Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Lên Khả Năng Nhân Nhanh Sinh Khối Phôi Sâm Ngọc Linh Trong Điều Kiện Nuôi Cấy In Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN
KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM
NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN
VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan
Sinh viên thực hiện

: Phạm Thảo My

MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN
KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM
NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN
VITRO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

TS. Hà Thị Loan

Phạm Thảo My

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8 Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cha mẹ và gia đình tôi, đã tạo
mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập tại Trƣờng đại học Hutech thành phố Hồ
Chí Minh. Cảm ơn cha mẹ đã luôn động viên tôi để tôi có thể hoàn thành tốt khóa
học của mình.
Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học thành
phố Hồ Chí Minh nói chung và phòng thực nghiệm cây trồng nói riêng đã cho phép
và hỗ trợ mọi mặt về cơ sở vật chất để tôi thực hiện đƣợc khóa luận tạ đây.

Xin đƣợc gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy
những ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin cảm ơn tất cả các anh chị trong
phòng thực nghiệm cây trồng đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong công việc
và học tập.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến trƣờng Đại học Hutech thành phố Hồ Chí
Minh, cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hƣơng Viện Khoa học Ứng dụng Hutech đã
tạo điều kiện cho tôi đƣợc gặp gỡ tiếp xúc với môi trƣờng làm việc thực tế và đƣợc
nghiên cứu đề tài tại Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh.
Cuối cùng tôi xin kính chúc ban giám hiệu trƣờng Đại học Hutech, ban lãnh
đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS. Hà Thị Loan, KS.
Đào Bá Uy luôn dooif dào sức khỏe, gặt hái đƣợc nhiều thành công trong công việc,
cuộc sống luôn tràn đầy niềm vui và hạnh phúc.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày

Tháng

Sinh viên thực hiện

i

Năm 2018


CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự
hƣớng dẫn khoa học của TS. Hà Thị Loan và KS. Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên
cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức
nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích,

nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ
trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng nhƣ số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác, đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung khóa luận của mình. Trƣờng Đại học Hutech không liên quan
đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tao gây ra trong quá trình thực hiện
(nếu có).
Tp. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

Tác giả

Phạm Thảo My

ii

năm2018


TÓM TẮT
Sinh viên thực hiện: Phạm Thảo My
Ngành: Công nghệ Sinh học

Lớp: 14DSH02

MSSV:1411100365

Tên đề tài: “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”.
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Hà Thị Loan.
Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm thực nghiệm cây trồng
Trung tâm Công nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM
Đề tài gồm 5 thí nghiệm lần lƣợt khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, của điều kiện nuôi cấy
ánh sáng và nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong
nuôi cấy in vitro.
Sau 10 tuần nuôi cấy, ở thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của BA, BA và
NAA, kết quả cho thấy mẫu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/l BA
và 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 2) cho kết quả tốt hơn
so với phôi đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng MS chỉ bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức
đạt kết quả tốt nhất thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối là 9,55 lần. Bên cạnh đó
đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Oligochitosan, kết quả

cho thấy

Oligochitosan không những không kích thích khả năng tăng sinh khối cho phôi sâm
Ngọc Linh mà còn ức chế khả năng sinh trƣởng phôi sâm Ngọc Linh. Ở thí nghiệm
ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trƣởng mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy
dƣới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh. Và đồng thời qua kết quả thí
nghiệm 4 chúng tôi nhận thấy mẫu phôi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trƣởng trong

iii


khoảng nền nhiệt từ 190C – 230C tuy nhiên trong đề tài này nhiệt độ tốt nhất là
230C.

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH ................................................................... ii
TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH ........................................................................ ii
TÓM TẮT ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ..............................................................................................x
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ xi
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU .........................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..........................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ..........................................................................................2
1.3 Nội dung nghiên cứu..........................................................................................2
1.4 Ý nghĩa đề tài .....................................................................................................2
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI.........................................................................3
2.1 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật.............................................................3
2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì? ..............................................................3
2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ...........................................................4
2.1.3 Ứng dụng .....................................................................................................5
2.2 Tổng quan về cây sâm Ngọc Linh .....................................................................6
2.2.1 Lịch sử phát hiện .........................................................................................6
2.2.2 Nơi phân bố của sâm Ngọc Linh .................................................................7
2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh .....................................................................7
2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh ...........................................................9
2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................11

v

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành .......................................................................19
3.2 Vật liệu thí nghiệm ..........................................................................................19
3.2.1 Vật liệu ......................................................................................................19
3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ ...........................................................................20
3.2.3 Hóa chất .....................................................................................................20
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm ..................................................................................20
3.4 Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................21
3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................21
3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................22
3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .....................................................23
3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................25
3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của nồng độ chitosan lên sự nhân nhanh phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .............................................................26
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................28
4.1 Kết quả thí nghiệm 1: ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro ..........................................................28
4.2 Kết quả thí nghiệm 2: ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh
sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro ..........................................31
4.3 Kết quả thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro..................................................35
4.4 Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro..................................................39
vi

