Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH
DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH
SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC 118
VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH
DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH
SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC 118
VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN MINH QUỲNH

PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội – 2019


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Chiếu xạ
Hà Nội (Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam) đã tạo mọi điều kiện để tôi được
học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Minh Quỳnh đã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu
và thực hiện luận văn này. Xin cảm ơn các nghiên cứu viên phòng Nghiên cứu
Công nghệ Bức xạ đã giúp đỡ và thảo luận với tôi trong suốt quá trình tiến hành thí
nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà đã luôn
đồng hành cùng tôi tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, chia sẻ với tôi
những kỹ năng, kinh nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu và góp ý cho tôi để
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ
môn Vi sinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời
gian học tập và thực tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạo
cho tôi động lực và điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn này.
Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Khoa học và Công
nghệ cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN 19/16 do TS. Trần Minh Quỳnh làm chủ
nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2019

Học viên
Nguyễn Thị Thu Thủy


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S
rRNA [49] .................................................................................................................10
Hình 2. Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón ......................................................25
Hình 3. Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt ........................................26
Hình 4. Hạt phân bón được tạo ra từ thiết bị tạo hạt và thành phẩm sau khi sấy khô
...................................................................................................................................34
Hình 5. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của phân vi sinh đến cây cải bắp, cà chua
và cải củ. (A) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây bắp cải, (B) Khảo nghiệm đồng
ruộng của cây cà chua, (C) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây cải củ. .....................37


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh ........................5
Bảng 2. Thành phần hóa học của rỉ đường mía [13] và nước chiết đậu [12]............12
Bảng 3. Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. .........13
Bảng 4. Điều kiện nhân sinh khối đối với B.megaterium VACC 118 ......................20
Bảng 5. Các môi trường nuôi cấy và nhân sinh khối vi khuẩn .................................21
Bảng 6. Hỗn hợp đệm pH pha môi trường nước chiết đậu .......................................23
Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng
và phát triển của B.megaterium VACC 118 ............................................................28
Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của B.megaterium VACC 118. ........................................................................29
Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên quá trình sinh trưởng và phát triển
của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA ..............................................................30

Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................31
Bảng 11. Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................32
Bảng 12. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 1 đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA .....................................................................33
Bảng 13. Chất lượng của phân vi sinh vật dạng hạt.................................................35
Bảng 14. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến mật độ tế bào trong hạt phân bón
...................................................................................................................................35
Bảng 15. Tỉ lệ sống sót của B.megaterium trong hạt phân bón sau thời gian bảo
quản ...........................................................................................................................36
Bảng 16. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm nông học của cà chua....37


Bảng 17. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm nông học của cải bắp ...39
Bảng 18. Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm của cải củ .....................40


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1.

Tổng quan về phân bón vi sinh vật ................................................................4

1.1.1.

Định nghĩa phân bón vi sinh vật ................................................................4

1.1.2.

Phân loại phân bón vi sinh .........................................................................4

1.1.3.

Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng ................................................6

1.1.4.

Hạn chế của phân bón vi sinh ....................................................................7

1.2.

Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trưởng phát triển

của thực vật ..............................................................................................................8
1.3.

Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật Bacillus

megaterium ..............................................................................................................9
1.4.

Một số đặc điểm nuôi cấy vi sinh vật ..........................................................10

1.4.1.

Nguồn dinh dưỡng....................................................................................10

1.4.2.

Điều kiện nhiệt độ ....................................................................................14

1.4.3.

Hàm lượng O2 ..........................................................................................14

1.4.4.

pH môi trường ..........................................................................................14

1.4.5.

Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống ................................................................15

1.5.

Đặc điểm của chất mang sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh ............15

1.6.

Bọc tế bào VSV trong chất mang nguồn gốc alginate ................................16

1.7.

Xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn ...........................................................16

1.8.

Tính mới của đề tài ......................................................................................17

1.9.

Mục đích nghiên cứu ...................................................................................18

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................20


2.1.

Vật liệu. .......................................................................................................20

2.2.

Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ................................................20

2.3.

Môi trường nuôi cấy VSV sử dụng trong nghiên cứu .................................21

2.4.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22

2.4.1.

Hoạt hóa chủng B.megaterium VACC 118 .............................................22

2.4.2.

Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 phù hợp ............22

2.4.2.1.

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình

sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118......................................22
2.4.2.2.

Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của

B.megaterium VACC 118 .....................................................................................22
2.4.2.3.

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sinh trưởng

của B.megaterium VACC 118 ..............................................................................23
2.4.2.4.

Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy đến quá

trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ..................................................23
2.4.2.5.

Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ giống gốc đến quá trình sinh trưởng của

B.megaterium VACC 118 .....................................................................................24
2.4.3.

Tạo hạt phân bón vi sinh vật ....................................................................24

2.4.4.

Đánh giá chất lượng của phân bón vi sinh dạng hạt ................................26

2.4.5.

