KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

M

U

Cá tra hi n đang đóng vai trò quan tr ng trong xu t kh u th y s n c a Vi t
Nam. N m 2011, đã có h n 230 doanh nghi p xu t kh u cá tra đ n h n 130 th
tr ng trên th gi i, đ t 1,8 t USD, t ng g n 26,5%, v i kh i l ng trên 600 nghìn
t n, t ng 3% so v i n m 2010 [3].
Tuy nhiên, vi c m r ng di n tích thâm canh và ni tr ng cá tra v i m t đ
cao mà ch a có bi n pháp qu n lý phù h p đã làm cho d ch b nh bùng n gây thi t
h i không nh cho ng i dân. M t trong nh ng b nh đ c đánh giá là nguy hi m
trên cá tra là b nh gan th n m do tác nhân vi khu n Edwardsiella ictaluri gây nên
gây ch t cá v i s l ng l n. Tr c đây, th i k cao đi m c a d ch b nh th ng
vào tháng 9 đ n tháng 12, nh ng hi n nay, d ch b nh đã x y ra quanh n m. T c đ
lây lan t l thu n v i m c đ thâm canh, m t đ nuôi cá trên m t đ n v di n tích
ao ni. T l cá ch t có th lên t i 90% cá tra gi ng, 50% cá tra th

ng ph m [4].

Hi n nay, vi khu n E. ictaluri đã đ kháng v i nhi u lo i kháng sinh, m t
khác ch a có vaccine phịng b nh gan th n m m t cách hi u qu nên vi c xác đ nh
s m tác nhân gây b nh đóng vai trị quan tr ng trong vi c phịng ch ng, ki m sốt
và đi u tr b nh cho cá. Thông th ng, đ phát hi n m t tác nhân gây b nh b ng
ph

ng pháp vi sinh v t trong phịng thí nghi m m t kho ng 7 ngày v i đ tin c y

không cao. Ph ng pháp PCR c n 5-6 ti ng v i k thu t ph c t p, đòi h i máy gia
nhi t t đ ng, đi n di, thu c nhu m hu nh quang đ c h i, đòi h i ngu n nhân l c
có tay ngh và v n c n ph i làm giàu m u. Do v y, m t yêu c u c p thi t là phát
tri n m t ph ng pháp phát hi n tác nhân gây b nh chi phí th p, hi u qu , d s
d ng, không đ c h i, có th ph bi n trong nhi u l nh v c. LAMP- Loop mediated
isothermal amplification là m t ph ng pháp khu ch đ i DNA đ t đ c nh ng đi u
ki n này. Tuy nhiên, do kh i l

ng các s n ph m khu ch đ i t o ra r t l n nên vi c

gây ơ nhi m khơng gian phịng thí nghi m v i các s n ph m khu ch đ i c a ph n
ng là m t v n đ nghiêm tr ng, ch có th kh c ph c b ng cách không m ng sau
khi ph n ng k t thúc. Vì v y chúng tơi ti n hành đ tài “Nghiên c u s d ng
Calcein là ch th màu phát hi n s
Edwardsiella ictaluri b ng ph

khu ch đ i gen eip18 c a vi khu n

ng pháp LAMP” nh m xác đ nh nhanh, chính xác,

an tồn tác nhân gây b nh gan th n m trên cá tra đ t đó có nh ng bi n pháp ki m
soát và đi u tr d ch b nh k p th i.

1
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

CH

K53B-CNSH

NG 1: T NG QUAN TẨI LI U

1.1. VI KHU N Edwardsiella ictaluri
1.1.1.
c đi m sinh h c vƠ đ c đi m h gen
Edwardsiella m t trong nh ng chi m i c a h Enterobacteriaceae đ c đ t
tên theo tên nhà bác h c ng i M P.R. Edwards (1901–1966) ng i đ u tiên đã
phân l p và phân lo i đ c vi khu n này. Chi Edwardsiella g m 3 loài:
Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E.tarda
và E. ictaluri đ

c xem là nh ng đ i t

ng gây b nh ch y u trên cá da tr n. Khác

v i E. tarda có kh n ng gây b nh c trên đ ng v t và ng i thì vi khu n E. ictaluri
ch tìm th y trên các loài đ ng v t máu l nh đ c bi t là trong môi tr ng n c ng t.
Các đ c đi m sinh hóa c a vi khu n E. ictaluri sai khác v i E. tarda m t s đ c
tính nh khơng sinh H2S, khơng sinh indole, di đ ng 25ºC và không di đ ng
37ºC.
Vi khu n thu c chi Edwardsiella mang các đ c đi m đi n hình c a h
Enterobacteriaceae: vi khu n Gram âm, hình que th ng, nh , kớch th c 1ì2-3 àm,
khụng hỡnh thnh bo t v di đ ng b ng tiên mao, hô h p k khí tùy ti n. Kích
th c khu n l c trên môi tr ng c s sau 24 gi ni c y r t nh (0,5-1 mm) [8].

A

B

Hình 1: Vi khu n Edwardsiella ictaluri soi d

i kính hi n vi đi n t (A) và

nhu m Gram (B) [33]
Trong phịng thí nghi m, nhi t đ t i u cho t ng tr

ng c a E. ictaluri khi

nuôi c y trong ng nghi m là t 25 - 30ºC và nhi t đ cho b nh b t đ u xu t hi n
ngồi mơi tr ng là kho ng 22 - 28ºC ph n ánh s thích ng c a chúng trong v t
ch bi n nhi t. Trong khi đó E. tarda và E. hoshinae sinh tr ng và phát tri n
nhi t đ cao h n, kho ng 37ºC. M t khác bi t n a so v i hai ch ng còn l i, E.
ictaluri sinh tr ng r t ch m trên môi tr ng th ch đ a, thông th ng sau 2-3 ngày

2
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
nuôi c y

K53B-CNSH

30ºC m i t o thành khu n l c kích th

c 1 mm. V m t sinh hóa, E.

ictaluri c ng ít ho t tính h n so v i các lồi Edwardsiella khác [8].
Genome c a E. ictaluri là m t nhi m s c th đ n d ng vịng, có kích th

c

kho ng 2,15 Mb. Nghiên c u DNA ch ra r ng E. ictaluri liên quan ch t ch nh t
đ n E. tarda. Trong h gen c a E. ictaluri thì h gen eip là đ c tr ng ch có lồi
E. ictaluri. H gen này bao g m 11 gen trong đó 8 gen xác đ nh mã hóa cho protein.
Trong s này có 3 gen l n l t là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các s n ph m
protein v i tr ng l ng kho ng 18, 19 và 20 kDa. Theo Moore và c ng s (2002)
thì gen eip18 đ c bi u hi n trong quá trình nhi m b nh và đóng vai trị là kháng
ngun gây đáp ng mi n d ch [17]. Do h gen này mang tính đ c tr ng cho lồi
nên có th s d ng m t trong s 3 gen này đ phân l p đ n loài b ng ph ng pháp
sinh h c phân t . Hi n nay, gen eip18 là gen đ c dùng nhi u trong các nghiên c u
đ phát hi n, đ nh danh vi khu n E. ictaluri, tác nhân gây b nh nhi m trùng huy t
trên cá da tr n M [31].
1.1.2. Tình hình b nh d ch
E. ictaluri đ

c phát hi n là tác nhân gây b nh gan th n m

cá da tr n

(Ictalurus punctatus) nuôi các bang ông nam M b i Hawke n m 1981[10]. Cá
th ng b nhi m b nh vào các tháng cu i n m khi nhi t đ n c h th p (kho ng t
tháng 9 đ n tháng 1 n m sau). Tuy nhiên, hi n nay do m r ng di n tích ni tr ng
và ki m sốt d ch khơng t t d n đ n vi c d ch b nh di n ra quanh n m.

