Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao, thích nghi dải pH rộng, có hoạt tính cellulase cao và bước đầu ứng dụng xử lý nước thải nhà máy giấy

Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng

PHÂN L P, TUY N CH N CH NG VI KHU N CH U NHI T
CAO,
THÍCH NGHI D I pH R NG, CÓ HO T TÍNH CELLULASE CAO VÀ
B
C
U NG D NG X LÝ N
C TH I NHÀ MÁY GI Y
V Th Dinh1, Phan Th Thu Nga2, Hoàng Trung Doãn3, Tr n Liên Hà4
1
2,3,4

i h c Khoa h c T nhiên Hà N i
i h c Bách Khoa Hà N i

TÓM T T
N m 2016, theo th ng kê c a Hi p h i gi y và b t gi y Vi t Nam, s n l ng gi y n c ta đ t kho ng
2.420.000 tri u t n. S n xu t 1 t n gi y c n dùng t 200 - 500 m3 n c, tuy nhiên, nhi u công ty gi y đang x
n c th i không x lý ra môi tr ng, gây ô nhi m tr m tr ng. Hi n nay, ph ng pháp x lý sinh h c là l a
ch n hàng đ u vì tính an toàn và không gây h i môi tr ng. Chính vì th , nghiên c u c a chúng tôi t p trung
phân l p, tuy n ch n ch ng vi khu n ch u nhi t đ cao, thích nghi d i pH r ng và có ho t tính cellulase cao v i
m c đích ng d ng x lý n c th i nhà máy gi y. T 5 m u n c th i nhà máy gi y, đã phân l p đ c 11
ch ng có ho t tính cellulase, trong đó, ch ng TD phân gi i cellulose t t nh t v i ho t l c cellulase lên t i 8,52
(U/ml). nh danh b ng ph ng pháp sinh hóa và sinh h c phân t , ch ng TD t ng đ ng 99% v i ch ng
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC3A288. Ch ng TD đ c g i tên là Bacillus subtilis TD, có kh
n ng phát tri n 30oC đ n 45oC, t t nh t 35oC và thích nghi v i d i pH r ng t 5 đ n 9, t t nh t pH = 6.
T khóa: Bacillus subtilis, n c th i nhà máy gi y, phân l p vi khu n, vi khu n phân gi i cellulose
ch u nhi t.

TV N

Theo s li u c a B Tài nguyên và Môi
tr ng, 43,3% khu công nghi p Vi t Nam có
công trình x lý n c th i t p trung, tuy nhiên
trong s này, nhi u công trình ho t đ ng th c
t r t kém (B Tài nguyên & Môi tr ng,
2010). N c th i c a ngành s n xu t gi y là
m t trong nh ng ngu n gây ô nhi m môi
tr ng nghiêm tr ng. N c th i nhà máy gi y
ch a ch t r n l l ng, b t gi y, lignin, hóa ch t
t y tr ng, ch t ph gia và các ch t h u c hòa
tan là nh ng h p ch t có đ c tính sinh thái cao,
có nguy c gây ung th , r t khó phân h y
trong môi tr ng (Tr nh Lê Hùng, 2009). Các
ch s v ch t l ng n c th i c a công nghi p
s n xu t gi y cao h n gi i h n cho phép r t
nhi u, c th : Trong giai đo n s n xu t b t
gi y, hàm l ng TSS: 2000 mg/l, COD: 2500
mg/l, BOD5:1900 mg/l, pH: 6,4 - 7,5; trong
giai đo n xeo gi y hàm l ng TSS: 3500 mg/l,
COD: 2500 mg/l, BOD5: 2000 mg/l, pH: 7,5 –
9 (Tr n Vi t Ba, 2012).
Hi n nay, có nhi u ph ng pháp x lý n c
th i nh : ph ng pháp v t lý, ph ng pháp c
h c, ph ng pháp hóa h c, tuy nhiên, các
ph ng pháp này có chi phí cao và ch a x lý
I.

