Sản Xuất Vi Khuẩn Bacilus Subtilis Và Lactobacillus Tăng Cường Phân Hủy Thức Ăn Thừa Tạo Chế Phẩm Phân Bón Lá

tên đề tài.txt
c
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai
SV: Huỳnh Phương Thảo
Lớp: 13DSH03
MSSV: 1311100669

Page 1


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt
nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án
tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án
của mình.
TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Huỳnh Phương Thảo


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ của
Thầy Cô, gia đình và bạn bè.

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gủi đến cô Nguyễn Thị Hai đã luôn tận tình
quan tâm hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập cho đến khi xây
dựng đề cương và hoàn thành đồ án này.
Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học- Thực
phẩm - Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt kiến
thức quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại đây.
Em xin gửi lời cám ơn đến gia đình đã luôn đã chăm sóc,dạy dỗ và hỗ trợ em
cũng như luôn bên cạnh và làm chỗ dựa tinh thần cho em.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến tất cả các anh chị và bạn bè cùng thực hiện đề
tài trong phòng thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ với em khi thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện
đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Với điều kiện thời gian cũng như kinh
nghiệm còn hạn chế của một sinh viên, đồ án này không thể tránh được những thiếu
sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô để em
có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, nhằm phục vụ tốt hơn công tác
thực tế sau này.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Em xin chân thành cám ơn!
TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Phương Thảo


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................ vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1

1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................................2
2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước..................................................... 2
2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước .................................................... 2
2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân bón vi
sinh. ........................................................................................................................................... 4
2.4. Tình hình chất thải thực phẩm thừa. .............................................................................. 6
3. Mục đích nghiên cứu ...........................................................................................................7
4. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................................8
4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu ...................................................................................... 8
4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu.......................................................................... 8
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................................8
6. Kết quả đạt được ..................................................................................................................8
7. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................................9
8. Kết cấu đồ án ........................................................................................................................9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 10
1.1.Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa .................................. 10
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................... 10
1.1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus........................................................................ 15
1.2. Tổng quan về enzyme.................................................................................................... 20
1.2.1. Enzyme protease ......................................................................................................... 20
1.2.2. Enzyme amylase .......................................................................................................... 24
1.2.3. Enzyme cellulase ......................................................................................................... 28
1.3.Tổng quan về phân bón .................................................................................................. 30
i


Đồ án tốt nghiệp

1.3.1.Khái niệm ...................................................................................................................... 30

1.3.2. Phân loại...................................................................................................................... 31
1.3.3. Thành phần dinh dưỡng ............................................................................................. 33
1.3.4. Ưu điểm của phân bón hữu cơ .................................................................................. 33
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 334
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................................ 34
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................................. 34
2.1.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................. 34
2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 34
2.2.1. Nguồn vi sinh vật ........................................................................................................ 34
2.2.2. Hóa chất và môi trường ............................................................................................. 35
2.3.Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................................... 36
2.3.1. Thiết bị ......................................................................................................................... 36
2.3.2. Dụng cụ ........................................................................................................................ 36
2.4.1. Bố trí thí nghiệm chung.............................................................................................. 37
2.4.2. Bố trí thí nghiệm chi tiết ............................................................................................ 38
2.5. Phương pháp nghiên c ứu............................................................................................... 52
2.5.1. Phương pháp tăng sinh .............................................................................................. 52
2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................................... 52
2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc............................................................. 53
2.5.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào ................................................................... 54
2.5.5. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật .................................................... 55
2.5.6. Phương pháp đục lỗ thạch......................................................................................... 56
2.5.7. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein, cellulose. ........ 57
2.5.8. Phương pháp xử lí số liệu .......................................................................................... 58
2.5.9. Xác định mật độ tế bào VSV ...................................................................................... 58
2.5.10. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
được tuyển chọn. .................................................................................................................... 59
2.5.11. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn ....................................................................................................................... 60
ii

