoạn
mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong
chất nền hơn và do đó lưu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích
thước lỗ gel không thể khuếch tán vào trong các lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình
di chuyển xuống dưới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trước nhất, sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình
tự kích thước của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung
môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi
trường lọc gel.
1.3.2. Phân tách nhóm
Sắc ký lọc gel được dùng trong phương thức phân tách nhóm để loại bỏ các
phân tử nhỏ ra khỏi một nhóm các phân tử lớn hơn và đây cũng là một giải pháp
nhanh, đơn giản trong việc trao đổi đệm. Các phân tử nhỏ như muối (quá trình khử
và loại muối) hoặc các gốc tự do dễ dàng được tách ra. Các mẫu có thể được chuẩn
bị để bảo quản hoặc dùng cho những phân tích hoặc kỹ thuật sắc ký khác. Sắc ký
lọc gel trong phương thức phân tách nhóm thường được dùng kết hợp trong quá
trình tinh sạch protein để loại muối hoặc trao đổi đệm.
Các loại gel như Sephadex G50, và G100 được dùng để phân tách nhóm. Thể
tích mẫu lớn, có thể lên đến 30 % tổng thể tích qua cột (nền gel đã nhồi trong cột)
có thể áp dụng với tốc độ dòng cao bằng cách sử dụng các loại cột ngắn, rộng. Hình
1.7, trình bày dữ liệu giải hấp (sắc ký đồ) của một quá trình phân tách nhóm tiêu
biểu. Các phân tử lớn được giải hấp trong hoặc ngay sau thể tích trống, Vo khi
chúng di chuyển qua cột ở tốc độ tương đương với tốc độ của dung dịch đệm. Đối

với một cột được nhồi tốt và đảm bảo, thể tích trống tương đương với khoảng 30 %
của tổng thể tích cột. Các phân tử nhỏ chẳng hạn như muối sẽ chui vào lỗ và di
Trang 24