nghiên cứu quá trình tách chiết và tinh sạch sơ bộ enzym cellulase từ trichoderma viride

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Chương 1: LỜI MỞ ĐẦU
Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều. Tận dụng
phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzym cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi
trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới
trong đó có Việt Nam. Cơ chất thường được sử dụng nhiều nhất là bã mía, bã mì, do có hàm
lượng cellulose cao. Đây là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất
cellulase ở quy mô lớn.
Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nền nông nghiệp khá phong phú, đa dạng và đang
trên đà phát triển. Lượng phế phẩm và phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào
nhưng lại không nhận được sự quan tâm đúng mức. Theo đó chất thải hữu cơ cũng tăng lên
rất nhiều. Trong đó phụ liệu của ngành sản xuất tinh bột khoai mì là một ví dụ điển hình và
chiếm khoảng ½ khoai nguyên liệu. Nếu công suất nhà máy tinh bột khoai mì là 200 tấn/ ngày
thì mỗi ngày nhà máy thải ra môi trường khoảng 20 tấn bã khoai mì gây ô nhiễm nghiêm
trọng chính vì thế đã và đang có nhiều hướng giải quyết lượng bã khoai mì sau sản xuất như
phơi khô làm thức ăn gia súc nhưng chưa khả thi do không thực sự đảm bảo nguồn dinh
dưỡng, và không tận dụng triệt để nguồn phế phẩm. Nguồn phế phẩm này để lâu sẽ bị vi sinh
vật tấn công gây hư hỏng tạo mùi khó chịu gây ô nhiễm môi trường và hao tốn diện tích.
Trong bã khoai mì có hàm lượng cellulose cao nên ta có thể tận dụng bã khoai mì như nguồn
cacbon để cảm ứng cho vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase.
Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong nông nghiệp enzym này
dùng chế biến thức ăn cho vật nuôi, bên cạnh đó chúng còn được ứng dụng cho sản xuất phân
hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase là tác nhân thủy phân nguyên liệu giàu
cellulose (rơm, rạ, gỗ vụn, mạt cưa, dăm bào…) để tạo thành glucose, mật đường thay thế dần
cho thủy phân bằng acid.
Việc tinh sạch enzym cellulase là một trong những bước tiến quan trọng của lĩnh vực
công nghệ enzym. Kỹ thuật này đã công cấp lượng enzyme sạch phục vụ cho rất nhiều lĩnh
vực, đặc biệt là trong y học.
Nắm bắt được nhu cầu của thị trường tôi tiến hành nghiên cứu việc thu nhận và tinh
sạch sơ bộ enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy Trichodema viride trên bã khoai mì.
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này chúng tôi cố gắng giải quyết các vấn đề sau:

SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 1
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Chọn chủng nấm mốc thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase.
- Tách chiết enzym thô.
- Tinh sạch sơ bộ enzym thô.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzym sau khi tinh sạch sơ bộ.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 2
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cellulose [16]
2.1.1. Cấu tạo cellulose
- Cellulose là polyanhydroglucose có mức độ trùng hợp khoảng 14000, có dạng hình
sợi. Nhiều phân tử celluose liên kết với nhau tạo thành chùm gọi là micelle nhờ liên kết
hydro. Mỗi mixen thường có khoảng 60 phân tử cellulose. Sợi cellulose không hòa tan chính
là do các phân tử cellulose được xếp song song, sát lại với nhau và phía ngoài được bao bằng
lớp vỏ chung có chứa sáp và pectin.
Bảng 2.1: Hàm lượng cellulose trong một số loại thực vật
Stt Loài thực vật Cellulose (%)
1 Tế bào nhu mô ở lá 15-20
2 Cây một lá mầm 25-40
3 Cây hạt trần 45-50
4 Cây hạt kín 40-55
5 Sợi bông 80-95
- Nghiên cứu cấu trúc Rontgen người ta thấy rằng trong cellulose có xen kẻ các phần
tinh thể và vô định hình. Ở những phần tinh thể, các mạng cellulose kết với nhau theo một trật
tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối với hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl của
carbon thứ ba của mạch khác. Những phần vô định hình thì các mạch tập hợp lại với nhau nhờ
lực Van der Waals.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 3