4.5 Kết quả thí nghiệm 5: ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh
sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro. .........................................43
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................46
5.1 Kết luận ............................................................................................................46
5.2 Kiến nghị..........................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................48
PHỤ LỤC ..................................................................................................................50

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

: 6 – Benzylaminopurine

NAA

: Naphthalene acetic acid

IAA

: 3 – Indoleacetic acid

IBA

: 3 – indol butyric acid

MS

: Murashige và Skoog (1962)

2i – P

: 2 – isopentenyladenine

Tp. Hồ Chí Minh

: Thành phố Hồ Chí Minh

KHCN

: Khoa học công nghệ

Cty TNHH

: công ty trách nhiệm hƣu hạn

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA lên khả năng
nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ................................................. 21
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với
NAA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh .................. 23
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân
nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh .......................................................... 24
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân

nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh .......................................................... 25
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Oligochitosan lên
khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ................................. 26
Bảng 4.1: so sánh ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc
Linh .............................................................................................................. 28
Bảng 4.2: so sánh ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân phôi và chồi sâm Ngọc
Linh .............................................................................................................. 31
Bảng 4.3: so sánh ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân phôi và chồi sâm
Ngọc Linh .................................................................................................... 35
Bảng 4.4: so sánh ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân phôi và chồi sâm
Ngọc Linh .................................................................................................... 40
Bảng 4.5: so sánh ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân phôi và chồi
sâm Ngọc Linh ............................................................................................. 43

ix


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ
BA khác nhau .......................................................................................... 28
Biểu đồ 4.2: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ
BA và NAA khác nhau............................................................................ 32
Biểu đồ 4.3: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các loại ánh
sáng khác nhau ........................................................................................ 36
Biểu đồ 4.4: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi giữa các mức nhiệt độ khác
nhau ......................................................................................................... 40
Biểu đồ 4.5: Biểu đồ so sánh khối lƣợng phôi tƣơi và số chồi giữa các nồng độ
Oligochitosan khác nhau ......................................................................... 43

x

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Hình ảnh cây sâm Ngọc Linh........................................................................ 6
Hình 2.2: Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh ............................................................ 8
Hình 2.3: Axit 2,4 dicloro - phenoxiaxetic(2,4D) ......................................................... 14
Hình 2.4: Naphthalene acetic acid (NAA) .................................................................... 14
Hình 2.5: Zeatin ............................................................................................................ 14
Hình 2.6: Benzyladenine ............................................................................................... 14
Hình 2.7: GA3 ............................................................................................................... 15
Hình 3.1: Phôi sâm Ngọc Linh 2 tháng tuổi tại Trung Tâm Công Nghệ sinh học
thành phố Hồ Chí Minh ............................................................................... 19
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của BA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh ở
giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần ................................................................... 29
Hình 4.2: Sự thay đổi số chồi giữa các nghiệm thức thí nghiệm 1 ............................... 30
Hình 4.3: Hình ảnh số lƣợng chồi ở 4 nghiệm thức thí nghiệm 2 ................................ 32
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm
Ngọc Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi ...................................... 33
Hình 4.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối phôi samm Ngọc
Linh ở giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi ................................................ 37
Hình 4.6: Sự khởi tạo lại phôi non xung quanh phôi già (thái hóa) trong thí
nghiệm ánh sang .......................................................................................... 38

xi


Hình 4.7: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở giai
đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi .................................................................... 41
Hình 4.8: Màu sắc phôi sâm Ngọc Linh của các nghiệm thức thí nghiệm ..................... 42