Đánh giá ảnh hưởng của phân bón VSV đối với cây rau .........................27

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................28
3.1.

Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium

VACC 118 và đánh giá chất lượng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt. .....28
3.1.1.
3.1.1.1.

Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 thích hợp ...........28
Đánh giá ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình

sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ...........................................................28


3.1.1.2.

Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của

B.megaterium VACC 118. ....................................................................................29
3.1.1.3.

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên men đến quá trình

sinh trưởng của B.megaterium VACC 118. .........................................................30
3.1.1.4.

Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy lên men

đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 ....................................31
3.1.1.5.

Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến quá trình sinh trưởng của

B.megaterium VACC 118. ....................................................................................33
3.1.2.
3.2.

Đánh giá chất lượng phân bón vi sinh dạng hạt .......................................34
Đánh giá hiệu quả phân bón trên cây rau ....................................................37

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT .............................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH ..............................................................42


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

PGPR

Vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng của thực vật (Plant

Growth Promoting Rhizobacteria)

VOCs

Các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (Volatile organic compounds)

VSV

Vi sinh vật

SX BA

Môi trường sản xuất nhân sinh khối Bacillus

ĐC

Mẫu đối chứng

TN1

Thí nghiệm 1

TN2

Thí nghiệm 2

LSD(0.05)

Chênh lệch nhỏ nhất ở mức độ tin cậy 95%

CV

Hệ số biến thiên


MỞ ĐẦU
Phân bón là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng bổ sung cho cây, giúp tăng
sản lượng cây trồng. Song theo các nhà khoa học đất đai và dinh dưỡng thực vật,
cây trồng chỉ có thể sử dụng chưa tới 50% lượng đạm (nitrogen) từ phân khoáng
hóa học cho sự phát triển, khoảng 50% còn lại được cung cấp từ phân chuồng, phân
hữu cơ, và một phần khá lớn do hoạt động của vi sinh vật (VSV) hữu ích trong đất
trồng như các chủng VSV cố định đạm (Azotobacter, Azospirilium, Rhizobium…),
VSV phân giải hợp chất phosphat thành dạng dễ tiêu (Bacillus, Pseudomonas…)
hay VSV sinh tổng hợp các hormon sinh trưởng thực vật (Azotobacter, Bacillus).
Theo định nghĩa, phân vi sinh là chế phẩm “inoculant” gồm các VSV sống
được bổ sung vào đất với khả năng cung cấp hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng giúp
cây trồng sinh trưởng tốt hơn, với năng suất và chất lượng cao hơn. Phân bón vi
sinh có thể được dùng ở dạng lỏng để phun trực tiếp vào đất hoặc ngâm với hạt
giống trước khi gieo. Tuy nhiên, ở dạng này, khả năng sống của các tế bào VSV và
mật độ của chúng trong quần thể nhanh chóng bị giảm xuống trong quá trình vận
chuyển và bảo quản. Trong những năm qua, các chế phẩm vi sinh dạng rắn trên nền
chất mang (carrier) đã được phát triển với các nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên như
than bùn, đất sét, bentonite và các phế thải nông nghiệp… song các chất mang này
đòi hỏi điều kiện đặc biệt để khử trùng do có mức độ tạp nhiễm ban đầu cao, và dễ
bị nhiễm tạp nên chỉ giữ được hiệu quả trong thời gian 3-6 tháng. Vì vậy, các nhà
khoa học đã quan tâm hơn đến việc làm thế nào để cải thiện tính ổn định của sản
phẩm và tăng thời gian bảo quản chúng.
Gần đây, các chất mang nguồn gốc polymer đã được các nhà khoa học quan
tâm nhờ khả năng hình thành cấu trúc mạng lưới không gian cho phép cố định các
tế bào sống để bảo vệ chúng chống lại các kích thích ngoại lai, giúp các tế bào vi

khuẩn ở trạng thái tiềm sinh dễ dàng nảy mầm khi được bón vào đất. Các tế bào có
thể được bọc vào trong gel polymer bằng cách phối trộn trước với chất mang hoặc
được hấp phụ vào trong chất mang dạng gel. Việc bọc “encapsulation” các tế bào

