CHUYÊN đề CÔNG NGHỆ di TRUYỀN ĐỘNG vật và bài tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN si06

HỘI THẢO KHOA HỌC
CHUYÊN ĐÊ

CÔNG NGHỆ DI TRUYÊN ĐỘNG VẬT
VÀ BÀI TẬP
CÔNG NGHỆ DI TRUYÊN

0


CHUYÊN ĐỀ

CÔNG NGHỆ Di TRUYÊN ĐỘNG VẬT VÀ BÀI TẬP

CÔNG NGHỆ DI TRUYÊN
A. PHẦN MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài, có nhiều lĩnh vực công
nghệ sinh học khác nhau theo đối tượng ứng dụng như công nghệ sinh học phân tử, công nghệ
sinh học thực vật, công nghệ sinh học động vật… Công nghệ sinh học có ứng dụng rộng rãi trong
y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hóa chất, vật liệu mới nông lâm ngư nghiệp, bảo vệ
môi sinh và ngày nay trong thể thao đỉnh cao công nghệ sinh học cũng ñược áp dụng một cách
hiệu quả.
Công nghệ sinh học động vật (Animal Biotechnology) là một lĩnh vực chủ yếu của công nghệ
sinh học và công nghệ di truyền trên cơ sở ứng dụng các kỹ thuật và khoa học hiện đại mang tính
công nghệ vào tế bào động vật. Tế bào được coi là đối tượng trung tâm vô cùng quan trọng,
chúng có cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao đổi chất như một nhà máy hóa học
với nhiều ưu việt. Do tế bào có nhiều ưu thế nên công nghệ sinh học đã sử dụng tế bào làm nhà
máy sản xuất và là công cụ thử nghiệm.
Giới hạn của chuyên đề chỉ giới thiệu các thao tác và ứng dụng của công nghệ di truyền
trên tế bào động vật, và với thời gian soạn thảo ngắn, trình độ hạn chế cho nên chuyên đề không
tránh khỏi sai sót, bản thân tôi rất mong nhận được sự đóng góp của các thầy cô giáo và các bạn

đồng nghiệp để chuyên đề được hoàn thiện. Một số câu hỏi sưu tầm đưa vào phần câu hỏi tự giải
chưa có hướng dẫn, xin gởi đến các thầy cô tham khảo và đóng góp lời giải, xin chân thành cảm
ơn !
B. PHẦN NỘI DUNG
I. LÝ THUYẾT
1. Nuôi cấy tế bào động vật
1.1. Lược sử nuôi cấy tế bào động vật
- Nuôi cấy tế bào động vật triển khai lần đầu tiên năm 1907, hơn 40 năm sau mới thực sự
triển khai một cách quy mô.
- Những năm đầu thập kỷ 50 thế kỷ XX, tế bào động vật có vú được nuôi với số lượng lớn để
nuôi các chủng của virus gây bại liệt ( Poliomyelite virus) dùng để chế vacxin phòng chống bại
liệt.

1


- Nuôi cấy tế bào người để nhân nuôi nhiều chủng của virus khác nhằm sản xuất các kháng
thể đặc hiệu và interferon. Sự phát triển của phương pháp nuôi cấy tế bào động vật và người dẫn
đến sự phát triển công nghệ vacxin và các chế phẩm miễn dịch.
- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại
các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương
hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng.
- Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô phôi ếch trong
dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop). Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật
nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh (in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát
triển tốt. Nhưng phải chờ đến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân
tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều
ngành công nghệ sinh học.
1.2. Đặc điểm của tế bào động vật
1.1.2. Đặc điểm cấu trúc tế bào động vật

Hình 1. Cấu trúc tế bào động vật
- Trong cấu trúc tế bào động vật không có thành xenlulôzơ, không có lục lạp, hóa dị dưỡng,
không có không bào trung tâm (nếu có thì rất nhỏ).Có trung thể, chất dự trữ glycogen và phân
bào có sao và phân tế bào chất bằng eo thắt ở trung tâm.
- Các tế bào dịch huyền phù: Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hình
dạng thể lỏng. Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspension
cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Các tế bào không dính
bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng. Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) bắt
nguồn từ mô bạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đường kính từ 10-20 µm.
Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự vi khuẩn.

2


- Các tế bào dính bám: Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thế
chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng. Trong các ứng dụng, người ta sử dụng rộng rãi
các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast). Các tế bào dính bám
cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặc plastic. Các tế bào động vật thường
được sử dụng trong nuôi cấy: tế bào bạch huyết, tế bào biểu mô, nguyên bào sợi

Hình 2: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy
(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi
- Sự liên kết giữa các tế bào : Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với
nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô, cơ quan và hệ cơ quan. Các tế bào thường kết
nối, tương tác và thông tin với nhau thông qua sự tiếp xúc vật lí trực tiếp. Mô động vật thường
được phân chia theo bốn nhóm:
Biểu mô (epithelium): tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên
trong và bên ngoài.
Mô liên kết (connective tissue): các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng

(kéo dài), đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn.
Mô cơ (muscle): Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắn với nhau thành một phiến
hoặc một bó bởi mô liên kết. Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậc
cao.
Mô thần kinh (nerve): Các tế bào mô thần kinh gồm có thân bào chứa nhân và một hoặc
nhiều phần mở rộng dài và mảnh được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng và
truyền xung động rất nhanh.
- Các mối nối giữa các tế bào ở mô động vật.
Mối nối kín: Màng tế bào của các tế bào liền kề bị nén rất khít, gắn kết nhau nhờ những
Protein đặc hiệu. Tạo thành đường bịt kín liên tục quanh các tế bào, các mối nối kín ngăn cản sự
rò rỉ dịch ngoại bào qua lớp tế bào biểu mô.
Ghép nối desmosome (thể nối): Thể nối có chức năng như những chiếc đinh tán, xiết các tế
bào thành tấm chắc. Thể nối được neo vào tế bào chất nhờ các sợi trung gian cấu tạo từ protein
keratin.

3


Mối nối hở (các mối nối thông tin): Tạo ra các kênh tế bào chất từ một tế bào đến các tế
bào liền kề. Các mối nối hở được cấu tạo từ các Protein màng, bao lấy các lỗ qua đó các phân tử
có thể lưu thông từ tế bào này sang tế bào khác.
1.3. Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật
- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử
phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán.
- Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm protein
sinh-dược (biopharmaceutical).
- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thường vào trong
tế bào soma mang gen tương ứng bị khiếm khuyết để chữa bệnh do sự khiếm khuyết đó gây ra).
Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV),
chứng viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang.

- Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất học và
dược học.
- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạo
hoặc sinh học, các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn :
+ Da nhân tạo để chữa bỏng.
+ Mô gan để chữa bệnh viêm gan
+ Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đường
1.4. Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một
số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau:
- Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật.Vì thế, sản lượng của
chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp
nhiều khó khăn hơn
- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế
bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến
dạng và vỡ.
- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi
trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền.
- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn bào
riêng biệt như vi sinh vật.

4


- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.
1.5. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
1.5.1. Các yêu cầu cơ bản của nuôi cấy tế bào: Có bốn yêu cầu cơ bản để nuôi cấy tế bào
thành công.
- Nhà xưởng, trang thiết bị : Các trang thiết bị tối thiểu cần phải có: Tủ an toàn sinh học, máy ly

tâm chuyên sử dụng cho nuôi cấy tế bào, tủ ấm CO 2, bể ổn nhiệt, kính hiển vi. Đối với các tế bào
linh trưởng, tế bào ung thư, tế bào bị nhiễm Mycoplasma cần nuôi cấy trong tủ an toàn sinh học
cấp độ 2 trở lên. Hệ thống nuôi cấy cần đạt tiêu chuẩn bảo vệ cả người làm việc và tế bào không
bị lây nhiễm, được thiết kế theo các yêu cầu an toàn phòng thí nghiệm (ISO, GMP).
- Yêu cầu về vô trùng : Tủ an toàn sinh học cần phải được hoạt động trước khi bắt đầu làm việc ít
nhất 15 phút để làm sạch không khí có thể bị nhiễm từ trước đó. Khu vực làm việc bên trong tủ
cấy phải được khử trùng ( thường sử dụng cồn 70o hoặc isopropanol). Các nguyên vật liệu cũng
cần được khử trùng trước khi đưa vào khu vực làm việc (hấp sấy tiệt trùng, lau cồn hoặc bật đèn
tím). Người làm việc phải mặc trang phục bảo hộ đầy đủ.
- Nguồn nguyên vật liệu phải đạt tiêu chuẩn. Các tế bào rất nhạy cảm đối với điều kiện dinh
dưỡng, pH, điều kiện nuôi cấy… Do đó, cần chọn nguồn nguyên vật liệu phù hợp. Các vật liệu
dùng trong nuôi cấy nên được kiểm tra xác nhận chất lượng và đảm bảo không bị nhiễm khuẩn,
đặc biệt đối với huyết thanh. Vì vậy, nên sử dụng các sản phẩm của những nhà cung cấp có uy tín.
- Người thực hiện nuôi cấy tế bào phải có kiến thức và kinh nghiệm thực hành tốt. Đồng thời
chấp hành các quy trình chuẩn đã được thẩm định đảm bảo cho sự thành công của việc nuôi cấy
tế bào.
1.5.2.Chuẩn bị tế bào để nuôi cấy
Nuôi cấy tế bào động vật có vú có nhiều công đoạn khác nhau. Công đoạn đầu tiên là chuẩn
bị tế bào để đưa vào nuôi cấy.
Trước hết, các mảnh mô được tách ra khỏi cơ thể động vật trong điều kiện vô trùng. Tiếp
theo, các mảnh mô này được xử lý với các enzym protease, thường dung enzym trypsin để thu
huyền phù tế bào. Sau khi loại bỏ tripsin, dịch huyền phù được chuyển vào bình nuôi cấy chuyên
dụng bằng nhựa plastic hoặc thủy tinh. Bình nuôi có đáy phẳng, rộng, có chứa môi trường nuôi
cấy dạng lỏng thích hợp cho từng loại mô. Tế bào phải trải qua pha log (từ thời điểm bắt đầu đến
lúc có dấu hiệu phân chia tế bào đầu tiên), các tế bào sẽ tự gắn vào đáy bình nuôi và bắt đầu phân
chia nguyên phân. Kiểu nuôi trực tiếp tế bào có nguồn gốc từ các mô đã phân hóa gọi là nuôi cấy
sơ cấp. Việc nuôi cấy sơ cấp các tế bào bình thường chỉ tạo một lớp đơn do hiện tượng kìm hãm
tiếp xúc kiểm soát quá trình phân bào của chúng. Nếu ta lấy một phần của lớp tế bào để tạo ra