Vi t Nam, nh ng n m g n đây cá tra là lồi cá n

c ng t đ

c ni và

xu t kh u nhi u nh t so v i các đ i t ng th y s n khác. N m 2011 xu t kh u cá
tra đ t 1,806 t USD, kh i l ng xu t kh u trên 600 nghìn t n [3].
i t ng này
đ

c ni v i quy mô công nghi p

m t s t nh đ ng b ng Sông C u Long nh :

An Giang,
ng Tháp, C n Th , B n Tre, Ti n Giang… Nuôi tr ng cá tra là m t
trong nh ng ngành có t c đ phát tri n r t nhanh và đem l i l i nhu n cao cho
ng i dân. B nh gan th n m xu t hi n đ u tiên n c ta vào cu i n m 1998 [4].
M c dù đ c phát hi n mu n h n so v i m t s các b nh khác nh ng b nh gan th n
m đ c đánh giá là b nh gây thi t h i nghiêm tr ng. Theo báo cáo n m 2011, t ng
di n tích th ni c a các đ a ph ng thu c đ ng b ng Sông C u Long vào kho ng
6.800 ha, b nh gây thi t h i kho ng 500 ha [3, 35]. T l cá ch t do nhi m b nh
cao, t 50 - 60% và nguy hi m nh t là giai đo n cá gi ng, t l cá ch t có th lên t i
90% [6].

3
Khóa lu n t t nghi p

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
Khi cá b b nh ng

i nuôi th

K53B-CNSH
ng dùng ch t hoá h c và thu c kháng sinh đ

ch a tr , tuy nhiên do s d ng b a bãi, vi khu n E. ictaluri trên cá tra đã kháng v i
m t s lo i thu c kháng sinh nh : Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [1];
Amoxicilin và Ampicilin [5]. Vi c s d ng kháng sinh còn làm cho các s n ph m
th y s n sau đó th ng khơng đ c a chu ng do s tích l y thu c, hoá ch t trong
th t.
Nh v y b nh gan th n m đ c đánh giá là m t trong nh ng b nh gây t n
th t l n cho ngành nuôi tr ng th y s n, đ c bi t là cá tra và cá basa c a n c ta.
Vi c phân l p đ xác đ nh chính xác tác nhân gây b nh là r t c n thi t đ ng i ni
tr ng th y s n có th phịng và tr b nh.
1.2. CÁC PH
NG PHÁP PHÁT HI N VI KHU N E. ictaluri
1.2.1. Ph ng pháp truy n th ng
1.2.1.1. Ph ng pháp vi sinh
Ph ng pháp phân l p là m t trong các ph

ng pháp c b n dùng đ phát

hi n vi khu n. M u b nh ph m sau khi thu nh n đ c nuôi c y trên môi tr ng
ch n l c riêng dành cho vi khu n E. ictaluri là EIM (Edwardsiella ictaluri
medium). Vi khu n phát tri n trên EIM đ c phân bi t v i E. ictaluri d a trên hình
thái c a khu n l c. EIM c ch vi khu n Gr (+) ngo i tr c u khu n (Enterococci).

Ngoài ra, fungizone c ng đ c thêm vào EIM nh m ng n ch n s phát tri n c a
h u h t các lo i n m. EIM cho phép đánh giá ngu n môi tr ng, m c đ nhi m và
ngu n mang E. ictaluri. Sau khi c y tr i vi khu n trên môi tr ng EIM, nuôi c y
nhi t đ 28oC sau 24 – 48 gi thu đ
kích th c t 0,5 – 1 mm [27].

c khu n l c đ n có hình trịn nh màu xanh và

1.2.1.2. Xác đ nh ho t tính sinh hóa đi n hình
Bên c nh ph ng pháp vi sinh, đ phát hi n chính xác vi khu n E. ictaluri, ta
ti n hành các ph n ng sinh hóa đ c tr ng c a E. ictaluri nh : ho t tính catalase
(+), ho t tính oxydase (-), kh n ng sinh Indole (-), sinh H2S (-), sinh axit trên các
môi tr ng sucrose, monitol, arabinose. E. ictaluri có ho t tính protease r t h n ch ,
không phân h y casein, gelatin, collagen nh ng l i phân h y chrondroitin sulfate và
có ho t tính tan huy t [8].
Vi c phân lo i d a vào ph ng pháp truy n th ng t n th i gian mà đ chính
xác ch a cao nên r t h n ch trong ch n đoán d ch b nh.

4
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
1.2.2. Ph

K53B-CNSH

ng pháp PCR vƠ sequensing

1.2.2.1. Phân lo i d a vào 16S rDNA
Vi c s d ng các trình t gen mã hóa 16S rRNA đ nghiên c u phát sinh loài
vi khu n và phân lo i đã đ c s d ng r t ph bi n. Gen mã hóa 16S rRNA t n t i
nh m t h đa gen ho c operon; ch c n ng c a gen mã hóa 16S rRNA không thay
đ i theo th i gian cho th y s thay đ i th t ng u nhiên là m t th c đo chính xác
trong q trình ti n hóa và gen 16S rRNA có kích th c kho ng 1500 bp là đ l n
cho các m c đích thơng th ng dùng trong phân lo i c p đ phân t [21].
i v i hai loài E. ictaluri và E. tarda, sau khi s d ng PCR nhân trình t
16S rDNA, đ c trình t cho th y đ t ng đ ng rDNA c a hai loài lên t i 99,6%
[5] và c ng ch có th k t lu n tác nhân gây b nh thu c chi Edwardsiella.
Nh v y k t h p ph

ng pháp truy n th ng và ph

vào 16S rDNA có th phát hi n đ
c ng khá dài, lên đ n 7 ngày.

ng pháp phân lo i d a

c E. ictaluri song t ng th i gian nghiên c u

1.2.2.2. Phân lo i d a vào gen đ c tr ng
Gen eip18 là m t trong ba gen đ c tr ng ch có

E. ictaluri mà khơng có

E. tarda, cho nên nó đ c xem là m t trong nh ng ch th phân t đ xác đ nh chính
xác đ n c p đ lồi. Vì v y đ ki m tra xem ch ng vi khu n nào có ch a đo n gen
đó có th s d ng ph ng pháp PCR v i c p m i là eip18 nh m nhân s l ng l n
gen eip18 đ i v i nh ng ch ng có đo n gen này. Sau khi khu ch đ i, s n ph m