Đồ án tốt nghiệp

2.5.12. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn. ....................................................................... 61
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 63
3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh, cellulse và protein của các
chủng BM13 và BDH ........................................................................................................... 63
3.1.1. Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 65
3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 65
3.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC của các chủng vi khuẩn BM và
BDH. ...................................................................................................................................... 67
3.2. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng BDH4 ................................. 63
3.2.1. Kết quả nhuộm Gram ................................................................................................. 70
3.2.2. Kết quả nhuộm bào tử ................................................................................................ 70
3.3. Kết quả khẳng định lại đặc điểm hình thái của chủng L2 ........................................ 71
3.4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis BDH4 với
Lactobacillus L2 .................................................................................................................... 73
3.5. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme protease của 2 chủng Bacillus subtilis
BDH4 với Lactobacillus L2 khi trộn chung với nhau ...................................................... 74
3.6. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis BDH4. 75
3.6.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 75
3.6.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng BDH4. .......................................................................................................................... 77
3.7. Khảo sát điều kiện nuôi cấy để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus L2. .......... 78
3.7.1. Thời gian nuôi cấy ...................................................................................................... 78
3.7.2. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 80
3.8. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme
của chủng BDH4.................................................................................................................... 82
3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh enzyme
của chủng L2 ........................................................................................................................ 827
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 92

iii


Đồ án tốt nghiệp

1. Kết luận .............................................................................................................................. 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 93
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...................................................................................................... 93
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ....................................................................................................... 97

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt,1992) ........... 13
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn BM và BDH được chọn để khảo sát ........... 34
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh amylase của các
chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 63
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của
các chủng vi khuẩn BM và BDH ......................................................................................... 65
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân CMC sinh enzyme cellulase của các

chủng vi khuẩn BM và BDH................................................................................................ 67
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
BDH4 ...................................................................................................................................... 75
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh
trưởng của chủng BDH4 ....................................................................................................... 77
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng vi khuẩn L2 ................................................................................................................. 78
Bảng 3.7. Khảo sát pH ban đầu của môi trường đến sự sinh trưởng của chủng vi
khuẩn L2 ................................................................................................................................. 80
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng
sinh enzyme của chủng BDH4............................................................................................. 82
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy đến sự ST và khả năng sinh
enzyme của chủng L2 ........................................................................................................... 87

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................................. 11
Hình 1.2. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus .................... 17
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan bố trí các bước thí nghiệm ............................................... 37
Hình 2.2. Sơ đồ quy làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH 38
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình làm thuần chủng Lactobacillus L2 ................................... 40
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các chủng
BM và BDH ...................................................................................................................... 42
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của các chủng
BM và BDH ...................................................................................................................... 44
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi

khuẩn BM và BDH ........................................................................................................... 46
Hình 2.7. Khảo sát tính đối kháng của hai chủng VSV được tuyển chọn dùng để
phối trộn vào thức ăn thừa. .............................................................................................. 48
Hình 2.8. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng
Bacillus subtilis được tuyển chọn ................................................................................... 50
Hình 3.1. Vòng phân giải tinh bột của các chủng BM và BDH ............................... 64
Hình 3.2. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân tinh bột sinh enzyme amylase của
các chủng vi khuẩn BM và BDH .................................................................................... 64
Hình 3.3. Khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease cuả các chủng BM và
BDH ................................................................................................................................... 65
Hình 3.4. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein sinh enzyme protease của 65
chủng vi khuẩn BM và BDH........................................................................................... 66
Hình 3.5. Vòng phân giải CMC của các chủng BM và BDH sau 48 giờ ................. 67
Hình 3.6. Vòng phân giải CMC của 6 chủng vi khuẩn BM và BDH sau 2 ngày nuôi
cấy ................................................................................................................................... 68
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng Bacillus subtilis BDH4
nhuộm Gram trên kính hiển vi x100 .............................................................................. 70
vi


