Phân Lập Chủng Vi Khuẩn Có Khả Năng Xử Lý Nitrate Trong Nước Thải Công Nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
XỬ LÝ NITRATE TRONG NƯỚC THẢI CÔNG
NGHIỆP

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

.
Giáo viên hướng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt.
Sinh viên thực hiện
MSSV:

: Nguyễn Thị Thanh Trang
Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012



MỤC LỤC

MỤC LỤC ............................................................................................................ i
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................9
1. Đặt vấn đề ......................................................................................................9
2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................10
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................10
4. Tính cấp thiết nghiên cứu ............................................................................10
5. Phạm vi nghiên cứu .....................................................................................11
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ..............................................................................12
1.1.Tổng quan về nitrate trong nƣớc thải và ảnh hƣởng của chúng ...............12
1.1.1.Qúa trình hình thành nitrate tổng quá [4] ..............................................12
1.1.1.1 Chu trình nitơ trong ao hồ ...............................................................13
1.1.1.2 Quá trình amon hóa .........................................................................13
1.1.1.3 Quá trình nitrate hóa ........................................................................14
1.1.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nitrate hóa[24] .............................15
1.1.2.1 Nhiệt độ ...........................................................................................15
1.1.2.2 pH ....................................................................................................15
1.1.1.3 Vi sinh vật .......................................................................................16
1.1.3.Ảnh hƣởng của nitrate đến sức khỏe con ngƣời[] .................................16
1.1.4. Ảnh hƣởng của nitrate đến các sinh vật thủy sinh[24] .........................17

i


1.1.5. Nguyên nhân có mặt nitrate trong nguồn nƣớc ngầm, nƣớc mặt, nƣớc
cấp[2] .....................................................................................................................19
1.2. Các phƣơng pháp loại bỏ nitrate trong môi trƣờng .................................19
1.2.1 Phƣơng pháp trao đổi ion.......................................................................19
1.2.2 Lọc thẩm thấu ngƣợc .............................................................................20
1.2.3 Phƣơng pháp sinh học ............................................................................21
1.3 Vai trò của các chủng vi khuẩn trong quá trình xử lý nitrate .................21

1.4 Tổng quan về vi khuẩn .............................................................................23
1.4.1 Thiobacillus denitrificans[11] ................................................................23
1.4.1.1 Phân loại. .........................................................................................23
1.4.1.2 Đặc điểm.........................................................................................24
1.4.1.3 Cơ chế loại bỏ nitrate của T.denitrificans ......................................25
1.4.1.4 Ứng dụng. ........................................................................................26
1.4.2 Pseudomonas stutzeri.............................................................................26
1.4.2.1 Nguồn gốc[19] .................................................................................26
1.4.2.2 Phân loại .........................................................................................27
1.4.2.3 Đặc điểm sinh lý và điều kiện sống[12] ..........................................27
1.4.2.4 Đặc điểm chung[22,23] ...................................................................28
1.4.2.5 Đặc điểm hình thái và cấu trúc khuẩn lạc.[14]...............................29
1.4.2.6 Hoạt tính sinh học...........................................................................31
1.4.2.7 Cơ chế khử

của P. Stutzeri[18] ...........................................32

1.4.2.8 Ứng dụng2[1, 2] .............................................................................33
1.4.3 Paracoccus denitrificans ........................................................................33
1.4.3.1 Nguồn gốc[5] ...................................................................................33

ii


1.4.3.2 Phân loại ..........................................................................................33
1.4.3.3 Đặc điểm sinh học. ..........................................................................34
1.4.3.4 Ứng dụng. ........................................................................................35
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................37
2.1 Thời gian và địa điểm ...............................................................................37
2.1.1 Thời gian ................................................................................................37

2.1.2 Địa điểm .............................................................................................37
2.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu ............................................................................37
2.1.2.2 Địa điểm thực hiện thí nghiệm ........................................................37
2.2 Dụng cụ và hóa chất .................................................................................37
2.2.1 Dụng cụ ..................................................................................................37
2.2.2 Hóa chất .................................................................................................37
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................38
2.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................38
2.3.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitrate trong mẫu ...........................38
2.3.3. Phƣơng pháp xác định hàm nitrite trong mẫu ......................................39
2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu .....................................................................40
2.4. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................40
2.4.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate.........................................40
2.4.1.1 Quy trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy nitrate ........40
2.4.1.2 Sàng lọc khả năng loại bỏ nitrate đối với các chủng vi khuẩn ........41
2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình xử lý nitrate của chủng vi
khuẩn phân lập đƣợc. .............................................................................................41

iii


2.4.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ
nitrate .................................................................................................................42
2.4.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ nitrate
............................................................................................................................42
2.4.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ nitrate
............................................................................................................................42
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................44
3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy nitrate .........................44
3.1.1. Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên môi trƣờng