tri t đ ngu n ô nhi m. X lý sinh h c là
ph ng pháp có nhi u u đi m do thân thi n
v i môi tr ng và kh c ph c đ c các h n ch

c a ph ng pháp khác (Desalegn Amenu,
2014). N c th i nhà máy gi y có t l
BOD5/COD ≥ 0,5, thích h p đ x lý sinh h c.
C s c a ph ng pháp x lý sinh h c d a trên
ho t đ ng s ng c a vi sinh v t đ phân h y các
ch t h u c gây nhi m b n trong n c th i.
Các vi sinh v t s d ng các ch t h u c và m t
s khoáng ch t làm ngu n dinh d ng và n ng
l ng. Trong quá trình dinh d ng, vi sinh v t
nh n các ch t dinh d ng đ xây d ng t bào
và phát tri n nên sinh kh i c a chúng đ c
t ng lên, sinh kh i này d dàng lo i ra kh i
môi tr ng n c th i, khi tách phân ly bùn
ho t tính (Ngô Th Nga, Tr n V n Nhân, 2002).
c tính c a n c th i nhà máy gi y là môi
tr ng nghèo dinh d ng, nhi t đ bi n đ ng
t 36oC lên t i 70oC, d i pH r ng kho ng t 5 10 (Tr n Vi t Ba, 2012). Do đó, trong bài báo
này đ c p đ n vi c phân l p và tuy n ch n
ch ng vi khu n ch u đ c nhi t đ cao, sinh
tr ng trong d i pH r ng và có kh n ng phân
gi i cellulose cao.

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018

3


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng

II. PH
NG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. V t li u
2.1.1. M u n c th i
5 m u n c th i l y t nhà máy gi y An
Hòa thu c thôn An Hòa, xã V nh L i, huy n
S n D ng, t nh Tuyên Quang và các c s
s n xu t gi y t i c m công nghi p gi y Phú
Lâm thu c thôn Tam T o, xã Phú Lâm, huy n
Tiên Du, t nh B c Ninh.
M u b o qu n 2 - 4oC trong quá trình
phân tích.
2.1.2. Hóa ch t và môi tr ng
Môi tr ng dinh d ng NB (10g/l cao th t;
10g/l pepton; 5 g/l NaCl); Môi tr ng th ch
phân l p vi khu n phân gi i cellulose - Hans
theo TCVN 6168:2002 (0,5 g/l K2HPO4; 0,5
g/l KH2PO4; 1,0 g/l (NH4)2SO4; 0,1 g/l
MgSO4.7H2O; 0,1 g/l CaCl2 ; 6,0 g/l NaCl; 0,1
g/l Cao n m men; 10 g/l Cellulose; 15 g/l agar;
Môi tr ng th ho t tính cellulase (10 g/l
Cellulose; 15 g/l agar).
Các lo i môi tr ng đ c thanh trùng
121oC trong 15 phút.
2.2. Ph ng pháp nghiên c u
2.2.1. Phân l p vi khu n
T các m u n c th i, l y 50 ml cho vào
bình tam giác 250 ml ch a 50 ml môi tr ng
NB, chu n v pH = 5, nuôi l c 150 vòng/phút
35oC trong 48h.

X lý m u trên 70oC trong 20 phút, sau đó
đ m u v nhi t đ phòng và ti n hành pha
loãng m u th p phân trong dung d ch NaCl
0,85% đ n n ng đ 10-4. L y 0,1 ml m u các
đ pha loãng c y lên môi tr ng ch n l c
Hans, m i đ pha loãng l p l i 3 l n, sau đó
nuôi các m u 35oC/48h. Sau th i gian nuôi,
ch n, nh n d ng các ch ng riêng bi t c y ria
trên môi tr ng Hans đ n khi thu đ c ch ng
thu n khi t (Nguy n Lân D ng và c ng s , 2009).
2.2.2. Tuy n ch n vi khu n
Xác đ nh ho t tính phân gi i cellulose theo
ph ng pháp ch m đi m, đ c l th ch (Ganesh
D. Saratete và c ng s , 2009):
4

Ph ng pháp c y ch m đi m: C y ch m
đi m các ch ng trên môi tr ng th ho t tính
ch a cellulose, nuôi 35oC/48h. Sau th i gian
nuôi, nhu m lugol và đo kích th c vòng phân
gi i, tính t s gi a đ ng kính vòng phân gi i
(D1) và đ ng kính khu n l c (d1).
Ph ng pháp đ c l th ch: Các ch ng
đ c ch n ti p t c t ng sinh trên môi tr ng
NB b sung thêm cellulose 1%, nuôi 48 gi
35oC. Sau th i gian nuôi, đem ly tâm v i t c
đ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu d ch
trong phía trên. Hút 100 µl d ch trong thu đ c
sau ly tâm c a m i ch ng cho vào t ng gi ng
(đ ng kính gi ng d2 = 8 mm) trên môi tr ng

