Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại việt nam và tạo chủng đột bi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

LÊ MINH HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ
BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN
GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT
VẮC XIN PHỊNG BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------

LÊ MINH HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ

BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN
GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT
VẮC XIN PHỊNG BỆNH
Chun ngành:

Cơng nghệ sinh học

Mã số:

9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Tâm
PGS.TS. Tô Long Thành

Hà Nội, năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do tơi thực hiện. Tồn
bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng
được sử dụng để công bố trong các cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, các
thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018
Tác giả luận án

Lê Minh Hải

i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài luận án này, ngồi sự lỗ lực của bản thân tơi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân. Trước hết tơi xin
bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở
Hà Nội), PGS. TS. Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đốn thú ý Trung ương)
đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tơi
hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công
nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong
đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hồn thành luận án này.
Để hồn thành luận án này, tơi cịn nhận được sự động viên, khuyến
khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp
đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tơi có thể hồn thành
cơng trình nghiên cứu này. Tơi xin chân thành cảm ơn tất cả những giúp đỡ
quý báu đó!
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018
Tác giả luận án

Lê Minh Hải

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................viii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tình hình ni cá biển trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 4
1.1.1. Tình hình ni cá biển trên thế giới ........................................................ 4
1.1.2. Tình hình ni cá biển ở Việt Nam......................................................... 5
1.2. Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng ........................................ 8
1.3. Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae gây
ra trên cá biển .................................................................................................. 10
1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae ....................................................... 10
1.3.2. Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển ......... 15
1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc .......................................... 19
1.4.1. Phương pháp vật lý ............................................................................... 19
1.4.2. Các phương pháp vi sinh vật học .......................................................... 21
1.4.3. Đột biến bằng kháng sinh rifampicin .................................................... 22
1.4.4. Giảm độc bằng kỹ thuật gen ................................................................. 24
1.5. Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh .................................. 25
1.5.1. Đáp ứng miễn dịch của cá ..................................................................... 25
1.5.2. Vắc xin phòng bệnh cho cá ................................................................... 29
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 42
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 42
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 42
2.2.1. Động vật thí nghiệm .............................................................................. 42
iii


2.2.2. Hóa chất................................................................................................. 42
2.2.3. Mơi trường và dung dịch ni cấy vi khuẩn ......................................... 42
2.2.4. Thiết bị .................................................................................................. 43

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 43
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 43
2.4.1. Phương pháp thu mẫu cá bệnh .............................................................. 43
2.4.2. Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng ...................................................... 44
2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae ................. 44
2.4.4. Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn ...................... 45
2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển
chọn ................................................................................................................. 45
2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả
năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn............................ 46
2.4.7. Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất
huyết nhiễm trùng) trên cá biển của vi khuẩn P. damselae ............................ 47
2.4.8. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 .......... 48
2.4.9. Phương pháp tách chiết DNA ................................................................. 48
2.4.10. Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P.damselae subsp.
Damselae và P. damselae subsp. piscicida ..................................................... 49
2.4.11. Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA .................................... 49
2.4.12. Phương pháp điện di trên agarose ....................................................... 50
2.4.13. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực
nghiệm ............................................................................................................. 50
2.4.14. Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm
độc lực.............................................................................................................. 51
2.4.15. Phương pháp mô bệnh học .................................................................. 52
2.4.16. Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen ........... 53

iv


2.4.17. Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá
của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực ....................................................... 53

2.4.18. Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu ............................. 53
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 55
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damselae ................................................... 55
3.1.1. Đặc điểm mẫu cá bệnh .......................................................................... 55
3.1.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển
nuôi lồng .......................................................................................................... 57
3.1.3. Xác định phân loài P. damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng
phương pháp sinh học phân tử ........................................................................ 61
3.1.4. Nghiên cứu độc lực của các chủng P. damselae phân lập .................... 63
3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae phân
lập được ............................................................................................................ 65
3.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và
gây dung huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................... 65
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi
khuẩn P. damselae .......................................................................................... 69
3.2.3. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung
huyết của vi khuẩn P. damselae ...................................................................... 71
3.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc
lực .................................................................................................................... 73
3.3.1. Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae
đột biến ............................................................................................................ 73
3.3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn
Photobacterium damselae đột biến ................................................................. 76
3.3.3. Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn P. damselae đột biến
giảm độc lực trên cá mú .................................................................................. 81