Giltay .....................................................................................................................44
3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn xử lý nitrate từ mẫu đất..............................45
3.2 Kết quả xác định đặc điểm hình thái ........................................................45
3.3. Kết quả sàng lọc khả năng phản nitrate, và khả năng sinh nitrite của các
chủng vi khuẩn .......................................................................................................47
3.3.1. Kết quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn sau 168 giờ ...................47
3.3.2. Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát ..........................48
3.3.3. Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn
sau 168h .................................................................................................................49
3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình loại bỏ
nitrate và khả năng sinh nitrite (Foglar và ctv, 2004) ............................................50
3.4.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình xử lý
nitrate .....................................................................................................................50
3.4.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite
trong quá trình xử lý nitrate ...................................................................................51
3.5.Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate đến quá trình loại bỏ
nitrate (Foglar và ctv, 2004; Reazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011) ................52

iv


3.6 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ
nitrate (Rwazee và ctv, 2010; Liang và ctv, 2011). ...............................................53
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................56
4.1. Kết luận ....................................................................................................56
4.2. Kiến nghị..................................................................................................56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................58
PHỤ LỤC ...........................................................................................................60

v

DANH MỤC HÌNH
Hình1.1: Chu trình nitơ trong hồ……………………..……………………………11
Hình1.2: Các con sông bị phú dƣỡng hóa, nhiễm nitrate………..………………..16
Hình 1.3: Khuẩn lạc P. stutzeri có nếp nhăn, màu hơi đỏ nâu, khô và dính chặt với
nhau……..………………………………………………………………………….21
Hình

1.4:

Tế

bào

vi

khuẩn

T.denitrificans

có

dạng

hình

que

ngắn………………………………………………………………………………...22

Hình 3.1: Kết quả xử lý nitrate sau 168 giờ của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303,
303, 304, 305…………………………………………………………………….…38
Hình 3.2 : Tốc độ xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát…………………39
Hình 3.3: Kết quả sinh nitrite trong quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn
sau 168h……………………………………………………………………………40
Hình 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite trong
quá trình xử lý nitrate………………………………………………………………41
Hình 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn đến sự sinh nitrite quá
trình xử lý nitrate……………………………………………………………...……43
Hình 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ nitrate 200mg/l, 400mg/l,
600mg/l, 800mg/l lên quá trình loại bỏ nitrate……………………………….…….44
Hình 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng loại bỏ
nitrate………………………………………………….…………...………………45

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả định tính các mẫu chứa vi khuẩn xử lý nitrate trên môi trƣờng
Giltay………………………………………………………………………………43
Bảng 3.2: kết quả hình thái khuẩn lạc của 5 chủng phân lập trên môi trƣờng
DM……………………………………………………………………………….44
Bảng 3.3: Bảng kết quả sát định đặc điểm của 5 chủng vi khuẩn 301, 302, 303, 304,
305………………………………………………………………………………….45

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DM

:

Denitrification medium

LB

:

Lysogeny broth

PDA

:

Diphenyl sulfur acid

ETDA

:

Ethylenediaminetetraacetic acid

viii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Căn cứ vào Luật Môi Trƣờng do Quốc hội khóa IX kỳ họp thứ tƣ (từ ngày 6 đến

ngày 30 tháng 12 năm 1993) thông qua thì “ Môi trƣờng bao gồm các yếu tố tự
nhiên và yếu tố vật chất nhân tạo quan hệ mật thiết với nhau bao quanh con ngƣời,
có ảnh hƣởng tới dời sống, sản xuất, sự tồn tại, phát triển của con ngƣời và thiên
nhiên”.
Bảo vệ môi trƣờng đƣợc quy định là “ Những hoạt động giữ cho môi trƣờng
trong lành, sạch đẹp, cải thiện môi trƣờng, đảm bảo cân bằng sinh thái, ngăn chặn,
khắc phục các hậu quả xấu do con ngƣời và thiên nhiên gây ra cho môi trƣờng, khai
thác, sử dụng hợp lý và tiết kiệm tài nguyên thiên nhiên”.
Một số nƣớc nhƣ Trung Quốc gọi môi trƣờng là hoàn cảnh sống, đó là từ chính
xác để chỉ điều kiện sống của cá thể hoặc quần thể vi sinh vật… Sinh vật và con
ngƣời không thể sống tách rời khỏi môi trƣờng của mình cho nên cũng có thể nói
môi trƣờng tự nhiên là cái nôi sinh thành của con ngƣời.
Trong các loại môi trƣờng từ môi trƣờng nƣớc, môi trƣờng không khí và môi trƣờng
đất là những môi trƣờng rất quan trọng trong cuộc sống của mỗi loài sinh vật sống
trên Trái Đất. Và môi trƣờng chúng tôi quan tâm ở đây là môi trƣờng nƣớc. Ở nƣớc
ta, ô nhiễm nguồn nƣớc chủ yếu ở các khu vực đô thị, các khu công nghiệp và các
bến cảng lớn.
Theo các số liệu đã phân tích trên đây, chúng ta thấy có thể nêu lên một số nhận xét
chung về tình hình ô nhiễm môi trƣờng nƣớc của chúng ta nhƣ sau:
Đất nƣớc sau giải phóng: nƣớc ta đã giành khá nhiều tập trung cho việc hàn gắn
những vết thƣơng chiến tranh, tốc độ phát triển công nghiệp chƣa cao. Vì vậy, tổng
lƣợng chất thải độc hại dƣới dạng rắn, lỏng chƣa phải đã nhiều so với các nƣớc
đang phát triển, tuy có nơi có lúc cũng đã thể hiện mức độ nghiêm trọng của nó.
Nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm phần lớn các nhà máy xí nghiệp chƣa có hệ thống xử
lý trƣớc khi đổ vào hệ thống nƣớc thải của thành phố. Nếu có hệ thống xử lý nƣớc
thải đi chăng nữa cũng chỉ mới bƣớc đầu nghiên cứu, thử nghiệm nên hiệu quả chƣa

