Định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat trong viên nén antigrip f bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘY TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ỉỊc ĩỊí ỳ ĩj? ĩjí
NGUYỄN THỊ HƯỚNG
ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL
VÀ QUININ SULFAT TRONG VIÊN NÉN
ANTIGRIP F BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn:
Nơi thực hiện:
Thời gian thực hiện:
TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN
PHÒNG HOÁ LÝ I - VIỆN KIEM n g h iệ m
BỘ MÔN HOÁ DƯỢC - ĐẠI HỌC DƯỢC HN
2/2003 ĐẾN 5/2003
Hà Nội 5-2003
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá Lý 1-Viện
Kiểm nghiệm và Bộ môn Hoá Dược-Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự
hướng dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, cán bộ của phòng Hoá Lýl-
Viện Kiểm nghiệm , các cán bộ của bộ môn hoá dược
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tân tình của TS.
Thái Phan Quỳnh Như-Trưởng phòng Hoá Lý 1-Viện Kiểm nghiệm và TS.
Thái Duy Thìn -Bộ môn Hoá Dược -Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp tôi
có những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hiện khoá luận.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các kỹ
thuật viên khác trong bộ môn Hoá Dược và các cán bộ phòng Hoá Lý 1 -Viện
Kiểm nghiệm đã giúp tôi hoàn thành khóa luận của mình trong thời gian ngắn

nhất.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội
đã cung cấp những tài liệu có liên quan.
Hà nội, tháng 5 năm 2003
Nguyễn Thị Hướng
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ 1
Phần 1: TỔNG QUAN
3
1.1. Paracetamol 3
1.2. Quinin sulfat 5
1.3. Phương pháp khảo sát trong khoá luận (HPLC)

6
Phần 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
16
2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ 16
2.2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 16
2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 20
2.3.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký 20
2.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất:
paracetamol và quinin sulfat 25
2.3.3. Khảo sát độ chính xác
.
28
2.3.4. Khảo sát độ đúng 31
2 .3 .5 . ứng dụng phương pháp để định lượng đồng thời paracetamol và quinin
sulfat trong viên nén Antigrip F 32
2.4. SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

34
2.5. BÀN LUẬN 36
Phần 3: KÊT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
NHỮNG CHỮ VIẾT TAT
CTD-VTYT
: Công ty Dược - Vật tư y tế.
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
nm
: Nanomet.
|um
: Micromet.
III
: Microlit.
: Microgam.
PA
: Tinh khiết phân tích (pure analysis).
SKĐ
: Sắc ký đồ.
UV-VIS
: Tử ngoại - khả kiến
ĐẶT VÂN ĐỂ
•
Với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là cá<
thành tựu khoa học của ngành dược, các dạng bào chế đa thành phần nhằn
phối hợp tác dụng dược lý giữa các hoạt chất ngày càng được sản xuất, lưi
hành, sử dụng rộng rãi. Nhiều biệt dược đã trở nên quen thuộc với người tiêi

dùng. Trong số đó nhóm thuốc hạ nhiệt, giảm đau là phổ biến nhất, thườn)
phối hợp 2 hoặc 3 thành phần nhằm nâng cao hiệu quả điều trị đồng thồ
giảm bớt được tác dụng phụ của các chất khi dùng ở liều cao. Dược điển M1
(USP 24 năm 2000) có rất nhiều chế phẩm kết hợp Acetaminophen vớ
aspirin, cafein, codein, diphenhydramine, pseudoephedrine, aspirin và cafein
Đối với Quinin sulfat Dược điển Mỹ mới chỉ có chuyên luận viên nén Quinii
sulfat đơn thành phần [16]. Trên thị trường Quininsulfat phối hợp vớ
Pyrimethamin và Sulfadoxin trong viên Fansimef (xí nghiệp dược phẩm 780
[6 ]. Hiện nay trong các dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam không có công thứ<
phối hợp Paracetamol và Quininsulfat. Trên thị trường có một số chế phẩn
như viên AntigripF và Tiphagrip của CTD-VTYT Tiền Giang (Tiphaco), viêi
Anogin quinin của CTD-VTYT Trà Vinh phối hợp Paracetamol vi
Quininsulfat để điều trị các chứng cảm sốt, nhức đầu, đau mình mẩy. Để địnl
lượng các thành phần này, hầu hết các dược điển chỉ có phương pháp đối vớ
chế phẩm đơn thành phần, còn với các chế phẩm đa thành phần thì tiêi
chuẩn của các nhà sản xuất đưa ra rất khác nhau: Phương pháp quang phổ hấ]
thụ tử ngoại-khả kiến, phương pháp chuẩn độ môi trường khan, phương pháj
acid-base. Các phương pháp này thường phải chiết tách phức tạp, tốn nhiềi
thời gian.
Hiện nay do nhu cầu sử dụng và sản xuất các thuốc đa thành phần (
trong nước cũng như nhập khẩu ngày càng tăng, đòi hỏi phải tăng cường côn<
tác quản lý, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc,. Để đáp ứng được nhiệm VI
đó cần phải có các biện pháp quản lý chặt chẽ, đồng bộ và có những phươnị
1
pháp kiểm nghiệm thuốc phù hợp cho phép định lượng hàng loạt các chế
phẩm cùng loại. Mặt khác cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ
thuật, nhiều máy móc thiết bị với kỹ thuật phân tích hiện đại, ra đời, đã và
đang được áp dụng vào thực tế kiểm nghiệm. Chính vì vậy trong luận văn này
chúng tôi tiến hành nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol và quinin
sulfat trong viên nén Antigrip F bằng phương pháp HPLC với mục đích:

- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và quinin
sulfat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Đánh giá, so sánh với phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả
kiến nhằm cho các cơ sở lựa chọn áp dụng. Đồng thời mong được góp phần
xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng của ngành cũng như của quốc gia cho các
dạng thuốc có thành phần tương tự.
2
Phần l:TổNG QUAN
1.1. PARACETAMOL. [1], [12], [15], [16],
1.1.1. Công thức:
HO— — NH-CO—CH3
[C8H9N02].
- Tên khoa học: N-Acetyl-p-Aminophenol; p-Hydroxyacetanilid.
- Tên khác: Acetaminophen.
1.1.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, không màu, dễ tan trong ethanol, khó tan trong
nước, hầu như không tan trong cloroform, tan trong kiềm do tạo muối
phenolat.
- Nhiệt độ nóng chảy từ 168°c - 172°c.
- Cho phản ứng của -OH phenol tự do: Với Fe3+ cho màu lam tím.
- Dễ bị thuỷ phân do chức amid không bền.
- Tạp chất cần chú ý: Là p-Aminophenol, thường xác định giới hạn tạp
chất này bằng phép đo nitrit và phương pháp sắc ký lớp mỏng.
1.1.3. Tác dụng dược lý: [7], [12].
- Thuộc nhóm thuốc chống viêm phi steroid có tác dụng hạ nhiệt, giảm
đau. So với Aspirin, paracetamol xuất hiện tác dụng nhanh và duy trì lâu hơn,
hạ nhiệt êm dịu hơn, giảm đau tốt hơn, ít tác dụng phụ hơn nên hay được dùng
để hạ sốt giảm đau hơn.
- Không có tác dụng chống viêm và chống ngưng kết tiểu cầu chủ yếu
do ức chế prostaglandin ở ngoại vi yếu nên được dùng để hạ sốt do mọi

nguyên nhân gây sốt kể cả trường hợp chống chỉ định Aspirin (sốt xuất huyết,
sốt virus).
3
- Với liều điều trị thông thường paracetamol không có tác dụng phụ,
không gây rối loạn đông máu và không gây tổn thương đường tiêu hoá.
- Liều cao ở người lớn gây viêm gan, hoại tử gan.
1.1.4. Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng paracetamol
Phương pháp chuẩn độ nitrit: [1], [10].
Nguyên tắc: Thuỷ phân paracetamol trong môi trường acid HC1 10% và
nhiệt độ tạo thành amin thơm bậc một, chuẩn độ bằng dung dịch natri nitrit
trong môi trường acid tạo hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá).
Phương pháp đo quang: [15].
Nguyên tắc:Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử paracetamol
trong methanol có cực đại hấp thụ tại 245 nm và trong môi trường kiềm có
cực đại hấp thụ tại 257 nm.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: [4], [10], [16].
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của Paracetamol trên
pha tĩnh và pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được. Kỹ thuật phát hiện
dựa vào tính chất hấp thụ u v đã nêu
Định lượng nỉtơbằng phương pháp Kendal: [12]
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự phân huỷ các phân tử hữu cơ
có chứa nitơ khi đun với H2S04 đặc với sự có mặt của Kali hay Natri sulfat.
Khi đó nitơ chuyển thành NH3, kết hợp với H2S04 tạo thành (NH4)2S04. Thêm
NaOH vào hỗn hợp phản ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng ra bằng hơi nước vào
dung dịch chuẩn H2S04 0.1N dư, chuẩn độ acid dư bằng dung dịch NaOH
0.1N.
❖ Định lượng theo phương pháp đo Cerỉ: [1], [14].
Nguyên tắc: Trong dung dịch acid có mặt Paracetamol là một chất khử,
Ceri IV là một chất oxy hoá sẽ kết hợp với một điện tử và chuyển thành Ceri
III. Phát hiện điểm kết thúc bằng feroin (phức chất sắt của 0-phenatrolin), sắt