đ c đi n di và nhu m Ethidium bromide. Toàn b qui trình đ đ c đ c k t qu
m t kho ng 6 ti ng [7] v i k thu t ph c t p, máy móc đ t ti n, thu c nhu m DNA
đ c h i.
1.2.3. Ph ng pháp LAMP
N m 2000, Notomi và c ng s đã phát tri n k thu t LAMP (Loop-mediated
isothermal amplifications), m t ph ng pháp phát hi n d a trên vi c khu ch đ i
m t trình t DNA có s n đi u ki n đ ng nhi t [20]. T đó đ n nay k thu t này
đ c th gi i ng d ng đ phát hi n r t nhi u tác nhân sinh h c bao g m virut, vi
khu n, n m, kí sinh trùng…, trong đó có E. ictaluri [26].
LAMP có kh n ng t ng h p m t l ng l n DNA, RNA mà không c n máy
gia nhi t t đ ng. Ph ng pháp LAMP d a vào quá trình t ng h p DNA đ c th c
hi n b i m t DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao và hai c p m i đ c
hi u. B

c đ u tiên c a quá trình b n m i đ

c s d ng, sau đó hai m i đ

cs

d ng cho m i chu k . Toàn b quá trình khu ch đ i đo n DNA đích c n th i gian
5
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

kho ng 60 phút. S n ph m cu i cùng nh n đ

c là các đo n DNA d ng g p khúc có

kích th c g p nhi u l n kích th c c a đo n gen đích. DNA polymerase th ng
đ c s d ng trong các ph n ng LAMP là Bst DNA polymerase ho c Bsm
polymerase. Ph ng pháp LAMP r t nh y, có th thu đ c k t qu t t ngay n ng
đ DNA th p [31]. Tuy nhiên, m i dùng cho ph n ng LAMP l i ph c t p h n m i
cho ph n ng PCR thông th ng. Ph n ng LAMP c n ph i s d ng ít nh t hai c p
m i, m t c p có chi u dài 40 nucleotide và đ c thi t k đ c bi t, c p còn l i có
chi u dài kho ng 20 nucleotide. Do đó, đ đ c hi u c a ph n ng cao h n nhi u so
v i ph ng pháp PCR.
Nh ng u đi m c a ph

ng pháp LAMP so v i ph

ng pháp PCR:

- Khơng địi h i máy bi n nhi t đ t ti n nh PCR b i vì t t c ph n ng di n
ra t i 1 nhi t đ c đ nh. Do v y ch c n m t máy n nhi t đ n gi n c a phòng thí
nghi m bình th

ng.

- K t qu có th đ

c đ c ngay sau khi ph n ng k t thúc mà không c n

đi n di trên gel agarose d a vào s t o thành Mg2P2O7 k t t a là s n ph m ph c a
ph n ng khu ch đ i gen có th đ c xác đ nh b ng ly tâm ho c đo đ đ c. Ho c

d a vào s chuy n màu c a ch th kim lo i ví d Calcein, FDR (Fluorescent
detected reagent), HNB (Hydroxyl naphthol blue) hay SYBR Green I.
- Th i gian th c hi n ph n ng r t ng n, v i gi i h n phát hi n cao g p h n
k thu t PCR t 10 – 1000 l n.
-

đ c hi u cao vì s d ng 2 c p m i nh n bi t 6 trình t khác bi t trên

DNA đích trong b
- Hàm l

c đ u tiên và 4 trình t
ng DNA t ng h p đ

trong các b

c sau đó.

c l n h n g p nhi u l n so v i PCR.

- B ng s ph i h p v i enzyme sao mã ng

c, LAMP có th khu ch đ i

trình t RNA v i đ đ c hi u cao.
1.2.3.1. nh ngh a
LAMP (loop- mediated isothermal amplification) là ph

ng pháp khu ch đ i

DNA đi u ki n đ ng nhi t có s t o thành các vịng loop trên phân t s n ph m
d i s h tr c a enzyme có ho t tính t tách chu i cao và s có m t c a các m i
đ c hi u.
1.2.3.2. M i cho ph n ng LAMP
Ph n ng LAMP c n ít nh t 4 m i: c p m i ngoài F3, B3 có vai trị trong
vi c chuy n m ch nên ch tham gia vào giai đo n đ u c a ph n ng; c p m i trong
6
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

FIP, BIP là m i lai ch a c trình t khn và đ i khn giúp cho vi c hình thành
vịng loop.
M i ngồi ng

c B3 b sung v i B3c c a DNA, m i ngồi xi F3 b sung

v i F3c c a DNA. M i trong xuôi FIP g m F1c đ u 5’ gi ng trình t F1c trên
DNA đích và F2 đ u 3’ b sung v i F2c DNA đích, t ng t m i trong ng c
BIP g m B1c đ u 5’ có trình t gi ng B1c DNA đích và B2 đ u 3’ có trình t
b sung v i vùng B2c

DNA đích.

Hình 2: M i cho ph n ng LAMP
6 vùng khác bi t trên s i DNA khn đ c kí hi u là F3, F2, F1, B1c, B2c và B3

t đ u 5’. Kí t c có ngh a là vùng trình t này n m trên s i b sung, trình t F1c là trình
t b sung v i trình t F1, B1c là trình t b sung v i trình t B1, B2c là trình t b sung
v i trình t B2. Hai m i trong là BIP và FIP và hai m i ngoài là F3 và B3 đ c s d ng
trong ph n ng LAMP. FIP (BIP) là m i lai có ch a trình t F1c (B1c) và F2 (B2).

Thi t k m i thích h p là m t chìa khóa quan tr ng trong khu ch đ i gen s
d ng ph ng pháp LAMP. Có th thi t k m i th công ho c s d ng ph n m m.
Các đi m chính đ thi t k m t m i t i u [20,29]:
- Các đi m k t thúc c a m i không đ c giàu AT đ tránh s t o thành c u
trúc b c 2 c a m i và s b t c p v i m i khác.
- Nhi t đ nóng ch y Tm c a m i vùng kho ng 55-65ºC, t ng đ ng v i
nhi t đ t i u c a Bst polymerase.
- Tm c a F1c và B1c h i cao h n F2 và B2 đ c u trúc loop đ

c hình thành

ngay sau khi s i đ n DNA đ c gi i phóng t m ch g c.
- Tm c a m i ngoài (B3, F3) nh h n F2, B2 đ đ m b o r ng s t ng h p
nh c p m i trong x y ra tr c c p m i ngồi. Thêm vào đó n ng đ c p m i ngoài
b ng 1/4 đ n 1/10 c p m i trong.
7
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

- Kho ng cách gi a các đo n trình t t đ u 5’ c a F2 và B2 kho ng 120-180

bp, kho ng cách gi a 2 đo n trong F2-F3 và B2-B3 t 0 đ n 20 bp. Kho ng cách
trong vùng t o loop (t đ u 5’ c a F2 t i 3’ F1 và 5’ B2 đ n 3’ B1) kho ng 4060bp.
- Chi u dài c a trình t DNA khu ch đ i (t F2 đ n B2) không nên l n h n
200bp.
tinh khi t c a m i là r t quan tr ng đ kh n ng tái khu ch đ i nhanh
chóng.
- N u trên gen đích ho c trên vùng ch a primer có v trí c t c a enzyme gi i
h n thì có th đ

c s d ng đ xác đ nh chính xác s n ph m khu ch đ i.

1.2.3.3. Nguyên lý c a ph ng pháp LAMP
LAMP là m t quá trình t ng h p DNA t đ ng đ

c th c hi n

m t nhi t

đ không đ i t 60-65ºC trong kho ng th i gian 45-60 phút v i s có m t c a Bst
DNA polymerase, dNTP, v i ít nh t 4 m i đ c thi t k b sung v i 6 trình t riêng
bi t trên gen đích. Có hai b c khu ch đ i LAMP là b c không theo chu k và
b c theo chu k [22].
- B c không theo chu k : m c tiêu là t o ra s i DNA có hai vòng loop hai
đ u, là c u trúc kh i đ u cho b

c LAMP theo chu k . V i ph

ng pháp LAMP,

không gi ng nh PCR, không c n có s bi n tính DNA s i đơi b i nhi t đ . Thông

qua ho t đ ng c a DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao, m i đ c g n
vào DNA đích, b t đ u t khu v c F2 đ u 3’ c a FIP, t ng h p DNA m i theo
nguyên t c b sung. Sau đó, m i F3 liên k t v i khu v c F3c bên ngoài m i FIP,
t ng h p s i DNA b sung v i DNA đích thay th s i DNA mà FIP đã t ng h p, do
đó m t s i DNA đơi đ c hình thành t s i DNA đ c t ng h p t m i F3 và DNA
đích, gi i phóng m t s i DNA đ n có đ u là FIP. S i đ n này hình thành c u trúc
loop đ u 5’ do s b sung gi a F1c và F1. S i DNA đ n này đ c dùng làm
khuôn kh i đ u quá trình t ng h p DNA b ng m i BIP và B3, quá trình t ng h p
t ng t nh trên b t đ u t v trí 3’ c a BIP. Sau đó, m i B3 t ng h p ra m t s i
m i b sung v i khn nên gi i phóng s i đ n đ c t ng h p b i m i BIP. S i
DNA đ n này hình thành c u trúc loop hai đ u nhìn gi ng qu t . DNA c u trúc
gi ng qu t nhanh chóng t ng h p DNA do s t m i. C u trúc này là c u trúc
kh i đ u cho s khu ch đ i hàm m theo chu k k ti p (Hình 3).

