Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƢNG

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hƣng đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
đƣợc học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá

trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá
K24, đặc biệt là những ngƣời bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ
những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015
Học viên

Vũ Anh Phƣơng

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Tổ ng quan về paraquat ......................................................................................3
1.1.1. Công thức paraquat.....................................................................................3
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat .............................................................3
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat ......................................................................4
1.1.4. Dƣợc động học paraquat ............................................................................6
1.1.4.1. Hấp thu .................................................................................................6
1.1.4.2. Phân bố .................................................................................................6
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ .............................................................................7
1.1.5. Tiên lƣợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tƣơng. .......7
1.2. Các phƣơng pháp xác định paraquat trong huyết tƣơng ...................................9
1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ .............................................................................9

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................10
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ..........................................................11
1.2.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................13
1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu huyết tƣơng phân tích Paraquat ........................15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................19
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị..........................................................................19
2.2.1 Chất chuẩn .................................................................................................19
2.2.2 Hoá chất .....................................................................................................19
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................21
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng paraquat. .............................21
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn...........................................................................21
2.3.1.2. Phƣơng pháp tách PQ từ huyết tƣơng ................................................21

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


2.3.1.3. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lƣợng PQ trong huyết
tƣơng ...............................................................................................................21
2.3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích PQ trong huyết tƣơng...........................22
2.3.2.1. Tính chọn lọc .....................................................................................22
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính ................................................................23
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ........................................23
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại) .....................23
2.3.2.5. Độ ổn định..........................................................................................23
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên
lƣợng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ.........................24

2.3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................24
2.3.3.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân ...........................................................24
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................26
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao ..............................26
3.1.1. Xác định bƣớc sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD.............26
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích mẫu tiêm vào cột..................................26
3.1.3. Khảo sát lựa chọn loại pha động ..............................................................28
3.1.4. Khảo sát thành phần pha động .................................................................29
“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu. .....................31
3.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng pH của pha đô ̣ng ......................................................31
“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu. .....................33
3.1.6. Khảo sát thành phần dung dịch đệm ........................................................33
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ natriheptanesulfonate ...................33
3.1.6.2. Ảnh hƣởng của nồng độ KCl .............................................................35
3.1.6.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ PEG ...............................................36
“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu. .....................37
3.1.7. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng .......................................................37
3.1.8. Đƣờng chuẩn, giới ha ̣n phát hiê ̣n và giới ha ̣n đinh
̣ lƣơ ̣ng. .......................39
3.1.8.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ......................................................................39

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


3.1.8.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ........................................42
3.1.8.3. Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn ................................................43
3.2. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu ...................................................................46
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch TCA ............................................................46

3.2.2. Khảo sát thời gian lắc xoáy ......................................................................48
3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích ...........................................................50
3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp ....................................................51
3.3.1. Đánh giá đô ̣ cho ̣n lo ̣c ................................................................................51
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp .........................................................51
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp ...............................................51
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp phân tích ..................................52
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại ...............................................................53
3.3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị ..........................................................53
3.3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phƣơng
pháp phân tích ................................................................................................55
3.3.3 Độ ổn định .................................................................................................57
Độ ổn định trong thời gian phân tích ..............................................................58
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng
bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ..........................................58
3.4.1. Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: ...................................................58
3.4.2. Nồng độ Paraquat huyết tƣơng trong tiên lƣợng bệnh nhân và đánh giá
hiệu quả lọc máu hấp phụ ........................................................................60
KẾT LUẬN ...............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thể tić h bơm mẫu ............................................................27
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của tỉ lê ̣ pha đô ̣ng t ới độ phân cực, thời gian lƣu, hệ số đối
xứng pic .....................................................................................................................31

