Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------BÙI THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG
NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội-2006

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------BÙI THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH
CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Từ Minh Koóng
2. GS.TS. Phạm Văn Ty

Hà Nội-2006

2


Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà nội, Tr-ờng ĐH Khoa
học Tự nhiên đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện về các thủ tục, kinh phí để tôi
hoàn thành nhiệm vụ của một nghiên cứu sinh.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Từ Minh Koóng,
GS.TS. Phạm Văn Ty những ng-ời thầy đã tận tình h-ớng dẫn và giúp đỡ tôi
để hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin cám ơn PGS.TS Kiều Hữu ảnh, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật
học, ng-ời đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi
làm việc và làm luận án tại Bộ môn Vi sinh vật học, Tr-ờng ĐH Khoa học Tự
nhiên, ĐH Quốc gia Hà nội.
Hoàn thành bản luận án này, tôi cũng đã nhận đ-ợc nhiều sự giúp đỡ
khác: các thầy các cô Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học, Tr-ờng ĐH Khoa hoc
Tự nhiên đã giúp đỡ về thời gian, hoá chất, thiết bị máy móc cho các thí
nghiệm của luận án, cảm ơn TS. Đỗ Quyên, Tr-ờng ĐH D-ợc Hà nội đã rất
nhiệt tình giúp tôi trong việc xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh
bằng ph-ơng pháp phân tích khối phổ và cộng h-ởng từ hạt nhân. Nhân dịp
này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quí báu đó.
Luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu tôi không nhận đ-ợc sự giúp
đỡ và ủng hộ lớn lao từ gia đình, ng-ời thân và những ng-ời đã luôn ở bên
cạnh tôi trong cả những lúc thuận lợi và khó khăn nhất để lắng nghe, động
viên và chia sẻ.
Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006
Bùi Thị Việt Hà

3

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất cứ công trình nào khác.
Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006
Tác giả

Bùi Thị Việt Hà

4


MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................. 14
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................................ 14
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .................................................... 15
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 16
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH .................................................................................. 16
1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ............................................................................................ 16
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh .................................................................... 16
1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH ................................................................. 18
1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào .......................................................................................... 19
Liên kết với protein thụ thể......................................................................................................... 20
1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein .............................................................................................. 20
1.2.3. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào ....................................................... 21
1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất ................................................................................. 22
1.2.5. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic ....................................................................................... 23
1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN. ................................. 24
1.3.1. Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ..................................................... 24
1.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên ................................. 24

1.3.3. Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn ............................................................................... 26
1.3.4. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm........................................................................................ 27
1.3.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN ..................................................................................... 32
1.3.6. Phân loại chi Streptomyces .............................................................................................. 36
1.4. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN ................................................... 37
1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ............................................... 37
1.4.2. Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing) ................. 40
1.4.3. Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS ............................................................. 40
1.5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH ............................................................ 41
1.5.1. Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty ......................................................................................... 42
1.5.2. Tách chiết CKS từ dịch lọc ............................................................................................... 42
1.5.3. Tinh chế CKS .................................................................................................................... 43
1.5.4. Đơn vị chất kháng sinh ..................................................................................................... 43
1.5.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân. ....... 43
1.6. CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ
DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP. ............................................................................................................. 44
1.6.1. Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật. ...................................... 45
1.6.2. Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp ................................................................... 47
1.6.3.

Thiệt hại về kinh tế do vi nấm gây ra đối với nông nghiệp .......................................... 51