9

cao. Hoặc có nơi tuy đã trang bị những hệ thống xử lý nƣớc thải nhƣng không chịu
vận hành vì sợ tốn kém…
Hiện nay, Việt Nam đang trong công cuộc xây dựng kiến thiết đất nƣớc theo
hƣớng công nghiệp hóa, hiện đại hóa với sự phát triển dân số và tốc độ đô thị hóa
cao. Xử lý sinh học bằng các chủng vi sinh vật với ƣu điểm là phù hợp điều kiện tự
nhiên, giảm chi phí năng lƣợng, hóa chất, đơn giản, có khả năng tận dụng các sản
phẩm phụ sau xử lý đang là phƣơng pháp có tiềm năng. Trong đó hoạt động của các
vi sinh vật giữ vai trò rất quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả xử lý của toàn bộ hệ
thống.Trong nƣớc thải công nghiệp có chứa hàm lƣợng nitrate cao có chứa các vi
sinh vật có khả năng phân hủy nitrate. Các chủng vi sinh vật này có nhiều ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn
này đƣợc chúng tôi tiến hành trong đề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi
khuẩn có khả năng xử lý nitrate trong nƣớc thải công nghiệp”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn
có khả năng phân hủy nitrate.
3. Nội dung nghiên cứu
Tuyển chọn và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải nitrate, nitrite
của các chủng vi khuẩn.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn
phân lập đƣợc.
4. Tính cấp thiết nghiên cứu
Hiện nay, việc loại bỏ các chất đạm từ công nghiệp và chất thải trong nƣớc đã
đƣợc nhận nhiều sự quan tâm do có nhiều hiện tƣợng phú dƣỡng hóa từ trong nƣớc.
Đã có nhiều phƣơng pháp xử lý để loại bỏ nitơ đƣợc xử dụng bằng phƣơng pháp
sinh học, hóa học, các yếu tố vật lý. Gần đây nitơ đƣợc loại bỏ bằng phƣơng pháp
sinh học đã đƣợc tìm thấy và áp dụng rộng rãi, do cách tiếp cận xử lý nƣớc thải từ
các vi sinh vật trở nên dễ dàng và dễ thực hiện, sử dụng hiệu quả, chi phí tiết kiệm.

10

Các quá trình sinh học phổ biến nhất bao gồm nitrate hóa, oxi hóa ammonium,
nitrite thành nitrate. Sinh vật tự dƣỡng trong điều kiện hiếu khí, kỵ khí và khử nitơ
chuyển đổi nitrite và nitrate thành nitơ . Vì vậy nó bao gồm các bƣớc chuyển hóa
khá đặc biệt, bao gồm hiếu khí và kỵ khí đƣợc chuẩn bị. Trong những năm qua, một
số nhóm di dƣỡng nitrate các vi khuẩn nhƣ Paracoccus,Thiosphaera
pantotropha,Cammamonas sp. và Alcaligences faecalis đƣợc báo cáo là có quá
trình nitrate hóa dị dƣỡng và khả năng khử nitơ hiếu khí. Nhƣ vậy chúng có thể
đƣợc xử dụng để khắc phục các vấn đề khó khăn trong hệ thống nƣớc thải nhƣ làm
giảm các chi phí có liên quan với tình trạng thiếu oxi trong các bể chứa hoặc làm
giảm kích thƣớc của bể chứa khi cần thiết. Khả năng khử yếm khí trong điều kiện
bầu không khí có oxi cao đã đƣợc chứng minh. Vì thế em thực hiện đề tài “ Phân
lập vi khuẩn xử lý nitrate từ nước thải và xác định khả năng loại bỏ nitrate của
chúng trong điều kiện hiếu khí”.
5. Phạm vi nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu hạn chế nên chỉ có thể phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn
có khả năng xử lý nitrate, nitrite tốt. Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến
khả năng phân hủy một cách tốt hơn.

11


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về nitrate trong nƣớc thải và ảnh hƣởng của chúng
Nitrate (NO3-) đƣợc tạo thành tự nhiên từ nitơ trong lòng đất. Nitơ là một loại khí
chiếm tới gần 80% bầu khí quyển và rất cần thiết cho sự sống. Rễ cây hấp thụ càng
nhiều nitơ thì năng suất của mùa màng càng cao.
Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần
hoàn của nitơ trong tự nhiên. Thực phẩm và đồ uống có chứa một hàm lƣợng nitrate

thấp thì không có hại cho sức khỏe. Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để lấy dƣỡng
chất và có thể sẽ tạo một dƣ lƣợng nhỏ trong lá và quả. Do tính cơ động cao, nitrate
dễ dàng thấm vào nguồn nƣớc ngầm. Nếu con ngƣời và súc vật uống phải nƣớc có
nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ.
Nitrate hình thành khi vi sinh vật chuyển hóa phân bón, phân hủy xác động thực
vật. Nếu cây cối không kịp hấp thụ hết lƣợng nitrate này thì nƣớc mƣa và nƣớc tƣới
sẽ làm cho nó ngấm vào lòng đất, làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm. Rất tiếc là con
ngƣời lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất thông qua các
hoạt động nông nghiệp.[1,3]
1.1.1.Qúa trình hình thành nitrate tổng quá [4]