5

khoảng trống thì tế bào tiếp tục phân chia tới khi khoảng trống được lấp kín thì dừng lại. Nuôi các
mô, cơ, da, thận, phổi … của phôi sẽ thuận lợi hơn nuôi các tế bào của các mô của cơ thể trưởng
thành. Các tế bào của quá trình nuôi sơ cấp sẽ được tách khỏi bình nuôi bằng cách xử lý với
trypsin hoặc EDTA. Các tế bào này dùng làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tạo ra dòng nuôi thứ
cấp (secondary cultures). Chúng được “gieo” vào môi trường sinh dưỡng với mật độ cao. Các tế
bào này được nhân lên với tốc độ ổn định qua nhiều lần cấy chuyển liên tiếp nhau. Kết quả thu
được từng nhóm tế bào, được gọi là một chủng tế bào (cell strain). Các tế bào không tăng lên vô
hạn mà chúng chỉ có khả năng phân chia một số lần nhất định cho đến khi khả năng phân chia
giảm sút và cuối cùng bị chết. Ví dụ, các chủng tế bào người thường chỉ phân chia tối đa là 100
lần trước khi chết.
1.5.3. Các dòng tế bào liên tục (Continuous cell lines)
Không phải tất cả các dòng tế bào nuôi sơ cấp và tạo ra các dòng tế bào đều bị chết sau một
số lần phân chia mà có một số tế bào biến đổi và chúng có thể tồn tại lâu dài. Ví dụ, khi nuôi tế
bào chuột thì có phần lớn các tế bào bị chết sau khi phân chia 30 – 50 lần. Một số ít tế bào bị biến
đổi và chúng có hình thái khác, tăng trưởng nhanh hơn và có khả năng tạo dòng tế bào riêng.
Những tế bào ngoại lệ này có thể tồn tại lâu dài khác với các chủng tế bào khởi đầu của chúng và
được gọi là các dòng tế bào (cell lines).
Trong quá trình cấy chuyển liên tục, các dòng tế bào chịu sự biến đổi sâu sắc. Sự thay đổi này
dẫn đến hình thành các cụm tế bào thay cho lớp đơn và sự sắp xếp các cụm tế bào này không đều.
Các dòng tế bào bị biến đổi này được gọi chung là mô ung thư và chúng có khả năng gây ung thư
khi đem các tế bào này cấy vào các cơ thế động vật tương ứng ban đầu của chúng. Các tế bào ung
thư này thường ở dạng lệch bội giống như trường hợp cơ thể bị nhiễm virut ung thư. Để giải
quyết vấn đề này, chúng ta cần phải giữ tế bào nuôi cấy ở điều kiện đông lạnh trong niều năm, chỉ
khi chúng ta cần thì sẽ nuôi cấy tế bào này sau khi đã được thực hiện giải đông. Thực tế người ta
tiến hành trộn các chất phụ gia (glyxerin, dimethylsulphoxit) để ngăn cản sự tác hại của các tinh
thể khi đưa vào đông lạnh
1.5.4. Các môi trường nuôi cấy tế bào
- Tế bào động vật có vú đòi hỏi điều kiện môi trường nuôi cấy phức tạp, đủ các chất dinh

dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phân chia của tế bào khi chúng đã bị tách ra khỏi cơ thể của
chúng .
- Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật có vú lớn hơn vi sinh vật do, không giống
các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin
cần phải được bổ sung vào môi trường. Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động

6


vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và
glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết tương của động
vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên
cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy.
- Môi trường hóa chất: Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thế
hoàn toàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường hóa chất
được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các chất cần thiết, ít bị lây
nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh dưỡng (Cacbonhydrat, acid amin,
vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng). Hiện nay, người ta dùng một số môi
trường nuôi cấy như môi trường Eagle, môi trường Dulbecco,…Môi trường nuôi cấy phải đẳng
trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu. Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết
hợp với hệ làm giàu CO2 môi trường (5-10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi. Độ
pH thích hợp là 7,4. Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi trường, nếu
môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển sang vàng nhạt
là môi trường bị nhiễm khuẩn.
- Nhân tố sinh trưởng: Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát
triển. Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%) vì trong
huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng. Nhưng dùng huyết thanh vừa đắt tiền lại vừa dễ bị
nhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bổ trợ để thay thế cho huyết thanh
như: insulin, transferin, ethanolamin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi.
- Môi trường nuôi cấy phải đạt những tiêu chuẩn sau:

+ Môi trường phải chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự tồn tại và sinh sản của tế bào .
+ Phải duy trì pH môi trường ( pH = 7,0 – 7,3) bằng các hệ đệm thích hợp cho từng loại mô
của loài nghiên cứu.
+ Môi trường phải có các ion cần thiết và đảm bảo áp suất thẩm thấu chuẩn xác.
+ Môi trường phải có các hợp chất cung cấp năng lượng như glucose.
+ Có chứa phenol red để chỉ thị pH.
- Có 2 loại môi trường là môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp.
+ Môi trường tự nhiên: Môi trường tự nhiên là các dung dịch chiết từ cơ thể động vật như:
dịch huyết tương, dịch nước ối bào thai, dịch chiết phôi …
+ Môi trường tổng hợp: Môi trường nuôi cấy tế bào được tổng hợp từ các chất vô cơ và hữu
cơ đơn giản. Với các môi trường muối cân bằng, tế bào có thể tồn tại một số giờ nhưng chúng
không phân chia. Muốn cho tế bào phân chia cần bổ sung vào môi trường các amino axit

7


(Arginin, Glutamin, Histidin,Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin…

bổ sung các vitamin cần

thiết (Cholin chlorit, axit floric, nicotinic axit, pyridoxin, riboflavin, thiamin) và chất đệm như
bicarbonat natri.
Ngoài ra, để chống hiện tượng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm người ta bổ sung kháng sinh như
penicillin để kháng khuẩn và nystatine để kháng nấm và một số loại kháng sinh khác như
tetracyline, kanamycine, gentamycine .. để kháng các loại khuẩn mycoplasma. Cần bổ sung thêm
5 – 10 % huyết thanh vì trong huyết thanh còn chứa những thành phần như glubiline miễn dịch ,
hooc môn sinh trưởng … đó là các chất rất cần thiết cho sự phân chia tế bào.
Tất cả các dụng cụ nuôi phải sạch khuẩn, có tính trung tính. Nước cất sử dụng để pha chế
phải tinh khiết, không có các ion lạ.
- Các chất kháng sinh: Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin

B thường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy. Tuy nhiên, các chất kháng sinh thường
độc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và phải kết hợp với quy trình tiệt trùng chu đáo.

8


Bảng 1. Thành phần môi trường Eagle (1959)
1.5.5.K ỹ thuật nuôi cấ y tế bào động vật :
Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên
(subculture).
Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng tế bào khác
nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào
khác (được gọi là tế bào nhiễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi
tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế
bào quan tâm cần thu nhận.
Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:
+ Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống.
+ Bước 2: Phẫu tích và tách rời tế bào, xác định nồng độ.
+ Bước 3: Nuôi cấy tế bào.
Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ:
Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làm sạch mô tại vị
trí lấy, đưa mô vào bảo quan trong dung dịch DPBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm,
sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô cần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3
mm2
Tách rời các tế bào:
Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:
- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép
- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase
- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng

- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt.
Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào.
Nuôi cấy
- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào.
- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex.
- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình Roux) và bỏ sung
1ml môi trường.
- Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ.

9


Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp. Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá
ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ cấp.

Thu nhận mẫu mô

Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô
chết)

Cắt nhỏ
(Mảnh nhỏ để
nuôi)

Tách TB bằng cơ
học
(nghiền, ép)

Trypsin
lạnh

Nuôi mẫu mô sơ
cấp

Tách TB bằng
enzyme
(ủ,…)

Trypsin
ấm

Collage

nase

Li tâm

Nuôi sơ cấp
Thu nhận tế bào
mới
Cấy chuyền

Nuôi mảnh mô
thứ cấp

Dòng tế bào
Hình 3: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp

10

Tái huyền phù


1.6. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
Sự sinh trưởng của tế bào động vật invitro thường trải qua 4 giai đoạn:
- Pha chậm (Lag phase): là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi
tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô
được lấy tế bào.
- Pha logarit (Log Phase): hay pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia
liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào. Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp
độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp.
Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi
một cách đều đặn. Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản
là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa
học và sinh lý học tế bào. Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế
bào được tổng họp với tốc độ tương đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi
trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều. Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp
các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng
mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường
nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hơn. Tế bào trước hết phải tạo nên các ribosome
mới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cưởng tổng hợp protein và
DNA. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.
- Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại. Số lượng tế
bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân
tố khác. Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào
mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ
nguyên hoạt tính trao đổi chất. Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một
chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Cũng có thể

sự sinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại. Sau nữa là,
một số chứng cứ cho thấy, khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng
có thể bị dừng lại.
- Giai đoạn tử vong (Death Phase): Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải
độc hại sẽ làm ảnh hưởng đến môi trường sống của tế bào, làm cho số lượng tế bào sống giảm
xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của tế bào
cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Muốn cho tế bào tiếp tục sinh
trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới.

