khảo sát khả năng hình thành bào tử bacillus clausii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
•

•

•

•

NGUYỄN THỊ HIÈN

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HĨNH
THÀNH BÀO TỬ CỦA VI KHUẨN
Bacillus cỉausii
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ
•

•

•

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ

HÀ NỘI - 05/2012


B ộ YTẾ
TRƯỜNG ĐAI HOC DƯƠC HÀ NÔI
•

•

•

•

NGUYỄN THỊ HIỀN

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÌNH
THÀNH BÀO TỬ CỦA VI KHUẨN
Bacillus clausỉỉ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ
•

•

•

Người hướng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Noi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 05/2012


LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu
sắc tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên bộ môn Công nghiệp

Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã luôn động viên, tận tình
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh, DSệ Nguyễn Khắc
Tiệp cùng toàn thể các thày cô giáo và các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công
nghiệp dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn
thảnh khỏa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập tại
trườngắ
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập.

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2012
Sinh viên
Nguyễn Thị Hiền


MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh muc các hình vẽ, đồ thi
Đặt vấn đề.............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về probiotic
1ệ1ệ1ệ Giới thiệu về probiotic từ bào tử ..................................................... 2
1ệ1ệ2ệƯu điểm của probiotic từ bào tử......................................................2
1ệ1ệ3. Tính an toàn của bào tử tạo chế phẩm probiotic.............................3
1.1.4ắ Chế phẩm probiotic từ bào tử.......................................................... 4
l ể2ể Giói thiệu về bào tử

1.2ắ1ắĐặc điểm của bào tử.........................................................................5
1.2ắ2ắ Sự hình thành bào tử........................................................................ 5
1ệ2ệ3ệ Cấu tạo của bào tử............................................................................ 6
1.2ắ4ắ Sự nảy mầm của bào tử....................................................................7
1.2ắ5. Sức đề kháng của bào tử ..................................................................7
1.2ắ6. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử ..............................8
1.3. Gỉớỉ thiêu về Bacillus clausii
1ệ3ệ1ệĐặc điểm sinh lí hình thái của Bacillus clausỉỉ...............................8
1.3.2ắứng dụng của Bacillus clausỉỉ.........................................................9
Chương 2ề NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIÉT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2ắ1ắ1ắNguyên liệu, hóa chất...................................................................... 12


2ểl ể2ểMáy móc, thiết bị............................................................................. 13
2ệl ệ3ệMôi trường sử dụng......................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu
2ệ2ệl ệ Khảo sát khả năng hình thành bào tử của B. clausii trong các
điều kiện nuôi cấy khác nhau....................................................................14
2ệ2ệ2ệKhảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử .... 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2ệ3ệ1ệHoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina.................................. 14
2ệ3ệ2ệ Giữ giống trên thạch nghiêng......................................................... 14
2ể3.3. Chuẩn bị dịch nhân giống................................................................14
2ắ3.4ắPhương pháp thu bào tử................................................................... 15
2ắ3.5. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ôgietska............................15
2ắ3.6. Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của vi khuẩn.............16
2ắ3.7. Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thời gian.... 17
2ệ3ệ8ệ Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình

thành bào tử.................................................................................................17
Chương 3. KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát khả năng tạo bào tử B. clausii trong các điều kiện nuôi cấy
khác nhau
3.1.1. Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cấy ở điều kiện tự nhiên..... 19
3.1.1.1. Môi trường lỏng..................................................................20
3.1.1.2ắMôi trường đặc...................................................................22
3.1.2ể Khả năng hình thành bào tử khi xử lý nhiệt sinh khối.................. 26
3.1.2ể1ểMôi trường lỏng..................................................................27
3 ệ1ệ2ệ2ệMôi trường đặc...................................................................28
3.2ể Khảo sát ảnh hưởng của ỉon mangan đến sự hình thành bào tử
3.2ểl ểMôi trường lỏng...............................................................................32

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ


3.2ắ2ắMôi trường đặc.................................................................................34
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT................................................................................37
Tài liêu tham khảo