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của pH tới thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic .........................32
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ natriheptanesulfonate đ ến thời gian lƣu, hệ số đối
xứng pic .....................................................................................................................34
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ KCl đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic. ...35
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ PEG đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic. ..37
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của tố c đô ̣ dòng đến thời gian lƣu và hệ số đối xứng pic ......38
Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ ............................................40
Bảng 3.9: Giới ha ̣n phát hiê ̣n và giới ha ̣n đinh
̣ lƣơng của PQ .................................43
Bảng 3.10: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ.
...................................................................................................................................44
Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phƣơng trình đƣờng chuẩn của PQ .45
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của nồ ng đô ̣ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tƣơng
...................................................................................................................................48
Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết ...........................48
Bảng 3.14: Kế t quả xác định độ ổn định khác ngày .................................................50
Bảng 3.15: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phƣơng pháp phân tích PQ .52
Bảng 3.16: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyế t tƣơng thêm chuẩn ...................52
Bảng 3.17: Các đại lƣợng thống kê ...........................................................................53
Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lƣu và diện tích pic của các chất .............................54
Bảng 3.19: Kết quả hàm lƣợng PQ tìm lại đƣợc bằng phƣơng pháp thêm chuẩn của
3 kỹ thuật viên khác nhau..........................................................................................55
Bảng 3.20: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích tiến
hành bởi ba KTV khác nhau .....................................................................................56
Bảng 3.21: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phƣơng pháp phân tích ..................57

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên

Bảng 3.22: Kế t quả xác đinh
̣ đô ̣ ổ n đinh
̣ trong ngày .................................................58
Bảng 3.23: Thời gian tƣ̀ lúc uố ng đế n khi lấy mẫu xét nghiệm ................................60
Bảng 3.24: Kết quả định lƣợng PQ trên 31 bệnh nhân .............................................61
Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tƣơng sau lọc máu hấp phụ ..............65

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH HÌNH
Chƣơng 1.
Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat .................................................................3
Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15] ...............................................................4
Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tƣơng (µg/ml), thời gian
sau uống, và khả năng sống.........................................................................................8
Chƣơng 3.
Hình 3.1: Phổ hấ p thu ̣ UV của PQ ............................................................................26
Hình 3.2: Sắ c đồ khảo sát thể tích bơm mẫu .............................................................27
Hình 3.3: Sắ c đồ phân tích PQ với hê ̣ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trong
nƣớc và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) ..............28
Hình 3.4: Sắ c đồ phân tích PQ với hê ̣ dung môi B ...................................................29
Hình 3.5: Sắ c đồ phân tích PQ với hê ̣ dung môi C ...................................................29
Hình 3.6: Sắ c ký đồ khảo sát tỉ lê ̣ pha đô ̣ng ACN : Đê ̣m %v/v ................................30
Hình 3.7: Sắ c đồ khảo sát ảnh hƣởng của pH ...........................................................32
Hình 3.8: Sắ c đồ khảo sát nồ ng đô ̣ của natriheptanesulfonate trong đê ̣m pH 2,5 ....34
Hình 3.9: Sắ c đồ của PQ khi thay đổi nồ ng đô ̣ của KCl trong pha động. ................35

Hình 3.10: Sắ c đồ của PQ khi thay đổi nồ ng đô ̣ của PEG trong pha động...............37
Hình 3.11: Sắ c đồ khảo sát tố c đô ̣ dòng ....................................................................38
Hình 3.12: Sắ c ký đồ các nồ ng đô ̣ PQ khác nhau tƣ̀ 0,02 – 10,00 µg/ml .................40
Hình 3.13: Đƣờng chuẩn PQ theo diện tích pic ........................................................41
Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tƣơng...................................49
Hình 3.15: Sắ c ký đồ PQ trong huyế t tƣơng chuẩ n áp du ̣ng quy trin
̀ h xƣ̉ lý mẫu
hình 3.14 ...................................................................................................................50
Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ của phƣơng pháp ..........................................................51
Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi ......................................58
Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp...................................59
Hình 3.19: Kết quả bệnh nhân ngộ độc Paraquat .....................................................60

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


Hình 3.20: Kết quả định lƣợng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân sống và tử vong. 63
Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP ở bệnh nhân sống và tử vong. ....................................64
Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lƣợng tử vong .....................................................65