Hình 4.9: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên sự nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh ở
giai đoạn 4 tuần tuổi và 10 tuần tuổi................................................................ 44

xii


CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Sâm Ngọc Linh là loại sâm thứ 20 đƣợc tìm thấy trên thế giới, chỉ mọc ở nơi
có độ cao từ 1200 mét trở lên, đƣợc phát hiện vào năm 1973 trên núi Ngọc Linh
(tỉnh KonTum). Điều đáng bất ngờ ở đây sâm Ngọc Linh là một trong những loại
sâm có chứa hàm lƣợng saponin (là một trong những thành phần hóa học của các
loại thảo mộc, có tác dụng giảm cholesterol trong máu, chống ung thƣ, tăng cƣơng
sức khỏe của xƣơng và kích thích hệ miễn dịch) nhiều nhất so với các loại sâm khác
trên thế giới. Những kết quả phân tích thân rễ và củ của sâm Ngọc Linh, các nhà
khoa học đã xác định đƣợc có tới 52 loại Saponin.
Ngoài ra, trong các công trình nghiên cứu khác ngƣời ta còn xác định đƣợc
thành phần dƣợc tính trong sâm Ngọc Linh có 17 acid amin, 20 chất khoáng vi
lƣợng và hàm lƣợng tinh dầu là 0,1%. Tất cả những điều đó khiến sâm Ngọc Linh
trở thành một loại sâm quý, một loại “thần dƣợc” mang tính Quốc Gia. Tuy nhiên
tình hình nhân rộng diện tích trồng sâm Ngọc Linh còn nhiều khó khăn và hạn chế,
do nguồn hạt giống khá hiếm hoi vì thời gian để một cây sâm Ngọc Linh ra quả là
khá lâu khoảng từ 4 - 5 năm, cộng với việc giá của một cây con sâm Ngọc Linh lại
quá cao, rơi tầm từ 150.000 - 200.000 đồng một cây. Do đó việc nghiên cứu để
nhân giống sâm Ngọc Linh In vitro là một yêu cầu cần thiết.
Hiện tại sâm Ngọc Linh vẫn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu, nhân nhanh
giống In vitro, để phục vụ sản xuất cây giống và để sản xuất sinh khối thu hợp chất
thứ cấp saponin. Do đó tôi quyết định làm đề tài “Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi
cấy lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”
nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy thuận lợi nhất cho phôi sâm Ngọc Linh, tạo ra

nguồn mẫu In vitro lớn cho các nghiên cứu sau này và cung cấp nguồn cây giống
cho Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM và thị trƣờng trong nƣớc.

1


1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng thực vật bổ sung và các điều kiện
môi trƣờng thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng) cho quá trình nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh nhằm tạo ra số lƣợng lớn mẫu sâm Ngọc Linh In vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi
sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA và BA lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng nhân nhanh sinh khối
phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của Oligochitosan lên khả năng nhân nhanh sinh
khối phôi sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro.
1.4 Ý nghĩa đề tài
Thông qua đề tài nghiên cứu, có thể tìm đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp
nhất cho sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh. Tạo điều kiện thuận lợi cho
các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh sau này. Đồng thời góp phần nghiên cứu để sản
xuất cây giống sâm Ngọc Linh ở quy mô công nghiệp, làm nguồn nguyên liệu để
nhân sinh khối, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và nƣớc ngoài.
Giúp cho sinh viên hiểu và có nhiều kiến thức hơn về sâm Ngọc Linh. Tìm
hiểu và nắm rõ kiến thức về phƣơng pháp nghiên cứu khoa học, thu thập, xử lý và
phân tích số liệu. Biết cách trình bày một nghiên cứu khoa học.

2


CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
2.1 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì?
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật đƣợc sử dụng để duy
trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên
môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng với những thành phần đã xác định. (Trần Văn
Minh, 1997)
Theo ông Dƣơng Công Kiên (2003) các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy
mô tế bào thực vật có thể cung cấp những lợi thế nhất định so với phƣơng pháp
nhân giống truyền thống, bao gồm:


Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lƣợng cao
hoặc có những tính trạng mong muốn khác.



Tạo ra các cây trƣởng thành một cách nhanh chóng



Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để
tạo hạt.



Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã đƣợc biến đổi gen.



Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối
đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh.



Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thƣờng có tỷ lệ
nảy mầm thấp hoặc sinh trƣởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm.



Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác
và nhân nhanh các cây này nhƣ là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng
ruộng và nông nghiệp.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh (còn gọi là totipotency – khả năng biệt
hóa của tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lƣợng không giới hạn).
Các tế bào đơn lẻ, các tế bào thực vật không có thành tế bào (protoplast), các mảnh
3


lá, rễ hoặc thân, thƣờng có thể đƣợc sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi
trƣờng nuôi cấy bổ sung các chất dinh dƣỡng và hormone thực vật. (Dƣơng Công
Kiên, 2003)

Nguồn ảnh:

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra ý tƣởng cấy mô
sinh vật ra ngoài cơ thể nhƣng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành
công.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của
việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1951, Skoog và Miller đã cải tiến môi trƣờng nuôi cấy đánh dấu một
bƣớc tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trƣờng của họ đã đƣợc dùng làm cơ sở
cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn đƣợc sử dụng rọng rãi cho đến ngày
nay.
Năm 1964, Ball là ngƣời đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trƣờng nuôi
cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chƣa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều

4


nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dƣỡng qua trọng cần thiết
cho sự phát triển của các tế bào đƣợc nuôi cấy.
Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi
cấy đỉnh sinh trƣởng. Từ kết quả đó, lan đƣợc xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên
đƣợc thƣơng mai hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã
đƣợc phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và đƣợc ứng dụng thƣơng mại
hóa. (Dƣơng Công Kiên, 2003)
2.1.3 Ứng dụng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực
vật, lâm nghiệp, và đồng ruộng (BioMedia VN, 2016). Các ứng dụng bao gồm:


Thƣơng mại hóa sản xuất các loài thực vật sử dụng nhƣ là cây cảnh, trang trí

phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, là thứ mà sử dụng nuôi cấy
mô phân sinh và chồi để tạo ra số lƣợng lớn các cá thể giống hệt nhau.



Bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa.



Các nhà nhân giống có thể ƣu tiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế
bào hơn là sàng lọc cây trồng để tìm các tính trạng tốt, ví dụ kháng/chống
chịu thuốc diệt cỏ.



Sinh trƣởng quy mô lớn các tế bào thực vật trong môi trƣờng lỏng trong các
bioreactors để tạo ra các hợp chất có giá trị, giống nhƣ sinh tổng hợp các hợp
chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổ hợp, đƣợc sử dụng nhƣ
là dƣợc phẩm sinh học.



Lai xa các loài thực vật bằng cách bởi dung hợp protoplast và tái sinh các
phép lai mới.



Nghiên cứu nhanh cơ sở phân tử của các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản
ở thực vật, ví dụ nhƣ chọn lọc in vitro các cây chống chịu với các điều kiện
bất lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro.

5




Lai - thụ phấn các loài xa nhau và sau đó nuôi cấy tế bào hợp tử đƣợc tạo
thành (thƣờng dễ bị chết nếu diễn ra trong tự nhiên) (cứu phôi).



Các thể đột biến nhân đôi nhiễm sắc thể và sự hình thành của các thể đa bội,
ví dụ nhân đôi đơn bội, tứ bội và các dạng khác của thể đa bội có đƣợc tạo ra
bằng cách áp dụng các chất chống phân bào (antimitotic) nhƣ là colchicine
hoặc oryzalin.



Các mô tế bào nuôi cấy sau khi biến nạp có thể sử dụng để thử nghiệm ngắn
hạn các cấu trúc di truyền (genetic constructs) hoặc tái sinh tạo các cây
chuyển gen.



Các kỹ thuật nhất định nhƣ là nuôi cấy đỉnh phân sinh có thể đƣợc sử dụng
để tạo nguồn nguyên liệu thực vật sạch từ nguồn bị lây nhiễm virus nhƣ là
khoai tây và rất nhiều các loài có quả mềm.



Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau

2.2 Tổng quan về c y s m Ngọc Linh

Hình 2.1. hình ảnh cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn: nhansamlinhchi.net.vn)
2.2.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1973, đoàn Điều tra dƣợc liệu Ban Dân Y khu 5 do dƣợc sỹ Đào Kim
Long và Nguyễn Châu Giang hƣớng dẫn đã phát hiện đƣợc một loài Panax mọc
thành quần thể ở độ cao 1800m tại vùng Ngọc Lây, Huyện Đắc Tô, Tỉnh KonTum
và đặt tên là “sâm đốt trúc“ với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulates L.
, họ Nhân sâm (Araliaceae)