11


1.7. Tiềm năng của nuôi cấy tế bào động vật
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số
lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn:
- Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. Vì thế, sản lượng
của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp
nhiều khó khăn hơn.
- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào
dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và
vỡ.
- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, môi trường
nuôi cấy cần bổ sung thêm huyết thanh, rất đắt tiền.
- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.
Tế bào động vật thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm
thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán. Một vài sản phẩm gene của động vật có vú cũng có
thể được sản xuất bởi vi khuẩn bằng cách dùng công nghệ ADN tái tổ hợp. Tuy nhiên, vi khuẩn
thiếu khả năng sửa đổi sau dịch mã (post-translational modifications) bao gồm việc phân giải
protein, liên kết các tiểu đơn vị (subunit) hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như

glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối isulfide hoặc
phosphoryl hóa (phosphorylation) các gốc amino acid. Những sửa đổi này rất quan trọng ảnh
hưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm. Do vậy, tế bào động vật vẫn là một nguồn cung cấp
quan trọng, khó có khả năng thay thế trong tương lai gần.
1.8. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
1.8.1 Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật
1.8.1.1. Tế bào lai soma (hybridoma)
- Nuôi cấy in vitro có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các mô khác nhau
trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm chí người ta có thể
nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để tạo nên tế bào lai soma.
- Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là đã tạo được tế
bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khác
nhau. Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm
chúng vào chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng
khác nhau.

12


- Tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả): Là tế bào lai được hình thành từ các tế bào
cùng một khởi nguồn.
- Tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật): Là các tế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơ
thể khác nhau về bậc phân loại khác
- Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tế
bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp. Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ
dàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người
ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố kích thích. Một số virut được sử dụng làm nhân tố kích
thích đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut
chứa ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,…) hoặc các virut gây ung thư (virut Sarcoma
Rous),…

1.8.1.2. Đặc tính của tế bào lai soma:
- Sự hoạt hóa của nhân:
+ Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào ung thư Hela của
người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của gà, người ta thu được tế bào lai có
chứa nhân lai ở trạng thái hoạt hóa, trong đó các gen của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã
trở nên hoạt hóa, tổng hợp ARN và protein đặc trưng cho gà.
+ Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa phải so với nhân hồng cầu gà, ví dụ đại
thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp ADN và tế bào ở giai đoạn
biệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ và tổng hợp ít ARN). Khi nuôi cấy các đại thực bào (của
chuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo
nên các tế bào lai heterocaryon, trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng hợp
ARN tăng 4-10 lần so với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN.
Điều này chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn.
+ Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai giữa đại thực bào và tế
bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân đại thực bào không phụ
thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến
từ tế bào chất của tế bào melanom.
+ Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế bào lai rất lâu (vài
tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào soma (ví dụ đem tinh tử
của chuột cống lai với tế bào soma của chuột nhắt) thì tạo nên các tế bào lai có khả năng phân
chia.

13


+ Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các tế bào soma khác nhau như tế bào chuột
cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào này có thể phát triển tới giai đoạn phôi
dâu.
- Sự thụ tinh
+ Là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa cả hai nhân – có thể được xem

như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong
ống dẫn trứng của con cái hoặc ở phần nào đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được
chương trình hóa trong bộ gen của sinh vật. Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinh
giữa tinh trùng và trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi
là khả năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần khả
năng hóa vẫn thực hiện được sự thụ tinh.
- Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai
+ Khi sử dụng các dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợp
ADN và ARN trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng:
+ Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạt
tính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích cực hơn (trừ trường hợp tế bào ít
hoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào hoạt tính cao, hoặc khi tế bào heterocaryon
được tạo thành từ các tế bào quá già).
+ Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN và ARN như ở nhân có
hoạt tính.Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào có hoạt tính
cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài.
+ Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN diễn ra trong tế bào lai tương tự như
ở tế bào bình thường. Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không có hoạt tính vẫn giữ trạng thái
bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt
đã trở lại hoạt động trong tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều. Những công trình cấy
ghép nhân hoặc nhân bản vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạn
biệt hóa mà tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họ
gen hay toàn bộ genom.
- Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai
+ Phân tích bộ nhiễm sắc thể của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung
hợp có thực sự là tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc, tập
tính của nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào. Bằng phương
pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu nhân, nhuộm

14

cắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền và
biến dị của tế bào lai soma.
+ Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết hợp lại với nhau sẽ
xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai bộ hoặc của cả hai bộ nhiễm sắc thể.
Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột nhắt thì bộ nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa
chuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể. Sự
giữ lại hoặc loại thải nhiễm sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy ra
không phải ngẫu nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng
thái tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro.
+ Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. Các tế bào bố mẹ được sử dụng để
tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào, khi các tế bào bố mẹ dung hợp
tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể,
thường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,
… Các nhiễm sắc thể bị đông đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào
lai.
- Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai
+ Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai heterocaryon chứa
hai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân
độc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc thể trong một tế bào lai được gọi là syncaryon. Các
heterocaryon có thể tồn tại rất lâu hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon. Người ta theo dõi số
phận và đời sống của các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính trạng
kiểu hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu trúc, sự
biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như phản ứng với các tác
nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,…
+ Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hiện của các gen trong nhiễm sắc thể
thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm sắc thể X.
+ Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ, đặc biệt là
các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt hóa cao, ổn định như limpho, tế bào

sợi, tế bào gốc hồng cầu,…
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền học, tế
bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho công nghệ tế bào
1.8.2.Công nghệ nhân bản vô tính động vật