8
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

Hình 3: B

K53B-CNSH

c t o c u trúc kh i đ u (không theo chu k )

Quá trình đ c kh i đ u là m i FIP, vùng F2 b t c p v i vùng F2c trên s i DNA
khuôn và kh i đ u cho s kéo dài chu i v phía đ u 5’ c a s i khuôn. Ti p t c đ n m i
BIP, vùng B2 c ng g n v i vùng B2c c a s i DNA và kéo dài chu i. M i F3 ti p t c đ n

và g n vào v trí F3c trên DNA khuôn, m t s i m i đ c t ng h p t m i F3 và thay th
cho s i t ng h p b i m i FIP. S i đ n t ng h p b ng m i FIP s b đ y ra và hình thành
nên m t c u trúc loop đ u 3’ c a nó (c u trúc 3). Quá trình s đ c ti p di n v i m i BIP
và m i B3. Cu i cùng m t s i đ n có c u trúc loop c hai đ u 3’ và 5’ đ c hình thành
(c u trúc 5).

- Khu ch đ i theo chu k : trong chu k LAMP, m i trong liên k t b sung
v i đo n loop trong s n ph m và b t đ u t ng h p s i DNA thay th , t o ra s i
DNA loop m i v i chi u dài g p đôi. Trong th i gian ng n, m i FIP liên k t v i
đo n loop c a s i đ n g c, t ng h p s i DNA thay th , phát hành s i t ng h p
tr c đó t o ra s i đ n có c u trúc loop đ u 3’ vì liên k t b sung gi a B1c và B1.
Sau đó, b t đ u t đ u 3’ c a B1, s t ng h p DNA b t đ u b ng cách s d ng c u
trúc c a b n thân nh là khn và gi i phóng s i b sung liên k t v i FIP, s i đ n
này có c u trúc gi ng qu t v i loop hai đ u do b sung gi a F1-F1c, B1-B1c.
H n n a, BIP liên k t v i B2c t ng h p s i thay th , gi i phóng s i DNA m i b i
B1. K t qu là t o ra các c u trúc có kích th c khác nhau, g m các trình t l p l i
luân phiên đ o ng c c a trình t đích trên các s i m i đ c t o thành. Ph n ng
theo chu k ti p t c v i s tích l y c a 109 b n sao c a DNA đích trong vịng ch a
đ y 1 gi .

9
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

S n ph m cu i cùng là các DNA m ch đơi có c u trúc g n gi ng súp l v i

r t nhi u loop đ c t o thành v i các trình t l p đi l p l i luân phiên đ o ng
trình t đích trong cùng m t s i (Hình 4).

Hình 4: B

c

c khu ch đ i theo chu k

S d ng c u trúc 5’ làm s i khuôn, DNA t m i đ c kh i đ u t đ u 3’ c a vùng
F1 và b t đ u kéo dài t m i FIP g n v i vùng F2c trong c u trúc loop. Qua m t vài b c,
c u trúc 7 s đ c hình thành là c u trúc b sung v i c u trúc 5. C u trúc 5 đ c hình
thành t c u trúc 8 trong ph n ng theo ki u hình thành c u trúc 5-7. C u trúc 9 và c u
trúc 10 đ c hình thành t c u trúc 6 và c u trúc 8, và các c u trúc kéo dài h n ti p t c
đ c t o thành.

1.2.3.4. DNA đích
Hi u qu c a ph n ng LAMP ph thu c vào kích th c c a DNA đích . K t
qu t t nh t là DNA đích có kích th c 130-200 bp. N u DNA đích dài h n 500bp
v n có th khu ch đ i đ c nh ng r t khó. Vì v y kích th
h n 300bp đã bao g m c F2 và B2 [20].

c DNA đích c n nh

1.2.3.5. Bst/Bsm DNA polymerase
Enzyme t o s
polymerase v i kh i l

khu ch đ i t t nh t cho ph n ng LAMP là Bst DNA
ng phân t 67000 dalton, th ng đ c mã hóa b i gen n m

trên nhi m s c th c a Bacillus stearothermophillus. Bst DNA polymerase là m t
DNA polymerase có ho t tính 5’-3’ polymerase và ho t tính t tách chu i cao
nh ng l i thi u ho t tính 3’-5’ exonuclease. Bst DNA polymerase có đ ho t đ ng
r t cao, ho t đ ng nhi t đ t i u 60ºC- 65ºC. B b t ho t nhi t đ l n h n
70ºC. Nó v a có kh n ng tách chu i, v a có kh n ng t ng h p chu i m i. Do đó
10
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
trong quá trình khu ch đ i DNA khơng c n thêm b

K53B-CNSH
c bi n tính DNA

nhi t đ

cao [16].
1.2.3.6. Betaine ( N,N,N- trimethylglycerine)
Trong các h th ng sinh h c, betaine ho t đ ng nh m t ch t đ c t bào t
t ng h p ho c l y t môi tr ng bên ngoài đ ch ng l i áp l c th m th u, h n hán,
đ m n cao ho c nhi t đ cao. Khi betaine tích t trong c th , nó giúp n đ nh c u
trúc b c 4 c a protein, n đ nh ch c n ng c a enzyme, n đ nh tính tồn v n c a
màng, cho phép gi n c trong t bào, do đó b o v t bào kh i nh ng nh h ng
c a s m t n c [32].
Glyceryl betaine (N,N,N- trimethylglycerine) là betaine đ c phát hi n đ u
tiên trong c c i đ ng th k 19. Tuy nhiên, đ i v i DNA thì betaine là ch t hóa
h c gây m t n đ nh xo n c a DNA (có th làm gi m s hình thành c u trúc th

c p trong trình t giàu GC), giúp DNA có th ch p nh n DNA polymerase bám vào,
đ c phát hi n đ nâng cao hi u qu khu ch đ i c a DNA trong ph n ng LAMP.
S có m t c a 0,5- 1,5 M betaine giúp gi m s ch ng chéo c a các baz , nh h ng
không ch đ n đ nh y c a ph n ng mà còn t ng m c tiêu ch n l c v i vi c gi m
đáng k trình t khơng liên quan [20,31].