ở trong phức hợp này có thể là sắt II hoặc sắt III. Phức chất sắt II có màu đỏ,
4
phức chất sắt III có màu xanh. Khi đến điểm tương đương, lượng Ceri IV quá
thừa sẽ oxy hoá phức chất sắt II thành sắt III và chỉ thị sẽ chuyển màu.
[(Cl2H8N2)3Fe]2+ - e' ► [(C12H8N2)3Fe]3+
1.2. QUININ SULFAT. [1], [3].
1.2.1.Công thức
+ Nguồn gốc: Là alcaloid chính phân lập từ vỏ cây canh ki na
[C20H24N2O2)2.H2SO4].
Phân tử Quinin gồm nhân quinolin gắn với nhân quinuclidin qua nhóm
alcol bậc hai.
+ Tên khoa học: bis[(R)-(6-methoxyquinolin-4-yl)-[(2S,4S,5R)-5-
ethenyl-l-azabicyclo[2 .2 .2 ]oct-2 -yl]methanol] sulfat.
1.2.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hoặc tinh thể hình kim không
màu, mịn. Vị rất đắng. Khó tan trong nước, hơi tan trong nước sôi và ethanol
96%, thực tế không tan trong ether.
- Quinin có tính base do hai nitơ mang lại, ứng dụng để điều chế các
muối quinin vững bền hoặc muối dễ hoà tan trong nước pha dung dịch tiêm.
1.2.3. Tác dụng dược lý: [7], [3].
+ Có tác dụng chủ yếu lên thể vô tính trong hồng cầu, nhất là với
p.falciparum. Còn diệt được giao bào p.vivax và p.malariae trong máu nhưng
không diệt được thể giao tử cuả p.falciparum. Là thuốc phòng và cắt cơn sốt,
5
quinin độc hơn và kém tác dụng hơn cloroquin nên hay dùng cho người bệnh
ở các vùng mà p.falciparum đã kháng với cloroquin .
+ Tác dụng hạ nhiệt: Thường phối hợp với paracetamol để điều trị
chứng cảm sốt, nhứe đầu, đau mình mẩy.
+ Vị đắng, giúp ăn ngon, dễ tiêu (rượu bổ quinquina).
1.2.3.MỘÍ số phương pháp đã được áp dụng để định lượng quinin sulfat:

phương pháp đo acid trong môi trường khan: [1 ], [3].
Nguyên tắc: Hoà tan muối quininsulfat bằng acid acetic khan hoặc
acetic (có thể sử dụng nhiệt độ). Chuẩn độ bằng acid percloric 0.1N, chỉ thị
tím tinh thể.
❖ Phương pháp acid-base: [11 ].
Nguyên tắc: Định lượng H2S04 tổ hợp bằng NaOH: Chế phẩm hoà tan
trong hỗn hợp dung môi cồn - cloroform trung tính được chuẩn độ bằng
NaOH 0.1N tới màu hồng, chỉ thị phenolphtalein.
Phương pháp đo quang: [3], [13].
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử quinin
sulfat trong môi trường acid HC1 0,1 N có cực đại hấp thụ tại 250 nm.
Phương pháp HPLC: [6], [16].
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của quinin sulfat trên
pha tĩnh và pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được. Kỹ thuật phát hiện
dựa vào tính chất hấp thụ u v đã nêu
1.3. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRONG KHOÁ LUẬN (HPLC):
1.3.1. Khái quát phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao. [1], [5], [9].
❖ Khái niệm: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia
tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn
đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các
6
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
iôn hay phân loại theo kích cỡ.
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột: [8], [9]
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình
sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ
pha thuận hoặc pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký
trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký
chiết. Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử. Cùng

