NGUYỄN THỊ TUYẾN NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học của THÂN rễ một LOÀI THUỘC CHI DIOSCOREA l ở SA PA, lào CAI KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
THÂN RỄ MỘT LOÀI THUỘC CHI
DIOSCOREA L. Ở SA PA, LÀO CAI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TUYẾN
MÃ SINH VIÊN: 1401666

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
THÂN RỄ MỘT LOÀI THUỘC CHI
DIOSCOREA L. Ở SA PA, LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Nghiêm Đức Trọng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật

HÀ NỘI – 2019


Lời cảm ơn
Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Nghiêm Đức Trọng,
người thầy đã hướng dẫn và tạo điều kiện học tập, nghiên cứu tốt nhất, cũng như động
viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các
bộ môn đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt 5 năm học tập cũng như thời gian thực hiện
khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Thực Vật – Trường Đại
học Dược Hà Nội, cô Phạm Thị Linh Giang, thầy Lê Thiên Kim và các chị kỹ thuật viên
đã luôn tận tình giúp đỡ và chỉ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian
em làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người
thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt
quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thị Tuyến


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1. Chi Dioscorea L. ................................................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Dioscorea L. .............................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Dioscorea L. ...................................... 2
1.1.3. Giá trị sử dụng của chi Dioscorea L. .............................................................. 2
1.2 Tổng quan về Diosgenin ........................................................................................ 3
1.2.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý-hóa ................................................................ 3
1.2.2. Tác dụng sinh học ........................................................................................... 4
1.2.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin .......... 6
1.2.4. Ứng dụng của diosgenin ................................................................................. 9
1.2.5. Các phương pháp định lượng diosgenin ......................................................... 9
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 11
2.1. Nguyên liệu, thiết bị. ........................................................................................... 11
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 11
2.1.2. Thiết bị và hóa chất....................................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 12
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật ...................................................................... 12
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................... 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 13
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật ................................................................................. 13
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học ................................................................................. 13
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 19
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật........................................................................... 19
3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật .......................................................................... 19
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu .......................................................................................... 22
3.1.3. Đặc điểm bột thân rễ ..................................................................................... 24


3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học ........................................................................... 25
3.2.1. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học .................. 25

3.2.2. Kết quả xác định hàm ẩm bột dược liệu ....................................................... 30
3.2.3. Kết quả định tính diosgenin - khảo sát dung môi khai triển HPTLC, lựa
chọn phương pháp chiết xuất. ................................................................................. 30
3.2.4. Kết quả thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin bằng HPTLC .. 31
3.2.5. Bán định lượng diosgenin bằng HPTLC ...................................................... 34
3.3. Bàn luận .............................................................................................................. 35
3.3.1. Đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học ................................................ 35
3.3.2. Đặc điểm vi học ............................................................................................ 36
3.3.3. Về hóa học .................................................................................................... 36
KẾT LUẬN ................................................................................................................ 39
ĐỀ XUẤT .................................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

D.

Dioscorea

16 - DPA

16 – dehydro pregnenolon acetat

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu nâng cao

MDA

Malondialdehyd

MeOH

Methanol

pp

Trang

STT

Số thứ tự

TT

Thuốc thử


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài Dioscorea quan trọng để sản xuất diosgenin trong công nghiệp ...... 7
Bảng 1.2. Hàm lượng diosgenin trong một số loài Dioscorea [14]. ............................... 8
Bảng 3.1: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân rễ Dioscorea collettii var.
hypoglauca..................................................................................................................... 26
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm ẩm bột dược liệu ....................................................... 30
Bảng 3.3 : Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống .................................................... 32
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định tính tuyến tính ................................................................. 33
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại ............................................................................ 34
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng .............................................................................. 34
Bảng 3.8. Đặc điểm phân biệt Dioscorea collettii var. hypoglauca và Dioscorea collettii