12


Hình 1.1 : Chu trình nitơ trong ao hồ
1.1.1.1 Chu trình nitơ trong ao hồ
Chu trình nitơ là một trong những mô hình tuần hoàn vô hình và quan trọng nhất
đối với môi trƣờng thủy sinh. Tôm cá và các động vật thủy sinh trong quá trình sinh
sống chúng bài tiết ra NH3, nếu ở nồng độ cao NH3 sẽ gây độc. Chu trình nitơ, trong
đó có quá trình amôn hóa và quá trình nitrate hóa diễn ra nhờ vào hoạt động của các
vi khuẩn có ích giúp chuyển hóa các chất độc thành những chất có ích cho đời sống
của thực vật thủy sinh và giúp các động vật thủy sinh không bị độc từ chất thải do
chúng bài tiết ra.
1.1.1.2 Quá trình amon hóa
Amôn hóa là quá trình phân hủy và chuyển hoá các hợp chất hữu cơ phức tạp
thành NH3 dƣới tác dụng cuả vi sinh vật. Dƣới tác dụng của enzyme phân hủy
protein (enzyme proteolytic, thƣờng gọi là enzym protease) làm chất xúc tác sẽ

13

phân hủy protein thành các chất đơn giản hơn, các chất này tiếp tục đƣợc phân giải
thành acid amin nhờ tác dụng của enzyme peptidase ngoại bào. Một phần nhỏ acid
amin sẽ đƣợc vi sinh vật sử dụng để tổng hợp thành protein của chúng (protein xây
dựng cấu trúc cơ thể của vi sinh vật), phần còn lại đƣợc tiếp tục phân giải tạo ra
NH3, CO2, SO42- (nếu các acid amin có chứa S) và các sản phẩm trung gian khác.
Trong nƣớc, NH3 sẽ đƣợc chuyển hóa thành NH4+ theo phản ứng sau:
NH3 + H2O  NH4+ + OH- (1)
1.1.1.3 Quá trình nitrate hóa
Dƣới tác dụng của một số vi sinh sinh thì NH4+ đƣợc hình thành từ quá trình
amôn hóa sẽ đƣợc tiếp tục chuyển hóa thành NO2- (nitrite) rồi thành NO3- (nitrate).
Trƣớc hết NH4+ đƣợc chuyển hóa thành NO2- bởi vi khuẩn Nitrosomonas, sau đó vi
khuẩn Nitrobacter sử dụng men nitrite oxidase để chuyển hóa NO2- thành NO3- .
NO3- có thể đƣợc các thực vật thủy sinh sử dụng nhƣ là một nguồn dinh dƣỡng hoặc
có thể bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2) qua hoạt động của các vi khuẩn yếm
khí nhƣ Pseudomonas. Các quá trình chuyển hóa NH4+ đều cần sự tham gia của oxy
và độ kiềm của nƣớc. Quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn đƣợc thực hiện bởi hai
nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau. Hai giống vi khuẩn này có mối quan hệ mật thiết với
nhau. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên; môi trƣờng đất, nƣớc. Môi trƣờng
thích hợp cho cả 2 loại này phải có pH>6 (tối ƣu ở pH=7-8).
Giai đoạn nitrit hóa :Chuyển hóa NH4+ thành NO2- (2) bởi nhóm vi khuẩn nitrite
hóa.
NH4+ + 1,5 O2  NO2+ 2H++ H2O (2)
Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hóa là vi khuẩn hóa vô cơ tự
dƣỡng, là loài vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Khi chúng chuyển hóa NH4+ thành NO2sẽ sinh ra năng lƣợng, năng lƣợng này sẽ đƣợc các vi khuẩn nitrite hóa sử dụng cho
hoạt động sống của mình. Sự có mặt của các nhóm vi khuẩn nitrite hóa giúp loại bỏ
đƣợc NH4+, khi hàm lƣợng NH4+ trong nƣớc giảm phƣơng trình phản ứng (1) sẽ
dịch chuyển theo chiều thuận dẫn đến làm giảm hàm lƣợng NH3 trong nƣớc, làm
giảm khả năng gây độc của NH3 đối với tôm cá.

14


Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hóa hiện diện rất nhiều: Nitrosococcuseanus,
Nitrosococcus (thuộc phân lớp γ- proteobacteria), Nitrosomonas sp và Nitrosopira
sp (thuộc phân lớp β- proteobacteria), Nitrosocystis, Nitrosolobus. Tất cả các vi
sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hoá nhƣng khác nhau khác nhau về
đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào. Tất cả đều thuộc loại tự dƣỡng bắt buộc,
không có khả năng sống trên môi trƣờng thạch.
Giai đoạn nitrat hóa : Chuyển NO2- thành NO3- (3) bởi nhóm vi khuẩn nitrate
hóa.
NO2 + 0,5 O2 --> NO3 (3)
Sau quá trình nitrite hóa thì các vi khuẩn thuộc nhóm nitrate hóa sẽ thực hiện giai
đoạn tiếp theo, chuyển hoá NO2- thành NO3- (là sản phẩm cuối cuả quá trình nitrat
hóa). Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa cũng là vi khuẩn hóa vô cơ tự
dƣỡng, vi khuẩn nitrate hóa thƣờng gặp (gồm có 3 chi khác nhau): Nitrobacter
vinogradskii, Nitrobacter agilis ( thuộc phân lớp α-Proteobacteria), Nitrospina
gracili , Nitrococcus mobilis (thuộc phân lớp β–Proteobacteria).
Quá trình nitrate hóa chỉ xảy ra trong điều kiện trong nƣớc có đầy đủ oxy lúc đó
thì nồng độ của NO2- không vƣợt quá 0,5 mg/L, nhƣng khi trong nƣớc thiếu oxy thì
NO2- sẽ tồn tại nhiều và gây độc cho tôm. Trong một số nghiên cứu thì quá trình
nitrate hóa trong hồ các ao hồ nuôi thủy sản xảy ra không mạnh do vi sinh vật phát
triển chậm, khả năng nitrate hóa khoảng 25–50g/m3/ngày.
1.1.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa[24]
1.1.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ cũng có ảnh hƣởng lớn đến hoạt động của nhóm vi sinh vật nitrate hóa
này. Ở nhiệt độ thấp hơn 5 °C và cao hơn 40 °C vi khuẩn hoạt động rất chậm nên sự
chuyển biến đạm NH4 thành đạm NO3 cũng rất chậm. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt
động của nhóm vi khuẩn này nằm trong khoảng 30 °C. Điều này giải thích đƣợc
hiện tƣợng nitrate hóa xảy ra rất kém vào mùa đông và mùa hè, và xảy ra rất mạnh