15


Nhân bản vô tính là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể đa bào không bằng
con đường sinh sản hữu tính tự nhiên mà thông qua sự phát triển của tế bào soma bằng cách phân
bào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành cơ thể trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với đa số
động vật sinh sản hữu tính thì kỹ thuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt.
1.8.2.1. Kỹ thuật chuyển nhân:
Trong nhân của tế bào soma có chứa 2n NST, chứa hệ gen quy định nên tất cả các tính trạng của
cơ thể giống như bộ NST của hợp tử. Qua quá trình phát triển, từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa
để cho ra các tế bào và mô khác nhau. Quá trình biệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong
hệ gen theo thời gian và không gian của phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội
bào và ngoại bào. Nhân còn ít biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế
bào gốc để nhân bản vô tính là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt hóa. Bình thường người ta
tách nhân từ tế bào cho (tế bào soma) và đem cấy chuyển vào tế bào trứng chưa thụ tinh đã bị lấy
hoặc hủy nhân để tạo nên một tế bào 2n giống như hợp tử chứa nhân của tế bào soma và tế bào
chất của tế bào trứng. Vì nhân 2n của tế bào cho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do
tế bào chất của nó quy định phù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi. Khi nhân
này được cấy chuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệt
hóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử và hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúng chương trình
phát triển do các nhân tố của trứng điều khiển.
Những thành công của nhân bản vô tính bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch, bằng cách sử dụng
nhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi. Năm 1952, lần đầu tiên, hai nhà khoa học tai
Philadelphia là R. Briggs và T. King đã nhân bản vô tính con nòng nọc bằng kỹ thuật chuyển cấy
nhân từ tế bào phôi nang ếch. Từ những năm 1960, J. Gordon đã nhân bản vô tính thành công con

ếch trưởng thành từ nhân tế bào ruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào ruột ếch. Đến nay
người ta đã thành công trong việc nhân bản vô tính nhiều động vật như cá và cả động vật có vú.
1.8.2.2. Nhân bản vô tính động vật có vú
Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạ con của mẹ dưới sự
nuôi dưỡng qua nhau thai. Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô tính khó khăn và phức tạp hơn các loài
động vật khác rất nhiều. Từ những năm 1960-1980, các nhà khoa học đã thành công trong kỹ
thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người mẹ
và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm (Em bé đầu tiên là Brown, 1978, tại
Anh)
Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người ta đã nhân
bản thành công đối với chuột từ nhân lấy ở giai đoạn phôi nang, và từ 1984 – 1986 đã thực hiện

16


thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở giai đoạn phôi. Trước năm 1992, các nhà khoa học cho
rằng, đối với động vật có vú chỉ có thể nhân bản vô tính thành công với nhân lấy từ giai đoạn
phôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì tính biệt hóa
của chúng là không thể đảo ngược. Tuy nhiên, sự kiện tháng 2/1997, khi báo chí công bố con cừu
Dolly ra đời (ngày 5 tháng 7 năm 1996) bằng kỹ thuật nhân bản vô tính với nhân lấy từ tế bào
tuyến vú của cừu mẹ trưởng thành 6 năm tuổi do I. Wilmut, Campbel và cộng sự ở Viện Roselin
(Scottland) thực hiện. Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến vú của một cừu cái giống Finn
Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tế bào đang tăng sinh và biệt hóa. Các tế bào này
được nuôi cấy, sau đó được đưa vào môi trường rất nghèo huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn
toàn chu kỳ tế bào. Đồng thời, một trứng của cừu cái giống Scottish Blackface (Đầu đen) có chu
kỳ tế bào ngừng ở kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực và
một ít tế bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy ở 37 0C, hoạt hóa
bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của Finn Dorset bằng một loạt xung điện
khác. Kết quả tạo thành một phôi, phôi này được đưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng
đã thắt của một cừu cái khác. Khi phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúng

được cấy vào tử cung của cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly. Điều đáng chú ý
là trong số 277 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 29 và chỉ có 1 trong số
đó phát triển được thành cừu con. Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổi nhưng những phân tích
trên tế bào chứng minh rằng nó đã 12 năm tuổi.
1.8.3. Ứng dụng trong lĩnh vực y tế.
- Cấy ghép mô, cơ quan : Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần
như tất cả mọi bộ phận trên cơ thể con người .
- Ghép thành công tế bào sừng tự thân nuôi cấy.
1.8.4. Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất:
Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiều thử nghiệm, trong đó có
giai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ, khỉ,… Các thử nghiệm này đã gặp phải sử
phản đối kịch liệt của các phong trào bảo vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm này
nhiều khi không thể mở rộng trên người, thí nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ
ra hướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất kỳ loại tế bào
nào.
1.8.5. Nuôi cấy tế bào trong độc chất học

17


Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng các chất độc, từ đó phát
hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinh hóa và phân tử của quá trình
chuyển hóa chất độc.
1.8.6. Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học
Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học. Các
vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có những đóng góp cho lĩnh vực y tế cộng
đồng trên thế giới mà điển hình nhất là hiệu quả ngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em,
trong ngành thú y là vaccine ngừa bệnh lở mồm long móng ở gia súc. Để sản xuất vaccine, người
ta cho nhiễm và nhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa. Sau đó, virus được ly
trích và xử lý bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng làm vaccine.