var. collettii .................................................................................................................... 35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của diosgenin ..................................................................... 4
Hình 3.1: Hình ảnh đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của cây ........................................... 20
Hình 3.2: Hình ảnh các đặc điểm của hoa đực .............................................................. 20
Hình 3.3: Hình ảnh các đặc điểm của hoa cái ............................................................... 21
Hình 3.4: Hình ảnh các đặc điểm của quả và hạt .......................................................... 21
Hình 3.5. Hình ảnh vi phẫu lá........................................................................................ 22
Hình 3.6. Hình ảnh vi phẫu thân.................................................................................... 23
Hình 3.7. Hình ảnh vi phẫu thân rễ ............................................................................... 24
Hình 3.8. Hình ảnh các đặc điểm bột thân rễ ................................................................ 25
Hình 3.9: Hình ảnh so sánh khai triển sắc ký lớp mỏng với 2 hệ dung môi sau khi phun
thuốc thử vanilin 1% trong acid sulfuric đặc................................................................. 30
Hình 3.10. Hình ảnh so sánh 2 phương pháp chiết xuất diosgenin ............................... 31
Hình 3.11: Kết quả thẩm định độ đặc hiệu .................................................................... 32
Hình 3.12. Phương trình biểu diễn mối liên hệ giữa diện tích pic và lượng diosgenin 33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoảng 50-60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ
diosgenin. Diosgenin được biết có mặt trong nhiều loài thực vật, như các loài thuộc chi
Trillium L. (Melanthiaceae), Costus L. (Costaceae), Tacca Forst. & Forst. f.
(Taccaceae),...Tuy nhiên, chỉ có các loài thuộc chi Dioscorea L. mới có giá trị thực tế
trong việc chiết xuất diosgenin [49]. Hàng năm ước tính ngành dược cần tới 10.000 tấn
thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [48], [50]. Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea
để sản xuất diosgenin ngày càng lớn trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng
giảm do sự khai thác quá mức [48], [35], [28]. Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những
nguồn nguyên liệu mới cung cấp diosgenin.

Ở Việt Nam, hiện biết hơn 40 loài thuộc chi Dioscorea L. [7]. Trong đó, một số
loài đã được nghiên cứu xác định hàm lượng diosgenin như D. zingiberensis
C.H.Wright., D. collettii Hook. f., D. chingii Prain & Burkill., Dioscorea poilanei Prain
& Burk., D. simulans Prain et Burkill., D. dissimulans Prain et Burkill., D.
membrancaea Pierre et Craib., D. paradoxa Prain et Burkill., D. subcalva Prain et
Burkill. và còn nhiều loài chưa được nghiên cứu.
Gần đây, trong quá trình điều tra tài nguyên cây thuốc chúng tôi có phát hiện một
loài Dioscorea sp. mọc hoang tại Sa Pa – Lào Cai có những đặc điểm hình thái khác với
các loài Dioscorea đã biết ở Việt Nam. Loài này có những đặc điểm tương đồng với một
số loài Dioscorea đã được biết đến là nguồn nguyên liệu để chiết xuất diosgenin
(Dioscorea deltoidea Wall. ex Griseb., Dioscorea collettii Hook. f.) như: thân khí sinh
quấn trái, thân rễ hình củ gừng, phát triển theo chiều ngang.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần
hóa học của thân rễ một loài thuộc chi Dioscorea L. ở Sa Pa, Lào Cai” với mục tiêu:
-

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của
mẫu cây thu được.

-

Nghiên cứu thành phần hóa học và bán định lượng diosgenin trong thân rễ của
mẫu cây thu được.

1


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Chi Dioscorea L.
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Dioscorea L.