v


3.3.4. Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn

Photobacterium damselae nhược độc ............................................................. 88
3.4. Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn
Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực......................................... 104
3.4.1. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu ............................. 104
3.4.2. Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ ............................... 106
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 111
Kết luận ......................................................................................................... 111
Kiến nghị ....................................................................................................... 111
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................ 112
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................... 113
PHỤ LỤC

vi


Chữ viết tắt
AFLP
BFNNV
BHI
CFU
cs
Da
DNA
ELISA
FA
GS
IgM
LD50
nt

OD
ORF
PCR
RNA
TCBS
UV
VNN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Giải thích
Amplified fragment length polymorphism
Barfin flounder nervous necrosis virus
Brain heart infusion
Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc
Cộng sự
Dalton
Deoxyribonucleic acid
Enzyme linked immunosorbent assay
Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang
Grouper spleen – tế bào lách cá mú
Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M
Lethal dose 50 - liều gây chết 50%
Nucleotide
Optical density - mật độ quang
Open reading frame -khung đọc mở
Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction
Ribonucleic acid
Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy
Ultra violet
Viral nervour necrosis

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới ........... 4
Bảng 1.2. Các lồi cá biển ni chủ yếu ở Trung Quốc ................................... 5
Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam ................................... 7
Bảng 1.4. Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực ................. 37
Bảng 2.1. Mồi khuếch đại các gen UreC và 16S RNA ................................... 49
Bảng 2.2. Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA .............................................. 49
Bảng 3.1. Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm .............................................. 56
Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn P. damsalae từ các mẫu cá biển nghi
mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) .............................. 58
Bảng 3.3. Kết quả xác định liều LD50 của các chủng vi khuẩn P.damselae
phân lập .......................................................................................... 64
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết
của vi khuẩn P. damselae T1.7 và T4.3 ......................................... 69
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P.
amselae T1.7 và T4.3 ..................................................................... 71
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn
P. damselae T1.7 và T4.3 .............................................................. 73
Bảng 3.7. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân
UV .................................................................................................. 74
Bảng 3.8. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae nhược độc bằng tác nhân
kháng sinh Rifampicin ................................................................... 75
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra gây dung huyết của các dòng Photobacterium
damsela đột biến ............................................................................ 77

Bảng 3.10. Kết quả xác định liều LD50 của các dòng vi khuẩn P.damselae đột
biến ................................................................................................. 80
Bảng 3.11. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm ........... 81

viii


Bảng 3.12. Biểu hiện bệnh tích do P. damselae trên cá thí nghiệm ............... 83
Bảng 3.13. Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá
thí nghiệm ...................................................................................... 85
Bảng 3.14. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập lại từ cá gây nhiễm .... 87
Bảng 3.15. So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank với chủng P.damselae
T4.3 ................................................................................................ 92
Bảng 3.16. So sánh độ tương đồng gen dly Genbank so với chủng P.damselae
T4.3 .............................................................................................. 101

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Hình thái của vi khuẩn P. damselae ............................................... 11
Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine. ......................... 21
Hình 1.3. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56]. ..................................... 23
Hình 1.4. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56]. ................................ 23
Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp mơ bệnh học .................................................. 52
Hình 3.1. (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng
(c) Mẫu cá mú khơng bị bệnh............................................................................. 55
Hình 3.2. Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis................. 56

Hình 3.3. Hình thái vi khuẩn P. damselae...................................................... 59
Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của chủng T1.7 ......... 60
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và
16S rRNA của vi khuẩn P. damselase ............................................................. 62
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của
vi khuẩn P. damselae T1.7 .............................................................................. 66
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của
vi khuẩn P. damselae T4.3 .............................................................................. 66
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P. damselae .... 70
Hình 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ... 72
P. damselae phân lập....................................................................................... 72
Hình 3.10. Khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV .......................................... 75
Hình 3.11. Khuẩn lạc sống sót sau khi sử dụng kháng sinh rifampicin ......... 76
Hình 3.12. Hình ảnh dung huyết thạch máu của các dịng vi khuẩn thí nghiệm . 77
Hình 3.13. Biểu hiện bệnh tích bên ngồi của cá mú gây nhiễm chủng P.
damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày) ............................................ 82
Hình 3.14. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây
nhiễm ............................................................................................................... 84