Hình 5: C u trúc hóa h c c a trimethylglycerine
1.3. CÁC PH

NG PHÁP PHÁT HI N S N PH M C A PH N

NG

LAMP B NG M T TH
NG
1.3.1. i n di trên gel agarose
Phát hi n s n ph m khu ch đ i ban đ u đ c th c hi n nh ph ng pháp
ph bi n nh t là đi n di trên gel agarose, sau đó nhu m v i EtBr soi d i đi u ki n
ánh sáng UV, b ng DNA xu t hi n nh m t c u trúc gi ng Marker (thang chu n
DNA), kích th c s i c b n là b ng d i cùng.
Tuy nhiên, do kh i l ng s n ph m khu ch đ i c a ph n ng LAMP là r t
l n, khi m n p th c hi n các thao tác đi n di có th làm DNA bung ra ngồi
khu ch tán vào khơng khí.
ng n ch n ô nhi m chéo, ph ng pháp phát hi n s n
ph m khu ch đ i ngay trong ng mà không c n m n p đ c phát tri n. Nói chung,

11
Khóa lu n t t nghi p

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

quá trình khu ch đ i DNA nh DNA polymerase đi cùng v i vi c t o ra magie
pyrophosphate (Mg2P2O7), đ c t o ra do k t qu c a s k t h p gi a ion
pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng. M t
l ng l n DNA cao đ c t ng h p t ph n ng LAMP d n đ n đ ng th i s n xu t
m t l ng l n ion pyrophosphate. Ion pyrophosphate liên k t c c m nh v i các ion
kim lo i khác t o mu i không tan và có th quan sát đ c b ng m t th ng. Tuy
nhiên, các tín hi u này khá y u nên m t th ng khó phát hi n.
đ t hi u qu cao
h n, s n ph m khu ch đ i trong ng còn đ c phát hi n b ng cách nhu m tr c ti p
DNA s i đôi nh các thu c nhu m nh SYBR Green, PicoGreen…[18], trong đó
đ n gi n và d s d ng nh t là SYBR Green ho c phát hi n hu nh quang gián ti p
s n ph m LAMP trong ng nh vào s n ph m ph pyrophosphate b ng vi c s
d ng Calcein.
1.3.2. S d ng SYBR Green I
SYBR Green I k t h p v i DNA s i đơi thì phát quang, vì v y khi s n ph m
càng tích l y thì tín hi u hu nh quang càng t ng lên. Nh ng l i th c a SYBR
Green I là d s d ng và nh y c m. i m b t l i là SYBR Green I s ph n ng liên
k t v i b t kì DNA s i đơi nào, bao g m c dimer do m i sinh ra và các s n ph m
ph n ng không đ c hi u khác.

Hình 6: S ho t đ ng phát quang c a SYRB Green
M t khác, n u thêm SYBR Green I tr c ph n ng, do đ c tính liên k t ch t
v i DNA đơi, nó có th gây c ch ph n ng, nh ng n u m n p đ thêm SYBR
Green I vào sau khi ph n ng k t thúc l i gây ra nguy c ô nhi m chéo. Và cu i
cùng, SYBR Green I là hóa ch t đ t ti n khó đ c ng d ng m t cách r ng rãi nh

EtBr.
kh c ph c nh ng nh c đi m trên, h th ng phát hi n s n ph m khu ch
đ i c a ph n ng LAMP nh Calcein đ c phát tri n. ây là m t h th ng phát
hi n không ch đ n gi n, giá thành r , h u ích trong nghiên c u c b n v y h c,
d

c ph m, v sinh môi tr

ng, các th nghi m trong nơng nghi p…mà cịn gi m

12
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

nguy c ô nhi m không gian làm vi c, không c n thi t b chuyên d ng và gi m
thi u ngu n nhân l c.
1.3.3. S d ng Calcein
1.3.3.1. Cơng th c hóa h c và tính ch t c a Calcein
Calcein có cơng th c hóa h c C30H26N2O13 kh i l ng phân t 622,55 g/mol
v i tên qu c t là 8- [N, N- Bis (carboxymethyl) aminomethyl]- 4methylunbelliferone, có màu tr ng ho c màu vàng cam d ng b t.

Hình 7: C u trúc hóa h c c a Calcein
Calcein là m t ch th kim lo i hu nh quang đ c s d ng đ phát hi n m t
s kim lo i nh Ca2+, Mg2+. Nó hịa tan trong dung d ch ki m, nh ng ít tan trong
n c. H ng s phân ly proton c a nó đ c báo cáo là pKa1 = 2,45; pKa2 = 7,24 và

pKa3 = 11,3. Calcein phát x quang h c

b

c sóng ánh sáng t 495 đ n 515 nm

và c c đ i b c sóng 509 nm t i pH 7.4. S thay đ i màu s c c a ch th kim lo i
này có th đ c quan sát b ng m t th ng ho c d i tia UV. S phát quang c a
Calcein đ c d p t t b i các ion kim lo i nh Co2+, Ni2+ và Cu 2 +, Fe3+ và Mn2+.
Tuy nhiên, Calcein t o thành m t h p ch t phát hu nh quang m nh v i các kim lo i
ki m th [34].
Hi n nay s n ph m th ng m i ch a Calcein đang đ c s d ng ph bi n là
FDR (Flourescent dectection reagent) do công ty Eiken c a Nh t cung c p.
1.3.3.2. S phát quang c a Calcein
G n đây, Tomita và c ng s n m 2008 đã báo cáo m t ph n ng LAMP
đ c phát hi n b ng cách thêm Calcein và ion Mn2+ vào ph n ng. Calcein không
đ c h i nh nh ng thu c th hu nh quang khác nh SYBR Green, EtBr (do liên k t
v i DNA gây đ t bi n). Trong khi đó, k t qu quan sát tr c quan s thay đ i màu
s c mà không c n m n p ho c b t k thi t b phát hi n chuyên d ng nào.
H n h p Calcein và Mn2+ đ c thêm vào tr c ph n ng. Do s có m t c a
ion Mn2+, Calcein liên k t v i Mn2+ nên ph n ng phát hu nh quang c a Calcein b
d p t t (khơng phát quang), dung d ch có màu cam. N ng đ ion Mg2+ trong mơi

13
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
tr

ng dung d ch ban đ u không đ đ đ y đ

K53B-CNSH
c Mn2+ ra kh i Calcein khi khơng có

ion P2O74-. Khi ph n ng khu ch đ i DNA x y ra v i s có m t c a DNA đích:
2Mg2+ + P2O74- -> Mg2P2O7
Mn2+ + Mg2P2O7-> Mn2P2O7 + Mg2+
Mg2+ th ch c a Mn2+ trong Calcein và phát quang, dung d ch chuy n t
màu da cam ban đ u sang màu vàng chanh. Các m u âm khơng có DNA đích v n
gi màu da cam [29].

Hình 8: Nguyên t c c a vi c s d ng ion kim lo i phát quang (Calcein)
Trong quá trình khu ch đ i DNA nh DNA polymerase, ion pyrophosphate đ c
tao ra t dNTPs là s n ph m ph c a ph n ng. Calcein trong h n h p ph n ng ban đ u
k t h p v i Mn2+ làm cho s phát quang không di n ra. Khi s n ph m ph n ng đ c
khu ch đ i, pyrophosphate t c Mn2+ c a Calcein nh đó ion Mg2+ thay th vào v trí
Mn2+ d n đ n phát hu nh quang.

Hình 9: Phát hi n s n ph m LAMP b ng ch th kim lo i phát hu nh quang
Calcein d

i ánh sáng th

Ph n ng d

ng và d

i UV [22]

ng (bên trái) cho màu vàng chanh d i ánh sáng th ng và phát
quang m nh d i đi u ki n UV.
Ph n ng âm (bên ph i) cho màu da cam d i ánh sáng th ng và không phát
quang d i đi u ki n UV.