DANH MỤC CÁC BẢNG
•

Nội dung

Trang

Bảng 2ệ1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

12

Bảng 2ắ2 Các máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

13

Bảng 3ệl Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi cấy 21
trong môi trường lỏng
Bảng 3ệ2 Tương quan giữa lượng sinh khối và bào tử B. clausỉi khi 23
nuôi cấy trong môi trường đặc
Bảng 3ệ3 Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong trong môi 27
trường lỏng khi xử lí nhiệt
Bảng 3ệ4 Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi 29
trường đặc khi xử lí nhiệt
Bảng 3.5 Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi 33
trường lỏng có ion mangan
Bảng 3.6 Tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối trong môi 34
trường đặc có ion mangan


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Nội dung
Hình 1.1

Trang
Hình ảnh B. anthrasis

5

Hình 1.2 Quá trình hình thành bào tử

5

Hình l ệ3 Cấu tạo bào tử

6

Hình l ể4

Chế phẩm Enterogermina

10

Hình l ệ5 Chế phẩm Erceflora

11

Hình 1.6 Chế phẩm Bazivic

11

Hình 3.1

Hình ảnh B. clausii trong môi trường lỏng sau 48h

20

Hình 3.2

Hình ảnh B. clausii trong môi trường lỏng sau 72h

20

Hình 3.3

Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa lượng bào tử và sinh
khối trong môi trường lỏng theo thời gian nuôi cấy
Hình ảnh B. clausii trong môi trường đặc sau 96h nuôi cấy

21

Hình 3.4
Hình 3.5

Biểu đồ tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi
cấy trong môi trường đặc
Hình 3.6 So sánh sự hình thành bào tử trong môi trường lỏng và đặc
khi chưa xử lí
Hình 3.7 Biểu đồ tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi
cấy trong môi trường lỏng có xử lí nhiệt
Hình 3.8 Biểu đồ tương quan giữa lượng bào tử và sinh khối khi nuôi
cấy trong môi trường đặc có xử lí nhiệt
Hình 3ệ9 So sánh sự hình thành bào tử khi nuôi cấy trong 2 môi
trường đặc và lỏng khi có xử lí nhiệt
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa lượng bào tử và sinh
khối trong môi trường lỏng có ion mangan
Hình 3.11 Hình ảnh B. clausii trong môi trường đặc có ion mangan
sau 24h
Hình 3ệ12 So sánh sự hình thành bào tử trong 2 môi trường đặc có và
không có ion mangan

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ

23
24
25
28
29
31
33
34
35


1

ĐẢT VẮN ĐÈ
•

Trong đường một con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh vật
với khoảng hơn 100 tỉ vi khuẩn, bao gồm cả vi sinh vật có lợi (như các loài
thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacteria) và vi sinh vật gây hại (như
Clostridium, Staphylococcus...). Các vi sinh vật có lợi sẽ có tác động tốt cho
sức khỏe như tổng họp vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong
một, hỗ trợ tiêu hóa, giúp hấp thu tốt hơn và cải thiện sự rối loạn của đường
một, cũng như tăng cường sức đề kháng, giúp phòng bệnhệ Ngược lại, các vi
sinh vật gây hại sẽ gây ra những tác động xấu cho cơ thể như hình thành các
chất gây hoại tử trong ruột, các chất gây ung thư, tiêu chảy... Trong cuộc
sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường một rất dễ bị tác động bởi các yếu tố
bên ngoài như sự lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn không vệ sinh... làm mất

cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và có hại, gây nên các bệnh đường
ruột trong đó tiêu chảy là một điển hình. Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật
có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở
đường một là rất quan trọng.
Sử dụng các sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm bổ sung,
cân bằng lại hệ vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp phòng và
chữa bệnh tiêu chảy. Probiotic có thể được sử dụng dưới dạng tế bào (chi
Lactobacillus, Bifidobacterium...) hoặc dạng bào tử (chi Bacillus ...) trong
đó chế phẩm chứa bào tử của B. clausỉỉ được dùng rất phổ biến trên thế giới.
Tuy nhiên, ở Việt Nam, vi khuẩn B. clausỉỉ vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.
Do đó đề tài: “Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vỉ khuẩn Bacillus
clausip’ được thực hiện để giải quyết các mục tiêu sau:
1. Khảo sát khả năng hình thành bào tử Bacillus clausii trong các điều
kiện nuôi cay khác nhau.
2. Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử.