x


Hình 3.15. Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm... 86
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng
giống gốc và các dòng gây giảm độc lực ........................................................ 89
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dly của chủng
giống gốc và các dịng gây giảm độc lực ........................................................ 89
Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự gen hlyA của chủng gốc T4.3 với trình tự
hlyA trên Genbankmã số KF984030.1 ............................................................ 92
Hình 3.19. So sánh trình tự gen hlyA của các dịng đột biến và chủng T4.3 gốc .. 95

Hình 3.20. Vị trí mã mở đầu và mã kết thúc vùng mã hóa protein của dịng
U4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 .......................................................................... 98
Hình 3.21. So sánh trình tự amino acid của các dịng T4.3U6, T4.3K8.2 và
chủng gốc T4.3 ................................................................................................ 99
Hình 3.22. Kết quả so sánh trình tự gen dly của chủng gốc T4.3 và LBT6 với
trình tự gen dly của Genbank ........................................................................ 100
Hình 3.23. Trình tự đoạn gen dly của các dịng đột biến với chủng gốc T4.3 . 102
Hình 3.24. Trình tự protein suy diễn của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 102
Hình 3.25. Biến thiên mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu ở cá được tiêm
vi khuẩn nhược độc và vơ hoạt ..................................................................... 105
Hình 3.26. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.8 sau khi
tiêm vi khuẩn nhược độc và vơ hoạt ............................................................. 107
Hình 3.27. Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.7 sau khi
tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt ............................................................. 108

xi


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích
có khả năng sử dụng phát triển ni cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi
triều ven biển và một phần ở các hải đảo, vùng biển hở. Biển Việt Nam có
nhiều lồi cá phân bố tự nhiên có thể đưa vào ni biển như nhóm cá mú, cá
hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược... Trong chương trình ni, đến năm
2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.000 tấn cá biển ni trong đó
50.000 tấn là ni theo quy mơ lớn [16].
Hiện tại, mơ hình ni cá lồng bè có giá trị kinh tế cao trên biển đang
được áp dụng phổ biến ở nhiều vùng ven biển nước ta. Tuy nhiên, việc phát
triển mơ hình nuôi nhanh về số lượng cũng như về mức độ thâm canh ngày

càng cao, tình hình dịch bệnh gây chết cá hàng loạt cũng đã được ghi nhận
ngày càng nhiều với tỉ lệ hao hụt cao. Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium
damselae gây bệnh Photobacteriosis hay Pasteurellosis còn được gọi là xuất
huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên cá biển [5].
Vi khuẩn P. damselae có thể tấn cơng và gây bệnh trên cá biển nuôi ở
tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá
nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp
tính, biểu hiện bệnh Photobacteriosis như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt
kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây
hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và
hoại tử rộng rãi [146], [41]. Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết
cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây
Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ,... Ở Việt Nam, theo báo cáo của các tác giả
Đỗ Thị Hòa và cs năm 2008, cho thấy các lồi cá biển ni tại Khánh Hịa,

1


Kiên Giang và các tỉnh phía Bắc đều bị bệnh do vi khuẩn P. damselae và gây
thiệt hại lớn cho người nuôi [5].
Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phịng bệnh cịn rất ít
do các nghiên cứu và sản xuất còn hạn chế, trên thị trường khan hiếm vắc xin
thương mại. Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn P. damselae chủ yếu là ở dạng
vô hoạt, sử dụng bằng cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá
giống kích thước bé. Người ni cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị
bệnh do vi khuẩn P. damselae dẫn đến sự kháng thuốc, tồn dư kháng sinh
trong sản phẩm. Nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, thì nghiên cứu tạo
vắc xin phịng bệnh là rất cần thiết. Hiện tại, có nhiều phương pháp để tạo vắc
xin, trong đó phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi khuẩn nhược
độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm là phương pháp phổ biến và rất

hữu hiệu khắc phục được các hạn chế của vắc xin vô hoạt.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây
bệnh trên một số lồi cá biển ni lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến
giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh” làm cơ sở ban đầu
hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển trên
quy mô công nghiệp.
2. Mục tiêu đề tài luận án
- Xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn
P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam.
- Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin
phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: Vi khuẩn Photobacterium damselae, một số loài cá biển
nuôi lồng (cá mú, cá hồng mỹ, cá bớp (cá giò).
2


- Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
- Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã xác định được các đặc tính
sinh học của các chủng vi khuẩn P. damselae gây bệnh Photobacteriosis ở cá
là cơ sở khoa học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng
trị bệnh.
- Kết quả tạo vi khuẩn P. damselae giảm độc lực bằng kỹ thuật gây đột
biến là cơ sở cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho
định hướng sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu quả cao.
Ý nghĩa thực tiễn:
Đề tài đã tạo được chủng vi khuẩn P. damselae giảm độc lực, an tồn,

có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc
xin phịng bệnh Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi và
phát triển bền vững nghề nuôi cá biển ở nước ta.
5. Đóng góp mới của đề tài luận án
- Ở Việt Nam đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện về vi
khuẩn P. damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng, đã phân lập và xác định
được 07 chủng vi khuẩn, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn
gây bệnh.
- Luận án là cơng trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi
khuẩn P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh
Photobacteriosis ở cá biển. Thành cơng của nghiên cứu sẽ góp phần giải
quyết vấn đề một cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng
nhờn thuốc và giảm sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, nâng giá trị sản
phẩm cá biển, tăng năng suất cá biển nuôi lồng.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ni cá biển trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Tình hình nuôi cá biển trên thế giới
Theo số liệu của FAO, 2016, tổng sản lượng ni trồng thủy sản tồn
cầu năm 2014 là 73,8 triệu tấn, trong đó 26,7 triệu tấn nuôi biển (Bảng 1.1).
Đối với sản xuất thủy sản biển, Trung Quốc vẫn là nước sản xuất chính tiếp
theo là Ấn Độ và Việt Nam.
Bảng 1.1. Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới
Đơn vị: Triệu tấn
Năm
Sản lượng
2009

2010 2011 2012 2013 2014
Đánh bắt
Nội địa
10,5
11,3
11,1 11,6
11,7
11,9
Biển
79,7
79,7
82,6 79,7
81,0
81,5
Tổng sản lượng đánh bắt
90,2
89,1
93,7 91,3
92,7
93,4
Nuôi trồng
Nội địa
34,3
36,9
38,6 42,0
44,8
47,1
Biển
21,4
22,1

23,2 24,4
25,5
26,7
Tổng sản lượng nuôi trồng
55,7
59,0
61,8 66,5
70,3
73,6
Tổng
145,9 148,1 155,5 157,8 162,9 167,2
Nguồn: FAO 2016
Ở Trung Quốc, việc nuôi lồng bắt đầu vào cuối những năm 1970, ban
đầu là nuôi trồng thủy sản nội địa và sau đó ni biển. Vào cuối những năm
1970, tỉnh Quảng Đông đã thành công trong việc nuôi cá biển bao gồm cá mú
và cá chẽm trong lồng. Năm 1984, số lượng lồng cá biển ở ba tỉnh Quảng
Đông, Phúc Kiến và Chiết Giang đã đạt trên 57000. Đến năm 2005, tổng số
lồng biển của các mơ hình khác nhau đã đạt đến một triệu, sản lượng nuôi
lồng là khoảng 200000 tấn/năm với hơn 40 loài cá (Bảng 1.2)[49]. Trong 5
năm gần đây, nghề nuôi cá biển của Trung Quốc phát triển đều theo từng
năm, số lượng báo cáo về tổng sản lượng cá biển nuôi từ năm 2010 - 2015
của Cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp cho thấy năm 2010 đạt 0,8082 triệu tấn,
năm 2011 đạt 0,9642 triệu tấn, năm 2012 đạt 1,0284 triệu tấn, năm 2013 đạt
1,1236 triệu tấn, năm 2014 đạt 1,1897 triệu tấn, năm 2015 đạt 1,3076 triệu
tấn [49].
4


Bảng 1.2. Các lồi cá biển ni chủ yếu ở Trung Quốc
Vùng ni

Lồi cá
Miền Bắc Miền Nam
Cá đù vàng (Larmichthys crocea)

Cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus)