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Hình 2.1: Cấu tạo của phân tử cellulose
- Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của
chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học ví dụ như metyl, hoặc các gốc acetyl hình
thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose. Mặt khác, cũng có nhiều dẫn xuất của cellulose
có ý nghĩa quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp. Ví dụ như các dẫn xuất nitrocellulose,
acetylcellulose trong kỹ nghệ sợi nhân tạo, da nhân tạo, kỹ nghệ chất nổ, chất dẻo. Đặc biệt
trong thời gian gần đây, các dẫn xuất cellulose như carboxymetyl cellulose, dietylaminoetyl
cellulose được dùng rất hiệu quả trong các phương pháp sắc ký trao đổi ion để phân chia hỗn
hợp protein.
- Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với con người nhưng ngược lại ở
gia súc đó là nguồn cung cấp năng lượng chính yếu vì chúng có thể tiêu hóa cellulose một
cách dễ dàng nhờ vi khuẩn cộng sinh trong dạ cỏ có khả năng tiết ra enzym cellulase để phân
giải cellulose thành chất dinh dưỡng.
2.1.2. Đặc tính của cellulose
2.1.2.1. Tính chất vật lý
- Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước ( chỉ
phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng
chảy. Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 4
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt 40-50
0
C do sự thủy phân
cellulose bởi enzym cellulase.
- Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao.
- Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin và lignin.
Điều này ảnh hưởng đến sự phân hủy cellulose của enzym cellulase.
2.1.2.2. Tính chất hóa học
- Cellulose có thể hòa tan trong dd [ Cu(NH

3
)
4
] (OH)
2
, tan trong dung dịch H
2
SO
4
đậm
đặc.
- Khi tác dụng với chất oxy hóa, mạch cellulose tạo thành hỗn hợp phức tạp. Tính bền
hóa học của cellulose sau khi bị oxy hóa, khi bị tẩy trắng giảm đi nhiều.
- Khi bị tác dụng với kiềm đặc, cellulose tạo thành sản phẩm tương tự ancolat gọi là
muối cellulose kiềm, muối này dễ bị thủy phân cho ra cellulose ở dạng hydrat cellulose, dạng
này giống cellulose về thành phần nhưng kém bền hơn, hút nước hơn, dễ nhuộm hơn.
- Cellulose còn có tác dụng với anhydric acetic tạo sợi diacetat hay tác dụng với acid
nitrit tạo ra nitro cellulose có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thuốc nổ.
2.2. Giới thiệu sơ lược về enzym [10,11]
- Pavlov đã nói: “ hoạt động của enzym là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống.
Không có sự sống nào lại không có quá trình enzym”. Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa
của Ăng- Ghen: “Sự sống đó chính là phương thức tồn tại của thể protein”. Như vậy enzym
có bản chất là protein có hoạt tính xúc tác chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật.
- Trong cơ thể sinh vật, các phản ứng sinh hóa được xảy ra liên tục. Nhờ có phản ứng
như thế các cơ thể sinh vật mới tồn tại và phát triển được. Thực hiện và điều khiển các phản
ứng này lại hoàn toàn do enzym.
- Enzym có mặt trong mọi mô, mọi tế bào, nhưng mỗi tế bào, mỗi loại mô thường có
những hệ thống enzym đặc biệt, và cùng một enzym có trong các mô khác nhau hoặc thậm chí
ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào cũng có thể khác nhau về lượng và có khi
cả về chất.

- Các loại enzym trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao
cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt xích hoàn
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 5
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
chỉnh. Sự trục trặc nào đó ở trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm cho rối loạn cả hệ thống. Trong
khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzym lại do gen.
- Các enzym không chỉ tham gia các phản ứng xúc tác sinh hóa trong cơ thể vi sinh vật
mà còn tham gia các phản ứng ngoài cơ thể do quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Quá
trình trao đổi chất này được sự tham gia của các enzym tạo ra được các sản phẩm. Các sản
phẩm trao đổi chất được chia thành hai loại: loại sản phẩm trao đổi chất bậc 1 (các sản phẩm
phục vụ trực tiếp trong xây dựng tế bào) và loại trao đổi chất bậc 2 (các sản phẩm trao đổi
chất hoặc dư thừa hoặc không tham gia trực tiếp vào quá trình xây dựng tế bào).
- Các enzym xúc tác hầu hết cho các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống. Bảo
đảm cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng
cân đối, theo những chiều hướng xác định. Enzym đảm bảo cho sự thay đổi thường xuyên
giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là đảm bảo tiên quyết cho sự tồn tại của cơ thể
sống.
- Enzym không những hoạt động xúc tác trong tế bào mà còn ngoài tế bào vi sinh vật,
chính điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng enzym vào nhiều lĩnh vực khác của
công nghiệp và đời sống.
- Enzym có hiệu suất xúc tác cực kì lớn, hoạt động xúc tác của enzym lớn gấp hàng
trăm hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Ví dụ như trong
phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng saccharase làm xúc tác tốc độ phản ứng tăng gấp
2x10
12
lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác.
- Điều quan trọng là enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ
nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý. Hơn nữa
enzym lại có khả năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà
nó tác dụng.

- Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hóa
học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Enzym có trong tất cả các cơ quan,
mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật.
- Enzym được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau: từ động vật (pepsin từ dạ dày,
trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…). Tuy nhiên
không thể dùng hai nguồn này để làm nguyên liệu sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các
chế phẩm enzym nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Như vậy, trong các
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 6
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi
khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn. Viện sỹ viện hàn lâm khoa học Liên Xô A.A.Imsenetxki
đã nhấn mạnh: “Số lượng, tính đa dạng và hoạt tính enzym của vi sinh vật là vô cùng đặc biệt,
động vật và thực vật không tài nào so sánh được”. Enzym thu nhận từ nguồn vi sinh vật có
nhiều ưu điểm nổi bật và có tính độc đáo vượt xa các enzym từ động vật và thực vật.
- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzym với một lượng lớn và có
thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và
có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghệ khác nhau.
- Hệ enzym vi sinh vật vô cùng phong phú. Từ vi sinh vật không những chỉ có thể thu
được một số lượng lớn các enzym khác nhau, mà từ một số rất lớn vi sinh vật đã biết luôn
luôn có thể tìm được những vi sinh vật có phức hệ thích ứng tốt hơn nhiều với điều kiện của
sản xuất. Vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên. Trong lúc đó có nhiều
chất mà động vật và thực vật không thể đồng hóa được.
- Enzym của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các vi sinh vật khác. Do vậy chỉ
cần sử dụng một lượng nhỏ enzym có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất. Người ta tính
rằng trong 24 giờ, vi sinh vật có thể chuyển hóa một lượng lớn thức ăn gấp 30-40 lần so với
trong lượng cơ thể của chúng.
- Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước
bé nhưng tỉ lệ enzym trong tế bào tương đối lớn nên trong quá trình sản xuất chế phẩm enzym
khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao. Trong một thời gian ngắn, với qui mô
nhỏ cũng có thể sản xuất được enzym. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối

vi sinh vật làm nguồn enzym.
- Phần lớn thức ăn dùng để nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền. Đa số vi sinh vật cho
enzym thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản rẻ tiền như các phụ phế liệu,
phế phẩm của các ngành sản xuất.
- Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường sinh tổng hợp
các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao. Vi sinh vật rất
nhạy cảm với tác động của môi trường, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dưỡng. Vì vậy,
khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác
nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 7
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi cấy. Điều đó cho phép ta có thể tạo được những
enzym theo ý muốn, dễ dàng thu được enzym có độ thuần khiết cao.
2.2.1. Giới thiệu về enzym cellulase [11]
2.2.1.1 Định nghĩa
- Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm
hòa tan. Phức hệ enzym cellulase khá phức tạp. Một mặt chúng như một enzym cảm ứng (mà
ở đây cellulose là một chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ
chế điều khiển sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế kiềm chế dị hóa.
- Cellulose là một loại homopolyme của β-D-1,4- glucan. Hệ thống enzym thủy phân
cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-
glucanohydrolase,EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91)
và β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, β-glucosidase). Các enzym này có tính đặc
hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ cho nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết
hydrogen trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose và sau
cùng là β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
2.2.1.2. Phân loại
Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB-International
Union of Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym:
endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucosidase

có ký hiệu EC 3.2.1.21.
 Endoglucanase EC 3.2.1.4
- Tên thường gọi là cellulase
- Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase
- Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- β-D-
glucanase; β-1,4- glucanase; cellulase A; endoglucanase D; alkali cellulase;cellulase A3;
celludextrinase…Enzym này thường thủy phân các kiên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose
và các β-D-glucan của ngũ cốc.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 8
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
 Exoglucanase EC.3.2.1.91
- Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase
- Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase.
- Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1; C1 cellulase; exo- β-
1,4-glucan-cellobiohydrolase…
- Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và
cellotetraose từ đầu không khử.
 β-glucosidase EC 3.2.1.21.
- Tên thường gọi là β-glucosidase
- Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase
- Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase; salicilinase;
arbutinase…
- Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid. Một số trường hợp cũng thủy phân β-D-
galactosidase, β-D-fucoside; β-D-xyloside; α-L- arabinoside.
2.2.1.3. Cấu tạo của cellulase
- Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin
này được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn những
phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi
không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng
glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết với cellulose có cấu

tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil
hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.
- Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal. Cấu trúc không gian
khoảng 280-600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và
trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin.
- Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân
cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Trong đó exoglucanase là enzym chính trong
quá trình thủy phân cellulose.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 9
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Exoglucanase là một enzym chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose
qua một vùng liên kết được glycosil hóa cao. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi gọi là chuỗi A và
chuỗi B. Cả hai chuỗi đều có 434 acid amin gốc nhưng giữa chúng cũng có sự khác nhau để
phân biệt.
Bảng 2.2 : Đặc tính cấu trúc của exoglucanase 1
Đặc điểm cấu trúc Chuỗi A Chuỗi B
Số bản xoắn 9 9
Số sợi 33 33
Số xoắn 10 10
Số nối β 64 65
Số nối γ 4 3
Số bóng β 8 8
Số kẹp tóc β 11 11
Số đơn vị β-α-β 1 1
Số cầu disulfide 10 10
Số ion Ca 1 1
Số ion I 2 2
Số ligand NAG 2 2
Số ligand IBZ-GLC 2 2
Các xoắn β không song song tạo bề mặt chung với nhau và tạo nên một thể tích lớn