th ho t tính cellulase ngo i bào.
các đ a
o
th ch này 35 C trong vòng 48h. Sau đó ti n
hành nhu m lugol và tính hi u s gi a vòng
phân gi i D2 và đ ng kính gi ng d2.
Ph ng pháp đo ho t l c enzyme
cellulase:
c xác đ nh d a vào l ng đ ng
kh t o thành sau ph n ng b ng ph ng pháp
đo quang ph theo Miller (Miller, 1959).
2.2.3. Ph ng pháp đ nh danh vi khu n
c tính sinh lý, sinh hóa: Kh n ng sinh
bào t , nhu m Gram và các ph n ng hóa sinh
trên môi tr ng đ c hi u (Nguy n Lân D ng
và c ng s , 2009). Sau đó, nh n di n s b
ch ng d a trên khóa phân lo i Bergay
(Gibbons và Buchanon, 1989).
Ph ng pháp sinh h c phân t : D a trên
phân tích trình t 16S rRNA c a các ch ng vi
khu n (Nguy n Lân D ng và c ng s , 2009).
Ph n ng PCR s d ng c p m i xuôi 27F v i
trình t 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’,
m i
ng c
1492R
v i
trình
t
3’TACGGYTACCTTGTTACGACTT5’. Chu

trình nhi t c a ph n ng PCR v i các giai
đo n: Bi n tính chu k đ u 95oC trong 5
phút. Các chu k sau bi n tính trong 30 giây;
B t c p m i 52oC trong 1 phút; Kéo dài
72oC trong 1 phút 30 giây; Th c hi n 35 chu
k ; Chu k cu i 72oC trong 5 phút; K t thúc
ph n ng h nhi t đ xu ng 4oC (Richard

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng
Devereux and Sherry S.Wilkinson, 2004).
K t qu gi i trình t 16S rRNA c a vi
khu n đ c phân tích so sánh v i các trình t
trên ngân hàng gen qu c t NCBI b ng ch ng
trình BLAST đ đ nh danh loài vi sinh v t.
2.2.4. Kh o sát nh h ng c a đi u ki n
ngo i c nh
Chu n b ch ng: Nuôi ch ng TD trên môi
tr ng NB 35oC trong 21 gi v i t c đ l c
150 vòng/phút. Thu d ch sinh kh i, m i thí
nghi m c p 5% d ch nuôi vào bình tam giác
250 mL ch a 100 mL môi tr ng NB.
Kh o sát:
Nhi t đ : Môi tr ng NB đ c chu n v pH
= 7. Nuôi t nh các bình l n l t nhi t đ
20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC và 50oC.

T c đ l c: Môi tr ng NB đ c chu n v
pH = 7. Các bình đ c nuôi cùng 35oC v i
t c đ l c l n l t là 50 vòng/phút, 100
vòng/phút, 150 vòng/phút, 200 vòng/phút, 250
vòng/phút và nuôi t nh.
Kh o sát pH: Môi tr ng NB đ c chu n
v các pH = 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Nuôi các
B ng 1.
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

M u

Ch ng

B vi sinh

B cân
b ng

B l ng 1
B l ng 2

c đi m hình thái khu n l c các ch ng phân l p

TD1

Hình thái
Khu n l c màu tr ng ngà, mép r ng c a, b m t nh n, vòng phân
gi i l n
Khu n l c màu h ng, mép r ng c a, nh n, vòng phân gi i v a