14
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

CH

K53B-CNSH

NG 2: V T LI U VẨ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1. V T LI U
2.1.1. M u DNA
DNA đã đ

c tinh s ch c a các ch ng vi khu n:

Edwardsiella ictaluri E7, E5, E40 đ

c phân l p t i Vi t Nam, E. ictaluri

ATCC 33202 (Ei), Edwardsiella tarda ATCC 15469 đ c cung c p b i Phòng K
thu t di truy n, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c và công ngh Vi t Nam.
Các ch ng vi sinh v t ki m đ nh: Vibrio sp., Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella typhimurium, Salmonella enteretidis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Proteus mirabilis, Aeromonas hydrophila, Enterococcus sp. đ c
cung c p b i Phòng K thu t di truy n, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c
và công ngh Vi t Nam.
2.1.2. Hóa ch t, enzyme, máy móc
Các hóa ch t dùng trong nghiên c u
+
m Tris HCl pH 8,8, acetic acid, EDTA, DMSO, KCl, MgSO4,
(NH4)2SO4, MnCl2 (MERK), Calcein, Triton 100X, Betaine, Agarose, dNTPs
(Fermentas), thang DNA chu n 100bp và 1kb (500µg/ml) (Fermentas), Ethidium
bromide (Sigma).
+ Các enzyme: Bst DNA polymerase (8000U/ml) (New England BioLabs),
enzyme gi i h n FastDigest Mnl I (Fermentas).
đ

+ Các m i đ khu ch đ i gen eip18: hai c p m i dùng đ nhân gen eip18 đã
c thi t k và đ c đ t t ng h p t i hãng Invitrogen, Anh (B ng 1).
Các thi t b dùng trong nghiên c u
ng Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml và 0,2 ml, máy ly tâm nh , máy spin, máy n

nhi t dùng n

c (

c), máy PCR 9700 (M ), máy đi n di, máy soi gel, l c vô

khu n 2 µm, b pipet, máy đo quang ph (Nh t)…

15
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

B ng 1: Danh sách các m i nhơn gen eip18 c a vi khu n E. ictaluri b ng
ph

ng pháp LAMP

Tên
m i

Lo i m i

Chi u dƠi m i
(nucleotide)

Trình t m i 5’-3’

F3

M i ngồi xi

18

TAAGACTCCAGCCCTCGG

18

ACTTTCCCTCGCTGGAAG

44 (F1c: 22, F2: 18)

CAGGAAACCATTGATTTCGCC

B3
FIP

M i ngồi ng

c

M i trong xi
F1c TTTT F2

BIP

M i trong ng

TTTT CCGCCTTACCGCTCTGAT
c

44 (B1c: 20, B2: 20)

B1c TTTT B2

CCAGAGGCCCCGGAGCAGTC
TTTTGCGTAAGTTCGCCTTCTGT

2.1.3. Các dung d ch hóa ch t c n chu n b
- Agarose 2%
- Dung d ch nhu m gel Ethidium bromide 0,5 µg/ml
- Dung d ch TAE 50x: 24,2 g Tris base; 5,71 ml acid acetic; 10 ml EDTA 0,5
M; ch nh pH = 8.
- Dung d ch Calcein:
B ng 2: ThƠnh ph n 10x Calcein LAMP buffer
ThƠnh ph n

N ng đ

Tris HCl pH 8.8

200mM

KCl

100 mM

(NH4)2SO4

100 mM

MnCl2

25 mM

Triton 100X

1%

+ Dung d ch Calcein 1.25 mM: B sung 125 µl Calcein 0.1 M vào 5 ml
Calcein LAMP buffer 2X, pha dung d ch thu đ c v i glycerol 80% t l 1:1 v th
tích. L c vơ khu n b ng gi ng l c 2 µm đ c dung d ch calcein 1.25 mM c n dùng,
b o qu n

-20ºC.
16
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

Buffer dùng cho ph n ng LAMP:

-

B ng 3: ThƠnh ph n 10x LAMP buffer ch y cho ph n ng LAMP v i
n ng đ MgSO4 thay đ i
ThƠnh ph n

N ng đ

Tris HCl pH 8.8

200mM

KCl

100 mM

(NH4)2SO4

100 mM

MgSO4

0, 10, 20- 100 mM

Triton 100X
H nh pđ
2.2. PH

1%

c l c vô khu n, gi

-20ºC.

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.2.1. Ph ng pháp LAMP
LAMP là ph n ng t t ng h p DNA có vịng loop khi có m t c a enzyme
Bst DNA polymerase

đi u ki n đ ng nhi t. Ph

ng pháp này s d ng 2 c p m i

khác nhau vì th s n ph m khu ch đ i r t đ c hi u.
Ph n ng LAMP đ c th c hi n th tích 25µl trong các ng eppendorf 0,2
ml, đ c b sung thêm thu c th Calcein đã liên k t v i Mn2+ vào h n h p ph n
ng LAMP. Thành ph n cho ph n ng LAMP đ

c th hi n trong b ng 4.

- H n h p thành ph n ph n ng (tr Bst DNA polymerase và DNA khuôn)
đ

c tr n đ u.
- Chia 23 µl h n h p trên vào các ng eppendorf 0,2ml.
- B sung 1 µl DNA khn, đ i ch ng âm DNA đ c thay th b ng n c.
- Thêm 1µl Bst DNA polymerase r i ch y chu trình nhi t nh sau: 60 phút

65oC, 10 phút

80ºC và k t thúc

22oC.

17

Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

B ng 4: ThƠnh ph n ph n ng LAMP 25 µl
ThƠnh ph n

Th tích (µl)

1

10X LAMP buffer

2,5

2

dNTP 25 mM

0,5

3

Betaine 5M

1

4

B3 2 µM

2

5

F3 2 µM

2

6

BIP 20 µM

0,8

7

FIP 20 µM

0,8

8

Calcein 1.25mM

1

9

H2 O

12,4

10

Bst DNA polymerase

1

11

DNA khn

1

i n di DNA
i n di s n ph m khu ch đ i c a ph n ng LAMP nh m so sánh v i k t qu
đ t đ c khi dùng ch th kim lo i phát hu nh quang Calcein, đ a ra kh ng đ nh v
đ nh y c a thu c th này.
C s lý thuy t: Ph ng pháp này d a trên m t đ c tính c a axit nucleic là

2.2.2.

pH trung tính mang đi n tích âm nh các nhóm phosphat n m trên khung
photphodieste c a các s i axit nucleic. i u đó có ngh a là các phân t s ch y v
c cd

ng khi đ

c đ t trong đi n tr

ng. K thu t này đ

c ti n hành trong m t

đ m gel agarose có tác d ng phân tách các axit nucleic theo kích th
nh sau:
- Chu n b khn và l p l

c có kích th

c và s l

c. Th c hi n

ng gi ng theo yêu c u.

- un tan 2,0 gam agarose trong 100 ml dung d ch đ m TAE 1X, đ vào
khuôn đã l p l c.
gel ngu i và n đ nh trong 30 phút. Sau đó rút l
trong máy đi n di, ng p trong dung d ch TAE 1X.