5


1.6.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các
bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................ 52
1.6.5. Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật. .............................. 54
1.6.6. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật ........................................................................... 59
1.6.7. Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm

gây bệnh thực vật................................................................................................................................... 59
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 62
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT ............................................................................................ 62
2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................................................... 62
2.1.2. Hoá chất ........................................................................................................................... 62
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................................... 63
2.1.4. Các công thức môi trường ................................................................................................ 63
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 66
2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên ..................................... 66
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ..................................................................................... 67
2.2.3. Bảo quản giống ................................................................................................................ 68
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 68
2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử .................................................................................. 71
2.2.6. Lên men tạo kháng sinh .................................................................................................... 76
2.2.7. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh ........................................................................... 78
2.2.8. Xác định một số tính chất của chất kháng sinh ............................................................... 79
2.2.9. Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn ................................................................................. 81
2.2.10. Tìm hiểu khả năng ứng dụng .......................................................................................... 82
2.2.11. Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10] ................................................................. 83
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 86
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN ........................................................................ 86
3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn .......................................... 86
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao .......................... 88
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN. .............................................................................................................................................. 89
3.2.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................................... 89
3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................................ 90
MÀU KTCC ..................................................................................................................................... 91
3.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá ............................................................................................. 92
3.2.4. Hoạt tính kháng sinh ........................................................................................................ 94

3.2.5. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............................................. 96
3.2.6. Phân loại ........................................................................................................................ 100

6


3.3. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN .................. 105
3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp ........................................................................ 105
3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41,
D-42 và TC-54 ..................................................................................................................................... 107
3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ. ..................................................................... 107
3.3.3. Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu .......................... 111
3.3.4. Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson ................. 113
3.3.5. Lên men xốp chủng T-41 ................................................................................................ 116
3.4. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54 ........................................................................... 117
3.4.1. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ .......................................................................... 117
3.4.2.

Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ..................................................... 119

3.4.3. Xác định Rf của chất kháng sinh ................................................................................... 120
CHẤT KHÁNG SINH ...................................................................................................................... 121
HỆ DUNG MÔI ................................................................................................................................ 121
RF....................................................................................................................................................... 121
3.4.4. Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ ..................................................................... 121
3.4.5. Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion ............................................................. 122
3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54 ................................................................................................... 124
3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn ................................ 125
3.4.8. Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) ..................................................................................... 125
3.5. TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D-42 VÀ TC-54 ........... 126

3.5.1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy
mầm của hạt ........................................................................................................................................ 126
3.5.2. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây ...................... 127
3.6. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ....................................................................................................... 129
3.6.1. Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42 ................................................................... 129
3.6.2. Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42.................................................. 131
3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng .......................................................... 132
KẾT LUẬN ....................................................................................................................................... 141
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .............................................................. 142
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..... 143

7


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

BVTV

Bảo vệ thực vật

CFU (colony forming unit)

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CKS

Chất kháng sinh

CMC (carboxymethyl cellulose)

carboxymethyl xenluloza

CZ (Czapek–Dox–Agar)

Môi trường Czapeck Dox

DAP (diamino acid pymelic)

Axit diamino pimelic

(DHF), dihidrofolic

axit đihidrofolic

dNTP (deoxyribonucleotide

Các loại nucleotit gồm:dATP, dCTP,

triphosphate)Deoxyribo

dGTP and dTTP dùng trong phản
ứng PCR

(PABA) para-aminobenzoic acid

Axit para-aminobenzoic

EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid)

Axit etylen diamin tetra axetic

FDA (Food and Drug Administration)

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

G (-) (+)

Vi khuẩn Gram âm, dương

HPLC ( High performance liquid chromatography)

Sắc ký lỏng cao áp

IR (Infrared) spectroscopy

Phổ hồng ngoại

ISP ( International Streptomyces Project)

Chương trình xạ khuẩn quốc tế

IU/ml

Đơn vị quốc tế/ml

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

LD50 (lethal dose)

Liều gây chết 50 %

MIC (Minimum inhibition concentration)

Nồng độ ức chế tối thiểu

MS ( mass spectrophotometry)

Khối phổ

MW (Molecular Weight)

Trọng lượng phân tử

NAG (N-acetylglucozamine)

N-acetylglucozamin

NAM (N-acetylmuramic)

N-acetylmuramic

8


NMR ( nuclear magnetic resonance)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PCR (Polymerase chain reaction)

Phản ứng chuỗi polime

PDA (Potato Dextrose Agar)

Môi trường thạch khoai tây

PG (peptidoglycan)

Thành tế bào vi khuẩn

RA (Retinaculiaperti)