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về probiotic
1.1.1. Giới thiệu về probiotic từ bào tử
“Probiotic” xuất phát từ “prolife”, tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “dành cho
cuộc sống”. Theo FAO/WHO probiotic được định nghĩa như sau:
Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà khi cung cấp cho
người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách
tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa [12]ệ
Vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotic có thể ở dạng tế
bào hoặc bào tử, trong đó các chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn tương
đối phổ biến. Trong các loại vi sinh vật có khả năng tạo bào tử, bào tử của các

loài thuộc chi Bacillus thường được sử dụng để tạo probiotic nhờ các ưu điểm
vượt trội và tính an toàn cao. Các loài hay dừng là: Bacillus subtilis, Bacillus
clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis. Sản phẩm
đầu tiên chứa bào tử của vi khuẩn B. clausiỉ là Enterogermina được sản xuất
tại Ý (năm 1958) [13].
1.1.2. ưu điểm của probiotic từ bào tử
Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng rất lớn với các điều kiện khắc nghiệt
của môi trường do đó chế phẩm probiotic từ bào tử có những ưu điểm sau:
v' Trong quá trình sản xuất, các điều kiện như sấy, đông khô... không
ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng bào tử trong các chế phẩm probiotic.
s

Trong quá trình lưu hành trên thị trường chế phẩm probiotic từ bào

tử ít chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nên đảm bảo được yêu cầu về
tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩmắ
v' Các bào tử có khả năng chịu đựng được pH của dạ dày và tác động
của muối mật, để tới một non và nảy mầm tại đó.


3

■S Kháng kháng sinh (đặc biệt là vi khuẩn B. clausỉỉ trong chế phẩm
Enterogermina) [4], [21], [26].
1.1.3. Tính an toàn của bào tử tạo chế phẩm probiotic
Việc sử dụng bất kì loại probiotic nào dù cho con người hay động vật
đều phải nghiên cứu tính an toàn của chế phẩmệ Đặc biệt là probiotic được
làm từ bào tử thì vấn đề an toàn càng phải được nghiên cứu kĩ lưỡng vì có rất
nhiều loại bào tử sản sinh độc tính có hại cho sức khỏe con người. Khi sử
dụng bào tử cũng như tế bào của vi khuẩn thuộc chi Bacillus, cần chú ý một

số điểm sau đây:
> Vi khuẩn chi Bacillus có thể gây ra nhiễm trừng:
Một số chủng B. cereus có thể gây nôn hoặc tiêu chảy do khi vào trong
đường tiêu hóa chúng sẽ nảy mầm thành tế bào và sinh ra các loại độc tố. B.
thuringiensis có thể sinh ra độc tố gây viêm dạ dày, m ột B. licheniformis
trong một số trường hợp cũng sinh ra độc tố dẫn tới tiêu chảy và cũng có
trường hợp ảnh hưởng nặng tới trẻ sơ sinhệB. subtỉlỉs cũng có thể gây ra nôn
mửa.
> Tính kháng kháng sinh:
Một số chủng trong các chế phẩm probiotic chứa bào tử khi sử dụng có
khả năng kháng một số loại kháng sinh như:
-

B.

clausii

ATCC

9799

kháng

erythromycin,

lincomycin,

cephalosporins và cycloserines.
-

B. cereus (cũng như B. thuringiensis) có khả năng tạo ra P-

lactamase và do đó có khả năng kháng kháng sinh nhóm penicillin và
cephalosporinệ
> Để đảm bảo tính an toàn khi tạo ra chế phẩm probiotic từ bào tử thì
cần phải tuân thủ theo nguyên tắc:
- Đưa ra tên chi và loài chính xác.