vào mùa xuân và mùa thu ở vùng ôn đới.
1.1.2.2 pH

15


Yếu tố quan trọng nữa có ảnh hƣởng đến hoạt động của vi khuẩn nitrite hóa và
nitrate hóa là pH của đất. pH thích hợp cho hoạt động của vi khuẩn này thƣờng trên
6. Sự thích hợp với các mức độ pH khác nhau còn tùy thuộc vào loài và chủng vi
khuẩn. Ở một số nơi, mức độ nitrate hóa giảm đi khi pH thấp hơn 6, rất thấp ở
pH=5, và ngừng hẳn ở pH=4 hoặc thấp hơn. Ở cuộc đất khác, nitrate hóa xảy ra
đƣợc ở pH=4,5, nhƣng ở nơi khác nữa vi khuẩn không hoạt động đƣợc ở pH này.
Các vi khuẩn nitrate hóa sống trong đất chua, có mức pH tối ƣu 6,5, còn vi khuẩn ở
nơi đất kiềm tính có mức pH tối hảo ở 7,8. Ngoài ảnh hƣởng hoạt động của vi
khuẩn, pH còn ảnh hƣởng đến mật số các vi khuẩn này. Mật số vi khuẩn nitrate hóa
tăng dần theo mức độ tăng pH từ chua sang kiềm tính. Do ảnh hƣởng này, việc bón
vôi cho đất chua sẽ làm gia tăng tốc độ nitrate hóa các đạm ammonium trong đất.
1.1.1.3 Vi sinh vật
Có 2 nhóm vi sinh vật tham gia 2 giai đoạn của quá trình này. Trong đó có 7
nhóm vi khuẩn tự dƣỡng:
Nhóm vi khuẩn ôxít hoá NH4+ thành NO2-: nhóm này do 5 chi vi khuẩn đảm
nhiệm:
Vi khuẩn hình (que) bầu dục: Nitrosomonas.
Vi khuẩn hình cầu: Nitrosococcus.
Vi khuẩn xoắn: Nitrosospira.
Vi khuẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa (zoogloae) và có nang (cyst): Nitrosococystis.
Vi khẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa, không có nang: Nitrosogcola.
Nhóm vi khuẩn ôxít hoá nitrite thành nitrate
Vi khuẩn không có zoogloea: Nitrobacter.
Vi khuẩn có zoogloea: Nitrocystis.

Trong bảy chi vi khuẩn trên đây, Nitrosomonas và Nitrobacter là thƣờng gặp
nhất. Ngoài các vi khuẩn trên, các vi sinh vật dị dƣỡng nhƣ Streptomyces,
Pseudomonas, Aspergillus,Paracoccus, Thiosphaera pantotropha,Commamonas sp.
và Alcaligences faecalis... cũng có tham gia quá trình chuyển hóa N này.
1.1.3.Ảnh hưởng của nitrate đến sức khỏe con người[]

16


Hàm lƣợng nitrate trong nƣớc cao có thể gây ra các bệnh về hồng cầu, dễ thấy
nhất là bênh xanh da ở trẻ nhỏ. Dịch axid trong dạ dày trẻ nhỏ không đủ mạnh nhƣ
của ngƣời trƣởng thành. Do đó, các loại khuẩn đƣờng ruột dễ dàng chuyển hóa
nitrate thành nitrite (NO2 -). Tuyệt đối không cho trẻ nhỏ uống nƣớc hoặc ăn các loại
thực phẩm có lƣợng nitrate vƣợt quá 10 mg/l NO3 --N.
Khi Nitrite hấp thụ vào máu, các hemoglobin (phƣơng tiện chuyên chở ô xy
trong máu) sẽ bị biến thành methemoglobin. Methemoglobin sẽ mất hoặc suy giảm
chức năng vận chuyển ô xy, gây ra hiện tƣợng các tế bào (nhất là ở não) không đủ ô
xy để hoạt động. Khác với ngƣời lớn, trong cơ thể trẻ em, Methemoglobin không
thể chuyển hóa ngƣợc thành hemoglobin, khi não không đủ ôxy rất dễ dẫn đến tử
vong.
Một ngƣời trƣởng thành khỏe mạnh có thể chịu đƣợc một lƣợng Nitrate tƣơng
đối lớn mà không bị ảnh hƣởng đến sức khỏe. Trên thực tế, phần lớn lƣợng nitrate
xâm nhập cơ thể qua thực phẩm, cụ thể là các loại rau củ. Tuy nhiên, lƣợng nitrate
này sẽ bị thải theo nƣớc tiểu. Thế nhƣng, nếu liên tục phải hấp thụ nitrate có thể sẽ
dẫn đến mắc phải một số bệnh do sự hình thành của các nitrosamines. Nnitrosamine là những tác nhân gây ung thƣ khi thí nghiệm trên động vật. Hiện chƣa
có các thí nghiệm trên cơ thể ngƣời để chứng tỏ nitrate có thể gây ung thƣ hay
không.
1.1.4. Ảnh hưởng của nitrate đến các sinh vật thủy sinh[24]
Không giống nhƣ nhiệt độ và oxy hòa tan, sự hiện diện của nitrat thƣờng không
có ảnh hƣởng trực tiếp côn trùng thủy sinh hoặc cá. Tuy nhiên, mức độ dƣ thừa

nitrat trong nƣớc có thể tạo ra các điều kiện mà làm cho nó khó khăn cho côn trùng
thủy sinh hoặc cá để tồn tại.
Tảo và thực vật khác sử dụng nitrat nhƣ là một nguồn thực phẩm. Nếu tảo có một
nguồn không giới hạn của nitrate, tăng trƣởng của chúng là vô hạn.