18
Khóa lu n t t nghi p

c và đ t t m gel vào

Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

- Tr n đ u dung d ch loading buffer 6x v i m u theo t l 1:6. Tra m u vào
gi ng.
- Ch y đi n di b ng dòng đi n m t chi u v i đi n th 100 V, c

ng đ dòng

đi n 80 mA trong 50 phút.
- Nhu m b n gel trong dung d ch EtBr (n ng đ 0,5 l/ml) 10-15 phút.
- Quan sát v ch DNA trên máy soi gel.
Chú ý: Khi đi n di c n ph i m n p ng, do đó kh n ng ô nhi m cao.
h n ch vi c nhi m vào m u khác, luôn luôn spin xu ng tr
n p nh nhàng trong th i gian ng n nh t có th .

c khi m n p, và m

2.2.3. C t DNA b ng enzyme gi i h n
Enzyme gi i h n là các nuclease n i bào có kh n ng nh n bi t các đo n
DNA v i các trình t nucleotide nh t đ nh, bám vào đo n DNA đó và c t c hai s i
c a phân t DNA. Các enzyme gi i h n th ng đ c s d ng đ c t DNA:
T o đ u b ng: Sma I, HinC II, EcoR V c t hai s i DNA t i cùng m t đi m
t o hai đ u b ng.
T o đ u so le: Bgl II, Kpn I và Mnl I c t theo v trí l ch nhau trên hai s i t o
các đ u dính b sung có th b t c p tr l i.

đây chúng tôi s d ng enzyme Mnl I nh n bi t và c t t i trình t CCTC
trên DNA đích.
Ph n ng c t DNA b ng enzyme gi i h n đ
10 µl. Thành ph n nh sau:
ThƠnh ph n
N

c ti n hành v i t ng th tích là

Th tích (µl)

c

6,8

Dung d ch đ m thích h p 10x

1

DNA (100 µg/ml)

2

Enzyme Mnl I (10u/µl)

H n h p ph n

ng đ

c tr n đ u,

(th ng 37ºC, 2 gi ). S n ph m ph n ng đ
agarose n ng đ thích h p.

19
Khóa lu n t t nghi p

0,2
nhi t đ và th i gian thích h p
c ki m tra b ng đi n di trên gel


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

2.2.4. Xác đ nh s có m t c a Mg2P2O7
Nguyên lý: S có m t c a Mg2P2O7 trong dung d ch ph n ng là k t qu c a
s k t h p gi a ion pyrophosphate t o ra t nguyên li u dNTP khi DNA đ c
khu ch đ i trong ph n ng LAMP và Mg2+ trong dung d ch ph n ng. Giá tr quang
h p th c a Mg2P2O7 b c sóng 400 nm là đ i l ng bi u th cho s có m t c a
Mg2P2O7, nói cách khác nó là giá tr bi u th s khu ch đ i DNA.
Ti n hành:
xác đ nh ph n ng có di n ra hay khơng, chúng tôi ti n hành
xác đ nh gián ti p s t o thành mu i Mg2P2O7 b ng ph ng pháp đo đ đ c: 25µl
c a ph n ng LAMP đ c pha loãng 5 l n chuy n 50µl h n h p sau ph n ng vào
cuvet. M u chu n là dung d ch h n h p tr c ph n ng. Sau đó đo OD400. L p l i
ba l n và l y k t qu trung bình.Giá tr OD400 thay đ i so v i đ i ch ng đ c xác
đ nh là có s t o thành k t t a làm t ng đ đ c c a dung d ch ph n ng đ ng ngh a

v i vi c DNA đã đ

c khu ch đ i trong ph n ng.

nh h ng c a n ng đ dNTP đ n ph n ng LAMP
Ph n ng LAMP th c hi n v i n ng đ dNTP cu i cùng trong m i ph n ng
thay đ i: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 mM.
i v i m i n ng đ dNTP, th c
hi n song song m t ph n ng khơng có DNA khuôn làm đ i ch ng.
2.2.5.

nh h ng c a n ng đ betaine đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ dNTP t i u đã xác đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c th c
hi n v i n ng đ betaine cu i cùng trong t ng ph n ng thay đ i: 0, 0,1, 0,2, 0,3,
0,4, 0,5, 0,6, 0,7 M.
i v i m i n ng đ betaine, th c hi n song song m t ph n

2.2.6.

ng không có DNA khn làm đ i ch ng.
2.2.7.

nh h ng c a t l m i ngoƠi vƠ m i trong đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ dNTP, betaine t i u đã xác đ nh đ c. Ph n ng LAMP

ti p t c đ

c th c hi n v i các m i có t l (m i ngồi:m i trong) là 1:1, 1:2, 1:3,

1:4, 1:5, 1:6, 1:7 1:8 đ c s d ng cho các ph n ng LAMP khu ch đ i đ c hi u

gen eip18. N ng đ m i ngồi có trong m i ph n ng là 0,16 µM.
iv im it l
m i, th c hi n song song m t ph n ng khơng có DNA khuôn làm đ i ch ng.
nh h ng c a n ng đ MgSO4 đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ betaine, dNTP và t l m i ngoài:m i trong t i u đã xác
đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c th c hi n v i n ng đ Mg2+ cu i cùng trong t ng
ph n ng thay đ i: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 mM.
i v i m i n ng đ Mg2+,
th c hi n song song m t ph n ng khơng có DNA khn làm đ i ch ng. Ph n ng
2.2.8.

20
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

K53B-CNSH

này có b sung Calcein trong thành ph n ph n ng đ nghiên c u nh h

ng c a

n ng đ Mg2+ t i s đ i màu c a Calcein.
nh h ng c a nhi t đ đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ Mg2+, dNTP, t l m i trong:m i ngoài và n ng đ betaine
t i u đã xác đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c th c hi n m t s nhi t đ khác
nhau, bao g m: 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 và 80oC. Xác đ nh b ng đi n di
2.2.9.

trên gel argarose và quan sát s đ i màu c a dung d ch sau ph n ng.
2.2.10. nh h ng c a th i gian ph n ng đ n ph n ng LAMP
S d ng n ng đ Mg2+, dNTP, t l m i trong:m i ngoài, n ng đ betaine và
nhi t đ ph n ng t i u đã xác đ nh đ c. Ph n ng LAMP đ c d ng l i m t
s th i đi m khác nhau, bao g m: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60
phút sau khi th c hi n ph n ng.
2.2.11. Gi i h n phát hi n c a ph n ng LAMP
N ng đ DNA ban đ u đ c xác đ nh và ti n hành pha loãng theo c s 10,
l y 1 µl DNA khn b sung vào 25 µl dung d ch ph n ng LAMP đ xác đ nh
ng ng n ng đ DNA mà ph n ng di n ra.
2.2.12.

đ c hi u c a ph n ng LAMP

Ti n hành ph n ng LAMP v i các m u DNA khuôn là genome đ c tách
chi t t các ch ng E. ictaluri và genome đ c tách chi t t các loài vi khu n đ c
s d ng làm đ i ch ng đã nói
LAMP.

ph n v t li u đ ki m tra đ đ c hi u c a ph n ng

21
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên

CH

K53B-CNSH

NG 3: K T QU VẨ TH O LU N

Chúng tôi ti n hành ph n ng LAMP v i 2 c p m i đ c thi t k đ c hi u
d a trên trình t c a gen eip18 c a vi khu n E. ictaluri. DNA khuôn là DNA
genome c a E. ictaluri E7 và m t s ch ng khác dùng làm đ i ch ng. Ph n ng
đ c ti n hành trong đi u ki n và thành ph n ph n ng đã đ
ph n ph ng pháp nghiên c u.
3.1. KHU CH

c trình bày trong

I GEN eip18

3.1.1. Khu ch đ i gen eip18 b ng ph
S d ng hai c p m i đ

ng pháp LAMP

c thi t k d a trên trình t gen eip18 có kích th

c

~ 500 bp chúng tôi s b khu ch đ i gen này. Ph n ng LAMP đ c th c hi n v i
DNA genome c a các ch ng nghiên c u, các thành ph n ph n ng và chu k nhi t
nh mô t
ph n v t li u và ph ng pháp. Phân tích s n ph m DNA c a ph n ng
b ng đi n di 3l s n ph m ph n ng LAMP trên gel agarose 2%.