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ


4

- Chủng phải được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế.
- Chửng phải được đánh giá trong ống nghiệm để xác định an toàn và các
yếu tố độc lực.
- Xác định hoạt động kháng khuẩnệ
- Đánh giá tính an toàn trên tiền lâm sàng trong các mô hình động vật.
- Đánh giá lâm sàng trên động vật để chứng minh hiệu quả.
- Giai đoạn I (xác định tính an toàn) thử nghiệm ở con người.
- Giai đoạn II (hiệu quả) và giai đoạn III (hiệu quả) thử nghiệm
ở người.
- Ghi nhẫn đúng qui định [13]ệ
i ằi ễ4. Chế phẩm probiotic từ bào tử
Trên thị trường có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn, các
loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausỉỉ, B. subtỉlỉs, B. cereus, B.
licheniformis với rất nhiều dạng bào chế khác nhau và số lượng bào tử cũng
khác nhau. B. clausỉỉ được sản xuất dưới hai dạng bào chế chủ yếu là viên
nang và dạng hỗn dịch - chứa 2 tỉ bào tử trong glycerin. B. subtỉlỉs có trong
rất nhiều chế phẩm, có trong cả chế phẩm đơn lẻ và chế phẩm phối hợp với

các loại vi khuẩn khác như Lactobacillus acidophilus, dạng bào chế có thể ở
dạng cốm bao trong gói hoặc trong nang cứng với số lượng bào tử từ 106 109[13]ắ
Việt Nam đã sản xuất chủ yếu các chế phẩm probiotic có chứa B.
subtỉlỉs như: Bio-acimin, Bibactyl, Bidisubtilis... một số chế phẩm chứa B.
cereus như Subtyl, chế phẩm chứa cả 3 loại B. clausỉỉ, B. subtilis, B.
licheniformis như: cốm vi sinh Bazivic.


5

1.2. Giói thiêu về bào tử
1.2.1. Đăc điểm của bào tử
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn
vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt
độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất
lợi.ệệ Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tửệ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào
tử sẽ phát triển thành tế bào sinh dưỡng [1], [4].

Hình l ẵl: Hình ảnh B. anthracis
1.2.2. Sự hình thành bào tử
Sự hình thành bào tử là quá trình tế bào sinh dưỡng chuyển thành dạng
bào tử có khả năng kháng nhiệt, hóa chất, dung môi, bức xạ, sấy khô.. Sự hình
thành bào tử vi khuẩn được chia ra làm nhiều giai đoạn như sau:

Hình 1.2: Quá trình hình thành bào tử


6

•

Trong tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chỉa thành chromosome

riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành
vách ngănễ
•

ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bào tử

được hình thành và một phần vỏ cũng được hình thànhễ
•

Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN.

•

Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài.

•

Quá trình hình thành bào tử mất khoảng 6 - 8h, lầ quá trình tương

đối phức tạp để tạo ra được cấu trúc bền vững chịu được điều kiện khắc
nghiệt [1].
2ắ2ề3ắ Cấu tạo của bào tử
Cấu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lóp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi
chứa ADN. Bào tử bao gồm:
• ADN nằm trong thể bào tử chất
• Màng bào tử bao ngoài bào tử chất
• Thành bào tử

• Vỏ bào tử
• Áo bào tử hai lớp và áo ngoài.
vỏ bào tử
áo trong
bào t

thành bào tử

mãng
bào tử

áo ng
t)ào tư

mảng ngoài
Hình 1.3: cấu tạo bào tử


7

Bào tử có các lớp bao bọc chiếm 50% thể tíchệ v ỏ bào tử có nhiều lớp,
bề mặt của các lớp này xù xì với thành phàn hóa học chủ yếu là protein có
chứa nhiều glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia
của keratin; hydratcarbon; lipid; peptidoglycan và canxi dipicolinat, không
chứa acid teichoicệ Đây là những lớp có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của
nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng
bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợiệ
Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết
cùng với canxi dipicolinat [1], [4]ệ
7.2Ề^ỆSự nảy mầm của bào tử