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8 – Kết quả nhuộm bào tử chủng vi khuẩn BDH4 ......................................... 71
Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng s L2 nhuộm Gram trên
kính hiển vi x100 .............................................................................................................. 72
Hình 3.10. Khả năng đối kháng chủng Bacillus subtilis BDH4 với Lactobacillus L2
................................................................................................................................... 73
Hình 3.11. Khả năng sinh enzyme protease khi trộn 2 chủng vi khuẩn BDH4 và L2 .
................................................................................................................................... 74
Hình 3.13. Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của

chủng BDH4 sau 36 giờ nuôi cấy................................................................................... 77
Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng vi khuẩn L2 ............................................................................................................ 79
Hình 3.16. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme amylase của chủng BDH4................................................................................. 83
Hình 3.17. Môi trường nuôi cấy chủng Bacillus subtilis BDH4 .............................. 83
Hình 3.18. Hình thái khuẩn lạc chủng BDH4 khi nuôi cấy trên từng loại môi trường
… ............................................................................................................................... 84
Hình 3.19. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase của
chủng vi khuẩn BDH4 ..................................................................................................... 85
Hình 3.20. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của
chủng vi khuẩn BHD4 ..................................................................................................... 86
Hình 3.21. Ảnh hưởng môi trưởng nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh
enzyme protease của chủng L2 ....................................................................................... 88
Hình 3.22. Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus L2 .......................... 88
Hình 3.23. Hình thái khuẩn lạc chủng L2 khi được nuôi cấy trên 4 môi trường.... 89
Hình 3.24. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của chủng L2 được nuôi cấy
trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90
Hình 3.25. Kết quả khảo sát khả năng sinh protease của chủng L2 được nuôi cấy
trên 4 loại môi trường....................................................................................................... 90

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Food and Agriculture Organization of

FAO

the United Nations

MĐVSV

Mật độ vi sinh vật

NA

Nutrient agar

NB

Nutient broth

ĐKVPG

Đường kính vòng phân giải

VSV

Vi sinh vật

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Xã hội ngày càng phát triển, những tiến bộ về khoa học và kĩ thuật làm cho
cuộc sống con người có những thay đổi lớn. Ngành công nghiệp dịch vụ ăn uống
mở rộng. Hàng ngày, một lượng lớn thức ăn thừa được thải bỏ từ các nhà hàng,
khách sạn dịch vụ ăn uống. Việc gia tăng lượng thức ăn thừa đang là vấn nạn trên
phạm vi toàn cầu (Syeda Azeem Unnisa, 2015). Ở Việt Nam, chỉ một lượng nhỏ
thức ăn thừa được thu hồi để làm thức ăn chăn nuôi. Đa phần, thức ăn thừa được đổ
bỏ theo rác sinh hoạt. Thức ăn thừa là nguồn rác thải thải giàu chất hữu cơ nên việc
đổ thức ăn thừa theo rác thải thường tạo ra mùi hôi, là nơi trú ẩn của côn trùng và vi
sinh vật có hại đến sức khỏe con người (Jayathilakan et al , 2012). Ngoài ra,việc
phân hủy thức ăn thừa tại các bãi rác tạo ra một lượng không nhỏ CH4 và CO2 tác
nhân gây hiệu ứng nhà kính. Vì vậy, Syeda Azeem Unnisa, (2015) cho rằng, việc xử
lý thức ăn thừa tại các bãi rác là không tốt cho môi trường và kém bền vững. Các
tác giả cho biết, sử dụng các vi khuẩn như Bacillus subtilis và Lactobacillus spp. để
phân hủy thức ăn thừa trong điều kiện thiếu oxy, tạo phân bón dạng lỏng là một
hướng đi đầy triển vọng vừa làm giảm ô nhiễm môi trường, vừa tạo được phân bón
hữu cơ thay thế cho phân bón vô cơ trong sản xuất nông nghiệp. Trong số các
chủng vi sinh vật được dùng để phối trộn vào thức ăn thừa để chế tạo phân bón vi
sinh thì có hai chủng được biết đến nhiều là Bacillus subtilis và Lactobacillus
(Ieshita et al. 2011, Syeda Azeem Unnisa, 2015). Tuy nhiên, ở Việt Nam, chưa có
nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn để phân hủy thức ăn thừa, tạo phân bón dạng
lỏng. Xuất phát từ thực tế trên, nhóm sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên
cứu sản xuất vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus tăng cường phân hủy
thức ăn thừa tạo phân bón lá”.