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

% Relative standard deviation

% Độ lệch chuẩn tƣơng đối

% Reproducibility standard

% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation

tƣơng đối

Acetonitrile

Acetonitril

Asymmetry factor

Hệ số đối xứng pic

ATP

Adenosin Triphophate

Adenosin Triphophat

BN

Patient

Bệnh nhân

diode-array detector

detector mảng diode

DQ

Diquat

Diquat

EPQ

Ethylparaquat

Ethylparaquat

% RSD
% RSDR
ACN
AS

DAD

GC - MS

HP
HPLC

LC - MS

Gas chromatography - Mass
spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lƣợng

Methanol

Methanol

ppm

Parts per million

Phần triệu

PQ

Paraquat

Paraquat

Relative coefficient

Hệ số tƣơng quan

Receiver operating characteristics

Đƣờng cong ROC

Reverse phase-HPLC

Sắc ký lỏng pha đảo

MeOH

R
ROC
RP-HPLC

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


Tên viết tắt
SD
SIPP
TCA
tR
UV-VIS

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

Severity Index of Paraquat

Chỉ số độ nặng của ngộ độc

Poisoning

Paraquat

Trichloroacetic acid

Acid Tricloacetic

Retention time

Thời gian lƣu

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại và khả kiến

Trường ĐHKH Tự nhiên


ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viế t tắ t của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ

giá

thành rẻ , hiệu quả diê ̣t cỏ da ̣i nhanh chóng , ít ảnh hƣởng tới môi trƣờng do đó hiện
đang đƣợc sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Tuy
nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng đô ̣c với ngƣời. Liều tử vong của
PQ ƣớc tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tại nhiều nƣớc phát triển, PQ đã bi ̣cấ m
sƣ̉ du ̣ng nhƣng ở Viê ̣t Nam viê ̣c thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sƣ̉ du ̣ng hóa
chấ t này nên trong những năm vừa qua có rấ t nhiề u trƣờng hơ ̣p ngô ̣ đô ̣c PQ đến cấp

cứu [1]. Trên thế giới, nhiề u ca tƣ̉ vong do ngộ đô ̣c PQ đã đƣơ ̣c báo cáo [10][19][27].
Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lƣợng
bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm
trọng, vƣợt ngƣỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Tỉ lệ tử vong
do ngô ̣ đô ̣c PQ rấ t cao, thƣờng khoảng 70-80% theo nhiề u nghiên cứu của các tác giả
nƣớc ngoài [29][32]. Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bê ̣nh viê ̣n Ba ̣ch Mai, tỉ lệ tƣ̉
vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu ta ̣i bê ̣nh viê ̣n Chơ ̣
Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lƣợng PQ
trong huyết tƣơng đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên lƣợng bệnh nhân cũng nhƣ đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu
các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nƣớc
ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc
máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cƣờng đào thải PQ cho
kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét
nghiệm định lƣợng nồng độ PQ huyết tƣơng cung cấp công cụ quan trọng để đánh
giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ
định tính trong nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Vũ Anh Phương

1

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ mà chƣa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lƣợng nồng độ PQ
máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn

đoán, tiên lƣợng cũng nhƣ đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho
việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên
cả nƣớc gặp rất nhiều khó khăn.
Để định lƣợng PQ trong huyết tƣơng trên thế giới đã áp dụng các phƣơng
pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS)... Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhƣng cũng chƣa có quy trình
chuẩn định lƣợng PQ huyết tƣơng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu định lƣợng Paraquat trong mẫu huyết tƣơng ngƣời bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người
và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.
2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat
trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc
bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

Vũ Anh Phương

2

Trường ĐHKH Tự nhiên


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổ ng quan về paraquat
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính
diệt cỏ nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,
đƣợc tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc
trừ cỏ từ những năm 1950 [42].