được bao bọc bên ngoài bởi các chuỗi kỵ nước và một phần nhỏ ưa nước.
Hai bản xoắn β không song song dựng chụm vào nhau mặt đối diện tạo một kẹp β.
Phần còn lại bao gồm các vòng ngắn được cố định bởi các cầu disulfide và nối các sợi β với
nhau và có 4 xoắn α trong cấu trúc.
Có một nguyên tử Ca
2+
ở cà hai chuỗi A và B của cellulose và ở mỗi chuỗi có kết hợp
với glu 295 và glu 325. Một phân tử nước được gắn vào Ca
2+
.
2.2.1.4. Tính chất
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 10
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
 Tính đặc hiệu
Cellulase thủy phân các liên kết 1,4- β-D-glucosid trong cellulose và gốc β-D-glucan
của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động lên trên các đầu chuỗi mới tạo
thành để sản xuất chủ yếu là cellobose, β-glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối
cùng từ các đầu của phân tử cellulose.
 Đặc tính hóa lý và hóa sinh
Theo nghiên cứu hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần các
acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Bên cạnh hoạt
tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác của enzym và các hoạt
động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm.
- Nhiệt độ tối ưu: 40-50
o
C
- pH tối ưu: 4-5
2.2.1.5. Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Ion
Hg

2+
ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn
2+
, Ag
+
, Zn
2+
ức chế nhẹ.
2.2.1.6. Cơ chế tác dụng
- Quá trình thủy phân cellulose tự nhiên nhờ enzym được thực hiện dưới sự tác động
của một phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu là các enzyme C1, Cx, và các glucosidase.
- Enzyme C1 là một enzym không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme này các loại
cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc…) bị trương lên và chuẩn bị cho tác động của các enzym
khác thủy phân tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzym C1 không phải là một
enzym mà chỉ là một yếu tố C1 có tác dụng làm biến đổi celluose , nhưng khi tách riêng ra thì
tác dụng này không còn nữa.
- Để xác định hoạt tính enzym C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên
nhất là sợi bông thấm nước.
- Enzym Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzym này thủy phân các cellulose
thành cellobiose, chữ x cho ta biết đây là loại enzym có nhiều thành phần khác nhau. Người ta
thường chia Cx thành 2 loại:
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 11
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Exo-β-1,4-glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ
đầu không khử của chuỗi cellulose.
- Endo- β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ chổ nào
bên trong chuỗi cellulose phân tử.
- Để xác định hoạt tính enzym Cx người ta thường sử dụng CMC (cacboxymetyl
cellulose) hay HEC (hydroxyetyl cellulose).
Theo Ogawa và Toyama (1967) cho rằng còn có một enzym khác có tác dụng trung gian giữa

C1 và Cx. Enzym C2 tác động vào các cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng
thành những loại cellulosedextrin hòa tan. Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại này thành
cellobiose.
Enzyme β-glucosidase là những enzym rất đặc hiệu, enzym này thủy phân cellobiose thành
cellohexose (D-glucose).
 Cơ chế tác động của cellulose được nêu ra bởi nhiều tác giả khác nhau:
• Theo Wakabayasi và Nisizawa (1964).
Cellulose tự nhiên cellulose kết tinh có glucose
mức cao phân tử thấp
Endoenzyme Exoenzyme
• Theo Mandels và Reese (1964).
Cellulose Cellulose Cellobiose Glucose
phản ứng
C
1
C
x
β- glucosidase
• Theo Iwasaki và các đồng sự (1965).
Cellulose Cellodextrin Glucose
C
1
C
x
Endoenzyme Exoenzyme
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 12
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
• Theo Ogawa và Toyama (1967).
Cellulose Cellulose Các sản phẩm hòa tan Cellobiose
tự nhiên không tan

C
1
C
2
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzym
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 13
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
2.2.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulase [12,13]
2.2.2.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase
Cellulase có mặt trong các hạt thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm, ốc
sên. Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn cung cấp cellulase khá phong phú gồm các loại xạ khuẩn,
vi khuẩn, nấm mốc. Popov (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của
vi sinh vật kỵ khí. G. Van Iterson (1903) phát hiện khả năng phân giải cellulose của các vi
sinh vật hiếu khí.
Trong điều kiện hiếu khí các loài nấm phân hủy cellulose mạnh hơn nhiều so với các
loài vi khuẩn. Ngược lại trong điều kiện kỵ khí thì các loài vi khuẩn lại tỏ ra khả năng này
mạnh hơn các loài nấm sợi.
Trong quá trình phân giải các chất hữu cơ có chứa cellulose, nấm và vi khuẩn tạo ra
các sản phẩm và sinh khối của chúng, khí CO
2
hoặc CH
4
và các sản phẩm phụ khác. Trong các
loài nấm chỉ có một số rất ít có khả năng sinh tổng hợp enzym cellulose cao. Các công trình
nghiên cứu về các sản phẩm enzym này phát triển không ngừng. Ngày nay nhiều nước trên
thế giới sản xuất chế phẩm cellulase vi sinh vật công nghiệp ở quy mô lớn, và đã áp dụng
trong nhiều lĩnh vực.
2.2.2.2. Xạ khuẩn
Nhiều tác giả đã nghiên cứu khả năng khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn
Streptomyces, Actinomyces… các ông đã nhấn mạnh rằng trong cùng một loài tính phân giải