Cuống sinh bào tử hình móc câu

RF (Rectiflexibiles)

Cuống sinh bào tử hơi lượn sóng

S (Spirales)

Cuống sinh bào tử dạng xoắn

SDS ( sodium docecyl sulfate)

Natri docecyl sulphat

TLC (thin layer chromatography)

Sắc ký bản mỏng

TLm ( Median Tolerance limit)

Giới hạn chịu đựng trung bình

THF (tetrahydrofolic)

axit tetrahydrofolic

U (Unit)

Đơn vị

UDP-GlcNAc

(Uridine

Diphosphate

-N- Uridin Diphotphat-N-

acetylglucosamine)

acetylglucosamin

VSV

Vi sinh vật

9


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes

15

Bảng 3.1. Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng

73

Bảng3.2. Đặc điểm nuôi cây của 3 chủng

78

Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54

79

Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54

80

Bảng 3.5. Hoạt phổ kháng khuẩn của 3 chủng xạ khuẩn

81

Bảng 3.6. So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với loài chuẩn S. 87
antimycoticus và chủng D-42 với loài chuẩn S.viridogenes
Bảng 3.7. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TC-54 với chủng 88
chuẩn S. hygroscopicus ISP – 5578
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng F. oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 93
trên các môi trường lên men khác nhau
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp
CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54

95

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng
96

sinh của 3 chủng xạ khuẩn
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54

97

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của
các chủng T-41, D-42 và TC-54

98

Bảng 3.13. Tối ưu hoá môi trường theo phương pháp Box- Willson

101

Bảng 3.14. Môi trường tối ưu “lên dốc” của chủng TC-54

102

Bảng 3.15. Các thông số lên men của chủng TC-54 trong nồi lên men 80 lít

103

10


Bảng 1.16. Hoạt tính kháng sinh được chiết bằng các loại dung môi khác 105
nhau
Bảng 3.17. Hệ số Rf của CKS T-41, D-42, TC-54 trên các hệ dung môi khác 108
nhau
Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua

120

Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm trên bắp cải

121

Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh trước khi phun thuốc

122

Bảng 3.21. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 5 ngày sau phun thuốc

123

Bảng 3.22. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 10, 15 và 20 ngày sau phun thuốc

124

Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày

125

11


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau

5

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của tetracylin và aminoglycosit

8

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của macrolit và chloramphenicol

8

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của amphotericin B

9

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của sunfonamit trong quá trình sinh tổng hợp

10

axit folic
Hình1.6. Đồ thị về tỷ lệ các vi sinh vật sinh chất kháng sinh

12

Hình 1. 7. Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học

13

Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu

74

Hình 3.2. Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh

75

Hình 3.3. Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn
75

Hình 3. 4. Bề mặt bào tử chủng T-41

76

Hình 3.5. Bề mặt bào tử chủng D-42
Hình 3.6. Bề mặt bào tử chủng TC-54

76

Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng TC-54

77

Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

77

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR

82

Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 84
16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-54 và các
90
đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces
99
Hình 3.11. Động thái lên men CKS của 3 chủng T-41, D-42, TC-54
104
Hình 3.12. Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường lên men
xốp

12


Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu chiết ở các pH khác 105
nhau
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh của 3 chủng xạ 106
khuẩn
Hình 3.15. Tách chiết CKS bằng than hoạt tính và giải hấp phụ bằng axeton

109

Hình 3.16. Sơ đồ phân lập chất kháng sinh TC-54-1

110

Hình 3. 17. Công thức cấu tạo của validamyxin
Hình 3.18. Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ

111
112

chất kháng sinh
Hình 3.19. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng T-41 lên khả năng nảy mầm
của hạt

113

Hình 3.20. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng TC-54 lên khả năng nảy 114
mầm của hạt
Hình 3.21. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 115

sinh trưởng của cây mạ
Hình 3.22. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 117
sinh trưởng của cây mạ
Hình 3.23. Quy trình sản xuất chế phẩm từ T-41 và D-42