PQ có khối lƣợng phân tử tƣơng đối 186,2 có công thức hóa học nhƣ hình
1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ thƣờng có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ
trong nƣớc 6,5 - 7,5.
PQ thƣờng ở d ạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh
thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trƣờng
acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trƣờng kiềm.
PQ tan tốt trong nƣớc (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu nhƣ
không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dƣới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề
mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

3

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ đƣợc sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thƣơng ma ̣i và
hàm lƣợng khác nhau, nói chung thƣờng đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số
tên gọi thƣờng gặp của PQ nhƣ: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,
Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nƣớc phát triển đều đã cấm
sử dụng PQ nhƣ là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nƣớc Châu Âu).
Một số nƣớc nhƣ Nhật Bản chỉ cho phép lƣu hành PQ dạng dung dịch với hàm

lƣợng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên
thế giới vẫn có gần 130 nƣớc cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].
Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ đƣợc lƣu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ
ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nƣớc
họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nƣớc
thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ đƣợc mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15]

Vũ Anh Phương

4

Trường ĐHKH Tự nhiên


Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải qua
một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu nhƣ
ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu
trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và
không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản
thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do
hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử
tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thƣơng tế bào: phản ứng
với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho
tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].

Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự
do khác) là đối tƣợng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào
việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất nhƣ desferioxamin, superoxid dismutase,
α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cƣỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện
nay không có chất nào trong số này đƣợc khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn
chƣa đƣợc biết nhƣng những gì ngƣời ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tƣơng tác
giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho
việc hình thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong
việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thƣơng giống nhƣ kiềm khi tiếp xúc với da,
mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là
đƣờng tiêu hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thƣơng nặng nề do tác dụng ăn
mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan
đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng
ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo
cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thƣơng hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có
liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

5

Trường ĐHKH Tự nhiên


hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thƣơng đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nhƣ tổn thƣơng phổi gây suy hô hấp, suy thận,
viêm gan, loét niêm mạc đƣờng tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].

Viê ̣c tiế p xúc với lƣơ ̣ng PQ ít hơn sẽ làm châ ̣m nguy cơ tƣ̉ vong do xơ phổ i tiế n
triể n và suy thâ ̣n [33]. Mô ̣t số nghiên cƣ́u gầ n đây còn cho thấ y phơi nhiễm PQ có
liên quan với hô ̣i chƣ́ng Parkinson [21][23].
Trong ngô ̣ đô ̣c cấ p PQ , có thể tiên lƣợng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong
huyế t tƣơng. Mô ̣t số báo cáo cho thấ y nồ ng đô ̣ PQ huyế t tƣơng vƣơ ṭ qua 2 µg/ml thì
hầ u hế t tƣ̉ vong, tuy nhiên mô ̣t vài trƣờng hơ ̣p bê ̣nh nhân vẫn hồ i phu ̣c khi nồ ng đô ̣
trong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22].
1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đƣờng tiêu hoá PQ đƣợc hấp thu rất nhanh nhƣng ít (5-10%). Hấp thu chủ
yếu ở ruột non. Khi dạ dày ruột bị tổn thƣơng lan rộng, số lƣợng chất độc đƣợc hấp
thu sẽ tăng lên. PQ không gắn với protein huyết tƣơng. Nồng độ đỉnh của PQ trong
huyết tƣơng đạt đƣợc trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu
vào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thƣơng. Tiếp xúc
với PQ qua đƣờng hô hấp không làm cho lƣợng PQ đƣợc hấp thu đến mức đủ để
gây nhiễm độc. Bởi vì kích thƣớc các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm
cho PQ không đi sâu đƣợc xuống đƣờng hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với
PQ sẽ bị tổn thƣơng, nhƣng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố
Sau khi uố ng, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tấ t cả các cơ quan chính nhƣ
phổi, thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi , PQ sẽ bi ̣khƣ̉ thành da ̣ng gố c tƣ̣ do hoa ̣t tin
́ h
cao [8][22]. Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đạt đƣợc nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi
có thể cao hơn so với nồng độ huyết tƣơng gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ
PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lƣợng PQ huyết tƣơng cũng cần đạt
đến một ngƣỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11].