6


Trải qua hơn 30 năm sâm K5 còn gọi là sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam,
một loài sâm đặc hữu của nƣớc ta đã đƣợc thế giớ biết đến với tên khoa học là
Panax vietnamenis Ha et Grushv. (Hà Thị Dụng và Grushvisky, 1985)
2.2.2 Nơi ph n bố của sâm Ngọc Linh
Cây sâm đƣợc phát hiện ở độ cao từ 1200 m trở lên,có tài liệu cho biết cao
độ tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1500m (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003), đạt
mật độ cao nhất ở khoảng từ 1700 - 2000m dƣới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có
hai tỉnh KonTum và Quảng Nam là có cây sâm này.
Sâm mọc tập trung dƣới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2578m với
lớp đất vàng đỏ trên đá Granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng
nguyên sinh còn rộng, nên đƣợc gọi là sâm Ngọc Linh
Những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc
Lum Heo thuộc Xã Phƣớc Lộc, Huyện Phƣớc Sơn, Tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi
Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc KonTum, núi Langbian ở Lạc Dƣơng

Tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này. (báo Thanh Niên, 2006)
2.2.3 Đặc điểm của sâm Ngọc Linh
a) Đặc điểm hình thái
Đây là một loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 cm đến 100 cm, thoạt
nhìn rất giống nhân sâm Triều Tiên, nhƣng nhìn kỹ sẽ thấy thân rễ có sẹo và các đốt
nhƣ đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại.
Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím,
nhỏ, có đƣờng kính thân độ 4 - 8 mm, thƣờng tàn lụi hàng năm tuy nhiên thỉnh
thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm.
 Thân rễ: có đƣờng kính 1 - 2 cm, mọc bò ngang nhƣ củ hoàng tinh trên hoặc
dƣới mặt đất độ 1 - 3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ.

7


 Các thân mang lá và lá: tƣơng ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài
khoảng 0,5 - 0,7 cm, tuy nhiên sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm
thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh
của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3 - 5 nhánh lá. Cuống lá kép
dài 6 - 12mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12 - 15 cm,
rộng 3 - 4 cm. Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cƣa, chóp nhọn, lá có lông
ở cả hai mặt.
 Hoa: hình tán đơn mọc dƣới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dƣới tán chính. Mỗi tán
có 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt,
nhị 5, bầu một ô với 1 vòi nhụy(đối với cây 4 - 5 tuổi).
 Quả: mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 cm - 1 cm và rộng
khoảng 0,5 cm - 0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm,
vàng lục, khi chín ngả màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi
quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10
đến 30 quả.

Hình 2.2. Các bộ phận của cây sâm Ngọc Linh
(Nguồn agi.gov.vn)

8


b) Đặc điểm sinh lí:
Mọc dƣới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C 25°C, ban đêm 15°C - 18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100
năm (Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động), sinh trƣởng khá chậm. Bộ phận dùng làm
thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu
tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần
lên thành cây sâm trƣởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và
kết quả. Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần
thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu giai
đoạn ngủ đông hết tháng 12. Chính căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông
đến mà ngƣời ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi tức
trên củ có một sẹo (sau 3 năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác,
khuyến cáo là trên 5 năm tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân
rễ của sâm (Cam Lu – Trƣơng Hiệu, 2003).
d)Dƣợc tính
Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt cán bộ Viện Dƣợc liệu thì về mặt hoá học, thân
rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập đƣợc 52 saponin trong đó 26
sanopin thƣờng thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật. Trong lá và cọng đã
phân lập đƣợc 19 saponin pammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác
định đƣợc trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin, 20 chất khoáng vi lƣợng và hàm
lƣợng tinh dầu là 0,1% ( Võ Tuấn, 2014, báo Lao Động)
2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh
Hiện tại cả nƣớc cả nƣớc có 4 địa điểm nghiên cứu và sản xuất sâm Ngọc
Linh chính đó là KonTum, Quảng Nam, Đà Lạt và Trung Tâm Công Nghệ Sinh

Học Tp. Hồ Chí Minh.
Tại Đà Lạt có Nhà sƣ Thích Huệ Đăng ở chùa Thanh Quang đƣợc Cục Sở
hữu trí tuệ của Bộ KHCN trao bằng “độc quyền sáng chế” với công trình: “Quy