2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng:
2.1. Đại cương về kháng thể và kháng thể đơn dòng
2.1.1. Kháng thể (antibody) :
- Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho
B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa
các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một
epitope kháng nguyên duy nhất.
- Cấu tạo:

Hình 4: Bề mặt của kháng thể IgG
Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptid, gồm hai chuỗi nặng (H, heavy) giống nhau
và hai chuỗi nhẹ (L, light) cũng giống nhau. Có hai loại chuỗi nhẹ (kappa) và  (lambda), do đó
hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng là  hoặc cùng là . Các chuỗi
của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồi nhất định. Một
phần cấu trúc của các chuỗi cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên

18


giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với
các kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó.
Trên kháng thể có 2 vùng:
+ Vùng biến đổi (ký hiệu là V): Vùng phía đầu -NH2 có trật tự axit amin luôn thay đổi ở các
kháng thể khác nhau gọi là vùng biến đổi, vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kết hợp với
nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratôp. Vùng này khác nhau ở các loại Ig, là
phần đầu 2 nhánh chữ Y nên mỗi phân tử Ig có hai vị trí kết hợp với kháng nguyên. Vị trí này
chiếm khoảng 1% diện tích bề mặt của Ig.
+ Vùng cố định (ký hiệu là C): Vùng phía đầu –COOH có trật tự axit amin không thay đổi
gọi là vùng cố định. Vùng này giống nhau ở tất cả các Ig, không có khả năng liên kết với kháng
nguyên. Chuỗi nhẹ có 1 vùng cố định (CL) còn chuỗi nặng có 3 vùng cố định (CH1, CH2, CH3).

Hình 5: Cấu trúc của một phân tử kháng thể.

19


Dựa vào đặc điểm của vùng cố định phân biệt 5 phân lớp kháng
thể:
Các Ig
IgG

Phân bố
Chức năng sinh học
Chiếm 75% - 85% Có số lượng lớn nhất đóng vai trò bảo vệ cơ thể

(Monomer)

các kháng thể có chống tác nhân gây bệnh, tăng thực bào, trung hòa
trong huyết tương, co độc tố và virut, hoạt hoá bổ thể.
mặt trong các dịch Là kháng thể duy nhất truyền qua thai nhi, bảo vệ
mô.

con trong những tuần đầu đời sau khi sinh khi hệ

IgM

miễn dịch của trẻ chưa phát triển.
IgM monomer là thụ Xuất hiện đầu tiên sau khi nhiễm trùng

(monomer

thể trên limpho B đối Liên kết với kháng nguyên.

và

dạng với kháng nguyên

pentamer)

IgM

pentamer

trong huyết tương

có
Là các ngưng kết tố chống ngưng kết nguyên A và B

IgA

của nhóm máu ABO.
Có trong chất tiết như Trung hòa kháng nguyên, chống các tác nhân gây

(dimer)

dịch nhầy, dịch ruột, bệnh bám vào lớp biểu bì và xâm nhập các mô phía
nước bọt, nước mắt dưới.

IgD

và sữa.
Gắn
trên

Có trong sữa giúp miễn dịch thụ động cho thai nhi.
màng Làm nhiệm vụ thụ thể cho kháng nguyên.

(monomer)
IgE

limpho B
Có trong máu với Kích thích tế bào mast và bạch cầu ưu kiềm tiết ra

(monomer)

nồng độ thấp

histamine và các chất gây viêm, gây ra các phản ứng
dị ứng.

Hình 6. Các dạng Ig
- Vai trò của kháng thể

20


Trong một đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: gắn với kháng nguyên, kích
hoạt hệ thống bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch.

Hình 6: Cấu trúc kháng thể immunoglobulin G (IgG)

- Có hai loại kháng thể
+ Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb)
Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitopee trên một kháng nguyên cho sẵn (hình
7). Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản
xuất bởi cùng một dòng tương bào.

Hình 7: Cấu trúc của một phân tử kháng thể.
Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa là phương tiện
chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong một phương pháp phát
hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay.

21


Hình 8: Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
+ Kháng thể đa dòng
Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên
một kháng nguyên cho trước (hình 9). Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể
tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên : đáp ứng như vậy gọi là đa dòng.