Vũ Anh Phương

6

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ qua đƣợc nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và
máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai
nào sống sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không
nguy hiểm đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ đƣợc đào thải hầu nhƣ hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu
thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên
90% PQ đƣợc đào thải dƣới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình
thƣờng [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nƣớc tiểu vài ngày sau do
có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dƣới dạng
không đổ i [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lƣợng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tƣơng theo
thời gian. Nồng độ PQ phải đo trƣớc khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm
giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lƣợng khả năng sống từ kết quả định lƣợng nồng
độ PQ huyết tƣơng tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN
sống có nồng độ dƣới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tƣơng ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24
giờ sau uống PQ. Schermann và cộng sự [35] mở rộng đƣờng cong tiên lƣợng BN
này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng
độ PQ huyết tƣơng trên 10 mg/l (định lƣợng trong vòng 8 giờ), thƣờng chết vì sốc
tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhƣng vẫn trên đƣờng tiên
lƣợng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự
(1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann
(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lƣợng

chính xác 101 trong 102 trƣờng hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống đƣợc đánh giá
trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ
nặng và tiên lƣợng tử vong nếu định lƣợng đƣợc PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng

Vũ Anh Phương

7

Trường ĐHKH Tự nhiên


đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ƣớc tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc
biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tƣơng giảm nhanh sai số về thời gian
thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lƣợng.
Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tƣơng có thể không hoàn toàn chính xác vì đƣợc
phân tích bằng một số phƣơng pháp khác nhau và các nghiên cứu thƣờng không
trình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa
các bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này
chƣa đƣợc nghiên cứu.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tƣơng (µg/ml), thời gian
sau uống, và khả năng sống.
Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lƣợng ngộ độc PQ
dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN
sống. Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính
bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ
huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử
vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP <50) với tử vong sớm do suy tuần hoàn

Vũ Anh Phương

8

Trường ĐHKH Tự nhiên


(SIPP > 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định
lƣợng dùng huyết thanh không phải huyết tƣơng. Suzuki và cộng sự (1991) đã so
sánh SIPP với đồ thị tiên lƣợng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau
uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1
trƣờng hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10
trƣờng hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận
rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên
lƣợng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phƣơng pháp xác định paraquat trong huyết tƣơng
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lƣợng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trƣờng kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,
có thể chiết đƣợc bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định
lƣợng PQ trong huyết tƣơng dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với
Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ƣu điểm của phƣơng pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều
kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và
không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định
luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó,
phƣơng pháp sử dụng TBPE thì mẫu đƣợc phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2

phƣơng pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato
K. [20] lại định lƣợng đồng thời cả PQ và DQ.
Phƣơng pháp định lƣợng PQ bằng NaBH4 đã loại đƣợc sự ảnh hƣởng của các
thuốc trừ sâu thông thƣờng và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ,
sẽ gây ảnh hƣởng khi định lƣợng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm
NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại nhƣ Fe3+ và Al3+, có
thể ảnh hƣởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%

Vũ Anh Phương

9

Trường ĐHKH Tự nhiên


trƣớc khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết
đƣợc với TBPE trong dichloromethane cũng giống nhƣ PQ nhƣng PQ-TBPE có
quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bƣớc sóng 603
nm & DQ ở bƣớc sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới hạn phát
hiện 4,77.10-7 M.
Phƣơng pháp định lƣợng PQ bằng NaBH4 đã đƣợc ứng dụng để định lƣợng
PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nhƣ máu, nƣớc tiểu, sữa mẹ cũng nhƣ các mẫu
thực phẩm và các mẫu trong môi trƣờng.
Với phƣơng pháp đo quang phổ thông thƣờng, không phát hiện đƣợc PQ tại
bƣớc sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lƣợng nồng độ PQ
trong huyết tƣơng dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật
Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nƣớc chuẩn PQ 10 μg/ml đƣợc quét bƣớc
sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nƣớc cất. Huyết tƣơng sạch và các dung
dịch huyết tƣơng chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml đƣợc thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v).
Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét

bƣớc sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu nhƣ trên, dịch trong phần trên
đƣợc chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trƣớc khi đo, 400
μl mẫu đƣợc lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích
Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tƣơng tự với mẫu huyết tƣơng trắng đối chiếu và
đo độ hấp thụ quang trong khoảng bƣớc sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bƣớc
sóng Δλ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể đƣợc tính toán theo công thức
Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bƣớc sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phƣơng pháp GC-MS là phƣơng pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,
từ lâu đã đƣợc sử dụng để định lƣợng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và
Almeida R. M. [5] cùng sử dụng phƣơng pháp GC-MS để định lƣợng PQ. Trong cả
hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He đƣợc dùng nhƣ là khí mang để đƣa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐHKH Tự nhiên


phân tích đều đƣợc khử bằng NaBH4 trƣớc khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m × 0,18 mm,
độ dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lƣợt là
280, 280, 200oC. Khí mang đƣợc bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu
đƣợc đƣa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là
70oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC đƣợc
duy trì trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 đƣợc dùng để định lƣợng