Cá giò (Rachycentron canadum)
Cá mú (Epinephelus spp.)
Cá vược (Lateolabrax japonicus)





Cá đá (Sebastodes fuscescens)
Cá tráp đỏ (Pagrus major)






Cá tráp đen (Acanthopagrus schlegelii schelgelii)







Cá chim vây ngắn (Trachinotus ovatus)
Cá nóc hố (Takifugu rubripes)



Cá bơn (Paralichthys olivaceus)



Cá lưỡi trâu (Cynoglossus semilaevis)



Ấn Độ triển khai nuôi cá biển từ năm 1950 bao gồm các loài cá da
trơn, cá mú, cá chẽm và cá điểm ngọc trai. Trong những năm đó, hầu hết các
trang trại nuôi cá đều ở quy mô nhỏ và bán tập trung. Theo số lượng thống kê
của Cục Chăn nuôi và Nghề cá, sản lượng nuôi cá biển của Ấn Độ tăng khá
đều đặn kể từ năm 1950-2014, sản lượng năm 1950 là 534.000 tấn, năm 2014
3.440.000 tấn, mặc dù tốc độ tăng trưởng không cao, nhưng nuôi cá biển tận
dụng tối ưu tài nguyên biển và đã đóng góp đáng kể cho nền kinh tế .
1.1.2. Tình hình ni cá biển ở Việt Nam
Trong giai đoạn 2005 - 2010, nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo đã
có những bước phát triển đáng kể, diện tích và sản lượng tăng khơng ngừng.
Sản lượng ni trồng hải sản trên biển và hải đảo trong giai đoạn năm 20052010 đạt tốc độ tăng trưởng bình quân năm về sản lượng 5,1%/năm, trong đó
cá biển tăng 38,1%/năm. Tổng diêṇ tích ni trồng hải sản trên biển và hải
đảo Việt Nam năm 2005 là 34.174 ha, đến năm 2010 tăng lên đaṭ 38.800 ha,

5

trong đó: tốc độ tăng trưởng ni vùng biển hở là 15,4%/năm, diện tích ni
vịnh, đảo và eo ngách tăng bình qn là 4,86%/năm; diện tích ni bãi triều
ven biển là 1,8%/năm [22].
Các lồi cá biển được ni chủ hiêṇ nay bao gồm cá song, cá giò, cá
cam, chép biển, tráp đỏ, hồng mỹ, cá vược, đối mục, cá dìa, cá chim vây
vàng, trong đó cá song, cá giị, cá vược được xem là một trong những đối
tượng được nuôi phố biến nhất. Riêng khu vực Quần đảo Trường Sa chủ yếu
nuôi cá chim trắng, cá hồng và cá vược mõn nhọn.
Trong giai đoạn năm 2005 - 2010, số lượng lồng, bè nuôi cá lồng liên
tục tăng. Tổng số ô lồng năm 2005 là 13.172 ô lồng, đến năm 2010 đạt 30.031
ơ lồng; số ơ lồng tăng bình qn năm trong giai đoạn năm 2005-2010 đạt
17,92%/năm. Số bè nuôi năm 2005 là 1.461 bè, tăng lên 2.142 bè năm 2010,
đạt tốc độ tăng trưởng bình quân là 7,96%/năm (bảng 1.3). Trong năm 2010,
có 1.019 bè cá ni ở khu vực vùng biển vịnh Bắc bộ (chủ yếu ở Hải Phòng,
Quảng Ninh, Thanh Hóa và Nghệ An), 630 bè ở vùng biển miền Trung (Chủ
yếu Phú Yên, Khánh Hòa và Ninh Thuận), 140 bè ở vùng biển Đông Nam Bộ
(chủ yếu ở Bình Thuận và Bà Rịa-Vũng Tàu) và 353 bè ở Tây Nam Bộ (chủ
yếu ở Kiên Giang). Khu vực cụm đảo Đá Tây - Quần đảo Trường Sa-Khánh
Hóa đã nuôi 8 lồng công nghiệp kiểu Nauy cải tiến (thể tích 218 m3/lồng.
Về sản lượng cá biển ni, năm 2005 sản lượng nuôi cá biển đạt 3.141
tấn, đến năm 2010 sản lượng tăng lên 15.751 tấn (đạt tốc độ tăng trưởng bình
quân 38,1%/năm). Năm 2010, tổng sản lượng cá biển là 15.751 tấn, trong đó
cá song 7.786 tấn (chiếm 49%), cá giò 4.734 tấn (chiếm 30%), cá vược 1.096
tấn (chiếm 7%), cá biển khác 2.135 tấn (chiếm 14%). Riêng khu vực nuôi cá
biển của Úc (ở vịnh Nha Trang) năm 2010 đã nuôi gần 3.000 tấn cá biển (chủ
yếu cá giò, song).
Đến năm 2014 (sau 3 năm Quy hoạch cá biển được phê duyệt 2011)
sản lượng nuôi cá biển ở các loại hình chỉ đạt 63.460 tấn, nhìn chung tốc độ