118

Hình 3.24. Quy trình thử nghiệm chế phẩm T-41 và D-42

119

Hình 3.25. Diễn biến tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 20 ngày thử nghiệm

126

13


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô
vằn, thối cổ rễ, mốc sương…đẫ gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm
83% trong số các bệnh ở cây trồng [173,174, 175]. Theo thống kê của Tổ chức Nông
Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên
tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [49,152, 187,189]. Việc sử dụng hoá
chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở
Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam
sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở
Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm [61]. Song việc sử
dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản

sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm
mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á Thái Bình
Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương
trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với 3 chiến lược cơ bản chính [49, 138]:
1. Sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh.
Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt
khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng.
2. Làm tăng các loại vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh
cho cây ở trong đất.
3. Thúc đẩy khả năng sinh trưởng của cây trồng, làm tăng sức chống chịu của
cây.
Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản
phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Khí hậu nhiệt
đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn thất
nặng nề đến năng suất cây trồng. Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD
thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%. [61].

14


Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã ứng dụng một số chế phẩm kháng
sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin,
blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại.
Xuất phát từ những yêu cầu đó, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay,
cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước ta.
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ” Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng
sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam”. Đề tài tập trung nghiên cứu các
chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiÕt xuÊt, tinh
chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất; đưa ra quy
trỡnh sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp. Việc tiến hành đề tài này là cần thiết

và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh
thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp
sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Việt Nam
Các vi nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam.
 Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh
chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào
sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ
xạ khuẩn của Việt Nam.
2. Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh
nhất theo phương pháp sinh học phân tử.
3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh.
4. Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh.
5. Thăm dò khả năng ứng dụng.

15


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic)
Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở
nồng độ thấp (g/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi
khuẩn, nấm nem, nấm mốc…) một cách chọn lọc [124]. Thuật ngữ antibiotic bắt
nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự sống. Thuật ngữ này
được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penixillin với sulfonamit
đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật ngữ này đã được thay đổi sau khi

penixillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong
phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi hơn để chỉ các
hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp hoàn toàn có hiệu quả
diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như là một chất hoá
trị liệu có khả năng kháng virut, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư…Tất cả các
CKS đều có tính độc chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một
nhóm vi sinh vật nhất định. Một số CKS sử dụng ngoài mục địch y học có tầm quan
trọng trong sinh thái như agroxin, bacterioxin, yếu tố gây chết (killer factor),
microxin…
1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh
Alexander Fleming, người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu
CKS – nhà sinh vật học người Anh làm việc tại viện St. Mary, London, đã phát hiện
ra penixillin vào tháng 10 năm 1928. Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan
sát thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus bị
nhiễm một loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc thì vi khuẩn không thể
phát triển được. Điều đó chứng tỏ rằng loại nấm này đã sinh ra một chất ức chế sự
phát triển và tiêu diệt S.aureus. Fleming đã phân lập và định tên loại vi nấm này là
Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn Êy là penixillin.

16


Một thập kỷ sau, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh vật häc vµ sinh ho¸
häc Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành
một “loại thuốc thần kỳ”. Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W. Florey đã được
nhận giải thưởng Nobel vì đã sự khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một
kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.
Năm 1939, Rene’ Jules Dubos nuôi cấy Bacillus brevis phân lập từ vùng New
Jersey và tách được một hỗn hợp gồm hai chất khác nhau là gramixidin và tiroxidin.
Sau đó ít lâu Abraham, Waksman, Schatz và Bugie [82, 135, 172] đã phát hiện ra

streptomixin, chất này có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn G(-), đặc biệt là trực
khuẩn lao. Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh. Những năm
1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS. Hàng loạt chất
kháng sinh được phát hiện trong gia đoạn này có ứng dụng trong y học như:
actinomixin (Waksman,1940), chloramphenicol (Erhlich,1947), chlotetraxyclin
(Dugar, 1948), [172]. Trong suốt những năm 1960 và 1970, ngành công nghiệp về
kháng sinh đã bùng nổ khắp thế giới. Vào đầu năm 1970, hơn 270 CKS đã được sản
xuất. Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và
phát triển, tìm ra các chất kháng sinh mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của các
vi sinh vật gây bệnh. [126]. Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các
tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về
tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn
đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129]. Như vậy, sau
hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên
tới trên 17.000 chất [46]. Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng
rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm
2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm
2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh
trong nền kinh tế quốc dân. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng
thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt
với “thời kỳ hậu kháng sinh” (post antibiotic era). [89,90]. Chính vì thế nhiệm vụ