cellulose của các chủng khác nhau là khác nhau.
Các loài xạ khuẩn phân giải cellulose thuộc loài Actinomyces có thể được xếp hạng
theo mức độ từ mạnh xuống yếu.
- Loại 1: Act. coelicolor, Act. sulfureus, Act. aureus, Act. ellulosae, Act. chromogenes, Act.
verne, Act. glaucus…
- Loại 2: Act. hydroscopycus, Act. griseoflavus, Act. albidus, Act. viridans, Act. griseolus…
- Loại 3: Act. themoficus, Act. xanthostromus.
- Loại 4: Act. flavochromogenes, Act. bovis, Act. sampsonii
Bằng phương pháp điện di trên tinh bột Enger và Steeper (1965) chứng minh cellulose
do Streptomyces antibioticus sinh ra thuộc loài Cx, enzym này gồm 3 thành phần khác nhau.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 14
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Sietsma và cộng sự (1968) lại nghiên cứu về enzym cellulase của một chủng xạ khuẩn chưa
định tên (Streptomices sp. 0143) và nhận thấy enzym này có tác động lên CMC, pH thích hợp
nhất là 5 còn nhiệt độ thích hợp nhất là 40
0
C.
Fergus (1969) chứng minh xạ khuẩn ưu nhiệt Streptomices thermoviolaceusvar.
Pingens có khả năng phân giải giấy lọc, chúng sinh khá nhiều enzym Cx khi phát triển trên
các môi trường chứa CMC.
2.2.2.3. Vi khuẩn
Vi khuẩn sinh ra chủ yếu endoglucanase và β-glucisudase gần như không tạo ra
exoglucnase. Người ta phân tích thấy rằng có đến 15-20 tỷ vi khuẩn/1cm
3
chất có trong dạ cỏ
ở động vật ăn cỏ, các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ.
2.2.2.4. Nấm sợi
Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Alternaria,
Trichoderma, Aspergillus, Penicillium… Chúng được tách từ đất xung quanh các vùng rễ cây,
từ rễ thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose. Một số

chủng nấm mốc đã tổng hợp cellulose có hoạt tính khá cao.
Phức hệ enzym cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ nấm Myrothecium verrucaia.
Bằng phương pháp điện di, người ta thấy phức hệ enzym này có 6 cấu tử nhưng chỉ có 3 cấu
tử có khả năng thủy phân được cellulase nguyên thủy (sợi bông) và cellulase hòa tan. Ở nấm
Polyporus versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có một là β- glucosidase. Các
enzym này khác nhau về khối lượng phân tử, về tính đặc trưng và về tốc độ tác dụng lên
cellulose.
Trong đó giống nấm sợi Trichoderma đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu sản xuất
cellulase, nấm này sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase,
nhưng chỉ một lượng ít β- glucosidase.
Quá trình sinh tổng hợp β- glucosidase thường xảy ra chậm hơn quá trình tổng hợp C1 và
Cx là do bản chất của β- glucosidase là một enzym tham gia quá trình chuyển hóa cellulose
biến tính chứ không có khả năng chuyển hóa cellulose kết tinh. Như vậy cellulose biến tính có
thể xem như là chất cảm ứng của β- glucosidase, mà cellulose biến tính được hình thành trên
cơ sở dưới tác dụng của enzym C1.
2.2.2.5. Giới thiệu về nấm sợi Trichoderma viride [13]
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 15
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
 Vị trí phân loại
- Lớp Deuteromycetes.
- Bộ Moniliales.
- Họ Moniliaceae.
- Giống Trichoderma.
- Loài Trichoderma viride.
Trichoderma được phân bố nhiều trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất có
chứa phân hữu cơ.
Trichoderma viride hoạt tính ưu việt là hệ cellulase của chúng hoạt động rất mạnh và
khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên tạo thành glucose với hiệu suất cao.
 Hình thái
Khuẩn lạc mọc nhanh trên môi trường thạch, ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc khi còn non có