PQ & EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nƣớc tiểu lần lƣợt là 94,00 - 99,85% và
95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là
0,01 µg/ml đối với cả máu và nƣớc tiểu. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng để phân
tích các mẫu sinh học thu đƣợc từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972)
với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1
µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ
phận ghép nối giữa GC và MS) là 270oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt
độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến
270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion đƣợc chọn cho các
hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220
(EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 đƣợc dùng để định lƣợng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P. đều định lƣợng PQ trong mẫu sinh
học bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41].
ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột
ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30oC. Còn Proenca P. sử
dùng hệ thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 ×
2,1 mm × 5 µm). Nhiệt độ cột duy trì 35oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector mảng

Vũ Anh Phương

11

Trường ĐHKH Tự nhiên


photodiode Water 996 hoạt động từ bƣớc sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV đƣợc đo ở 258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.

Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH
3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc
độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20%
trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng
thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và
đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc
độ 300 µl/phút.
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dƣơng để ion hóa PQ và
chuẩn nội nhƣng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY
BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ƣu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm
dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250
mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h
ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lƣợng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản
phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản
phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) đƣợc thực hiện trên máy
khối phổ tƣ́ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lƣợng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)
0,1s. Đƣờng chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu
(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nƣớc
tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và

Vũ Anh Phương

12

Trường ĐHKH Tự nhiên


nƣớc tiểu lần lƣợt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định
lƣợng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nƣớc tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lƣu
với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phƣơng pháp HPLC để định lƣợng PQ trong
dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và
tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. Bƣớc sóng hoạt động là 230 nm.
Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thƣớc hạt 5
µm) với cột bảo vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích thƣớc hạt 5 µm). Pha
động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nƣớc (dung dịch A) và dung
dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1 ml/phút.
Chạy pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15
phút. Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện ban đầu trong 5 phút trƣớc khi
chuyển sang chạy mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của phƣơng pháp trong máu
và nƣớc tiểu lần lƣợt là 63 và 32 µg/l.
Paixão P. [26] định lƣợng PQ trong huyết thanh và huyết tƣơng ngƣời đƣợc
làm đơn giản và nhanh bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu
model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS. Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar
C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn
đƣợc rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bƣớc sóng hấp thụ 258 nm.
Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong
900 ml nƣớc khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile
nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lƣu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.
Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lƣợng (LOQ) 0,4 µg/ml trong
huyết tƣơng và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vƣợt quá 3,5%; 3,2% đối

Vũ Anh Phương

13

Trường ĐHKH Tự nhiên


với huyết tƣơng, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vƣợt quá 4,7%; 3,1%
đối với huyết tƣơng, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tƣơng và huyết thanh lần
lƣợt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lƣợng đồng thời PQ và DQ trong huyết tƣơng bằng
phƣơng pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm
mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS đƣợc tách trên cột pha đảo Capcell PaK
C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung
dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và
sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC đƣợc trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp đƣợc dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và đƣợc làm ấm trong bể
nƣớc SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bƣớc sóng 391 nm bằng
detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic đƣợc dùng để định lƣợng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tƣơng.
Định lƣợng PQ trong huyết tƣơng sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
cặp ion đã đƣợc Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký đƣợc sử dụng có 2
bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model
64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100
hoặc 200 µl để đƣa mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm đƣợc lấp đầy các
hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thƣớc hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18
(25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lƣợt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột

phân tích đƣợc gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne đƣợc điều khiển bằng bơm 2
nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bƣớc sóng 258 nm với
flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Các pha động:

Vũ Anh Phương

14

Trường ĐHKH Tự nhiên