với pha tĩnh, để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động
được bơm vào cột sắc ký dưới áp suất cao.Như vậy nếu ta nạp mẫu phân
tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, c vào cột tách, kết quả là các chất
A, B, c sẽ được tách khỏi nhau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự
tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác.
Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi
cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất, và ngược lại. Đối với mỗi chất sự lưu
giữ được qui định bởi ba lực thành phần : FI, F2, F3. Trong đó FI, F2 là quyết
định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. ở đây F1 là lực giữ chất phân tích
trên cột, F2 là lực kéo nó đi khỏi cột. Như vậy các chất khác nhau thì FI, F2
sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ
khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột. Sau khi ra khỏi cột các chất sẽ
7
được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận sử lý kết quả. Kết
quả sau khi được sử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình.
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian
lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín
hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được, phụ
thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC.
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng: [1], [9].
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại
và ghi thành sắc ký đồ .
signal Component 1 Component 2
Hình 1: Các đại lượng đặc trưng trên sác ký đồ trong phép định lượng bằng HPLC
❖ Thòi gian lưu tp(Retention timeV
+ Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột
đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cựe đại.
8
+ Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì
thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn. Vì vậy

thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
+ Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố :
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
- Bản chất,thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH pha động.
^0(dung dịch)( 1 ) . ( 1 )
Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR quá
lớn (tR > 2 0 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài.
Để thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các
yếu tố phụ thuộc trên đây.
Hê số dung lương K’ (Capacity factor).
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
(2)
'o to
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém, K’ lớn thì pích bị doãng, độ
nhạy kém. Trong thực tế K’ từ 1 đến 5 là tối ưu.
Đổ chon loc ạ (Selectivity)
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất
A, B có K’Avà K’Bkhác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị
ở độ chọn lọc a:
a = ặ ị = lMZl± Kb) (3)
B Ì r A - Í 0
a khác 1 càng nhiều khả năng tách càng rõ ràng
9
Hê số phân bố K:
Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất
tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi hệ số phân

bố, nó được tính theo công thức:
Trong đó cs, CM lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha
động.
Khi nồng độ chất tan không cao quá thi K là một hằng số chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha và chất tan, nhiệt độ.
Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa( H):
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: Số đĩa lý thuyết và
chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H.Ta có thể
tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:
Trong đó :+WBlà chiều rộng píc ồ đáy píc
+W1/2 là chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết
được tính bằng công thức:
❖ Đỏ phân giải (Rg):
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải được định nghĩa như sau:
(4)
N = Ỉ6
w
VY B
R
(5)
(6)
10
Khoảng cách giữa hai pic
t R,B ~ Ír ,A
_
______________________________________________________________________________________________

y^\W B+ WA] Độ rộng trung bình giữa hai pic
Dỏ lẽch chuẩn:
Là đại lượng đặc trưng cho một píc sắc ký và một quá trình tách sắc ký
của một hỗn hợp.
❖ Phương trình Van-Deemter: [5].
Phương trình mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông
số động học khác đến hiệu lực của cột sắc ký:
H = A + — + c.u (8)
u
Trong đó: + H : chiều cao đĩa lý thuyết.
+ U: tốc độ dòng pha động.
+ A, B, C: Là các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký
+ A: Mô tả ảnh hưởng đến H của khuy ếch tán xoáy
+ B/U: Ảnh hưởng của sự khuy ếch tán của các phân tử chất tan
theo phương dòng chảy của pha động.
+ C: Nói lên sự không đều của tốc độ di chuyển của các phân
tử chất tan trong lòng pha động.
1.3.3. Hệ thống HPLC: [5], [8], [9].
Theo thứ tự từ đầu đến cuối hệ thống, có các bộ phận chính như sau:
+ Bình chứa dung môi.
+ Bơm cao áp, đẩy pha động qua cột sắc ký.
+ Van bơm mẫu, bơm vào cột một thể tích mẫu nhất định.
+ Cột tách.
+ Detector.
+ Máy ghi sắc ký hoặc máy vi tính.
11
1.3.4. Pha tĩnh trong HPLC: [5], [9].
Cũng như sắc ký cột ở áp suất thường, pha tĩnh (stationenary phase)
trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất
phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và có kích thước hạt rất nhỏ, đường kính