1


Đồ án tốt nghiệp

2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước
Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự (2005), đã tuyển chọn từ 70 chủng vi khuẩn
phân giải protein (phân lập từ ao nuôi tôm) hai chủng có hoạt tính protease mạnh là
P42 và P62. Đã khảo sát điều kiện sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease
của chúng. Kết quả cho thấy, trong môi trường Vinogradski dịch thể cả hai chủng vi
khuẩn đều thích nghi với pH môi trường là 8.0, thời gian nuôi cấy 42 giờ ở nhiệt độ
30 0C. Chủng P42 thích hợp với nguồn carbon là rỉ đường còn chủng P62 là glucose
và cả hai chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển cũng như sinh tổng hợp protease
mạnh nhất với nguồn nitrogen là gelatine. (Phạm Thị Ngọc Lan và Nguyễn Công
Minh, 2005)
Nguyễn Văn Hiếu và ctv (2010), đã tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của
các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp protease kiềm của chủng B. subtilis HT24
phân lập ở Việt Nam. T9.
Nguyễn Hiền Trang và ctv (2010), cũng tuyển chọn và nghiên cứu một số yếu
tố ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn
B.amyloliquefaciens.
Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009. Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus
phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm.
2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease ngoài nước
Protease chiếm khoảng 60% tổng số enzyme thương mại trên thế giới và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp sản
xuất enzyme thường sử dụng vi sinh vật để sản xuất protease bởi chúng có thời gian
sinh trưởng nhanh và chi phí thấp, đem lại lợi ích kinh tế cho việc thương mại hóa
sản phẩm (Lưu Thị Nguyệt Minh, 2007).

2


Đồ án tốt nghiệp

Naidu K.S và ctv (2005) xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease
là 55 0 C ở pH 9 với tỷ lệ giống 4% (w/v) cấy trong môi trường có chứa cám gạo 1%
sau 96 giờ. (Naidu K.S.B., Devi K.L, 2005).
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính
enzyme protease của các chủng Bacillus, đặc biệt là Bacillus subtilis. (Đỗ Thị Bích
Thủy, 2012).
Tác giả Kumar và cộng sự (2010) đã cố định tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis
vào các chất mang khác nhau, sau đó đem nuôi cấy để thu enzyme protease có hoạt
độ cao nhất là 10,8 UI/ml trên chất mang gelatin (Kumar R. and Vats R, 2010).
Yang và ctv (2000) đã nghiên cứu khả năng tách protein trong phế thải vỏ
tôm, cua, tôm hùm của chủng vi khuẩn B. subtilis bằng cách lên men trong môi
trường lỏng với các phế thải chưa xử lí. Tác giả cho thấy rằng hiệu quả tách protein
của chủng này khá cao, nó tách protein khỏi vỏ tôm, cua, tôm hùm lần lượt là 88%,
67% và 83% trong điều kiện nuôi cấy ở 30 oC, thời gian là 96 giờ (Yang J.K., Shih
I.L., Tzeng Y.M., Wang S.L, 2000).
Ghafoor và ctv (2008) cùng nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất
protease ngoại bào từ B. subtilis AG-1 và B. subtilis EAG-1. Kết quả pH môi trường
tối ưu lần lượt là 7 và 7,2, nhiệt độ là 35 oC và 37 oC, thể tích ủ khoảng 1% (v/v).
Thời gian nuôi cấy thích hợp từ 24 - 32 giờ cho cả hai chủng (Ghafoor A., Hasnain
S, 2008).
Das và ctv (2010) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để B. subtilis
sản xuất protease với lượng lớn. Vi khuẩn Bacillus subtilis tăng trưởng tối ưu ở
37ºC trong 48 giờ ở pH 8,0 với nguồn carbon và nitơ thử nghiệm với tối ưu tăng
trưởng trong dextrose và peptone tương ứng sản xuất protease tốt nhất, được ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp.