1


VSV trong lớp vỏ polymer như các polyacrylamide, alginate… có thể ngăn chặn
nhiễm tạp một cách hiệu quả, và kéo dài hoạt lực của các VSV. Nhiều loại chất
mang polymer đã được nghiên cứu và sử dụng như giá thể cố định enzyme, tế bào
VSV. Đáng chú ý nhất trong số đó là sodium alginate, một polysaccharide tích điện
âm có khả năng tạo gel khâu mạch với các ion tích điện dương. Vì vậy, các hạt
(bead) khâu mạch hình thành giữa alginate và ion calcium (Ca2+) đã được sử dụng
phổ biến như chất mang để vận chuyển các chất có hoạt tính sinh học, các enzym và
tế bào. Kết quả là, một số sản phẩm phân bón trên nền chất mang dạng gel alginatecalcium đã được phát triển [7, 29].
Tuy nhiên, do alginate là polysaccharide có kích thước phân tử lớn và độ
nhớt cao, dung dịch alginate thường chỉ có nồng độ thấp, làm cho gel tạo được
không đồng nhất và có tính bền cơ học kém. Hơn nữa, polymer này rất ưa nước, nên
sản phẩm dễ bị nhiễm tạp. Vì vậy, một số polymer khác đã được sử dụng như chất
độn (filler) để cải thiện tính bền cơ lý của hạt, đồng thời giảm chi phí làm khô, bảo
quản. Gần đây, người ta thấy rằng tinh bột biến tính có thể được sử dụng như chất
độn bổ sung vào công thức để tạo thành chất mang có tính bền cải thiện mà vẫn
phân hủy sinh học. Bên cạnh đó, polysaccharide này cũng có thể được các VSV tận
dụng như nguồn cacbon để duy trì khả năng sống trong quá trình bảo quản.
Trong những năm qua, kỹ thuật khử trùng sử dụng công nghệ bức xạ đã được
nghiên cứu và ứng dụng tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội để diệt côn trùng, nấm
mốc, đảm bảo chất lượng hàng hóa và kéo dài thời gian bảo quản. Xử lý chiếu xạ
cũng có thể tạo các hiệu ứng khâu mạch, cắt mạch và ghép mạch polymer tạo cho
chúng những đặc tính mới phù hợp với ứng dụng. Phương pháp này đã được áp
dụng để biến tính tinh bột sắn tạo sản phẩm tinh bột biến tính có khả năng tan trong

nước tốt hơn, dễ phân hủy sinh học hơn, với các đặc tính hóa lý phù hợp cho nhiều
ứng dụng khác nhau thay vì chỉ sử dụng như thành phần thực phẩm hoặc thức ăn gia
súc như hiện nay. Quá trình chiếu xạ với liều phù hợp cũng có tác dụng thanh trùng,
giúp tận dụng tinh bột biến tính bức xạ như thành phần chất mang chất lượng cao
trong sản xuất phân bón vi sinh trên nền chất mang khử trùng.

2


Nhằm cung cấp lựa chọn mới cho người dân, giảm thiểu sử dụng phân bón
hóa học, cũng như thúc đẩy ứng dụng năng lượng nguyên tử vì hòa bình, cụ thể là
xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản
xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn
Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ”.

3


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về phân bón vi sinh vật
1.1.1. Định nghĩa phân bón vi sinh vật
Phân bón vi sinh hay phân vi sinh là chế phẩm có chứa các loài vi sinh vật
(VSV) sống, mà khi được bón vào đất hay tiếp xúc với bề mặt rễ sẽ kích thích sự
phát triển của cây trồng bằng cách tăng lượng dinh dưỡng hữu ích cho cây trồng
[58]. Phân bón sinh học nói cách khác là một dạng phân bón hữu cơ hiện đại kết
hợp với sự có mặt của lợi khuẩn [55]. Theo Mohammadi và Sohrabi công bố năm
2012, phạm trù phân bón vi sinh có thể được sử dụng để chỉ tất cả các loại phân bón
hữu cơ giúp kích thích sinh trưởng thực vật thông qua sự tương tác giữa vi sinh vật
có trong phân bón đó với đất hoặc với cây trồng [44]
1.1.2. Phân loại phân bón vi sinh

Phân bón vi sinh được phân loại thành nhiều loại tùy thuộc vào chức năng
của các nhóm VSV chứa trong đó. Bảng 1. trình bày một số loại phân bón vi sinh
được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp hiện nay.
Phân bón vi sinh cố định nitơ (Nitrogen fixing bio-fertilizers - NFB): Ví dụ
Rhizobium spp., Azospirillum spp. và bèo hoa dâu; chúng cố định nitơ trong khí
quyển chuyển thành dạng nitơ hữu cơ (cây có thể sử dụng) trữ trong đất hoặc trong
nốt sần của rễ như ở cây họ đậu [18].
Phân bón vi sinh hòa tan phosphate (Phosphate solubilizing bio-fertilizer –
PSB): Một số VSV được sử dụng phổ biến để sản xuất phân bón loại này gồm
Bacillus spp., Pseudomonas spp. và Aspergillus spp. Các VSV này hòa tan
phosphate không tan trong đất chuyển thành dạng hòa tan, giúp cây trồng dễ dàng
hấp thu. Trong thực tế, phốt pho trong đất hầu hết tồn tại ở dạng không tan và cây
trồng không thể sử dụng [15]. Tuy vậy, một vài nhóm vi khuẩn và nấm trong đất có
tham gia vào quá trình chuyển hóa phốt phát bằng cách tiết ra axit hữu cơ làm giảm
pH đất, giúp hòa tan các hợp chất phosphate không tan [15].
Phân bón vi sinh chuyển hóa phosphate (Phosphate mobilizing bio-fertilizer –
PMB): Ví dụ nấm rễ Mycorrhiza sẽ biến đổi các hợp chất phosphat thông qua quá