17


Hình 1.2: Các con sông bị phú dƣỡng hóa, và nhiễm nitrate
Các sông bên phải là màu xanh nhƣ súp đậu, một kết quả của nồng độ cao của
tảo.Một lƣợng lớn tảo có thể gây ra biến động cực đoan trong oxy hòa tan. Quang
hợp của tảo và thực vật khác có thể tạo ra oxy trong ngày. Tuy nhiên, vào ban đêm,
oxy hòa tan có thể làm giảm đến mức rất thấp nhƣ là một kết quả của số lƣợng lớn
các vi khuẩn oxy tiêu thụ ăn tảo chết hoặc đang phân hủy và thực vật khác.
Trong hệ thống nƣớc ngọt hoặc cửa sông, nitrate có thể đạt đến mức độ cao có
khả năng có thể gây ra cái chết của cá. Trong khi nitrate là ít độc hại hơn so với
ammonia, nitrite, mức độ trên 30 ppm nitrate có thể ức chế sự phát triển, làm giảm
hệ thống miễn dịch và gây ra căng thẳng ở một số loài thủy sản. Tuy nhiên, thí
nghiệm độc tính cấp tính nitrate, mức độ nhiễm độc nitrat là chủ đề của cuộc tranh
luận gần đây.
Trong hầu hết các trƣờng hợp nồng độ nitrate dƣ thừa trong hệ thống thuỷ sản,
các nguồn chính là bề mặt dòng chảy từ khu vực nông nghiệp,đã nhận đƣợc phân
bón lƣợng nitrate vƣợt quá. Điều này đƣợc gọi là hiện tƣợng phú dƣỡng và có thể
dẫn đến tảo nở hoa. Cũng nhƣ dẫn đến nƣớcbị ô nhiễm trầm trọng và trở thànhvùng
chết , những bông hoa này có thể gây ra những thay đổi khác để chức năng hệ sinh
thái, gây ra mất cân bằng hệ sinh thái. Kết quả là, nhƣ nitrate tạo thành một thành
phần của tổng chất rắn hòa tan , chúng đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là một chỉ số về
chất lƣợng nƣớc .

18

1.1.5. Nguyên nhân có mặt nitrate trong nguồn nước ngầm, nước mặt, nước
cấp[2]
Nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bón đặc biệt là phân đạm, lƣợng nƣớc
thải chứa hàm lƣợng chất hữu cơ cao từ nhà máy chế biến thực phẩm. Nhƣng nitrate
trong nƣớc từ sản xuất nông nghiệp chiếm tỷ lệ lớn nhất.
Nguồn nƣớc này thấm vào sâu trong lòng đất, nồng độ nitrate trong nguồn nƣớc
ngầm tăng đều và rõ ở những đất canh tác.
Nƣớc mặt bị nhiễm nirate là do quá trình rửa trôi bề mặt hay từ lớp đất đá mà
nƣớc chảy qua hay ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm trong mùa khô (nƣớc ngầm cung cấp
nƣớc cho sông hồ vào mùa khô ).
Nƣớc cấp đƣợc lấy từ sông hồ rồi mới đem xử lý. Dù hạn chế đến mức tối đa
nồng độ nitrate nhƣng cũng không tránh khỏi còn một lƣợng nhỏ.
1.2. Các phƣơng pháp loại bỏ nitrate trong môi trƣờng
Nitrate/nitrite trong nguồn nƣớc có thể bị loại bỏ bằng nhiều phƣơng pháp, tùy
theo hàm lƣợng, ứng dụng và quy mô: chƣng cất, trao đổi ion, lọc thẩm thấu ngƣợc,
phƣơng pháp sinh học.
1.2.1 Phương pháp trao đổi ion
Trao đổi ion là quá trình hấp thụ các ion trong dung dịch lên lớp vật liệu trao đổi
và thay thế bằng những ion của lớp vật liệu trao đổi hòa tan vào dung dịch ấy.
Để khử ion nitrat trong nƣớc, khi sử dụng phƣơng pháp trao đổi ion chất lƣợng
nƣớc sau xử lý sẽ đạt đƣợc độ an toàn cao. Ion nitrat sẽ đƣợc trao đổi với một ion
của nhựa trao đổi ion với một lƣu lƣợng dòng chảy đƣợc lựa chọn.
Trong phƣơng pháp xử lý nƣớc ngầm nhiễm nitrat, loại nhựa anionit có tính kiềm
mạnh rất thích hợp và thông dụng. Loại nhựa này có độ bền khá cao, hiệu quả trao
đổi tốt, chất lƣợng trao đổi lớn. Nhựa trao đổi anionit thƣờng có dạng tổng quát là R
- Cl.
Quá trình khử nitrat bằng phƣơng pháp trao đổi ion dựa theo phản ứng sau:
R - Cl + NO3- → R - NO3 + Cl-