ng th i xác

đ nh s có m t c a s n ph m ph ph n ng là Mg2P2O7 thông qua giá tr OD400.
OD400
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

A

Các loƠi vi khu n

B

Hình 10: A: S n ph m ph n ng LAMP khu ch đ i đo n gen eip18 đ c hi u
vi khu n E. ictaluri
M: Thang DNA chu n 1 kb
2:

1, 3, 4: E. ictaluri phân l p

i ch ng âm Aeromonas hydrophila

Vi t Nam

5: E. tarda ATTC 15469

6: E. ictaluri ATCC 33202 (Ei)
B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút
Hình 10B cho th y v i các m u d
t

ng tính thì xác đ nh đ

65oC

c giá tr OD400

ng ng v i s có m t c a Mg2P2O7 trong h n h p, đ ng ngh a v i vi c DNA
22
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
đ

c khu ch đ i. Ng

c l i, n u không xác đ nh đ

K53B-CNSH
c giá tr OD400 thì đ ng ngh a

v i DNA khơng đ c khu ch đ i. i u này đ c ch ng minh b ng ph

đi n di s n ph m ph n ng trên gel agarose hình 10A.

ng pháp

Nh v y, ch có s n ph m LAMP khu ch đ i t genome c a E. ictaluri m i
xu t hi n m t d i b ng DNA gi ng nh thang chu n DNA khi phân tích trên gel
agarose 2% (đ ng ch y 1, 3, 4). B ng DNA c s có kích th c 230 bp. Còn
đ ng ch y 2 và 5 không xu t hi n b ng DNA nào t ng ng v i vi c không xác
đ nh đ c giá tr OD400 khi k t thúc ph n ng sau 60 phút 65oC, đi u đó ch ng t
khơng có đo n DNA nào đ c khu ch đ i. T k t qu này có th k t lu n r ng ph n
ng LAMP s d ng c p m i chúng tôi thi t k đã khu ch đ i đ c gen eip18. M c
dù gen này có đ t ng đ ng khá cao, t i kho ng 80% v i gen evpC c a ch ng
E.tarda [11]. Tuy nhiên, d a trên nh ng đo n trình t có đ t ng đ ng th p đ
thi t k nh ng m i trong và ngoài khu ch đ i DNA theo ph ng pháp LAMP. K t
qu trên xác nh n r ng các m i đ c thi t k là hoàn toàn đ c hi u cho E. ictaluri.
S d ng các m i này chúng ta hoàn toàn có th xác nh n đ
trên cá tra Vi t Nam Pangasius hyphophthalmus.

c tác nhân gây b nh

3.1.2. C t ki m tra s n ph m ph n ng LAMP b ng enzyme gi i h n
ch ng minh đo n gen đ

c khu ch đ i đúng là gen eip18 c a vi khu n E.

ictaluri chúng tôi d a vào m t s trình t nh n bi t c a enzyme gi i h n trong đo n
eip18. Enzyme Mnl I có kh n ng nh n bi t m t đo n trình t 4 nucleotit n m 2
v trí th 218/217 và 320/319 n m trong đo n c s B2F2 nên s n ph m c t s là
m t đo n có kích th c 102 bp. K t qu
hình 11 hồn tồn có th kh ng đ nh

đ c s n ph m khu ch đ i b ng ph ng pháp LAMP v i c p m i đ c thi t k là
hồn tồn chính xác.

Hình 11: C t s n ph m LAMP b ng enzyme Mnl I
M: marker 100bp; 1,3: s n ph m LAMP c t b ng Mnl I; 2: s n ph m LAMP khơng c t

23
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
3.2. NH H

NG C A CÁC Y U T

K53B-CNSH
LÊN PH N

NG LAMP VẨ S

I

MẨU C A THU C TH CALCEIN
3.2.1. nh h ng c a n ng đ dNTP
dNTP là ngun li u chính cho q trình sao chép DNA. Innis và c ng s .
(1988) đã cơng b r ng n ng đ dNTP có nh h ng đ n đ đ c hi u c a quá trình
khu ch đ i DNA s d ng DNA polymerase. N ng đ dNTP cu i cùng l n l t đi t
0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 mM đ c ki m tra đ tìm n ng đ t i u. Song
song v i m i n ng đ dNTP, th c hi n m t ph n ng khơng có DNA làm đ i

ch ng.

OD400
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

B

0 (-) 0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5 0.6 0.6 0.7 0.7
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)
N ng đ dNTP (mM)

Hình 12: nh h ng c a n ng đ dNTP đ n ph n ng LAMP
A: K t qu đi n di trên gel agarose, nhu m EtBr và soi d i tia UV
B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút

65oC

1-2: 0 mM; 3-4: 0,1 mM; 5-6: 0,2 mM; 7-8: 0,3 mM; 9-10: 0,4 mM;
11-12: 0,5 mM; 13-14: 0,6 mM; 15-16: 0,7 mM. Các đ ng ch y l là
đ i ch ng không có DNA. M: marker 100 bp
K t qu thu đ c cho th y r ng các đ ng ch y s 8, 10, 12, 14, 16 đã xu t
hi n s n ph m ph n ng LAMP phân b gi ng nh thang DNA nh ng l ng DNA
đ
đ

c khu ch đ i trong các ph n r t khác nhau. DNA đ c khu ch đ i nhi u nh t
ng ch y s 16, t ng đ ng v i n ng đ dNTP là 0,7 mM (Hình 12A).

24
Khóa lu n t t nghi p


Nguy n Th Nga
– Tr ng i h c Khoa h c t nhiên
T

K53B-CNSH

ng t k t qu đo đ đ c t i OD400 cho th y

các ph n ng d

ng, giá tr

OD400 b t đ u đ c xác đ nh 0,3 mM, t ng d n khi dNTP t ng lên 0,7 mM và k t
qu n đ nh h n b t đ u n ng đ 0,5 mM. N ng đ dNTP này th p h n r t nhi u
so v i các công b v vi c s d ng dNTP 1 mM đ khu ch đ i gen đ c tr ng c a vi
khu n nh ph ng pháp LAMP [13,26]. Do v y, n ng đ dNTP 0,5 mM đ c ch n
đ s d ng cho các nghiên c u ti p theo.
3.2.2.

nh h ng c a n ng đ Betaine
N m 2005, Yeh và c ng s đã cơng b khi t ng n ng đ Betaine thì l

ng

s n ph m ph n ng LAMP c ng t ng. S d ng n ng đ dNTP t i u là 0,5 mM,
ph n ng LAMP đ c th c hi n v i n ng đ Betaine cu i cùng trong t ng ph n
ng thay đ i: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 M.
i v i m i n ng đ Betaine,
th c hi n song song m t ph n ng khơng có DNA khuôn làm đ i ch ng.

A
OD400
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

B

0 (- 0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5 0.6 0.6 0.7 0.7
) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)
N ng đ Betain (M)

Hình 13: nh h

ng n ng đ Betaine đ n ph n ng LAMP

A: K t qu đi n di trên gel agarose, nhu m EtBr và soi d i tia UV

B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 65oC
1-2: 0 M; 3-4: 0,1 M; 5-6: 0,2 M; 7-8: 0,3 M; 9-10: 0,4 M; 11-12: 0,5 M;
13-14: 0,6 M; 15-16: 0,7 M. Các đ
DNA. M: marker 100 bp
25
Khóa lu n t t nghi p

ng ch y l là đ i ch ng khơng có