3

Đồ án tốt nghiệp

Hindhumathi và ctv (2011) đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp
protease ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus GPA4. Trong môi trường nuôi cấy
có bổ sung 0,1% casein, với nguồn carbon là glucose, nguồn nitrogen là bột đậu
nành, pH 8,0, thời gian nuôi cấy 24-36 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ
30 oC chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme với hoạt độ protease mạnh nhất
(Hindhumathi M., Vijayalakshmi S., Thankamani V, 2011).
2.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis và Lactobacillus tạo phân
bón vi sinh.
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.
Phạm Văn Toản đã nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng việc
sản xuất, ứng dụng phân VSV cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông
nghiệp bền vững. (Phạm Văn Toản , 2002).
Lê Thị Thanh Thủy đã chọn được chủng Bacillus velezensis (kí hiệu M),
Bacillus subtilis (kí hiệu Ba51), chủng Bacillus polymyxa (kí hiệu B14) và chủng
Lactobacillus farraginis (kí hiệu L15) được phân lập từ các vùng trồng ớt và các
cây họ cà, các chế phẩm sinh học và sản phẩm lên men truyền thống trong việc tạo
chế phẩm VSV hỗn hợp để nâng cao năng suất , chất lượng và hiệu quả trồng trọt
của ớt cay và ớt ngọt thông qua việc ứng dụng chế phẩm làm tăng hiệu quả sử dụng
dinh dưỡng và hạn chế bệnh héo rũ, thối quả cho cây trồng (Lê Thị Thanh Thủy,
2010).
Nguyễn Văn Thao và ctv,đã sử dụng hỗn hợp các chế phẩn VSV gồm:
CPVSV1 ( Penicillum sp, Aspergillus sp., Psendomonas sp., Saccharomyces sp,
Bacillus sp, Streptomyces sp); CPVSV2 (Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis;
Bacillus

mycodes;

Streptomyces

sp.

F;

Saccharomyces

cerevisiae);

CPVSV3(Bacillus subtilis, Streptomyces sp. F, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces
marxianus, Trichoderma spp) để sản xuất phân hữu cơ sinh học từ bã nấm và phân

4


Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Rengathavasi và ctv (2011) đã phân lập được chủng Lactobacillus delbrueckii
từ bánh dầu có khả năng phân giải dầu thô một cách tự nhiên và dùng bổ sung trong
xử lý phân giải sinh học đồng thời phối trộn vào phân bón cho hiệu quả cao.
Kengo Yamada và Hui-Lian Xu (2008) đã chứng minh được tác động có lợi
trực tiếp của phân bón vi sinh chứa các vi sinh vật như Lactobacillus spp, nấm
actinomycetes và nấm men cũng như tác động gián tiếp của các sản phẩm chuyển
hóa
2.3.3. Tình hình sử dụng phân bón VSV ở Việt Nam
Các nhóm VSV chính sử dụng làm phân bón sinh học bao gồm: VSV cố định
nitơ, VSV phân giải hợp chất photpho khó tan, VSV tổng hợp kích thích sinh
trưởng thực vật, VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng và VSV chuyển
hoá chất hữu cơ.

Theo số liệu của Hiệp hội Phân bón Việt Nam (FAV), nhu cầu phân bón ở
Việt Nam hiện nay vào khoảng trên 10 triệu tấn các loại. Trong đó, Urea khoảng 2
triệu tấn, DAP khoảng 900.000 tấn, SA 850.000 tấn, Kali 950.000 tấn, phân Lân
trên 1,8 triệu tấn, phân NPK khoảng 3,8 triệu tấn, ngoài ra còn có nhu cầu khoảng
400.000 - 500.000 tấn phân bón các loại là vi sinh, phân bón lá.Tuy nhiên, theo
thông tin thực tế thì hiệu suất sử dụng phân bón hiện nay mới chỉ đạt 40-45% với
phân đạm, 25-30% với phân lân và khoảng 55-60% với phân kali. Như vậy, nếu ước
tính hiệu suất sử dụng các loại phân bón trung bình khoảng 45-50%, có nghĩa lượng
phân bón bị thất thoát ra môi trường hoặc bị cố định trong đất, cây trồng không sử
dụng được chiếm 50-55% (tương đương trên 5 triệu tấn) thì mỗi năm ngành nông
nghiệp đã lãng phí khoảng 40-44 nghìn tỷ đồ.(Tập đoàn hoá chất Việt Nam,
).
2.3.4. Một số chế phẩm sinh học được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus và Lactic
Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm VSV hữu hiệu bao
gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế
5