cỡ hạt từ 3-10 |um, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.
❖ Phân loại pha tĩnh.
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người
ta chia nó thành nhiều loại: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
- Căn cứ vào trạng thái rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm hai loại:
nếu pha tĩnh là chất rắn thì ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid Soli
Chromatography), riếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký lỏng lỏng LLC
(Liquid Liquid Chromatography).
- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có hai kiểu
xốp là : Xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
Điều kiện đối với một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.
-Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
Chê tạo pha tĩnh: pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel.
+ Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm.
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ.
12
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền Silicagel ưu việt hơn và được sử
dụng nhiều nhất. Có hai loại Silicagel hấp phụ cho sắc ký hấp phụ (pha thuận)
và silicagel được biến đổi hoá học cho một số kiểu sắc ký khác nhau:
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha thuận. Loại này
trên bề mặt của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động có tính
chất phân cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không
phân cực và các chất ít phân cực. Pha động của loại này là những chất ít phân

cực hoặc không phân cực.
- Silicagel đã alkyl hoá:được sử dụng cho các sắc ký phân bố (pha
đảo). Nhóm -OH của silicagel trung tính đã được alkyl hoá bằng các gốc
alkyl của mạch carbon thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl.
Chính vì bị thế mất nhóm -OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân
cực hay ít phân cực. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân
cực hay ít phân cực, các chất phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion. Pha
động cho loại này là các chất hữu cơ phân cực như methanol, acetonnitriL.hay
nước hoặc là hỗn hợp của các chất này với nhau theo tỷ lệ nhất định.
- Silicagel đã được Sunfonic hoá hay nitro hoá: Được sử dụng cho sắc
ký trao đổi ion (cation). Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro hoá
các silicagel trung tính để thay các nhóm -OH trên bề mặt Silicagel trung tính
bằng các nhóm -SO3H hay N 02H. Các nhóm chức này có ion H+ có thể trao
đổi được với các cation kim loại khác. Đây là các pha tĩnh trao đổi cation
mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm -R-COOH thì ta có loại pha
tĩnh trao đổi cation acid yếu. Pha tĩnh loại này dùng để tách các chất có cấu
tạo ion như các ion kim loại và hợp chất của chúng, hay các chất khi tan trong
pha động thì phân li thành các ion như các acid, base.
- Các Silicagel được amin hoá: Được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion.
Các Silicagel này được chế tạo bằng cách thay thế nhóm -OH bằng các nhóm
-NH2, -NH, -NR2, -CH2(OH). Pha tĩnh loại này được sử dụng để tách các
13
anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay các chất khi tan trong pha động thì
phân li thành các ion như các acid, base. Pha động của loại này cũng giống
như trên.
1.3.5. Pha động trong HPLC: [8], [9].
Pha động là dung môi để rửa giải các chất tan (chất cần phân tích) ra
khỏi cột tách để thực hiện qúa trình sắc ký. Đây là một yếu tố hết sức linh
động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung
môi trộn lẫn với nháu theo những tỷ lệ nhất định. Nó cũng có thể là một dung

dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ
có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất
tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất
mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể làm thay đổi:
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ chất tan.
- Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải R.
-Độ rộng hoặc sự cân đối của các pic sắc ký.
❖ Trong HPLC, pha động phải thoả mãn một số điều kiện sau:
- Trơ đối với pha tĩnh.
- Hoà tan được chất cần phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các quá trình cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với các loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân
tích.
- Có tính kinh tế, dễ kiếm.
14
Trong sắc ký hấp phụ (pha thuận): Pha động phải là các dung môi hữu
cơ không phân cực hoặc ít phân cực như n-hexan, n-heptan, cloroform,
tetraclorocarbon.
Trong sắc ký hấp phụ (pha đảo): Pha động là hệ dung môi của những
dung môi đồng tan với nước, có khi nước lại là thành phần chính trong pha
động ví dụ như methanol, acetonitril Trong nhiều trường hợp, thành phần pha
động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất
tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong sắc
ký cặp ion.
Trong sắc ký trao đổi ion: pha động là dung dịch nước của acid hoặc

base, hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có chứa
chất đệm pH, chất tạo cặp ion, chất tạo phức.Trong loại sắc ký này thì pH pha
động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn.
❖ Có 4 yếu tô quan trọng cần chú ý trong lựa chọn pha động:
-Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ của pha động.
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở trao đổi ion và cặp ion).
15
Phần 2:THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: HP 1100
- Bộ lọc dung môi và bộ lọc mẫu với màng lọc 0,45 |im.
- Máy lắc siêu âm.
- Cân phân tích có độ chính xác ±0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: Bình định mức, pipet, ống đong.
2.1.2. Hoá chất
- Chuẩn paracetamol và chuẩn quinin sulfat.
- Methanol: Dùng cho HPLC
- Acid acetic glacial: Dùng cho HPLC (dung dịch acid acetic 4%: 4 ml
acid acetic glacial thêm nước vừa đủ 1 0 0 ml).
- Natriheptansulfonat (PA)
- Diethylamin (PA)
- Ethanol (PA)
- Nước cất
2.2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Mẫu sử dụng: Viên nén ANTIGRIP F
Cổng thức:

(ewragel, tinh bột, talc, magnesi stearat, HPMC, tinh dầu tràm, tinh
dầu hương nhu).
Quinin sulfat
Paracetamol
Tá dược vđ
30 mg
150 mg
1 viên
16
Số kiểm soát: 050801-08-03
Nơi sản xuất: CTD-VTYT Tiền Giang
Các chất đối chiếu:
Là các chất chuẩn làm việc paracetamol (99,8%) và quininsulfat
(95,5%) (Phòng hoá lý I- Viện Kiểm nghiệm cung cấp)
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện đ ể xây dựng chương trình sắc ký định
tính và định lượng đồng thời paracetam ol và quinin sulfat
trong viên nén A ntigrip F .
Qua tham khảo một số tài liệu và trong điều kiện trang thiết bị của cơ
sở nghiên cứu (Phòng hoá lý I-Viện Kiểm Nghiệm), cũng như điều kiện thực
nghiệm ở nước ta hiện nay, chúng tôi khảo sát những điều kiện sau để chọn
chương trình sắc ký thích hợp:
+ Lựa chọn cột sắc ký: Chúng tôi sử dụng cột sắc ký pha đảo
Lichrosorb RP18 (250mm X 4mm; 5 ịim). Đây là cột sắc ký thông dụng
được sử dụng khá nhiều trong công tác kiểm nghiệm.
+ Khảo sát, lựa chọn dung môi pha động và tốc độ dòng thích hợp cho
phép tách đồng thời paracetamol và quinin sulfat. Chúng tôi tiến hành khảo sát
các hệ dung môi có trong tài liệu tham khảo, lựa chọn và điều chỉnh tỷ lệ các
thành phần sao cho các thành phần được tách tốt nhất.
+ Khảo sát chọn bước sóng xác định đồng thời paracetamol và

quinisulfat: Tiến hành đo phổ hấp thụ tử ngoại của hai chất này, dựa trên
nguyên tắc chọn bước sóng phát hiện ưu tiên cực đại hấp thụ của chất có hàm
lượng nhỏ hoặc có độ hấp thụ riêng nhỏ. Đồng thời kết hợp với quá trình thực
nghiệm để lựa chọn bước sóng thích hợp.
Để định lượng đồng thời hai thành phần là paracetamol và quinin sulfat
trong viên nén Antigrip F bằng phương pháp HPLC, chúng tôi tiến hành:
+ Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký.
17
•Vc i
+ Khảo sát độ tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ
paracetamol và quinin sulfat với diện tích pic trên sắc ký đồ.
+ Khảo sát độ chính xác của phương pháp
+ Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm.
Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và thử nằm
trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Sau đó tiến hành định lượng bằng
phương pháp ngoại chuẩn, có nghĩa là so sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu
thử được thực hiện trên cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng
paracetamol và quinin sulfat trong chế phẩm cần phân tích theo công thức:
X(mg/viên) = _x — M
sc X m T
Trong đó: - Sp và Sc là diện tích pic của các dung dịch thử và chuẩn
- c là nồng độ chất chuẩn£ >£>/m t)
- mT là lượng cân mẫu thử (mg)
- M là khối lượng trung bình viên (mg)
❖ Đánh giá phương pháp đã xây dựng và so sánh với phương pháp UV-
VIS
- So sánh về kết quả định lượng của hai phương pháp.
- So sánh độ chính xác của hai phương pháp.
- So sánh hai giá trị trung bình.
- Đánh giá ưu, nhược điểm của hai phương pháp.