màu trắng, khi già chuyển màu xanh rêu do màu của bào tử đính.
Khuẩn ty có vách ngăn, cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh như cành cây, mỗi nhánh
mang nhiều tế bào sinh ra bào tử đính riêng rẽ. Bào tử đính có màu xanh, hình cầu, bào tử
đính dính nhau thành cụm.
Hình 2.3: Hình thái nấm mốc Trichoderma viride
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 16
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
2.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzym
Trong công nghệ enzym từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzym.
- Giống vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính
enzym).
- Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
- Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm. Như vậy giống vi sinh vật có ý
nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật.
2.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzym
Công nghệ sản xuất enzym thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo
quy mô công nghiệp. Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzym cần có những
yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
- Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số
lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì vậy trong quá trình trao đổi chất, để
chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một
khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều
loại sản phẩm khác nhau. Chính vì thế giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào
đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
- Cho năng suất sinh học cao.
- Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp.
- Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại đại phương nơi nhà máy
đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần

khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản phẩm ra khỏi
các tạp chất.
- Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công
nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
2.5. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp cellulase [12,13]
2.5.1. Sinh tổng hợp enzym cảm ứng
Một quá trình sinh tổng hợp enzym được gọi là cảm ứng nếu như nó chỉ xảy ra với
mức độ đáng kể khi môi trường có cơ chế đặc hiệu của enzym này hoặc các chất có cấu trúc
tương tự cơ chất. Các enzym thuộc loại này được gọi là enzym cảm ứng. Các cơ chất kích
thích quá trình sinh tổng hợp enzym này được gọi là cơ chất cảm ứng. Cellulase là một hệ
enzym thuộc hệ enzym cảm ứng. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên môi
trường chứa cellulose hay dẫn xuất của cellulose và lactose, còn trên môi trường chứa
glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không sinh ra. Một trong các phân tử kích thích
nấm sợi sinh tổng hợp cellulase có hiệu quả nhất là sophorose, chất này có nguồn gốc từ các
phân tử celloligosaccharide.
2.5.2. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp enzym
cellulase của vi sinh vật.[11]
2.5.2.1. Nguồn carbon
Để vi sinh vật tổng hợp enzym cellulase , trong môi trường nhất thiết phải có chất cảm
ứng là cellulose. Cellulose trong môi trường có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô,
mùn cưa, rơm… Ngoài ra chất cảm ứng của cellulase còn có thể là cám mì, lactose.
Những loài vi sinh vật khác nhau thì có những nguồn cản ứng khác nhau vì từ chất cảm
ứng đó vi sinh vật sẽ sinh ra enzym có hoạt tính mạnh nhất.
Các nguồn carbon khác nhau như glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalate và những sản
phẩm trung gian của chu trình Krebs, nếu trong môi trường có nồng độ rất ít thì có tác dụng
kích thích vi sinh vật phát triển và tạo ra enzym, nhưng nếu có nồng độ cao thì kìm hãm sinh

tổng hợp cellulase.
2.5.2.2. Nguồn nitơ
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 18
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất rõ rệt với việc tạo thành cellulase
ở nấm. Theo Sin và Sinden (1951) khi sử dụng hết 1g nitơ nhiều vi sinh vật phân giải
cellulose sẽ phân giải được khoảng 24-25g cellulose.
Hoạt tính enzym có thể thay đổi rất nhiều khi ta thay đổi các thành phần chính của môi
trường trong đó có nitơ. Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật.
Trong môi trường nuôi cấy, các muối amon làm acid hóa môi trường nên nó ít có tác
dụng nâng cao hoạt lực enzym cellulase mà thậm chí còn ức chế quá trình sinh tổng hợp
enzym, và có thể làm mất hoạt tính enzym sau khi tạo thành.
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành
cellulase. Tùy theo đặc tính sinh lý của từng giống mà các hợp chất nitơ có tác dụng khác
nhau đến sinh tổng hợp cellulase. Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành
endoglucanase, còn cao ngô kích thích sinh ra exoglucanase I và exoglucanase II. Tác dụng
kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt các acid amin, các nguyên tố khoáng và
những nhân tố sinh trưởng khác.
2.5.2.3. Các nguyên tố khoáng và vitamin
Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rất rõ rệt đến khả năng tổng hợp cellulase của vi
sinh vật. Trong đó, Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzym này ở nhiều chủng.
Nồng độ tối thích của Zn là 1,1- 2,2mg/l, Fe 2-10mg/l, Mn 3,4-27,2 mg/l.
Biotin và thiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến tổng hợp enzym
cellulase.
2.5.2.4. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzym của vi
sinh vật. Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hóa của hàng loạt các phản
ứng dựa theo những trình tự xác định. Khi nhiệt độ tăng tốc độ các phản ứng này cũng tăng
theo, nhưng khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó thì tốc độ các phản ứng sẽ giảm.
Các loài khác nhau thì có nhiệt độ hoạt động khác nhau, như Aspergillus niger,

Trichoderma koningi phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-30
0
C, đối với loài xạ khuẩn ưa nhiệt
như Thermonospora curvate phát triển ở nhiệt độ 50-60
0
C và tích lũy nhiều enzym phân giải
cellulose trên môi trường nuôi cấy chứa cellulose vi tinh thể và cao nấm men.
2.5.2.5. pH ban đầu
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 19
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp
cellulase của vi sinh vật. pH của môi trường ảnh hưởng không giống nhau đối với những loài
vi sinh vật khác nhau. Nhiều loài nấm phát triển và phân giải cellulose mạnh ở pH 4,6.