4


trình khoáng hóa và hòa tan phốt pho cung cấp cho cây. Hiện nay, cơ chế và chứng
năng của PMB vẫn chưa được hiểu rõ [17].
Bảng 1. Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh
Loại phân bón
Nhóm VSV

Phân bón vi sinh cố định nitơ (Nitrogen fixing biofertilizers)

Sống tự do

Azotobacter, Bejerinkia, Clostridium, Klebsiella,
Anabaena, Nostoc

Sống cộng sinh

Rhizobium, Frankia, Anabaena, Azollae

Hoại sinh

Azospirillum
Phân bón vi sinh hòa tan phốt phát (Phosphate
solubilizing bio-fertilizer)

Vi khuẩn
Nấm

Bacillus megaterium var, Phosphaticum, Bacillus
subtilis, Bacillus circulans
Penicillum spp. , Aspergillus awamori
Phân bón vi sinh chuyển hóa photphat thành dạng
dễ tiêu (Phosphate mobilizing bio-fertilizers)

Nấm cộng sinh

Glomus spp., Gigaspora spp., Acaulospora spp.,

(Arbuscular Mycorrhiza)

Scutellospora spp. and Sclerocystis spp

Nấm rễ ngoài

Laccaria spp. Pisolithus spp., Boletus spp. and Amanita

(Ectomycorrhiza)

spp

Ericoid Mycorrhiza

Pezizella ericae

Orchid Mycorrhiza

Rhizoctonia solani
Phân bón vi sinh cung cấp dinh dƣỡng vi lƣợng
(Bio-fertilizers for micronutrients)

Bacillus sp.

VSV hòa tan silicat và kẽm (Silicate and zinc
solubilizers)
VSV rễ kích thích sinh trưởng thực vật

5


Pseudomonas

Pseudomonas fluorescens

Nguồn tham khảo: "Biofertilizer, a way towards organic agriculture: A review", in
trên tạp chí African Journal of Microbiology Research năm 2014 [10]
Phân bón vi sinh kích thích sinh trƣởng thực vật (Plant growth promoting
bio-fertilizer – PGPB). Nhóm này gồm các VSV vùng rễ như Pseudomonas spp….
Nhiệm vụ của nhóm VSV này là sản xuất ra các hocmon và chất kháng chuyển hóa
(anti- metabolites) giúp kích thích rễ phát triển, phân hủy chất hữu cơ, thúc đẩy quá
trình khoáng hóa trong đất, làm tăng năng suất cây trồng [11, 44]
Phân bón vi sinh hòa tan kali (Potassium solubilizing bio-fertilizer – KSB).
Thuộc nhóm này gồm Bacillus spp. và Aspergillus niger. Kali trong đất chủ yếu tồn
tại dạng khoáng silicat và cây trồng không sử dụng được kali dạng này. Một số
VSV tổng hợp ra các axit hữu cơ gây phân giải silicat, chuyển kali từ dạng khó tan
thành dạng dễ tan giúp cây dễ dàng hấp thụ.
Phân bón vi sinh làm di động kali (Potassium mobilizing bio-fertilizer –
KMB). Đại diện được sử dụng trong nhóm này bao gồm Bacillus spp. Các VSV này
sẽ thu hút kali dạng khó tan về khu vực chúng hoạt động và phân giải kali. Một số
phân bón vi sinh hòa tan phosphate có chứa Bacillus spp. và Aspergillus spp., đồng
thời cũng có khả năng di động kali [31].
Phân bón vi sinh oxi hóa sulfur (Sulfur oxidizing bio-fertilizer – SOB):
Thiobacillus spp. là một trong số các VSV có khả năng này. Chúng oxi hóa sulfur
thành sulfate giúp cây dễ dàng hấp thụ [31]
1.1.3. Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng
Phân bón vi sinh đóng vai trò quan trọng trong cải thiện độ màu mỡ của đất.
Bên cạnh đó, chúng cải thiện cấu trúc đất và giảm việc lạm dụng phân bón hóa học.
Tại các vùng đất ngập nước, việc sử dụng tảo xanh (blue green algae – BGA) cùng
với Azospirillum giúp cải thiện đáng kể năng suất của các cây họ lúa. Phân bón vi
sinh kết hợp Azotobacter, Rhizobium và Vesicular Arbuscular Mycorrhiza bón kèm
phosphate vô cơ giúp các cây họ lúa đạt năng suất tối đa [10]. Bèo hoa dâu (Azolla)