Bào tử vi khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH, đinh
dưỡng. ắ. sẽ nảy mầm thành tế bào sinh dưỡngắ Sự nảy mầm của bào tử xảy ra
theo 3 giai đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng [4].
1.2.5. Sức đề kháng của bào tử
Bào tử vi khuẩn có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hoá học
như: nhiệt độ, hóa chất, dung môi, bức xạ. ắ. Nguyên nhân là do:
•

Nước trong bào tử phàn lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có

khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
•

Do bào tử có lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào

tử kết hợp với canxi dipicolinat thành một phức chất có tính chất ổn định cao
đối với nhiệt độ.
•

Các enzym và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều

tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với
tế bào bên ngoài.
•

Cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp

màng làm cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào
tử [4].

8

1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử
Sự hình thảnh bào tử từ tế bào sinh dưỡng được kích thích bởi nhiều
yếu tố khác nhauệ Ngay cả trong môi trường nuôi dưỡng vi sinh vật thì sự
giảm nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường (đặc biệt là cacbon, nitơ,
phospho...), hoặc sự thay đổi về nhiệt độ và pH cũng ảnh hưởng tới thời điểm
và thời gian hình thành bào tử của vi khuẩn [11], [22]ệ Một số báo cáo đưa ra
khoảng pH tối ưu để hình thành nhiều bào tử nhất của vi khuẩn B. subtỉlỉs là
từ 6 - 8 [7]. Ngoài ra các thành phàn của môi trường cũng có ảnh hưởng tới
sự hình thành bào tử của vi khuẩn đặc biệt là sự có mặt của ion Mn2+. Ion
Mn2+ ở mức độ thấp sẽ cần thiết cho sự tăng trưởng và ữao đổi chất của vi
khuẩn và trực khuẩn cần nhiều Mn2+ hơn cho sự hình thành các bào tử kháng
nhiệt vì khi đó, Mn2+ sẽ bị oxy hóa thành M n02 bám trên bề mặt bào tử [6],
[8], [19].
1.3. Giới thiêu về Bacillus clausii
1.3.1. Đặc điểm sinh lí hình thái của Bacillus clausii
> Đặc điểm phân loại:
Bacillus clausỉỉ thuộc:
Bộ: Eubacterỉales
Họ: Bacỉllaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus clausiỉ
> Đặc điểm phân bố:
Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất, có thể
là đất vườn (B. clausii KSM- K I6, B. clausii DSM 8716, ATCC 31084ẽ..),
hoặc đất sét (B. clausii DSM 9784.ắ.)ắ Ngoài ra có thể tìm thấy B. clausii ở
nước (B. clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vừng ven biển phía đông
Ấn Độ), trong bùn [14], [10], [25].

9

> Đặc điểm hình thái
Bacillus clausỉỉ có hình que đứng đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi
khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có hình bầu dục.
B. cỉausii có kích thước chiều rộng l-2|im, chiều dài 5|im [23 ]ệ
> Điều kiện nuôi cấy
•

Nhu càu oxy: B. clausỉỉ là vi khuẩn hiếu khí do đó trong quá trình

nuôi cấy cần có sự cấp khí.
•

v ề nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là từ 15 - 50°c. Mỗi chửng

có nhiệt độ tối ưu riêng như: chủng B. clausii DSM 8716 có nhiệt độ tối ưu là
30°c, chủng B. clausii KSM-K16 có nhiệt độ tối ưu là 40°c, B. clausii ATCC
31084 có nhiệt độ tối ưu là 37°c. ệ. [24], [25]ẽ
•

v ề pH: khoảng pH nuôi cấy thích họp là từ 7 - 10,5. Chửng B.