17


đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ
để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển
(R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn
toàn.[113].
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng

chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút
được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế
giới. Có thể nói ngành công nghiệp sản xuất CKS vẫn đang là một trong những
hướng phát triển mạnh mẽ nhất trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển
mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và
đặc biệt là sự ra đời của công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực
nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Dưới đây là các mốc thời gian
phát hiện ra các CKS trong những năm vừa qua. [45,101,108,153]

Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau
1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị
trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh
vật. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu
trúc hiển vi của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ
chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có
hoạt phổ tương tự như nhau. Đồng thời nó còn phụ thuộc vào nồng độ. Một số chất

18


kháng sinh khi ở nồng độ thấp không những không tác dụng ức chế sinh trưởng của
vi sinh vật mà còn kích thích vi sinh vật phát triển. Ngoài ra, cùng một chất kháng
sinh như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động cũng có thể
không hoàn toàn giống nhau. Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện
theo năm phương thức sau .
1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào
Thành tế bào của vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất
thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglycan (PG). PG
là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm đơn phân là các dẫn

xuất của đường glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAGNAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi polisaccarit của PG
phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptit ngắn giữa các tetrapeptit của
tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn
vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [135]. Phần
lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá
trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM. Nổi bật nhất
giữa các chất này là các kháng sinh -lactam mà đại diện là penixillin và
cephalosporin. Đây là các chất kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng lactam. Các kháng sinh -lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với
transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi
PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào
của vi khuẩn [135]. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất kháng sinh này chỉ hoạt
động ở giai đoạn tế bào đang sinh trưởng vì các tế bào già hay ở trạng thái nghỉ
không sinh tổng hợp PG. Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi
khuẩn Gram (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp, tuy nhiên các
penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài
vi khuẩn Gram (-). Tế bào của người không có PG nên các kháng sinh -lactam rất
ít độc đối với tế bào người [135, 172].

19


Các chất kháng sinh khác như vancomyxin do Streptomyces orientalis sinh
ra và CKS bán tổng hợp xycloserin ức chế sự hình thành thành tế bào theo một cách
khác. Chúng cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết các
tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gram (+). Tuy nhiên, các vi khuẩn không có cầu
D-alanin-D-alanin có khả năng đề kháng tự nhiên đối với những chất kháng sinh
này. Một chất kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào khác là bacitracin ngăn cản
sự vận chuyển các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí tổng hợp của thành tế
bào. Cũng như các CKS -lactam, vancomyxin, xycloserin và bacitraxin làm gián
đoạn sự tổng hợp thành tế bào và làm tế bào bị phá vỡ do áp suất thẩm thấu [135].

Liên kết với protein thụ thể
Người ta cho rằng, một số protein liên kết với penixillin–(Peniciline Binding
Protein (PBP) nằm trên màng tế bào vi khuẩn) là các đích cho các penixillin và các
cephalosporin liên kết. Tất cả các vi khuẩn đều có loại protein này, ví dụ
Staphylococcus aureus có 4 PBP còn E.coli thì có ít nhất là 7 PBP. Các PBP này
hoạt động như các enzym và biểu hiện hoạt tính của cacbocylpeptidaza,
transpeptidaza, enđopeptidaza và transglycozylaza. Song vai trò chính xác của các
PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzym nào, trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào,
vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế phân tử của hoạt động gây chết của các chất
kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chưa được giải thích.
1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein
Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của riboxom gồm
các aminoglycozit và các tetraxyclin. Aminoglycozit bao gồm streptomyxin,
gentamyxin, neomyxin, kanamyxin, amykaxin, tobramyxin…Chúng gắn vào tiểu
phần 30S của riboxom, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không
chính xác giữa các codon của ARNt và các anticodon của ARNvc tương ứng. Kết
quả làm mã di truyền trên phân tử ARNt bị đọc sai. Ví dụ dưới tác động của
streptomyxin, codon UUU mã hoá cho phenylalanin bị đọc sai thành codon AUU
mã cho isolexin. Tetracyclin phong bế vị trí gắn của phân tử ARNvc với ARNtt ở