Đồ án tốt nghiệp

phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường.
Chế phẩm sinh học Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều nhờ lợi ích
từ sản phẩm này đối với sức khỏe con người và vật nuôi, tổng hợp vitamin, sinh
chất diệt khuẩn, acid lactic.
2.4. Tình hình chất thải từ lượng thực phẩm thừa
2.4.1. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trong nước
Theo Tổ chức Nông-Lương Liên Hợp Quốc (FAO), mỗi năm có 1,3 tỉ tấn
lương thực bị lãng phí. Khối lượng này tương đương với giá trị sản xuất được của
khu vực Châu Phi cận Sahara. Đồng thời, cứ 7 người trên thế giới có 1 người đói và

hơn 20.000 trẻ em dưới 5 tuổi chết mỗi ngày vì đói.
Với nỗ lực duy trì sự sống cho 7 tỉ người trên toàn thế giới, FAO ước tính
khoảng 1/3 sản lượng thực phẩm toàn cầu hoặc là bị lãng phí hoặc bị mất mát.
Trong đó, chất thải thực phẩm là một nguồn thải khổng lồ đối với tài nguyên thiên
nhiên và gây ra các tác động tiêu cực về môi trường. Và theo đó, tác động ngược lại
đến chính sức khỏe của người dân như đối mặt với nguồn nước ô nhiễm, không khí
ô nhiễm và cả không gian ô nhiễm cũng không là ngoại lệ (Dương Hà - Phạm Ngọc,
2017).
2.4.2. Tình hình chất thải thực phẩm thừa trên thế giới
Các phương pháp xử lí thường tạo ra mùi hôi do các hợp chất nitơ và lưu
huỳnh thoát ra trong quá trình xử lí. Phần lớn chi phí cho việc xử lí chất thải của
thành phố dao động từ 75% đến 80% ngân sách của thành phố và thêm 30% chi phí
cho việc đổ rác (Arvanitoyannis, 2008 ).
Năm 2012 có khoảng 9.278 tấn chất thải rắn đô thị đã được xử lý tại các bãi
rác mỗi ngày, trong đó khoảng 3.337 tấn là chất thải thực phẩm. Gần 809 tấn chất
thải thực phẩm được tạo ra từ nhà hàng, khách sạn, chợ ướt, sản xuất và chế biến
6


Đồ án tốt nghiệp

thực phẩm. Chất thải thực phẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao, nhưng thực tiễn cho
thấy việc xử lý rác thải thực phẩm ở bãi chôn lấp không thân thiện và bền vững, làm
giảm diện tích đất, tạo ra mùi khó chịu (Birdie và ctv, 2014).
Tại Hàn Quốc đã tăng 8% mỗi năm nhưng đạt đến đỉnh điểm vào năm 1991 và
giảm sau đó. Tuy nhiên, chất thải thực phẩm vẫn duy trì tỷ lệ cao (31,6%) và thành
phần chất thải dự kiến khoảng 41% tổng lượng chất thải rắn đô thị (Ministry of
Environment, 1996 và Environmental Newspaper, 1996).
Tại Ấn Độ, gần 700 triệu tấn chất thải hữu cơ được tạo ra hàng năm, dẫn đến
những thách thức đối với việc xử lý chất thải an toàn, với chất thải thường được