clausii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [24] ệ
•

v ề dinh dưỡng, B. clausii có thể sử dụng nhiều nguồn cacbohydrat

khác nhau như: glucose, galactose, mannose,

sorbitol, 2- ketogluconat...;

nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng.
> Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn B. clausỉỉ có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh
bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Cho phản
ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat thành nitrit [17].
1.3.2. ứng dụng của Bacillus clausii
B. clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản xuất
chế phẩm probiotic.
B. clausỉỉ có khả năng sản xuất nhiều loại enzym như: xylanase,
cellulase, amylase, và protease... Trong các enzym này quan trọng nhất là
protease. Sản xuất enzym protease:

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ


10

Protease là enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số các
enzym trên thế giới. Protease có ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như
chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, thực phẩm. ặ. Protease cũng có thề được
sử dụng với mục đích thủy phân protein dạng sợi như sừng, lông và tóc [9],
[18], [24].
> Sản xuất chế phẩm probiotic từ bào tử B. clausỉỉ

Hình 1.4: Chế phẩm Enterogermỉna
Bào tử B. clausỉỉ được sử dụng ừong sản phẩm Ẽnterogermỉna (Sanoíi Aventis) - một chế phẩm probiotic có tác dụng hữu hiệu trong điều trị tiêu

chảy ở trẻ em. Enterogermỉna chứa bào tử vi khuẩn B. clausỉỉ dưới 2 dạng:
dạng huyền dịch ừong ống nhựa (2 tỷ bào tử trong 5ml) và dạng viên nang (2
tỷ bào tử trong 1 viên nang). Enterogermina được chỉ định trong các trường
hợp:
• Điều trị và phòng ngừa rối loạn khuẩn chí đường một và bệnh lý kém
hấp thu vitamin nội sinh.
• Điều trị hỗ trợ để phục hồi hệ khuẩn chí đường ruột bị ảnh hưởng khi
đùng thuốc kháng sình hoặc hóa tậ liệu.


11

•

Rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em do nhiễm độc hoặc rối loạn

khuẩn chí đường ruột và kém hấp thu vitaminắ
B. clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng sinh
nên uống chế phẩm xen kẽ với khoảng thời gian dùng kháng sinhể Chế phẩm
sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm (như đã nêu ở mục 1.1.2).
Chế phẩm Enterogermina chứa bốn loài B. cỉausii, mỗi loài kháng một
số loại kháng sinh nhất định: o /c kháng chloramphenicol, N/R kháng
novobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng sữeptomycin và
neomycin [15].
Ngoài Enterogermina chứa bào tử B. clausỉỉ còn một số chế phẩm khác
chứa B. clausii như: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin, Enterum. ệ.

Hình l ể5: Chế phẩm Erceflora

Hình l ể6: Chế phẩm Bazivic

12

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2Ễ/ Ễ2ỄNguyên liệu, hóa chất
> Các hóa chất sử dụng:
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chât

Xuât xứ

Hóa chât sử dụng pha môi trường
Natri clorid

Trung Quôc

Pepton

Trung Quôc

Cao thịt

Trung Quôc

Thạch bột

Việt Nam

Mangan sulfat

Trung Quôc

Kali clorid

Trung Quôc
Hóa chât sử dụng thu bào tử

Dung dịch đệm phosphat pH 7,6
Viện kiêm nghiệm

Lysozyme
Dung dịch KC1 IM
Dung dịch NaCl IM

Hóa chât sử dụng nhuộm bào tử
Đỏ Fuchsin
Dung dịch HC10,5%
Dung dịch H2S04 1%
Xanh methylen

Kho tài liệu miễn phí của Ket-noi.com blog giáo dục, công nghệ


13

2.1.2. Máy móc, thiết bị
Bảng 2.2: Các máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiêt bi

Xuât xứ

rin 9

Tủ cây

Bioair (Italy)

Máy ly tâm

Rotofix (Đức)

Nôi hâp

ALP (Nhật)

Tủ lạnh

Toshiba (Nhật)

rin •>

Tủ âm

Memmert (Đức)

Tủ sây

Memmert (Đức)

Tủ lăc

Bioshake (Đức)

Máy vortex

IKA (Đức)

Lò vi sóng

Daewoo (Hàn Quôc)