20


tiểu phần 30S, ngăn cản sự gắn bổ sung các axit amin vào chuỗi polypeptit đang
được kéo dài. [135]

Hình 1.2. Cơ chế tác động của tetracylin và aminoglycosit
Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của
riboxom. Chloramphenicol và một số chất tương tự phong bế vị trí hoạt động của
enzym xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptit giữa các axit amin trong chuỗi

polypeptit đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành phân tử protein hoàn chỉnh.
Clindamyxin và các tác nhân kháng khuẩn thuộc nhóm macrolit bao gồm
erythromyxin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của riboxom từ codon
này đến codon kế tiếp. Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp phân
tử protein bị dừng lại.

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của Macrolit và Chloramphenicol

1.2.3. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào
Một số CKS phá vỡ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách tương
tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó. Đây là cơ chế
hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen. Amphoterixin B là một polyen có khả
năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol-thành phần cấu tạo nên màng sinh chất
của nấm và tạo ra các lỗ rò trên màng, làm nội chất của tế bào thất thoát ra môi
trường bên ngoài. Màng sinh chất của tế bào người và động vật có thể bị tổn thương

21


bởi amphoterixin B vì chúng chứa cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự
như ergosterol, mặc dù cách gắn của amphoterixin B với cholesterol hơi khác so với
ergosterol.

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của Amphotericin B
Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng
đề kháng với amphoterixin B. Tuy nhiên, chúng vẫn có thể bị phá vỡ bởi các polyen
khác. Ví dụ: polymyxin một polyen do Bacillus polymyxa sinh ra có khả năng
kháng đặc hiệu đối với vi khuẩn Gram (-). Polymyxin phá vỡ màng sinh chất của vi
khuẩn bằng cách gắn vào photpholipit của màng, làm biến dạng bề mặt tế bào và
thay đổi cấu trúc của màng dẫn đến sự rò rỉ một số chất của tế bào ra môi trường

bên ngoài, gây chết tế bào [135,137].
1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất
Phần lớn các CKS kháng vi sinh vật theo cơ chế này đều có cấu trúc gần giống
với các chất trao đổi bình thường của tế bào như axit amin, coenzym, nên được coi
là các chất kháng chất trao đổi (antimetabolite), tác dụng theo kiểu ức chế cạnh
tranh. Ở nhiều vi sinh vật axit para-aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng
enzym dẫn đến sự tổng hợp axit tetrahydrofolic (THF), một dạng của axit folic đóng
vai trò như một coenzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và
pyrimidin của axit nucleic. Để tổng hợp THF, PABA phải được chuyển thành axit
đihidrofolic (DHF), rồi từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các enzym

22


xúc tác. Sunfonamit là chất hoạt động như một chất kháng chất trao đổi vì nó có cấu
trúc hoá học gần giống với PABA. Khi có mặt sunfonamit, nó sẽ cạnh tranh với
PABA vị trí hoạt động của enzym xúc tác chuyển PABA thành DHF. Kết quả là sự
thiếu hụt DHF đã làm cản trở quá trình tổng hợp THF, ức chế sự sinh trưởng của
các vi sinh vật.