6


vừa không tốn kém, kinh tế lại thân thiện môi trường góp phần quan trọng trong
việc làm giàu carbon và nitơ cho đất.
Đối kháng sinh học (antagonis) là một đặc điểm khác mà phân bón vi sinh có
thể mang lại. Các chủng nấm Trichoderma đã được chứng minh là có khả năng
kiểm soát bệnh thối rễ ở cây đậu [10]. Tốc độ sinh trưởng, năng suất và chất lượng
là những thước đo cơ bản để đánh giá hiệu quả tác động của phân bón vi sinh lên
cây trồng, trong đó phải kể đến một số phân bón chứa các nhóm VSV hữu ích phổ
biến như nhóm vi khuẩn cố định đạm, hòa tan phosphate và kali [44].
Tóm lại, phân bón vi sinh có vai trò quan trọng trong nông nghiệp mà trong
đó phải kể tới 5 hiệu quả chính yếu sau: (1) kích thích sinh trưởng thực vật; (2) bảo
vệ cây trồng khỏi sự tấn công của sâu bệnh; (3) cải thiện độ màu mỡ của đất; (4)
thay thế một phần và giảm sử dụng phân bón hóa học; (5) tham gia vào chu trình tái
tạo đất tự nhiên và cải thiện lượng mùn hữu cơ.
1.1.4. Hạn chế của phân bón vi sinh
Hạn chế quan trọng nhất của phân bón vi sinh là hàm lượng dinh dưỡng của
chúng so với phân bón vô cơ. Điều này có nghĩa rằng, khi chỉ sử dụng phân bón vi
sinh sẽ dẫn tới sự thiếu hụt một số chất trong quá trình sinh trưởng của cây trồng.
Tuy nhiên, vấn đề này có thể được cải thiện bằng cách bổ sung một số cơ chất như
bột xương (giàu phốt pho), tro gỗ (giàu kali) hoặc các cơ chất khác có nguồn gốc tự
nhiên như quặng apatit để bổ sung vào phân bón vi sinh. Ngoài ra việc sử dụng các
phụ phẩm nông nghiệp giàu dinh dưỡng như khô dầu cọ (giàu kali), tro gỗ (giàu
kali)… làm thành phần phân bón vi sinh cũng cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho
đất. Mahimairaja và cộng sự đã cho thấy việc bổ sung phốt pho từ các phụ phẩm
nông nghiệp giúp phân bón sinh học cân bằng hơn và giảm hao hụt nitơ [40].
Một điểm hạn chế nữa của phân bón vi sinh là kém bền và dễ bị giảm chất
lượng sau một thời gian bảo quản do VSV bị chết hoặc nhiễm tạp. Thông thường,
phân vi sinh được đóng vào các túi polyethylene (PE) có độ dày khoảng 50-70 m,

và bảo quản ở nhiệt độ thấp (4C) hoặc trong phòng không bị chiếu sáng trực tiếp
(25C) [43]. Thời gian sử dụng ngắn, chất mang không phù hợp, nhiệt độ cao, và

7


những khó khăn trong vận chuyển, bảo quản là những vấn đề cần được cải thiện để
giúp phân bón vi sinh trở nên phổ biến trong nông nghiệp.
1.2. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trƣởng phát
triển của thực vật
Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria- PGPR) là vi khuẩn trong đất, sinh sống xung quanh hoặc trên bề mặt
rễ, trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia kích thích sinh trưởng và phát triển thực vật
thông qua sản xuất và tiết ra những chất hóa học khác nhau vào vùng rễ cây [34].
PGPR phát triển qua ba giai đoạn: phát tán từ hạt giống, nhân nhanh mật độ trong
vùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển trong hệ thống cây [33]. Sự giảm tác dụng
của PGPR trong các thí nghiệm ngoài đồng ruộng thường là do vi khuẩn thiếu khả
năng bám trụ vào rễ cây [9, 14]. Các nhà khoa học phỏng đoán có nhiều gene chịu
trách nhiệm giúp vi sinh vật xâm nhập vào rễ cây, tuy nhiên, hiện tại mới có một số
ít gene được giải mã [9, 38]. Các gene này chi phối khả năng di động của vi sinh vật
như khả năng hình thành tiêm mao hoặc roi, khả năng sản sinh ra những chất đặc
biệt giúp bám trên bề mặt rễ cây hoặc khả năng sản sinh các chất cảm ứng [38].
PGPR tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng thực vật bởi trực tiếp hoặc hỗ
trợ việc thu thập nguồn dưỡng chất (đạm, lân và các khoáng chất thiết yếu) hoặc
điều chỉnh hormone thực vật, hoặc gián tiếp làm giảm các tác nhân gây bệnh khác
nhau ức chế sinh trưởng thực vật. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, PGPR kích thích
sinh trưởng thực vật nhờ khả năng hòa tan phốt pho [21, 50], kali [48] hoặc cố định
nitơ [59] từ dạng tự do trong không khí. Không chỉ vậy, PGPR còn thúc đẩy sự tăng
trưởng thực vật thông qua việc sản xuất các phytohormone như auxin, cytokinin và
gibberellin [52]. Ngoài ra, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs - Volatile organic

compounds) như acetoin và 2,3-butanediol có tác dụng điều hòa nội cân bằng auxin
trong cây cũng được Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqufaciens và Enterobacter
cloacae tạo ra như các chất kich thích tăng trưởng thực vật [30, 60]. Các cofactor
PQQ (pyroquinoline quinine) cũng là tác nhân kích thích tăng trưởng thực vật được
tìm thấy ở Pseudomonas fluorescens [30]. Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các