Nôi cách thủy

Trung Quôc

•

/V

/V

- Đĩa petri, pipet, ống nghiệm, đàu côn, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh,
que trang, giấy lọcệ..
2.1.3. Môi trường sử dụng
❖ Môi trường canh thang (MT1)
Natri clorid

0,5g

Cao thịt

0,5g

Pepton

lg

Nước máy

vđ 100ml

❖ Môi trường thạch thường (MT2) = MT1 + l,8g thạch


14

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát khả năng hình thành bào tử B. clausii trong các điều kiện
nuôi cấy khác nhau
2ệ2.1ệ1. Khả năng hình thành bào tử khi nuôi cấy ở điều kiện tự nhiên.
2ệ2.1ệ2. Khả năng hình thành bào tử khi xử lý nhiệt sinh khối (đun cách
thủy 100°c/lh).
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của ion mangan đến sự hình thành bào tử
2ể3ẵPhương pháp nghiên cứu
2ếj Ệi ế Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina
Pha 100ml môi trường canh thang (MT1) trong bình nón dung tích
250ml, đậy bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trừng ở 113°c trong 20

phút, để nguội. Tiến hành cấy giống B. clausiỉ từ chế phẩm vào bình nón
trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110 vòng/phút trong
24hắ
Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi trườngắ
2ếj Ệ2ế Giũ1giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường canh thang thạch (MT2), đun sôi cho đồng nhất các
thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín,
hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20 phút. Để nguội bớt rồi đặt nghiêngắ Dừng que
cấy cấy giống trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng theo hình
ziczac trong tủ cấy vô trùng, để ữong tủ ấm

37°c, trong khoảng 48hắ Sau khi

khuẩn lạc mọc thì cất giống vào tủ lạnhắ
Định kỳ 2 tháng cấy truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn.
2ếj Ệj ế Chuẩn 6;ềdịch nhân giống
Chuẩn bị 100ml môi trường MT1 trong bình nón dung tích 250ml. Hấp
tiệt trùng ở 113°c trong 20 phútệ Để nguội, dùng que cấy cấy khuẩn lạc trong


15

ống nghiệm chứa giống vào môi trường. Để trong máy lắc 110 vòng/phút ở
37°c trong 24h.
Cấy 10ml dịch nhân giống vào 100ml môi trường MT1 đã chuẩn bị,
đem lắc ở 37°c, 110 vòng/phút trong máy lắc. Sau khoảng thời gian xác định
lấy mẫu.
2.3.4. Phương pháp thu bào tử
2.3.4.1. Phả vỡ màng tể bào bằng lysozyme
- Ly tâm dịch sau khi lên men, thu cắn (5000 vòng/phút trong 10-15 phút).

- Cắn được hòa trong 10ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6, thêm khoảng
15 - 20ml dung địch lysozyme (1 mg/ml), ủ ở 37°c trong 30 phút để phá
vỡ vỏ bọc tế bào, giải phóng bào tử.
- Ly tâm dịch thu cắn (tốc độ 6000 vòng/phút trong 10-15 phút)
- Hòa cắn trong dung dịch KC1 IM để loại vỏ tế bào, ly tâm dịch thu cắn
(6000 vòng/phút trong 10-15 phút).
- Tiếp tục hòa cắn trong dung dịch NaCl IM để loại hoàn toàn vỏ tế bào, ly
tâm dịch thu cắn (6000 vòng/phút trong 10-15 phút)
- Thu cắn và rửa bằng nước cất 3 làn thu được bào tửệ
- Lượng bào tử được xác định bằng phương pháp cân hoặc đo độ đục hoặc
đếm số lượng bào tử [16].
2.3.4.2. Xử lí bằng nhiệt
- Dịch nuôi cấy sẽ được đun cách thủy ở 100°c trong lh để diệt hoàn toàn
dạng sinh dưỡng và tạo điều kiện để bào tử hình thành.
- Sau đó xác định lượng bào tử thu được bằng phương pháp đếm số lượng
khuẩn lạc hoặc xử lí bang lysozyme như trên rồi cân lượng bào tử [3].
2.3.5. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ôgietska
Nguyên tắc:


16

Màng bào tử: dày, chắc, chứa nhiều lipid khỏ bắt màu nên phải xử lý
để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acidệNhuộm màu cả tế bào
chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế
bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc nhuộm màu bằng thuốc nhuộm
bổ sung. Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bào có màu phân biệt.
Tiến hành:
- Làm tiêu bản vết bôi và để vết bôi khô tự nhiên.
- Nhỏ vài giọt HC1 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn cồn cho bốc

hoi, giữ 2 phút rồi rửa nước cấtệ
- Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc, rồi nhỏ dung dịch fuchsin Ziehl, hơ nóng
cho đến khi bốc hơi, nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5
phút.
- Bỏ giấy ra và rửa vết bôi lại bằng nước cất.
- Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2S04 1% trong 2

phútệ
- Rửa vết bôi bằng nước cất.
- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen Loeffler trong 5 - 1 5 phút.
- Rửa nước cất, để khô tự nhiên vết bôi.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu: bào tử màu đỏ, tế bào màu
xanh [2]ắ
2.3.6. Phương pháp xác định thời điểm tạo bào tử của Vỉễkhuẩn
❖ Trong môi trường lỏng:
Chuẩn bị môi trường lên men MT1, hấp tiệt trùng ở 113°c trong 20
phút. Cấy dịch nhân giống B. clausỉỉ vào, nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110
vòng/phút. Tại các thời điểm khác nhau (1, 2, 3, 4, 5.ệ. ngày) lấy mẫu đem
nhuộm tiêu bản theo Ôgietska để xác định thời điểm xuất hiện bào tử trong


17

điều kiện tự nhiênệ Đồng thời, lấy mẫu đem xử lí nhiệt rồi nhuộm tiêu bản
theo Ôgietska xác định thời điểm xuất hiện bào tử trong điều kiện xử lí nhiệt.
❖ Trong môi trường đặc
Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trùng ở
113°c trong 20 phút đổ vào mỗi đĩa petri 25ml thạch, để nguội đến nhiệt độ
phòng. Cấy vào mỗi đĩa lml dịch nhân giống, ủ trong tủ ấm 37°c. Sau các
thời điểm xác định làm tiêu bản theo phương pháp 2.3.5 xác định sự có mặt

của bào tử trong điều kiện tự nhiên và sau khi xử lí bằng nhiệt.
2.3.7. Phương pháp xác định lượng bào tử hình thành theo thời gian
❖ Trong môi trường lỏng:
Chuẩn bị môi trường lên men MT1, hấp tiệt trùng ở 113°c ữong 20
phútệ Cấy dịch nhân giống B. clausỉi, nuôi cấy trong máy lắc ở 37°c, 110
vòng/phút. Tại các thời điểm xác định thu dịch nuôi cấy xử lí theo phương
pháp 2.3.4ệl rồi xác định khối lượng bào tử hình thành khi nuôi cấy tự nhiên,
xử lí nhiệt để thu lượng bào tử tạo thành tại các thời điểm khác nhau bằng
phương pháp cân.
❖ Trong môi trường đặc:
Chuẩn bị môi trường thạch thường (MT2) và đĩa petri hấp tiệt trừng ở
113°c ữong 20 phút, đổ vào mỗi đĩa petri 25ml thạchắ Để nguội đến nhiệt độ
phòng, cấy vào mỗi đĩa lml dịch nhân giống, ủ trong tủ ấm

37°c. Sau các

khoảng thời gian xác định thu sinh khối, hòa vào nước cất vô trùng. Sinh khối
được xử lí bằng lysozyme để xác định lượng bào tử hình thành bằng phương
pháp cânắ
Tiến hành tương tự, sinh khối được xử lí nhiệt, phá vỡ vỏ bọc tế bào
bằng lysozyme để xác định lượng bào tử hình thành khi xử lí nhiệt.
2.3.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của Iểơn mangan đến sự hình
thành bào tử