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp dùng trong khoá luận là phương pháp HPLC
- Bằng thực nghiệm tìm các điều kiện tối ưu để xây dựng phương pháp,
xử lý thống kê và rút ra nhận xét.
❖ Một sô đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thông
qua các đặc trưng sau:
18
Giá trị trung bình:
Độ lệch chuẩn:
Sai số chuẩn:
- 1 J L
n ,=1
5 =
5 (x) - —
ấ ( x/ - x )2
_M
________
n -ỉ
( 10)
(11)
(12)
Sai số tương đối: 8% = a- x^
So sánh các phương sai (test F):
8% = ^ ^ 1 0 0
X
p =
1 TN
S]
nA 1 /=1

_________
n U % [x^
n B ~~ 1 i=\
-So sánh các giá trị trung bình (test t):
|x~- jLl\yfn
\xA -■
trN —
n A n B__
nA +nB
(13)
(14)
(15)
(16)
s = (17)
V
nA + n B ~ 2
19
2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.
2.3.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký
Qua nghiên cứu tính chất hoá lý của hai dược chất, chúng tôi đã lựa
chọn kiểu sắc ký pha đảo tạo cặp ion để phân tách chúng (tạo cặp ion giữa một
anion với cation base hữu cơ là quinin).
Trên cơ sở cột sẵn có của cơ sở nghiên cứu (Phòng hoá lý I-Viện Kiểm
nghiệm) và qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi sử dụng cột sắc ký
Lichrosorb RP 18 (250mm X 4mm; 5|j,m) trong quá trình khảo sát các điều
kiện như pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện cho phép tách được các
chất ra khỏi hỗn hợp.
- Lựa chọn pha động:
Để thực hiện kỹ thuật tạo cặp ion, sử dụng tác nhân tạo cặp ion là
natriheptansulfonat (thường sử dụng ở nồng độ 0,005 M ). Sử dụng một tỷ lệ

acid acetic để đưa pH pha động về vùng acid. Dung môi hữu cơ được sử dụng
là methanol. Hoà tan 1,1 g natriheptansulfonat trong 1 lit hỗn hợp gồm có
methanol và dung dịch acid acetic 4%. Tỷ lệ ban đầu được lựa chọn là đồng
thể tích. Ở tỷ lệ này, quinin sulfat được rửa giải rất chậm, pic doãng và không
cân xứng. Chính vì thế chúng tôi tăng dần tỷ lệ methanol. Qua các thực
nghiệm khảo sát, tỷ lệ methanol được xác định là khoảng 65% (tt/tt). Để pic
của quinin sulfat gọn và cân xứng, chúng tôi cho thêm 1 tỷ lệ nhỏ diethylamin
(khoảng 1 %).
Pha động được lựa chọn cuối cùng như sau: hoà tan 1,1 g
natriheptansulfonat trong 1 lit hỗn hợp gồm có methanol- dung dịch acid
acetic 4% (tt/tt) - diethylamin tỷ lệ (650 : 350: 1 ).
Với dung môi này, hai dược chất được phân tách hoàn toàn,
Paracetamol được rửa giải ra trước (thời gian lưu = 2,3 phút), Quinin sulfat
được rửa giải ra sau (thời gian lưu = 4,9 phút), các pic đều cân xứng.
20
- Qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 1 mỉ/phút cho kết quả tách
tốt nhất, thời gian lưu vừa phải.
- Lựa chọn bước sóng:
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện paracetamol và quininsulfat
chúng tôi quét phổ tử ngoại của 2 chất chuẩn trên (mỗi chất đều được pha
trong pha động với nồng độ như sau: Paracetamol là 7,5|ig/ml; quininsulfat là
8 |Lig/ml. Kết quả cho thấy paracetamol có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng
250,9 nm và quininsulfat có 3 đỉnh hấp thụ cực đại tại các bước sóng (233,6
nm; 265,0 nm; 327,5 nm)
Hình 2: Phổ UV-Vis của paracetamol (7,5|ig/m l) và của
quinin sulfat (8 |!g/ml) trong pha động
21