2.6. Giới thiệu phương pháp lên men bề mặt.
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện theo
phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu
nhận chế phẩm enzym mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá
trình lên men truyền thống.
2.6.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề
mặt môi trường, những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
+ Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp.
+ Lượng enzym tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy
chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao nuôi cấy bề mặt hiện nay
phát triển mạnh trở lại.
+ Chế phẩm enzym thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzym
và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành
công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.

+ Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là
môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó
khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những nhược điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn
thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tốn khá nhiều diện
tích nuôi cấy. Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi
trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 20
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
2.6.2. Phương pháp lên men bề mặt và thu nhận enzym cellulase từ nấm Trichoderma
viride .
2.6.2.1. Lên men bề mặt
Là quá trình mà vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (bã mì, bã
mía, bột bắp…) được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng nước từ
30-70% phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cơ chất và thế nước tối thiểu cần cho sự
phát triển của vi sinh vật).
Trichoderma viride phát triển trên môi trường chất dinh dưỡng dạng rắn ( môi trường
rắn trước khi nuôi cấy nấm mốc cần làm ẩm trước). Để môi trường không bị bết dính trong
khi hấp chín người ta bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác. Sau khi hấp môi trường
được làm nguội 30-40
0
C rồi cấy vi sinh vật vào, trộn đều và nuôi ở nhiệt độ 28-30
0
C trong 35-
48 giờ, trong phòng thí nghiệm vô trùng có độ ẩm không khí 80-90%.
Nấm khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxy của
không khí để hô hấp. Để đảm bảo nấm mọc đều trên bề mặt của môi trường và sử dụng nhiều
chất dinh dưỡng để sản sinh enzym, lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày khoảng từ
2-5 cm.
Sau khi nuôi đủ thời gian để Trichoderma viride tổng hợp enzym, thu lấy môi trường

đem sấy nhẹ ở nhiệt độ 40
0
C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ,
thủy tinh hay túi PE. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết
phải qua giai đoạn tách và tinh chế.
2.6.2.2. Cơ chất cảm ứng
Bã khoai mì là chất thải có được từ quá trình chế biến tinh bột khoai mì. Lượng bã thải
này chiếm khoảng 20% lượng nguyên liệu và chiếm 50% tổng bả rắn.
Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 1998, diện tích trồng khoai mì ở nước ta gần
300000 ha với năng suất bình quân khoảng 9-10 tấn/ha, cho sản lượng gần 3 triệu tấn/năm.
Với kỹ thuật chế biến như của nước ta hiện nay lượng bã chiến khoảng ½ lượng nguyên liệu
và như vậy sẽ đạt đến trên 1 triệu tấn/năm. Có nhiều nhà máy sản xuất tinh bột khoai mì với
công suất bình quân 200 tấn/ngày, thải ra khoảng 120 tấn bã khoai mì tươi/ ngày.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 21
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
- Trong hàm lượng bã khoai mì có hàm lượng tinh bột kể cả carbohydartes hòa tan
chiếm 40-70%, xơ khoảng 10-20%, protein 2-4%, chất béo 1-2% và lượng khoáng tổng không
quá 3%.
- Phần bã lâu nay vẫn chưa được sử dụng một cách hợp lý đồng thời cũng là một nhân
tố làm ô nhiễm môi trường sống của dân cư vùng chế biến. Với số lượng lớn như vậy, việc xử
lý và sử dụng có hiệu quả nguồn bã thải này sẽ có ý nghĩa kinh tế xã hội đáng kể.
2.7. Tách và tinh sạch chế phẩm enzym
- Trong cơ thể sinh vật , enzym có trong tế bào chất của tế bào. Các phân tử enzym không có
khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút enzym nội bào trước hết cần phải
phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học
( nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng tác dụng của các
dung môi hữu cơ (rượu butylic, aceton, glycerin…), của sóng siêu âm.
- Việc tách enzym ra khoải tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng phải hết sức
lưu ý:
+ Enzym có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác.

Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn.
+ Enzym là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên
ngoài.
+ Enzym là protein mà proteine enzym luôn luôn đi cùng với những loại protein
không phải enzym nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau. Do đó việc tách protein
enzym ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải
không gặp những khó khăn nhất định.
- Đa số các ngành sản xuất thực phẩm cũng như công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải dùng
enzym sạch. Để tách chiết enzym từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung
dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó, nước được sử dụng rộng rãi
và cho kết quả tốt nhất. Các enzym được chuyển từ tế bào vào nước do sự chênh lệch nồng
độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp sao cho hàm lượng
chất khô không nhỏ hơn 50-55%.
- Theo phương pháp khuếch tán bằng nước, có thể chiết được lượng enzym trên 90-95% và
trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dùng để chiết có nhiệt độ
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 22
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
25-28
0
C. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10-15% chất khô hòa tan và
được làm lạnh kịp thời xuống còn 10-12
0
C. Trong dịch chiết ngoài enzym còn chứa các
protein tạp và nhiều chất khác , để loại bỏ chúng cần thực hiện nhiều biện pháp khác nhau.
- Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng biện pháp thẩm
tích đối với nước hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel.
- Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp
nhiều biện pháp khác nhau. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc
pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi
hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp

lọc gel.
2.8. Ứng dụng của cellulase [8]
Enzyme cellulase là enzym thủy phân cellulose, tạo ra các sản phẩm đường dễ tiêu
hóa. Thêm chế phẩm cellulase vào thức ăn giàu cellulose của động vật, thậm chí của người
làm cho thực phẩm này mềm ra, dễ tiêu hóa hơn, do vậy tăng chất lượng và độ hấp thụ thức
ăn này.
2.8.1. Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc
Chúng ta đều biết cellulose là thành phần quan trọng của vỏ tế bào thực vật. Các
nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ
mềm ra tăng hệ số đồng hóa, chất lượng được tăng lên. Do đó rất bổ ích khi sử dụng thức ăn
cho trẻ em, cho người ăn kiêng cũng như chế biến thức ăn cho gia súc. Việc nghiên cứu và sử
dụng trực tiếp enzym cellulase trong quá trình chế biến thực phẩm cũng như trong chế biến
thức ăn gia súc để cải thiện độ tiêu hóa đang được chú ý rất nhiều. Ở Trung Quốc đang có
phong trào sử dụng nấm mốc để chế biến các phụ phẩm nông nghiệp thành thức ăn cho lợn,
còn ở Việt Nam đang có những ứng dụng cellulase trong việc thủy phân vỏ dứa, vỏ chuối…để
làm thức ăn gia súc.
2.8.2. Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ
Cellulase thủy phân gỗ và các phế liệu của gỗ, giấy báo cũ thành glucose. Enzym
cellulase của Trichoderma viride thủy phân 100g cellulose thành 25g đường. Trong quá trình
ủ cỏ xanh, sự phối hợp giữa enzym cellulase và các enzym thủy phân khác như pectinase,
hemicellulase…có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 23
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
nhóm vi sinh vật Lactobacillus lên men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh
vật có hại khác.
2.8.3. Cellulase được sử dụng để phá vỡ thành tế bào
- Cellulase phá vỡ tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật từ cây thuốc dễ
dàng. Điều này còn giúp cho việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào trần nhằm tạo các tế bào lai có
những tính trạng mới theo mong muốn.
- Cellulase được sử dụng để sản xuất tinh bột. Cellulase của chủng Trichoderma viride và của

một số chủng nấm còn được sử dụng để tách tinh bột ra khỏi khoai lang và đậu tương. Sau khi
tách rời các tế bào khoai lang hay đậu tương ra nhờ các enzym tách tế bào người ta cho tiếp
xúc với cellulase để phá vỡ thành tế bào và do đó giải phóng tinh bột ra một cách thuận lợi
hơn. Cellulase còn có tác dụng làm mềm vải nên được bổ sung vào thành phần chất giặt tẩy
trong công nghiệp bột giặt.
- Một ứng dụng khác của cellulase là thủy phân cellulose để cung cấp cơ chất cho quá trình
lên men, tạo ra hàng loạt các sản phẩm mong muốn như ethanol, glycerin, protein đơn bào…
việc sử dụng cellulase của T.viride để chuyển hóa các phế liệu chứa cellulose thành ethanol
cũng đang được nghiên cứu và áp dụng. Người ta nhận thấy trộn xăng với ethanol là biện
pháp hữu hiệu để giảm bớt chi phí về xăng cho các loại xe hơi, xe máy và bớt bụi khói.
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 24
Luận văn tốt nghiệp GVHD: Ths. Huỳnh Quang Phước
Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên vật liệu
3.1.1. Giống vi sinh vật
Vi sinh vật sử dụng cho nghiên cứu là nấm mốc: Trichoderma viride, Aspergillus
oryzae. Các giống vi sinh vật được phân lập và giữ giống tại phòng thí nghiệm vi sinh Trường
đại học kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Nguyên liệu
Bã khoai mì: được cung cấp bởi nhà máy chế biến tinh bột khoai mì ở Tây Ninh. Sau
khi mang về được sấy khô cho vào túi PE bảo quản ở nhiệt độ phòng. Thành phần chính của
bã khoai mì gồm ( theo hàm lương chất khô).
Bảng 3.1: Thành phần hóa học bã khoai mì
Thành phần Hàm lượng
Tinh bột 21,1%
Cellulose 19%
Protein 1,75%
Đường khử 0,324%
SVTH: Huỳnh Thị Hồng Sương 25