đem đi đốt hoặc đổ đầy tại các bãi chôn lấp (Bhiday 1994, Nagavallemma và cộng
sự 2006, Zeinhom và cộng sự 2010)
Tại EU, ước tính khoảng 88 triệu tấn thực phẩm bị lãng phí hàng năm, khoảng
20% lương thực,thực phẩm được sản xuất và 95-115 kilogam thực phẩm / người
mỗi năm. EU đang nỗ lực để giảm tác động đến môi trường của chất thải thông qua
chiến lược kinh tế bằng cách duy trì giá trị của nguyên vật liệu trong nền kinh tế
càng lâu càng tốt và để giảm lượng rác thải đặc biệt là chất thải thực phẩm thừa (
Stoknes và ctv, 2016).
Sự sản xuất thực phẩm ở Mỹ sử dụng khoảng 50% diện tích đất của họ, và sử
dụng 80% tổng lượng nước sạch được tiêu thụ. Tuy nhiên, khoảng 40% tổng sản
lượng lương thực là chất thải tương đương với 165 tỷ USD mỗi năm (Gunders,
2012). Ngược lại, hiện nay hơn một tỷ người bị suy dinh dưỡng mãn tính (Foley và
ctv 2011). Về lý thuyết, tổng lượng chất thải thực phẩm sản xuất ở Bắc Mỹ và Châu
Âu có thể có khả năng giảm tình trạng đói nghèo trên thế giới ba lần (Stuart, 2009).
3. Mục đích nghiên cứu
Nhân sinh khối được chủng Bacillus subtilis và Lactobacillus để tăng cường
quá trình thủy phân thức ăn thừa tạo ra được phân bón dạng lỏng.

7


Đồ án tốt nghiệp

4. Phương pháp nghiên cứu
4.1 - Phương pháp tổng hợp tài liệu
Nghiên cứu thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài.
Tổng hợp lựa chọn các đề tài liên quan đến mục tiêu đề tài
4.2 - Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS).

5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng:
Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BM và BDH được phân lập từ ruột cá bởi
Hồng Sêch Hếnh (2016) và chủng Lactobacillus L2 đã được phân lập bởi và
Nguyễn Thị Phương Vy (2015).
Phạm vi nghiên cứu
+ Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải enzyme ngoại bào tốt nhất để phối
trộn vào thức ăn thừa trong việc tạo chế phẩm phân bón lá.
+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh
trưởng và khả năng sinh enzyme protease và amylase cho 2 chủng vi khuẩn được
tuyển chọn.
6. Kết quả đạt được
Tuyển chọn được 1 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại
bào cao nhất trong 6 chủng khảo sát. Hoạt hóa lại chủng Lactobacillus L2
Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn đã được tuyển
chọn.

8


Đồ án tốt nghiệp

Xác đinh được tỷ lệ phối trộn của 2 chủng vào thức ăn thừa để tạo phân bón
dạng lỏng.
Đánh giá được chất lượng của phân bón được tạo thành thông qua các việc
đánh giá sự có mặt của vi khuẩn Coliform, Salmonella, khả năng kích thích sinh
trưởng của hạt, của cây trồng.
7. Ý nghĩa đề tài
+ Ý nghĩa khoa học: Tuyển chọn được chủng Bacillus subtilis có khả năng
phân hủy protein, tinh bột và cellulose tốt nhất và khả năng sinh acid lactic của

chủng Lactobacillus sp tốt nhất . Đồng thời khảo sát khả năng thủy phân protein khi
phối trộn 2 chủng vi khuẩn này lại với nhau. Bên cạnh đó có thể xác định được hình
thái khuẩn lạc, điều kiện nuôi cấy, yếu tố môi trường và môi trường nhân sinh khối
tối ưu cho các chủng vi khuẩn.
+ Ý nghĩa thực tiễn: Việc phân hủy thức ăn thừa để tạo chế phẩm phân bón sẽ
giảm ô nhiễm môi trường, cung cấp phân bón sạch cho nền nông nghiệp hữu cơ,
giảm tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập phân bón từ nước ngoài.
8. Kết cấu đồ án
Phần mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ , thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà
đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận biện chứng cho kết quả thu được.
Phần kết luận và đề nghị: nội dung tóm tắt lại những kết quả mà đề tai đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