19


NO3- đƣợc hấp phụ kết nối trên nhựa trao đổi ion tạo thành R -NO3, còn ion Cl- ở
trong hạt nhựa sẽ hòa tan trong nƣớc.
R - NO3- có thể đƣợc tái sinh lại dạng ban đầu R - Cl bằng cách hoàn nguyên
nhựa trao đổi bởi dung dịch NaCl hay dung dịch NaOH theo phản ứng sau hóa học
sau:
R - NO3 + NaCl → RCl + NO3Hoặc R - NO3 + NaOH → ROH +
Tuy nhiên loại nhựa kiềm mạnh cũng khử các anion khác có trong nƣớc. Tùy
thuộc vào lƣợng SO42- trong nƣớc nhiễm nitrate mà ảnh hƣởng đến dung lƣợng trao
đổi nitrate của nhựa. Tùy theo yêu cầu chất lƣợng nƣớc và từng điều kiện cụ thể có
thể chọn phƣơng pháp khử nitrate thích hợp, thông thƣờng ngƣời ta thƣờng dùng
phƣơng pháp trao đổi ion.
Điều kiện áp dụng phƣơng pháp trao đổi ion đạt hiệu quả cao: Nƣớc có hàm
lƣợng cặn < 1 g/l. Tổng hàm lƣợng ion nitrate, sulfat và clor có trong nƣớc nguồn
muốn xử lý phải nhỏ hơn 250 mg/l (vì hàm lƣợng clo lớn nhất cho phép trong nƣớc
ăn uống là 250 mg/l).
1.2.2 Lọc thẩm thấu ngược
Khử nitrate bằng phƣơng pháp lọc qua màng có hiệu quả cao với thẩm thấu
ngƣợc (RO) và siêu lọc UF. Tuy nhiên hiệu quả chỉ khoảng 60 - 65% hàm lƣợng
nitrate đƣợc loại trừ. Để khử nitrate triệt để, phƣơng pháp RO thƣờng đƣợc đƣa vào
dây chuyền công nghệ vận hành trƣớc cột trao đổi ion.
Phƣơng pháp thẩm thấu ngƣợc dùng màng bán thấm RO rất tốn kém chỉ dùng để
khử nƣớc có tổng lƣợng khoáng (TDS) cao, nƣớc nhiễm mặn hoặc có nguồn gốc
nƣớc ven biển, nƣớc biển.
Chọn phƣơng pháp khử nitrat cần phải dựa vào chất lƣợng nƣớc yêu cầu sau xử
lý, thành phần muối hòa tan trong nƣớc nguồn:
- Khi tổng hàm lƣợng muối trong nƣớc nguồn thấp: nitrate vƣợt quá tiêu chuẩn,

lƣợng ion Cl- trong nƣớc thấp dùng phƣơng pháp trao đổi ion phù hợp.

20


- Khi tổng hàm lƣợng muối trong nƣớc nguồn cao:

, SO42- ,

cao ứng dụng

phƣơng pháp trao đổi ion không hiệu quả kinh tế, nên dùng phƣơng pháp phối hợp
với phƣơng pháp thẩm thấu ngƣợc dùng màng bán thấm RO.
1.2.3 Phương pháp sinh học
Lọc nƣớc đã đƣợc khử hết sắt và cặn bẩn qua bể lọc chậm hoặc bể lọc nhanh,
thổi khí lien tục từ dƣới lên. Do quá trình hoạt động vi khuẩn Nitrosomonas oxi hóa
NH4+ thành NO2- và vi khuẩn Nitrobacter oxy hóa NO2-thành NO3- . Quá trình diễn
ra theo phƣơng trình:
NH4+ + 2O2 → NO3- + 2H+ + H2O
1.02NH4++ 1.89O2 + 2.02HCO3- → 0.21C5H7O2N + 1.0NO3- + 1.92 H2CO3 +
1.06H2O
Khử Nitrate NO3Để khử nitrate dùng lọc thẩm thấu ngƣợc RO, điện phân, trao đổi ion trong các
bể lọc ionit.
Điều kiện áp dụng phƣơng pháp trao đổi ion
Nƣớc có hàm lƣợng cặn < 1mg/l.
Tổng hàm lƣợng ion NO3- và SO42- và Cl- có sẵn trong nƣớc phải nhỏ hơn 250
mg/l là hàm lƣợng ion Cl- lớn nhất cho phép có trong nƣớc ăn uống. Vì khi lọc qua
bể lọc anionit các ion SO42-, NO3- đƣợc giữ lại, thay bằng ion Cl- khi hoàn nguyên
bể lọc anionit bằng dung dịch muối ăn.
1.3 Vai trò của các chủng vi khuẩn trong quá trình xử lý nitrate[6]

Vi khuẩn xử lý nitrate có quá trình khử nitơ là một phần của chu kỳ nitơ , mục
đích chính của chúng là để chuyển hóa đạmhợp chất , với sự hỗ trợ của các
enzymenitrate reductase , biến oxit trở lại khí nitơ oxit nitơ cho thế hệ năng lƣợng .
Quá trình này chỉ diễn ra trong sự vắng mặt của oxy , nhƣ hầu hết các vi khuẩn xử
lý nitrate là hiếu khí tùy ý thích sử dụng oxy là chất nhận điện tử cuối cùng, tuy
nhiên chúng cũng có thể sử dụng nitrate thay cho oxy. Vì vậy, quá trình khử nitơ
chỉ có thể đƣợc thực hiện theo điều kiện kỵ khí. Đây là lý do chính lý do tại sao quá