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của sunfonamit
trong quá trình sinh tổng hợp axit folic
Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimethoprim cũng can thiệp vào quá
trình tổng hợp axit nucleic. Tuy nhiên thay vì gắn vào enzym chuyển hoá PABA
thành DHF, trimethoprim lại gắn vào enzym chuyển DHF thành THF. Các chất
kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vì chúng ức chế các tế bào vi khuẩn và
động vật nguyên sinh mà không tác dụng lên tế bào người và động vật. Nguyên do
vì người không tổng hợp THF từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu
nhận các axit folic đơn giản từ chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển
chúng thành THF [135,137].

1.2.5. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic
Axit nucleic gồm ADN và ARN là các đại phân tử sinh học không thể thiếu
được đối với sự sống của tế bào. Một số CKS cản trở quá trình sao chép ADN và
phiên mã ở vi sinh vật. Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp axit nucleic

23


bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế sao chép hoặc làm dừng phiên
mã. Vì sự khác biệt giữa ADN của tế bào prokaryot và eukaryot là rất nhỏ nên
những CKS ức chế sinh tổng hợp axit nucleic không những tiêu diệt vi sinh vật mà
còn độc với cả con người. Ví dụ actinomyxin gắn với ADN ức chế sự tổng hợp
ADN và phiên mã không chỉ ở các tế bào vi khuẩn gây bệnh mà còn đối với cả con
người. Các kháng sinh tổng hợp như các quinolon và fluoroquinolon có khả năng ức
chế đặc hiệu ADN của tế bào prokaryot mà ít ảnh hưởng đến các tế bào eukaryot.
Những kháng sinh này ức chế sự hoạt động của enzym tháo xoắn sợi ADN mạch
kép trong quá trình sao chép ADN của tế bào là ADN gyraza. Các kháng sinh khác
ức chế hoạt động của ARN polymeraza trong quá trình sinh tổng hợp ARN từ ADN
mạch khuôn. Một số kháng sinh bao gồm rifampin kết hợp mạnh mẽ với ARN
polymeraza của prokaryot nhưng ít ảnh hưởng đến ARN polymeraza của eukaryot
nên rifampin độc với vi khuẩn gây bệnh hơn so với con người [135, 137,153].
1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.
1.3.1. Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rói và đóng vai trò quan
trọng trong tự nhiên [139]. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá
hợp chất trong đất, trong nước. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu,
thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong 1 gam
đất có khoảng 29.000-2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số vi sinh vật
[181]. Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70%

xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh.

1.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên
Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7,8, 62,99,
134,178]
Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá… từ các loại môi trường khác nhau.
Phân lập và thuần khiết các chủng từ các mẫu đó.

24


Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định của các chủng
đã thuần khiết.
Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng
nấm, kháng u, dùng trong y học, trong nông nghiệp và trong thú y để nghiên
cứu tiếp. Lên men khối lượng lớn hơn để tách chiết CKS và xác định hoạt
tính kháng khuẩn của CKS.
Xác định phổ kháng khuẩn của CKS.
Nếu CKS là loại cần tìm thì lên men với khối lượng lớn hơn, nghiên cứu thu
nhận và tinh chế chúng.
Xác định tính chất lý, hóa và cấu trúc hóa học của chất kháng sinh (công bố
và đưa ra bản quyền)

Tỷ lệ các nhóm VSV sinh kháng sinh (%)

Đánh giá CKS qua các thí nghiệm in vitro và in vivo (Hiệu lực và độ độc)
90
80
70
60

Xạ khuẩn (Actinomycetes)

50
40

Vi nấm ( Fungi)

30
20

Vi khuẩn khác ( other bacteria)

10
0
82-84

85-87

88-90

91-93

94-96

97-99 năm

Hình 1.6. Đồ thị về tỷ lệ các chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh
( Japanese patent 1982-1999)
Phần lớn CKS lµ do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, song khả năng

sinh CKS của các chi thuộc “ xạ khuẩn hiếm” ngày càng được đặc biệt chú ý. Dưới
đây là đồ thị biểu diễn tỷ lệ các vi sinh vật sinh các chất kháng sinh theo khảo sát
năm 1982-1999 ở Nhật Bản và mục đích tuyển chọn các chất kháng sinh được ứng
dụng trong thực tiễn [107].

25