TAD
VS41
VS42
VS43
VS44
VS45
VS46
VS47
VS48

CB41
CB42
CB43
CB44
CB45
L141
L142
L241
L242

Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu
Khu

TD

N c
ngu n

bình thí nghi m
35oC v i t c đ l c 150
vòng/phút.
M i thí nghi m l p l i 3 l n. Sau m i 3 gi
và kéo dài t i 48 gi nuôi , hút 3 mL d ch
m u các th i đi m đo m t đ quang h c.
2.2.5. Kh o sát kh n ng x lý c a ch ng
phân l p quy mô bình tam giác 250 ml
Ch ng TD đ c nuôi trên môi tr ng NB
v i pH = 6 35oC trong 21 gi , v i t c đ l c
150 vòng/phút. Sau th i gian nuôi c y, ki m
tra m t đ t bào trong d ch thu đ c. C p 5%
d ch nuôi các m t đ 10³, 104, 105, 106
CFU/mL t ng ng vào các bình tam giác 250
mL ch a 100 mL n c th i. S d ng thêm m t
bình tam giác 250 mL ch a 100 mL n c th i
không b sung ch ng làm m u ki m ch ng.
Nuôi các m u trên 35oC v i t c đ l c 150
vòng/phút, sau m i 24 gi , kh o sát kh n ng
và tính hi u su t x lý n c th i c a ch ng TD
m i m t đ c p gi ng qua xác đ nh ch s
COD theo TCVN 6491:1999.
III. K T QU VÀ TH O LU N
3.1. Phân l p ch ng vi khu n

nl

nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl
nl

c màu tr ng ngà, mép r ng c a, vòng phân gi i l n
c nh , tròn, tr ng, vòng phân gi i v a
c tròn, lan to h n lên m t th ch, vòng phân gi i nh
c tròn tr ng, vòng phân gi i nh
c tròn, lan to h n lên m t th ch, vòng phân gi i to
c tròn, h n lên m t th ch, vòng phân gi i nh
c tr ng b m t nh n, không có vòng phân gi i
c tr ng, không có mép, vòng phân gi i nh
c tròn nh , tr ng bóng, không có vòng phân gi i
c tr ng, không có mép, vòng phân gi i l n
c tròn lan trên b m t th ch, vòng phân gi i l n
c tròn, vòng phân gi i nh

c nh , tr ng có tâm, vòng phân gi i l n, b m t nh n
c nh , tròn, tr ng, vòng phân gi i l n
c đ c, mép r ng c a, không có vòng phân gi i
c tr ng, có tâm tr ng s a, vòng phân gi i l n
c tròn tr ng b m t nh n, vòng phân gi i v a
c tròn, không có vòng phân gi i

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018

D1/d1
6,03
1,07
5,77
1,38
/
/
1,13
/
/
/
/
4,53
5,83
/
6,25
1,08
/
3,27

3,39
/

5


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng
T các m u n c th i, sau khi x lý pH =
5 trong 48 gi và nhi t đ 70oC trong 20 phút,
nuôi c y trên môi tr ng Hans đã phân l p
đ c 11 ch ng vi khu n có kh n ng phân gi i
cellulose đ c th hi n b ng 1.

3.2. Tuy n ch n ch ng vi khu n
11 ch ng phân l p
trên, ti p t c
ch n kh n ng phân gi i cellulose
ph ng pháp c y ch m đi m, đ c l th
xác đ nh ho t l c enzyme, k t qu thu đ
th b ng 2.

B ng 2. Kh n ng phân gi i cellulose c a các ch ng qua các ph ng pháp tuy n ch n
TD
TD1 TAD VS41 VS44 CB41 CB42 CB44 CB45 L142
Ch ng
1,38
1,13
4,53
5,83
6,25

1,08
3,27
D1/d1
6,03 1,07 5,77
D2-d2
/
22,02
/
/
22,3
20,39 23,37
/
22,11
24,91
(mm)
Ho t l c
/
7,06
/
/
6,64
7,16
7,44
/
7,09
8,52
(U/ml)
D1:
ng kính vòng phân gi i cellulose ph ng pháp c y ch m đi m; d1:
ng kính khu n l c;

D2:
ng kính vòng phân gi i cellulose ph ng pháp đ c l ; d2 = 8 mm:
ng kính gi ng.

Hình 1. Kh n ng phân gi i cellulose
c a ch ng TD

K t qu các thí nghi m cho th y, ch ng TD
có kh n ng phân gi i cellulose m nh nh t:
Ph ng pháp ch m đi m cho t l đ ng kính
vòng phân gi i so v i đ ng kính khu n l c là
6,03; hi u s đ ng kính vòng phân gi i qua