21


trình khử nitơ chủ yếu xảy ra sâu trong lòng đất , hoặc trong các khu vực nƣớc tù
đọng .
Các quá trình của quá trình khử nitơ làm giảm độ phì nhiêu của đất và do đó ít
phổ biến hơn tại các khu vực nơi có đất là khá tốt canh tác . Nhƣng sự mất mát này
của nitơ trong khí quyển cuối cùng có thể đƣợc lấy lại qua thực phẩm và nƣớc, nhƣ
là một phần của chu kỳ nitơ.
Quá trình khử nitơ phổ biến nhất là cơ bản đƣợc trình bày dƣới đây, với nitơ oxit
đƣợc chuyển đổi trở lại khí nitơ (nhƣ trái ngƣợc với các vi khuẩn nitrat):
2 NO 3- + 10 e - + 12 H + → N 2 + 6 H 2 O
Nhƣ có thể thấy, kết quả là một phân tử nitơ (bao gồm hai nguyên tử) và sáu
phân tử nƣớc.
Vi khuẩn nitrat có các chi (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrobacter,
Nitrococcus) vi khuẩn phát triển bởi các hợp chất nitơ vô cơ tiêu thụ. Nhiều loài vi
khuẩn nitrat có hệ thống màng phức tạp nội bộ có vị trí cho các enzyme quan trọng
trong quá trình nitrat hóa: ammonia monooxygenase oxy hóa ammonia
hydroxylamine, và Oxidoreductase nitrite, oxy hóa nitrite thành
Một nhóm các vi khuẩn làm giảm nitrate, nitrit để thành khí nitơ. Ví dụ các vi
khuẩn tiềm năng bao gồm Thiobacillus, Micrococcus,Paracoccus và Pseudomonas .
Điều này là quan trọng vì nó cho phép nitơ đƣợc tái trở lại vào bầu khí quyển .

Những vi khuẩn này cũng đã đƣợc liên quan đến sự suy giảm độ màu mỡ của đất,
và do đó năng suất nông nghiệp có thể cung cấp cho việc cấy ghép tốt nhất nó có
thể cung cấp cho.
Vi khuẩn nitrate đƣợc phổ biến rộng rãi trong đất và nƣớc, và đƣợc tìm thấy ở
cao nhất số lƣợng đáng kể của amoniac có mặt (khu vực mở rộng phân hủy protein,
và các nhà máy xử lý nƣớc thải). Vi khuẩn nitrate phát triển mạnh trong các hồ và
suối với đầu vào cao của nƣớc thải và nƣớc thải vì hàm lƣợng amoniac cao.
Vi khuẩn nitrate có thể oxy hóa ammonium thành nitrite (
nitrate (

)và sau đó là

). Nitrite là độc hại đối với cá và các loài thủy sản khác, nhƣng nó

thƣờng không tích lũy trong môi trƣờng bởi vì nó đƣợc nhanh chóng chuyển thành

22


nitrate trong một môi trƣờng hiếu khí. Ngoài ra, nitrit và nitrat có thể trải qua vi
khuẩn khử nitơ trong một môi trƣờng thiếu ôxy. Trong quá trình khử nitơ, nitrat
đƣợc chuyển thành nitrite, và sau đó tiếp tục chuyển đổi sang các hình thức nitơ khí
của nguyên tố nitơ (N2), nitơ oxit (N2O), nitric oxide (NO), hoặc oxit nitơ (NOx) các
hợp chất. nitrate hóa xảy ra dễ dàng trong môi trƣờng hiếu khí nhận đƣợc dòng suối
và đất khô trong khi quá trình khử nitơ có thể là đáng kể ở các vùng nƣớc phía dƣới
thiếu ôxy và đất bão hòa.
1.4 Tổng quan về vi khuẩ[n23]
Hiện nay vi khuẩn nitrate hóa đƣợc sử dụng rộng rãi trong xử lý nƣớc (nƣớc thải
công nghiệp, nƣớc thải sinh hoạt và nƣớc thải từ nuôi trồng thủy sản). Trong nuôi
trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa đƣợc sử dụng rất phổ biến trong lãnh vực

sản xuất giống thủy sản và nuôi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất đƣợc thực
hiện thông qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, nƣớc thải từ các bể ƣơng nuôi tôm
cá chứa hàm lƣợng NH3 (do tôm cá bài tiết ra) đƣợc đƣa vào bể lọc sinh học để xử
lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hóa NH4+ thành NO2(giai đoạn nitrite hóa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa NO2- thành NO3(giai đoạn nitrate hóa). Nƣớc sau khi xử lý qua bể lọc sinh học hoàn toàn không độc
cho tôm cá và đƣợc đƣợc tái sử dụng để ƣơng nuôi tôm cá (đƣa trở lại bể ƣơng
nuôi). Trong suốt quá trình nuôi, nƣớc sẽ tuần hoàn trong một hệ thống kín và hoàn
toàn không thay nƣớc, chỉ có một lƣợng nhỏ nƣớc mới đƣợc cấp thêm vào hệ thống
đề bù đắp cho lƣợng nƣớc hao hụt do bốc hơi.
Giới thiệu một số chủng xử lý nitrate
1.4.1 Thiobacillus denitrificans[11]
1.4.1.1 Phân loại.
Giới: Bacteria.
Ngành: Proteobacteria.
Lớp: Betaproteobacteria
Bộ: Hydrogenophilales
Họ: Hydrogenophilaceae

23