6


tăng trưởng về quy mơ diện tích và sản lượng nuôi khá chậm so với quy
hoạch. Sản lượng nuôi cá biển trong lồng bè đến năm 2015 có thể đạt được
chỉ tiêu theo quy hoạch là 44.000 tấn. Riêng sản lượng nuôi ao đầm nước mặn
lợ chỉ đạt được 50% so với quy hoạch và sản lượng nuôi công nghiệp gần như
không thể đạt được chỉ tiêu trong quy hoạch đến năm 2015 đề ra (Bảng 1.3).
Đối tượng nuôi cá biển cũng khá đa dạng, tuy nhiên tập trung chủ yếu vẫn là
cá vược (chẽm), cá song, cá bớp và cá hồng Mỹ. Diện tích ni cá biển trong
ao đất cũng đã được mở rộng, tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như Quảng
Ninh, Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu và Kiên Giang. Nuôi lồng bè nhỏ nằm rải
rác trong eo, vịnh ở các tỉnh ven biển. Nuôi cá biển quy mô công nghiệp dạng
lồng bè lớn trên 1.000m3 ở các vùng eo vịnh, biển mở, có thể chịu được sống
gió lớn cấp 11 -12 hầu như chưa được các thành phần kinh tế quan tâm đầu tư
sản xuất.
Bảng 1.3. Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam
TT

Danh mục

QH 2015

2013

QH 2014

1

Tổng sản lượng (tấn)

160000

60953

63460

-

Nuôi trong ao nước mặn lợ, ao nuôi 61000

29.058

30289

31895

33171

tôm chuyển đổi (tấn)
-

Nuôi trong hệ thống lồng nhỏ (tấn)

44000

-

Nuôi công nghiệp tập trung (tấn)

55000

2

Giá trị (tỷ USD)

1,04

3

Số lồng bè (lồng)

18231

28273

4

Diện tích ni trong ao (ha)

18367

29781

Theo quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015 và định hướng
đến năm 2020 ban hành kèm theo Quyết định số 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày
08 tháng 07 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ NN và PTNT [16]:

7

+ Phát triển nuôi trồng ở tất cả các loại hình mặt nước biển,bao gồm:
khu vực bãi triều ven biển, eo vịnh, quanh các đảo (ưu tiên các đảo có dân cư
sinh sống) và vùng biển mở, biển khơi ở các vùng biển Vịnh Bắc bộ (Quảng
Ninh - Quảng Trị), biển miền Trung (Thừa Thiên Huế - Khánh Hịa), biển
Đơng Nam bộ (Ninh Thuận - Cà Mau, biển Tây Nam bộ (Cà Mau - Kiên
Giang, giữa Biển Đông.
+ Đa dạng hóa đối tượng ni và phương thức ni với cơ cấu diện tích
và sản lượng phù hợp với từng vùng kinh tế, sinh thái trên cơ sở phát huy lợi
thế so sánh của từng sản phẩm. Phát triển nuôi các đối tượng có lợi thế cạnh
trạnh và có thị trường tiêu thụ lớn như: cá song, cá giò, cá chim vây vàng, cá
hồng mỹ, cá vược, cá ngừ, cá măng biển; nhuyễn thể (ngao, hàu, tu hài ); rong
biển (rong câu, rong sụn, rong mứt), giáp xác (tôm hùm, ghẹ xanh) và các lồi
bản địa có giá trị kinh tế cao như hải sâm, bào ngư.
+ Phát triển nuôi cá biển trên tất cả các khu vực được qui hoạch, từng
bước nâng dần mật độ lồng bè, năng suất và sản lượng của từng khu vực khi
đã đáp ứng được yêu cầu về con giống, thức ăn và nhu cầu thị trường.
+ Đến năm 2020, tổng sản lượng nuôi cá biển đạt 200.000 tấn, trong
đó: sản lượng ni cá biển trong hệ thống lồng nhỏ đạt 60.000 tấn, sản lượng
nuôi quy mô công nghiệp tập trung đạt 140.000 tấn.
1.2. Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng
* Bệnh do ký sinh trùng
Bệnh do ký sinh trùng gây ra rất phổ biến ở cá biển nuôi, đặc biệt là cá
biển nuôi lồng. Theo kết quả khảo sát trên 80% nơng hộ cho biết cá biển ni
đều có các biểu hiện liên quan đến bệnh nhiễm ký sinh trùng. Các lồi ký sinh
trung gặp nhiều nhất trên cá biển ni là sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo
và động vật đơn bào. Chủ yếu là ngoại ký sinh trên da, trong miệng, gây tổn
thương mang làm cá khó thở, bỏ ăn, chậm lớn và thường gây chết giai đoạn
cá nhỏ [5], [79].
8