D- Mannitol
Glucose
Lactose

6

K t qu
+
+
+
+
+
+
-

L241
3,39

17,34
5,84

ph ng pháp đ c l là 24,91 mm cao h n
ch ng vi khu n PV41 (24,5 mm) (Nguy n
Ng c Trúc Ngân và Ph m Th Ng c Lan,
2014) và ho t l c enzyme cellulase qua
ph ng pháp xác đ nh ho t l c enzyme đ t
8,52 (U/ml) cao h n ch ng PTCX04 (5,73
(U/ml)) c a m t s nghiên c u tr c đó (Ph m
Bích Hiên và c ng s , 2011).
3.3.
c tính sinh hóa c a các ch ng đ c
tuy n ch n
T ng sinh ch ng TD trong môi tr ng NB
o
35 C trong 24 gi . Sau đó, x lý nhi t d ch
t ng sinh
70oC trong 20 phút và nhu n
Gram. K t qu cho th y ch ng TD là vi khu n
Gram d ng, hình que, ng n và có kh n ng
sinh bào t .
Ti n hành th nghi m m t s tính ch t sinh
hóa ch ng TD thu đ c k t qu b ng 3.

B ng 3. Tính ch t sinh hóa c a ch ng TD
Tính ch t sinh hóa
Gram
Catalase
Di đ ng

Phân gi i huy t
D-Xylose
Sucrose

tuy n
b ng
ch và
cc

Tính ch t sinh hóa
-Galactosidase
Indol
Sinh H2S
Ph n ng Voges - Proskauer
Citrat
Lysine decarboxylase

K t qu
+
+
+

Ornithine decacboxylase
Arginine dihydrolase
Ure

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

-

1-2018


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng
Ch ng TD có nhi u tính ch t sinh hóa gi ng
v i Bacillus spp. nh : Catalase d ng tính,
Voges - Proskauer d ng tính, Glucose d ng
tính, D - Mannitol d ng tính, Citrat d ng
tính, Arginine Dihydrolase âm tính, D - Xylose
âm tính, Ure âm tính… (O’donnell và c ng s ,
1980).
3.4. K t qu đ nh danh b ng sinh h c
phân t

Hình 2. S n ph m PCR c a ch ng TD
-ve: N c - M u ki m soát âm;
+ve: DNA ch ng E.coli - M u ki m soát d ng.

Gi i trình t gen 16S rRNA c a ch ng TD
v i kích th c 1492 bp. Phân tích so sánh
t ng quan v c u trúc, k t h p s d ng thu t
toán
x
lý
d
li u
BLAST

( />nh n
th y trình t 16S rRNA c a ch ng TD tu ng

đ ng 99% v i các ch ng Bacillus subtilis
subsp.
inaquosorum
BGSC3A288;
Brevibaterium halotolerans DSM 8802;
Bacillus subtilis DSM10; Bacillus subtilis
IAM121188; Bacillus vallismortis DSM11031;
Bacillus mojavensis IFO15718; Bacillus
subtilis 168; Bacillus subtilis subsp. spizizenii
NBRC1012g39; Bacillus amyloliquefaciens
subsp. plantarum FZB42; Bacillus subtilis
NBRC13719 và g n g i nh t v i ch ng
Bacillus
subtilis
subsp.
inaquosorum
BGSC3A288.
T các k t qu phân tích đ c tính sinh h c
và c u trúc 16S rRNA nêu trên, ch ng vi
khu n TD đ nh danh là ch ng Bacillus
subtilis TD.
3.5. K t qu kh o sát nh h ng c a nhi t
đ và pH
3.5.1. nh h ng c a nhi t đ
Kh o sát s phát tri n c a ch ng TD các
nhi t đ khác nhau, trong cùng đi u ki n môi
tr ng dinh d ng NB v i pH = 7, nuôi t nh.
K t qu cho th y ch ng TD, có kh n ng ch u
nhi t. Chúng có th phát tri n t t nhi t đ t
30oC đ n 45oC và t t nh t 35oC v i m t đ t

bào OD600nm = 0,88.

OD 600nm

1.20

0.80

0.40

0.00
20

Hình 3. nh h

25

30

35
40
Nhi t đ (oC)

45

50

ng c a nhi t đ đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi

3.5.2. nh h ng c a t c đ l c

Ch ng TD phát tri n t t nh t 35oC. Ti n
hành nuôi ch ng TD 35oC v i ch đ c p khí
khác nhau. K t qu thu đ c cho th y, ch đ

c p khí khác nhau, ch ng TD phát tri n v i t c
đ khác nhau và phát tri n t t nh t khi nuôi l c
150 vòng/phút v i giá tr OD600nm = 1,79.