Hình 9: Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau.
2.1.2. Các domain hằng định

Hình 10: Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể

22


Các domain hằng định (C, constant domain) đặc trưng bởi các chuỗi amino acid rất ít biến
đổi ở các kháng thể. Domain hằng định của chuỗi nhẹ ký hiệu là CL. Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc

4 domain hằng định, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4.
Các domain hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu
nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do đó, phần "chân" của chữ Y còn được gọi là
Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng thể F: fragment, c: cristallisable) thường được liên
kết với các thụ thể tế bào miễn dịch.
2.1.3. Các domain biến thiên
Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V, variable domain) ở đầu tận hai "cánh tay"
của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên
các chuỗi nhẹ kappa và lambda (VL) tạo nên vị trí nhận diện và liên kết với epitope của kháng
nguyên ( phần kháng thể liên kết với kháng nguyên còn gọi là paratopee). Như vậy, mỗi
immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một
kháng thể có thể gắn được với 2 kháng nguyên giống nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là
Fab (tức là phần liên kết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Domain của kháng
nguyên gắn vào kháng thể gọi là epitope.
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều và biểu hiện đa dạng giữa
các kháng thể. Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng thể nhận biết được
nhiều loại tác nhân kháng nguyên gây bệnh khác nhau.
2.1.4. Các lớp kháng thể
Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype.
Tùy theo cấu tạo của các domain hằng định của các chuỗi nặng: các chuỗi nặng , , , 
và  lần lượt tương ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE và
IgD.Tất cả các kháng thể đều chứa các chuỗi nhẹ là kappa và lambda .Ngoài ra, các khác biệt đặc
trưng hơn cũng tồn tại bên trong một số lớp immunoglobulin. Ở người, có 4 loại dưới lớp
(subclass) IgG (IgG1, IgG2, IgG3 và IgG4) và 2 loại dưới lớp IgA (IgA1 và IgA2).
Thông thường một tế bào B sản xuất đồng thời nhiều lớp kháng thể: chúng khác nhau ở
phần C các chuỗi nặng nhưng giống hệt nhau ở tính đặc hiệu với một kháng nguyên. Mỗi lympho
B chỉ có thể sản xuất 1 loại kháng thể đặc hiệu đối với 1 epitope kháng nguyên nhất định, do đó
cần phải có hàng nhiều triệu lympho B khác nhau. Số lượng này vượt quá số lượng gen của con
người.
Trong đó, IgG là loại immunoglobulin monomer, là kháng thể phổ biến nhất trong máu và các

dịch mô. Đây là isotype duy nhất có thể xuyên qua màng nhau thai,qua đó bảo vệ trẻ sơ sinh

23


trong những tuần lễ đầu đời sau khi sinh khi hệ miễn dịch của trẻ chưa phát triển. Vai trò chính
của IgG là hoạt hóa bổ thể và opsonine hóa. Có 4 thứ lớp: IgG1 (66%), IgG2 (23%), IgG3 (7%)
và IgG4 (4%) trong đó IgG4 không có chức năng hoạt hóa bổ thể.
2.1.5.Kháng nguyên
- Kháng nguyên (antigen) là chất có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch khi đưa vào cơ thể
của động vật thích hợp hoặc một chất có khả năng phản ứng với một kháng thể hoặc một tế bào
của hệ thống miễn dịch. Như vậy, tất cả những chất tự nhiên hoặc tổng hợp được sử dụng để tạo
đáp ứng miễn dịch (kể cả các kháng thể) đều được gọi là các kháng nguyên.
Khi một kháng nguyên kể cả kháng thể khác loài xâm nhập vào cơ thể của một loài, các
lympho có thể nhận biết đặc hiệu bằng cách kết hợp với kháng nguyên nhờ thụ thể đặc hiệu. Sự
nhận biết gây cảm ứng sinh sản lympho-B và biệt hóa quần thể tế bào này thành các tế bào
plasma có khả năng sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên xâm nhập. Đó là đáp ứng miễn
dịch thể dịch.
Đáp ứng miễn dịch cũng có thể gây ra sự xuất hiện quần thể lympho-T miễn dịch mang các
thụ thể đặc hiệu với kháng nguyên. Đó là sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Tính phản
ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với
kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào một phần cấu trúc giới hạn của kháng
nguyên. Phần cấu trúc giới hạn này được gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant)
hay epitope.
Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitope có cấu trúc ba chiều của phân tử kháng
nguyên. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ nhận diện epitope kháng nguyên
gọi là paratope. Tính miễn dịch của một epitope kháng nguyên là đặc tính gây ra một đáp ứng
miễn dịch của phân tử kháng nguyên khi nó xâm nhập vào cơ thể. Trong trường hợp kháng
nguyên là các protein, người ta có thể nhận biết được kích thước của một epitope kháng nguyên
vào khoảng 5 đến 10 gốc acid amin bằng phương pháp phân hủy hóa học hoặc phân hủy enzyme

đối với kháng nguyên này. Người ta cũng phân biệt một dạng epitope thứ hai, gọi là epitope gián
đoạn. Loại epiotop này được sắp xếp nhưng lại gần nhau về không gian của protein do sự gấp lại
của chuỗi polypeptid.
- Kháng nguyên có 2 thuộc tính: tính lạ và tính đặc hữu.
+ Tính lạ là khác với cơ thể chủ. Nhưng không phải tất cả các chất lạ đều là kháng nguyên.
+ Tính đặc hữu là mỗi kháng nguyên chỉ kích thích cơ thể tạo nên một kháng thể tương ứng
để làm mất tác dụng của kháng nguyên.
- Ái lực giữa kháng nguyên và kháng thể:

24