9


trình trồng cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô”. Thầy đã chọn phƣơng pháp nhân
giống vô tính cho cây Ngọc Linh bằng việc áp dụng nuôi cấy lan bằng giá thể vỏ cà
phê sang việc nuôi cấy sâm Ngọc Linh với nguồn nguyên liệu sẵn có giúp giảm giá
thành trong chi phí sản xuất. Sau một thời gian huy động trí lực của khá nhiều
ngƣời cùng với việc bỏ ra hàng tỉ đồng để lập phòng thí nghiệm và nuôi cấy mô,
Cty TNHH xuất khẩu hoa lan Thanh Quang đã thành công trong việc nhân giống
hàng loạt và trồng thử nghiệm thành công (tỉ lệ cây sống đạt khá cao – khoảng 60%)
cây sâm Ngọc Linh tại Đà Lạt.
Nhóm nghiên cứu của GS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt thuộc viện nghiên cứu khoa
học Tây Nghiên đã nghiên cứu tạo nguồn cây giống chất lƣợng phục vụ cho công
tác phát triển sản xuất quy mô lớn, tiến tới làm chủ nguồn giống, giảm sự phụ thuộc
nguồn cây giống từ hạt trong tự nhiên đang đƣợc trồng nhƣ hiện nay tại 2 tỉnh
Quảng Nam và KonTum. Kết quả tạo ra cây In vitro hoàn chỉnh, đảm bảo tỉ lệ sống
sau trồng hơn 80%. Ông là ngƣời đầu tiên bắt cây sâm Ngọc Linh ra hoa đồng thời
cũng là ngƣời đi đầu trong việc áp dụng đèn LED đơn sắc trong việc nhân giống vô
tính sâm Ngọc Linh. (báo Lâm Đồng, 2017)
TS.Nguyễn Hữu Hổ, Viện Sinh học Nhiệt Đới đã nghiên cứu thành công đề
tài “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất sinh khối tế bào và rễ Sâm Ngọc Linh
in vitro”. Nhóm nghiên cứu của ông đã thực hiện thành công quy trình nuôi cấy
nhân giống các loại mô sâm mang tính mới cao đó là nuôi nhân mô phôi vô tính, rễ
bất định, nhân rễ bằng bioreactor sục khí , sánh kịp các nƣớc trong khu vực và thế
giới về trình độ khoa học – công nghệ. Hơn nữa, do thao tác nuôi cấy không phức
tạp; sinh khối thu đƣợc có thể đáp ứng cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau nhƣ

thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và y dƣợc; và điều kiện nuôi không chịu sự chi
phối của môi trƣờng bên ngoài. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Nghiên cứu tạo và nuôi nhân mô sẹo có khả năng sinh phôi soma từ mô sẹo
lá trong môi trƣờng lỏng; tạo mô phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự
phát sinh hình thái chồi/rễ của mô phôi soma trong nuôi cấy và nuôi nhân phôi

10


soma sâm Ngọc Linh trong môi trƣờng lỏng tạo kết quả tiền đề cho nghiên cứu
nhân sinh khối quy mô lớn hai loại mô có khả năng sản sinh hàm lƣợng hợp chất
thứ cấp cao do chúng đã mang ít nhiều trạng thái biệt hóa. (Nguyễn Hữu Hổ, 2014)
Tại Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh nhóm nghiên
cứu Hà Thị Loan đã nghiên cứu thành công đề tài “nghiên cứu tạo rễ tóc sâm ngọc
linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn
agrobacterium rhizogenes”. Vì sâm Ngọc Linh có hàm lƣợng saponin trong thân rễ
cao hơn so với những loài sâm cùng chi Panax. Biến nạp gen nhằm thay đổi thông
tin di truyền giúp cải thiện tạo đƣợc những hoạt chất sinh học có giá trị, đặc biệt là
dùng vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes chứa gen rol cảm ứng tạo rễ tóc. (Tạp
chí sinh học, 2014)
GS.TS Dƣơng Tấn Nhựt tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh bằng cách lấy mảnh lá
(0,5 x 0,5 cm) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D. Mô
sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l NAA + 0,2 mg/l
kinetin + 10% nƣớc dừa để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi và môi trƣờng MS½ +
0,2 mg/l 2,4-D + 10% nƣớc dừa để tạo mô phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi tăng
nhanh sinh khối qua nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5
mg/l NAA. Mô phôi có khả năng tăng sinh nhanh trong môi trƣờng lỏng MS½ + 0,2
mg/l NAA + 0,2 mg/l BA. Tùy môi trƣờng nuôi cấy ban đầu và ở các giai đoạn tiếp
theo, mô phôi phát triển theo hƣớng tạo chồi hoặc rễ tạo quần thể chồi hoặc rễ.
(Dƣơng Tấn Nhựt, 2012)

2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo ông Dƣơng Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật (tập 1, 2, 3). NXB
ĐHQG TP.HCM nuôi cấy mô tế bào thực vật bị ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố, bao
gồm:
a) Khoáng đa lƣợng:
-

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với
cây trồng trong điều kiện tự nhiên.

11