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018

7


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng
2.00

OD 600nm

1.60
1.20
0.80
0.40
0.00
0

50

100

150
200
T c đ l c (Vòng/phút))

250

Hình 4. nh h

ng c a t c đ l c đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi
v i giá tr OD600nm lên t i 2,10. Ch ng TD có
3.5.3. nh h ng c a pH
Kh o sát s phát tri n c a ch ng TD các
kh n ng ch u axit đ n ki m thích nghi đ c
pH khác nhau cho th y, chúng phát tri n t t t
v i ngu n n c th i có pH dao đ ng t 5 - 9.
pH = 5 cho đ n pH = 9 và t t nh t pH = 6
2.40
OD 600 nm

OD 600nm

2.00
1.60
1.20
0.80
0.40
0.00
2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

pH

Hình 5. nh h

ng c a pH đ n s phát tri n c a ch ng TD sau 24 gi

3.6. Kh o sát kh n ng x lý n
250 ml

c th i nhà máy gi y c a ch ng TD

quy mô bình tam giác

1400
1200

COD (mg/L)

1000
800
600
400
200
0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Th i gian (ngày)

10³CFU/mL

10 CFU/mL

10 CFU/mL

Hình 6. Hi u qu x lý COD c a ch ng TD

8

10 CFU/mL

KBS

quy mô bình tam giác 250 mL

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng
K t qu
hình 6 cho th y, khi b sung
ch ng TD vào m u n c th i, hàm l ng COD

gi m đáng k . Hàm l ng COD ban đ u là
1309,1 (mg/L), sau 3 ngày cho th y s khác
bi t rõ r t gi a m u b sung thêm ch ng TD
còn kho ng 793,0 - 918,3 mg/L v i m u không
b sung và ch có vi sinh v t n n (1051,7
mg/L). Sau 9 ngày, hàm l ng COD trong m u
b sung ch ng TD đ t 205,7 mg/L th p h n
nhi u so v i m u ki m ch ng không b sung
548,6 mg/L.
M t đ b sung ch ng khác nhau cho hi u
qu x lý n c th i khác nhau. Trong đó, khi
b sung m t đ 105 CFU/ml, kh n ng x lý
n c th i t t nh t v i t c đ x lý nhanh h n
và hi u su t x lý ngày th 9 đ t t i 84,3%.
IV. K T LU N
T các m u n c th i nhà máy gi y đã phân
l p đ c 11 ch ng có kh n ng phân gi i
cellulose, trong đó ch ng TD có kh n ng ch u
đ c nhi t đ cao, thích nghi v i d i pH t ng
đ i r ng và phân gi i cellulose t t nh t.
ã nghiên c u và xác đ nh đ c m t s đ c
tính sinh hóa và trình t c u trúc gene 16S
rRNA c a ch ng TD. T đó ch ng TD đ c đ
ngh đ nh danh loài là Bacillus subtilis TD.
ã kh o sát đ c kh n ng phát tri n c a
ch ng TD trong các đi u ki n nhi t đ , t c đ
l c và pH khác nhau, k t qu cho th y ch ng
TD có kh n ng ch u và phát tri n nhi t đ
cao lên t i 45oC, t l c p khí t t nh t 150
vòng/phút, trong d i pH t axit nh (pH = 5)

đ n ki m (pH = 9).
B c đ u s d ng ch ng TD x lý n c
th i nhà máy gi y quy mô bình tam giác 250
mL v i ch đ c p khí l c 150 vòng/phút cho
th y hi u qu khá cao, hi u su t COD đ t t i
84,3% sau 9 ngày x lý.
TÀI LI U THAM KH O
1. Tr nh Lê Hùng (2009). K thu t x lý n
Nhà xu t b n Giáo d c.

c th i.

2. Ngô Th Nga, Tr n V n Nhân (2002). Giáo trình
công ngh x lý n c th i. Nhà xu t b n Khoa h c và
K thu t.
3. Nguy n Lân D ng, Ngô ình Quy t, Ph m V n
Ty (2009). Vi sinh v t h c. Nhà xu t b n Giáo d c, Hà N i.
4. Nguy n Ng c Trúc Ngân, Ph m Th Ng c Lan
(2014). Tìm hi u kh n ng phân gi i cellulose c a vi
sinh v t phân l p t ch t th i r n c a nhà máy
FOCOCEV Th a Thiên Hu . T p chí Khoa h c và Công
ngh , Tr ng i h c Khoa h c Hu , t p 1, s 1.
5. Ph m Bích Hiên, ào V n Thông, L ng H u
Thành, V Thúy Nga (2011). Tuy n ch n ch ng vi sinh
v t có kh n ng phân gi i xenluloza cao cho s n xu t
ch ph m x lý ph th i ch n nuôi d ng r n. T p chí
Khoa h c và Công ngh Nông nghi p Vi t Nam s 3(24).
6. TCVN 6168: 2002. Ch ph m vi sinh v t phân
gi i xenlulo/Microbial preparation for cellulose
degradation.