8


chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, một số chủng vi khuẩn cũng sinh enzyme
phân hủy các hợp chất hữu cơ, góp phần cải tạo đất, hoặc sinh tổng hợp các
phytoalexin có hiệu quả kích thích khả năng chống chịu của thực vật đối với một số
dịch bệnh do virut, vi khuẩn gây ra [22]. Nhiều nghiên cứu cũng đã ghi nhận việc
ứng dụng PGPR trong trồng trọt làm tăng sức đề kháng và năng suất của các loại
cây trồng khác nhau trong cả điều kiện bình thường và bất lợi [11]. Các vi khuẩn có
lợi ở vùng rễ thực vật có thể làm giảm sự phụ thuộc vào nông dưỡng nguy hại gây
bất ổn cho hệ sinh thái nông nghiệp. Do những đặc tính trên, PGPR đã đươc ứng
dụng rất nhiều trong sản xuất.
1.3. Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật Bacillus
megaterium
B.megaterium lần đầu được miêu tả bởi Anto De Bary từ năm 1884 [6]. Tên
“megaterium” do vi khuẩn này có kích thước lớn, thực tế đây là vi khuẩn lớn nhất
trong số các bacilli với kích thước từ 1.5 - 4µm. Rất lâu trước khi Bacillus subtilis
được sử dụng như một sinh vật đại diện cho nhóm Gram Dương, B.megaterium đã
được nghiên cứu trong lĩnh vực hóa sinh như một bacteriophages [20]
B.megaterium là vi khuẩn Gram Dương, có hình que, có bào tử và được xếp
là loài chìa khóa (key species) trong quá trình phát sinh loài của nhóm Bacillus. Vị
trí của B.megaterium trong cây phát sinh được mô tả trong Hình 1.
B.megaterium có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và nông
nghiệp. B.megaterium là một trong số những sinh vật được sử dụng áp dụng công

nghệ gene để sản xuất B12 [23]. Đặc biệt, B.megaterium được chứng minh có thể
tổng hợp vitamin B12 trong điều kiện có hoặc không có oxy [25]. Bên cạnh đó,
B.megaterium được sử dụng như sinh vật chuyển gene để sản xuất protein tái tổ hợp
nhờ có vùng multiple cloning sites và khả năng tạo protein thể vùi dễ tinh sạch [51].
Trong nông nghiệp, B.megaterium

được chứng minh có khả năng hòa tan

phosphate vô cơ, tổng hợp IAA – một loạt chất kích thích sinh trưởng thực vật,
chuyển hóa sắt vô cơ và tổng hợp một số chất có hoạt tính kháng nấm [16]

9


Hình 1. Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S
rRNA [49]
1.4. Một số đặc điểm nuôi cấy vi sinh vật
1.4.1. Nguồn dinh dƣỡng
Vi sinh vật cũng như các loài động thực vật khác, chúng luôn có nhu cầu sử
dụng các nguồn dinh dưỡng để duy trì các hoạt động sống. Các chất dinh dưỡng cần
thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của VSV có thể được hấp thụ từ môi trường
xung quanh và được sử dụng làm nguyên liệu cung cấp năng lượng hoặc chuyển
hóa trao đổi chất tạo ra các thành phần của tế bào. Tuy nhiên không phải mọi thành
phần của môi trường nuôi cấy đều được coi là chất dinh dưỡng. Một số chất rắn cần

10


thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về thế
oxy hoá - khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion… Chất dinh dưỡng phải là

những chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào [39]
Cacbon là nguyên tố quan trọng nhất, hình thành nên các hợp chất hữu cơ
thiết yếu cho sự sống. Các hợp chất chứa cacbon cũng có thể bị thủy phân và là
nguồn năng lượng chính cho hoạt động sống của tế bào. Các hợp chất hữu cơ chứa
nhiều cacbon trong tự nhiên là các loại hydrat cacbon, mà khi thủy phân sẽ tạo
thành các gốc đường. Mặc dù, các chủng VSV khác nhau có thể sử dụng các nguồn
cacbon khác nhau, nhưng đường thường được bổ sung vào môi trường nhân sinh
khối, do chúng dễ dàng được các VSV hấp thụ và chuyển hóa cho hoạt động sống
của các VSV. Trong sản xuất công nghiệp, rỉ đường và nước chiết đậu thường được
dùng như nguồn cung cấp cacbon và năng lượng. Rỉ đường cũng chứa nhiều nguyên
tố vi lượng cần thiết cho sản xuất sinh khối (Bảng 2). Cellulose cũng có thể được
đưa vào các môi trường nuôi cấy VSV phân giải cellulose dưới dạng giấy lọc, bông
hoặc các loại bột cellulose (cellulose powder, avicel ...)
Thành phần rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, đất trồng và điều kiện canh
tác, cũng như công nghệ sản xuất đường. Thông thường, rỉ đường chứa lượng chất
khô chiếm 80-85%, còn lại là nước. Thành phần chính của chất khô gồm đường,
hợp chất hữu cơ chứa nitơ dưới dạng axit amin, các chất hữu cơ không chứa nitơ và
nhiều nguyên tố vi lượng khác. [13]
Nitơ. Chỉ một số chủng VSV cố định nitơ có khả năng chuyển hóa N2 tự do
trong không khí, còn lại phần lớn các VSV bao gồm các chủng VSV kích thích sinh
trưởng chọn không thể đồng hóa N2 không khí [41]. Do rỉ đường chứa ít nitơ (Bảng
2), khi nhân sinh khối sử dụng rỉ đường, thường phải bổ sung nguồn nitơ dưới dạng
ure hoặc amon sulfat. Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự
phát triển của vi sinh vật. Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 và
NH4+. Muối nitrat là nguồn thức ăn chứa nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm
sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nấm men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật
sử dụng hết gốc NO3 các ion kim loại lẫn trong muối hoặc trong rỉ đường sẽ làm

11

kiềm hoá môi trường. Đối với, nhân giống cấp 1 trong phòng thí nghiệm, các hợp
chất hữu cơ chứa nitơ như pepton cũng có thể được sử dụng để cung cấp nitơ cho
VSV phát triển.
Bảng 2. Thành phần hóa học của rỉ đường mía [13] và nước chiết đậu [12]
Thành phần

Tỷ lệ

Rỉ đƣờng mía

Nƣớc chiết đậu

Đường tổng số

%

48 - 56

48 - 52

Chất hữu cơ khác đường

%

9 - 12

12 - 17

Protein

%

2-4

6 - 10

Kali

%

1.5 - 5.0

2,0 - 7,0

Canxi

%

0.4 - 0.8

0,1 - 0,5

Magie

%

 0.06

Photpho

%

0.6 - 2.0

0,02 - 0,07

Biotin

mg/kg

1.0 - 3.0

0,02 - 0,15

Axit pantotenic

mg/kg

15 - 55

50 - 110

Inozitol

mg/kg

2500 - 6000

5000 - 8000

Tiamin

mg/kg

 1.8

 0,09

 1,3

Nguồn tham khảo: Thành phần nước chiết đậu -"Chemical composition of some
faba bean cultivars", đăng tạp chí Canadian Journal of Plant Science năm 1974
[12]. Thành phần gỉ đường - Composition of Came Juce and Cane Final Molasses
đăng tạp chí Advances in carbohydrate chemistry năm 1953 [13].
Ngoài việc cung cấp các nguyên tố đa lượng từ các hợp chất hữu cơ, một số
chất khoáng cũng được bổ sung như thành phần môi trường trong nuôi cấy VSV. Vì
lượng chất khoáng cần thiết đối với VSV thay đổi theo loài, giai đoạn phát triển và
điều kiện sống của VSV, cần phải nghiên cứu lựa chọn hàm lượng khoáng phù hợp
cho từng loại VSV cụ thể. Đối với VSV kích thích sinh trưởng lựa chọn trong

12


nghiên cứu này, nguồn chất khoáng cần thiết tương tự như đối với các loài nấm và
xạ khuẩn (Bảng 3).
Bảng 3. Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn.
Muối khoáng

Nồng độ cần thiết (g/l)

Đối với vi khuẩn

Đối với nấm và xạ khuẩn

K2HPO4

0.2 - 0.5

1-2

KH2PO4

0.2 - 0.5

1-2

MgSO4.7H2O

0.1 - 0.2

0.2 - 0.5

MnSO4.4H2O

0.005 - 0.01

0.02 - 0.1

FeSO4.7H2O

0.005 - 0.01

0.02 - 0.05

Na2MoO4

0.001 - 0.005

0.01 - 0.02

_

0.02 - 0.1

CoCl2

Tới 0.03

Tới 0.06

CaCl2

0.01 - 0.03

0.02 - 0.1

0.001 - 0.005

0.01 - 0.05

ZnSO4.7H2O

CaSO4.5H2O

Nguồn tham khảo: "Effects of pH, temperature, and mineral nutrition on
cellulolytic fungi", đăng tạp chí American Journal of Botany năm 1951 [53]. Và
cuốn Brock biology of microorganisms 13th edition năm 2010 [39]
Các nguyên tố khoáng này có thể không cần thiết khi nhân sinh khối VSV
trong các môi trường tự nhiên như môi trường nước chiết đậu, nước canh thịt, sữa,
huyết thanh, pepton, giá đậu… Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (dùng
nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đầy đủ các nguyên tố khoáng.
Vi sinh vật muốn phát triển bình thường không những đòi hỏi phải được
cung cấp đầy đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh
trưởng. Tuỳ thuộc vào khả năng sinh tổng hợp của từng loại vi sinh vật mà cùng
một chất có thể hoàn toàn không cần thiết với VSV này nhưng lại không thể thiếu