* Bệnh do vi rút ở cá biển nuôi
Bệnh do vi rút nguy hiểm nhất ở cá biển nuôi lồng là bệnh do Nervous
Necrosis Virus- NNV là bệnh cấp tính gây ra trên nhiều loài cá biển. Bệnh
hoại tử thần kinh thường xuất hiện trong giai đoạn cá giống, với tỷ lệ nhiễm
lên tới 53/64 mẫu thu thập (tương ứng 82,8%), tỷ lệ cá chết do NNV khoảng
90-100%. Hầu hết những nghiên cứu về VNN đều cho thấy: mơ đích của
VNN là hệ thần kinh trung ương (gồm não và tuỷ sống) và võng mạc [82].
Virus này gây hoại tử các nơron thần kinh dẫn đến những biểu hiện bất
thường như bơi khơng định hướng, chủ yếu theo hình trơn ốc hoặc lao thẳng,
nhanh về phía trước. Tác nhân gây bệnh do vi rút trên cá biển đã được nghiên
cứu bởi nhiều tác giả và đã đề xuất các biện pháp khắc phục thiệt hại do bệnh
này gây ra đến nay chủ yếu là phòng bệnh [79].
* Bệnh do vi khuẩn
Ở cá biển vi khuẩn chủ yếu gây bệnh là vi khuẩn gram (-), chúng chủ
yếu là vi khuẩn thuộc họ Vibrionacea (Vibrio alginolyticus, V. vunificus, V.
cholerea, V. parahaemolyticus, V. anguilarum, V. ordalii, V. carchriae, V.
harveyi). Ngồi ra cịn có một số loài như Photobacterium damselea,
Edwardsiella tarda, Pseudomonas sp [91].
Tại Việt Nam nhiều nghiên cứu cũng đã phát hiện vi khuẩn V.
parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, V. carchriae, V. vunificus là tác nhân
gây bệnh xuất huyết lở loét cho cá biển nói chung và cá mú nói riêng ở cả 3
miền Bắc, Trung, Nam. Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng là các vết xuất huyết lở
loét trên thân, bệnh lây lan nhanh và có thể gây chết đến 30% đàn cá ni [4],
[5], [17], [18].
Trong các bệnh thường gặp ở cá biển ni thì bệnh xuất huyết do vi
khuẩn P. damselea gây nên, vi khuẩn P. damselae có thể tấn cơng và gây bệnh
trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng,
cá giống đến cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn

9


tính và cấp tính, biểu hiện bệnh như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt trắng
hoặc u hạt màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng , tập
trung ở thận và lách [58], [145] [41]. Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ
lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhật, Mỹ, Pháp,
Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ,... Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các
vùng nuôi trên cả nước, đã gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá biển [5].
1.3. Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P. damselae
gây ra trên cá biển
1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae
1.3.1.1. Phân loại
Hệ thống phân loại:
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Photobacterium
Loài: Photobacterium damselae
Tình hình phân loại của P. damselae trong hệ thống được thay đổi
nhiều lần, ban đầu chủng này được phân lập như Vibrio damselae và được
công nhận là một tác nhân gây bệnh cơ hội có khả năng gây bệnh ở cá và
động vật có vú. McDonell và Colwell (1985) đã phân loại lại, xem như một
thành viên của chi Listonella dựa trên việc nghiên cứu các mối quan hệ phát
sinh lồi bằng cách phân tích chuỗi 5S rRNA [117]. Các nghiên cứu di truyền
và kiểu hình tiếp theo cho thấy các dịng V. damselae có quan hệ mật thiết với
các loài thuộc họ Photobacterium và tên P. damselae đã được đề xuất [156].
Sau đó, Smith et al. (1991) dựa trên đặc điểm kiểu hình đã chuyển các lồi này
vào chi Photobacterium. Trong nghiên cứu của Gauthier et al. (1995) về tác

nhân gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) ở một số loài cá đã
10


chứng minh và xác định chủng vi khuẩn này là P. damselae bằng phương pháp
phân tích trình tự 16S rDNA và DNA [73].
1.3.1.2. Đặc điểm hình thái
Theo nghiên cừu của Austin et al., (1997) vi khuẩn P. damselae là trực
khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 – 0.8 µm x 0.7 – 2.6 µm, lưỡng cực (khi
nhuộm thường thấy vi khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện
tượng nguyên sinh chất bị dung giải về hai đầu của vi khuẩn), khơng có roi và
khơng di động [33].

Hình 1.1. Hình thái của vi khuẩn P. damselae
(Nguồn: Austin et al., 1997)[33]
1.3.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
P. damselae là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện. Vi khuẩn P. damselae
phản ứng tích cực với Metyl đỏ (1%NaCl), Arginene (1%NaCl), khử Nitrat
thành Nitrit, sinh acid nhưng không sinh khí gas từ các loại đường glucose,
mannose, maltose, fructose, và galactose, sinh khí từ D-glucose, lipase,
esculin. Vi khuẩn P. damselae dương tính với oxidase, catalase, methyl red và
âm tính với indol, nitrate, citrate, H2S [33], [67].
1.3.1.4. Đặc điểm nuôi cấy

11


Vi khuẩn P. damselae phát triển tốt trên môi trường có nồng độ NaCl từ
0,5% - 4%. Vi khuẩn P. damselae phát triển tốt nhất ở nồng độ NaCl từ 1,0% 2,5%, khơng phát triển trong mơi trường có nồng độ NaCl 0%, 8% -12% và
không thể phát triển nếu thiếu ion Na+. Nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn P. damselae

từ 15ºC – 32,5ºC. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn P. damselae tốt nhất là BHI
Agar, TCBS, Marine Agar hoặc môi trường thạch máu (2% máu cừu) bổ sung
thêm muối. Khuẩn lạc trên mơi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính
khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết β và quan sát được rõ ràng sau 48h ở
28ºC [33], [67].
1.3.1.5. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P. damselae
Theo nghiên cứu của Pasqualina et al. (2011), thử nghiệm tính mẫn
cảm với kháng sinh của các chủng P. damselae phân lập từ một số trang trại
nuôi trồng thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P. damselae phân lập có khả năng
kháng một số loại kháng sinh như: ampicillin, carbenicillin, kanamycin,
cefalothin; trong khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh như:
chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin [133].
Theo nghiên cứu của Toranzo et al., (1991); Bakopoulos et al., (1995);
Sano (1998), các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị xuất huyết
nhiễm

trùng

bao

gồm

amoxicillin,

chloramphenicol,

erythromycin,

florfenicol, flumequine, acid oxolinic, oxytetracycline, nitrofurazone,
trimethoprim sulfadiazine và tetracycline [167], [35], [151].

Tuy nhiên, Thyssen et al., (2000) đã nghiên cứu tính nhạy cảm của vi
khuẩn P. damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau với một số
kháng sinh, cho thấy phần lớn (93%) các chủng kháng với erythromycin và
một tỷ lệ thấp (dưới 10%) kháng với amoxicillin, ampicillin, florfenicol và
trimethoprim- sulfamethoxazole. Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy
cảm với kanamycin, florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole [166].

12