9


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi sinh vật dùng để phối trộn vào thức ăn thừa
1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion
Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm
sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,

Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là
Bacillus subtilis. (Lý Kim Hữu, 2005)
Năm 1941 Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng
thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử
dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời (Lý Kim Hữu,
2005).
1.1.1.2. Đặc điểm phân loại Bacillus subtilis
- Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới (Kingdom):

Bacteria

Ngành (Division):

Firmicutes

Lớp (Class):

Bacilli

Bộ (Order):

Bacillales

Họ (Family):

Bacillaceae

Giống (Genus):

Bacillus

10


Đồ án tốt nghiệp

Loài (Species):

Bacillus subtilis

Hì nh 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
/>1.1.1.3. Đặc điểm phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
(Cohn, 1872). Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú
trong đất, đường tiêu hóa của động vật nhai lại và của con người (theo Nguyễn Đức
Duy Anh, 2005). Bacillus subtilis thường được tìm thấy trong đất và rơm rạ, cỏ khô
nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 10 –
100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện
của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như
bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào
tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương và chao. Bacillus subtilis đóng
vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học
(Vũ Thị Thứ, 1996).
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong
khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu
cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus
popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát

11


Đồ án tốt nghiệp

triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB)( theo Hiroshi Fujikawa và Mitsugu Matsushita ,1991).
1.1.1.4. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase
dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt.
Bacillus subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di
chuyển nhanh chóng trong chất lỏng. Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,50,8µm × 1,8-3 µm . Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử
để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ
nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới. Bào tử B.subtilis
có hình bầu dục, kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm. Phân bố không theo quy tắc chặt
chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm theo (Hong và ctv, 2009).
1.1.1.5. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau: lên men nhưng không
sinh hơi các loại đường glucose, maltose, mannitol, sucrose, xylos; Indol (-); VP
(+); nitrate (+); H2S (-); NH3 (+); catalase (+); amylase (+); casein (+); citrate (+);
có khả năng di động và hiếu khí. (Lý Kim Hữu, 2005)
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Catalase

+

Indol

-

MR

+

VP

+

Citrate

+

Nitrate

+

Gelatin

+

Di động

+

Amylase

+

12


Đồ án tốt nghiệp

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992)
1.1.1.6. Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử
a) Đặc điểm tế bào
Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng
sinh ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt
như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn. Thành phần hóa
học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng
vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào (McKenney và ctv , 2013).
b) Cấu tạo bào tử
Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang
của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử (Ngô Tự
Thành và ctv, 2009).
Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong
một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi
trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định. Hai chủng vi
khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium (Ngô Tự
Thành và ctv 2009).
Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005),
bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó
là lớp vỏ của tế bào mẹ,ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp
13


Đồ án tốt nghiệp

protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào
tử (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).
Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu
nối nội peptide và ít liên kết chéo. Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách
bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng
bất hoạt (McKenney và ctv, 2013).
c) Đặc điểm của bào tử
Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà
chúng là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại
qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi. Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong
những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất
lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm
hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống (Ngô Tự Thành và ctv,
2009).
Nhiệt độ 100 0C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 20 giờ. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khô hạn
cũng như tác động của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng. Quá trình
hình thành bào tử: các tế bào sinh bào tử trong những điều kiện thiếu thức ăn hoặc
có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình
thành bào tử.Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40% và chứa nhiều ion Ca2+
(Ngô Tự Thành và ctv, 2009)
d) Sự nảy mầm của bào tử
Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được
gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy
mầm và sinh trưởng. Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi (2007) thì một trong
những đặc điểm quan trọng nhất của Bacillus subtilis là khả năng sinh bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay
khi gặp điều kiện bất lợi (Ngô Tự Thành và ctv, 2009).

14