7. TCVN 6491:1999. Ch t l ng n c - Xác đ nh
nhu c u oxi hóa h c/Water quality - Determination of
the chemical oxigen demand.
8. Tr n Vi t Ba (2012). Nghiên c u nâng cao hi u
qu x lý c a các b hi u khí b ng cách đi u ch nh dinh
d ng thích h p cho vi khu n đ i v i h th ng x lý
n c th i c a nhà máy gi y Bãi B ng.
9. B Tài nguyên & Môi tr ng (2010). Báo cáo
Môi tr ng qu c gia n m 2009. Môi tr ng Khu công
nghi p Vi t Nam.
10. Ganesh D. Saratete, Yung-Chung Lo, Wen-Ming
Chen, Ming-Der Bai, Jo-Shu Chang (2009). Isolation of
cellulose-hydrolytic and applications of the cellulotic
enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme
and Microbial Technology, 44(417-425).
11. N. E. Gibbons R. E. Buchanon (1989). Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology. Vol.8: The
Williams and Wilkins company, Baltimore.
12. A. G. O’donnell, J. R. Norris, R. C. W. Berkeley,
D. Claus, T. Kaneko, N. A. Logan, R. Nozaki (1980).
Characterization of Bacillus subtilis, Bacillus pumilus,
Bacillus licheniformis, and Bacillus amyloliquefaciens
by
Pyrolysis
Gas-Liquid
Chromatography,
Deoxyribonucleic
Acid-Deoxyribonucleic
Acid
Hybridization, Biochemical Tests, and API Systems.

International Journal of Systematic Bacteriology, pp.
448-459.
13. Miller (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent
for determination of reducing sugar. Analytical
Chemistry, 31(3): 426-428.
14. Richard Devereux, Sherry S. Wilkinson (2004).
Amplification of ribosomal RNA sequences. Molecular
Microbial Ecology Manual, Second Edition 3.01:
509-522.

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018

9


Công ngh sinh h c & Gi ng cây tr ng

ISOLATION AND SELECTION OF BACTERIA STRAINS ADAPTED
TO HIGH TEMPERATURES, WIDE pH RANGE, HAVE HIGH
CELLULASE ACTIVITY AND THE FIRST INITIAL APPLICATION
TO WASTEWATER TREATMENT OF PAPER MILLS
Vu Thi Dinh1, Phan Thi Thu Nga2, Hoang Trung Doan3, Tran Lien Ha4
1
VNU University of Science
2,3,4
Ha Noi University of Science and Technology
SUMMARY
In 2016, according to the Vietnam Pulp and Paper Association, the country's paper production reached

2,420,000 million tons. Each ton of manufactured paper requires about 200 - 500 m3 of water, however, many
paper mills are discharged into environment with out untreated wastewater, causing serious pollution. At
present, biological treatment method is the best choice because of its safety and not harmful to the environment.
Therefore, our research focused on the isolation and selection of bacteria strains adapting to high temperatures,
wide pH range and having high cellulase activity for the purpose of wastewater treatment. From 5 wastewater
samples of paper mill, 11 strains with cellulase activities have been isolated, among them, TD strain assimilate
cellulose the best with activity of cellulase up to 8.52 (U/ml). Identified by biochemical and molecular biology,
the TD strain is 99% similarity with Bacillus subtilis subsp. inaquosorum BGSC3A288 strain. The TD strain’s
name is Bacillus subtilis TD, could grow at 30°C to 45°C, pH range of 5 to 9 but the best conditions are 35oC
and pH of 6.
Keywords: Bacillus subtilis, isolated bacteria, thermotolerant bacteriaassimilate cellulose, wastewater of
paper mill.

10

Ngày nh n bài

: 20/4/2017

Ngày ph n bi n
Ngày quy t đ nh đ ng

: 26/4/2017
: 02/5/2017

T P CHÍ KHOA H C VÀ CÔNG NGH LÂM NGHI P S

1-2018