13


VSV khác. Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung đối với tất cả các
loài VSV. Tuỳ theo từng loại VSV mà chúng ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy
những chất sinh trưởng khác nhau.
1.4.2. Điều kiện nhiệt độ
Hoạt động trao đổi chất của tế bào VSV có thể coi là kết quả của các phản
ứng hoá học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt
độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào [39]. Mỗi loại VSV
thích ứng với khoảng nhiệt độ khác nhau. Tuỳ theo quan hệ với các vùng nhiệt khác
nhau, có thể phân chia thành:
-

Nhóm VSV ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhất ở dải nhiệt độ từ 6 - 15°C.

-

Nhóm VSV ưa ấm: Đa số vi sinh vật thuộc loại này, nhiệt độ tốt nhất cho
loài vi sinh vật này nằm trong khoảng từ 25 - 37ºC.

-

Nhóm VSV ưa nhiệt: Sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt độ từ 50 60°C, một số loài không sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 30ºC, nhiệt độ sinh
trưởng cực đại của các vi sinh vật nằm trong khoảng 75 - 80°C.
Do quá trình lên men luôn có sự toả nhiệt rất mạnh, cần thiết phải kiểm soát

nhiệt độ trong thiết bị lên men trong khoảng phù hợp cho sự sinh trưởng và phát
triển của VSV, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả lên men. Thông thường, cần
phải bổ sung hệ thống làm mát khi nhân giống trên quy mô công nghiệp.
1.4.3. Hàm lƣợng O2
O2 có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống của tế bào. Tuỳ thuộc vào
nhu cầu O2 của VSV mà người ta đưa vào hoặc có biện pháp điều chỉnh để cung cấp
đủ lượng O2 cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển phù hợp VSV trong từng giai
đoạn của quá trình nhân sinh khối [39].
1.4.4. pH môi trƣờng
pH có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật. Các
ion H+ và OH- là hai ion hoạt động mạnh nhất trong tất cả các ion, những biến đổi
dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có những ảnh hưởng mạnh mẽ. Các loại vi
sinh vật khác nhau có khả năng thích nghi với các điều kiện pH khác nhau.[53]

14

1.4.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống
Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn.
Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất
thu hồi sinh khối thấp. Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút
ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển quá nhanh làm
cho nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế
quá trình sinh trưởng [39]. Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm giống,
đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men.
1.5. Đặc điểm của chất mang sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh
Phân bón vi sinh thường phải sử dụng chất mang để tăng hiệu quả, chất
lượng và thời gian bảo quản. Theo Somasegaran và Springer [54], một chất mang
tốt cần phải thỏa mãn các đặc tính sau: (1) Rẻ và dễ kiếm. (2) Dễ khử trùng bằng
hấp tiệt trùng hoặc xử lý chiếu xạ gamma. (3) Dễ xử lý, chế biến mà không bị vón
cục. (4) Không độc hại cho vi sinh vật và thực vật. (5) Có khả năng hấp thụ ẩm tốt
và có thể giữ nước trên 50%. (6) T tạo được cấu trúc tốt cho sự bám dính của vi sinh
vật. (7) Có pH phù hợp, ổn định và chứa hàm lượng chất hữu cơ cao.
Khosro và Yousef [44] cho rằng việc kết hợp các vi sinh vật vào chất mang
cho phép quá trình tạo phân bón vi sinh trở nên dễ dàng, đồng thời kéo dài thời gian
lưu trữ lâu dài và hiệu quả của phân. Họ cũng cho rằng khử trùng chất mang là điều
cần thiết để giữ số lượng lớn VSV có ích trong thời gian dài. Một vài ví dụ về chất
mang thông dụng hiện đang được sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh bao gồm
mùn cưa, đất sét, phân chuồng, phân giun đất. Trong vài thập niên trở lại đây, một
vài chất mang mới nguồn gốc polymer đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản
xuất phân bón như polyacrylamide [24] hoặc sodium alginate [26]. Các chất mang
polymer này đều dạng bột, cấu trúc mạng lưới, cho phép bắt giữ VSV trong mạng
lưới của chúng, bảo vệ VSV khỏi các áp lực từ môi trường trong quá trình bảo quản
(nhiệt độ, ánh sáng,…) và khi gặp điều kiện thuận lợi, các polymer này sẽ lại từ từ
giải phóng VSV vào trong đất [32]. Các chất mang dạng gel polymer cho phép các
tế bào có thể tồn tại với hoạt tính lâu dài [7].

15