Vị trí phân loại của chi Dioscorea L. theo hệ thống phân loại thực vật của
Takhatajan 1987 [2] như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliaphyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp Hành (Liliidae)
Bộ Củ nâu (Dioscoreales)
Họ Củ nâu (Dioscoreaceae)
Chi Dioscorea L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Dioscorea L.
1.1.2.1 Đặc điểm thực vật
Dây leo gỗ hoặc cỏ lâu năm, thân rễ dạng củ có nhiều hình dạng khác nhau. Thân
khí sinh quấn trái hoặc phải, có lông hoặc không. Lá nguyên, đơn hoặc kép chân vịt,
mọc xen kẽ hoặc mọc đối, có cuống, 3-9 gân từ gốc. Kiểu hoa: đa phần hoa đơn tính,
hiếm khi lưỡng tính. Hoa thường không có cuống hoặc có cuống rất ngắn, mọc thành
chùm hay bông rủ xuống. Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3. Hoa đực:
nhị 6, tất cả hữu thụ hoặc 3 chiếc hữu thụ, 3 chiếc bất thụ; chỉ nhị rời nhau, đính ở gốc
bao hoa hoặc trên đế hoa; bao phấn hướng trong, đính gốc hoặc đính lưng, 2 ô, mở bằng
khe dọc. Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không
phong phú như hoa đực. Bầu dưới, 3 ô, mỗi ô chứa 2 hoặc nhiều noãn đính trung trụ,
vòi nhụy 3, núm nhụy xẻ 2 thùy nông. Quả nang, 3 cạnh dạng cánh mở theo khe dọc từ
đỉnh, một số ít quả mọng. Hạt có cánh dạng màng [7], [59].
1.1.2.2. Phân bố
Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và ôn đới châu Á,
Australia và châu Mỹ. Châu Á có khoảng 140 loài [24], Việt Nam có 43 loài [7].
1.1.3. Giá trị sử dụng của chi Dioscorea L.
1.1.3.1 Trong đời sống
- Thân rễ của một số loài được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn nhất là khi
thiếu đói: khoai mỡ (D. alata L.), củ từ (D. esculenta Lour.), khoai rạng (D. glabra

2

Roxb.), củ mài (D. persimilis Prain & Burk.),… do có chứa nhiều tinh bột [2], [5],
[7].
- Lá cây có chứa tanin được sử dụng để thuộc da, nhuộm vải cho màu nâu bền: củ
nâu (D. cirrhosa Lour.), từ ngược mùa (D. intempestiva Prain & Burk.),…[5], [7].
- Thân rễ một số loài có độc được sử dụng để diệt chấy rận, tẩm mũi tên, duốc cá
như: Củ nần trắng (D. hispida Denst.), Củ mài gừng (D. zingiberensis C. H.
Wright.),…[5], [7].
1.1.3.2. Trong y học
Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ. Ngoài ra, nhiều loài Dioscorea
được sử dụng làm thuốc [7], [24]:
-

Khoai trời (D. bulbifera L.): dái củ dùng làm thuốc trị ho gà, thân rễ dùng điều
trị bướu giáp, lao hạch bạch huyết, loét dạ dày, chảy máu cam,…

-

Củ nâu (D. cirrhosa Lour.): dùng làm thuốc chữa xích bạch đới, băng huyết, ỉa
chảy và lỵ.

-

Khoai rạng (D. glabra Roxb.): chữa ăn uống kém, gầy gò, đái tháo, di mộng tinh.

-

Củ nần trắng (D. hispida Denst.): củ giã đắp trị nhọt độc, đòn ngã bị thương;
nước sắc thân rễ làm thuốc lợi tiểu hoặc thấp khớp mạn tính, củ ăn sống kịp thời

ngay sau khi bị rắn hổ mang cắn có thể giúp ngăn ngừa các rối loạn trong cơ thể.

-

Củ mài (D. persimilis Prain & Burk.): thuốc bổ ngũ tạng, chữa tỳ vị hư nhược,
ăn uống kém tiêu, tiêu chảy lâu ngày không khỏi, phế hư hen, tiểu đường, di tinh.

Phytoestrogens trong các loài Dioscorea có tác dụng kháng độc tố, làm chậm quá
trình lão hóa, tăng cường sức khỏe toàn diện đặc biệt là phụ nữ. Gần đây, thân rễ các
loài Dioscorea được xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm,
chống loãng xương. Hơn nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin – một protein dự
trữ trong thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi. Dioscin
trong thân rễ Dioscorea batatas có ảnh hưởng đến chức năng dạ dày ruột trên chuột thí
nghiệm, làm giảm nồng độ glucose huyết thanh, lipid trung tính và cholesterol tổng [44].
1.2 Tổng quan về Diosgenin
1.2.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý-hóa
Công thức cấu tạo

3


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của diosgenin
Công thức phân tử: C27H42O3
Tên IUPAC: (3β, 25R)-spirost -5-en-3-ol
Tính chất vật lý
-

Khối lượng phân tử: 414,62058 g/mol

-

Tỷ trọng: 1,13 g/cm3

-

Nhiệt độ nóng chảy: 205-208 °C

-

Độ tan: tan tốt trong chloroform 20mg/ml, cho màu hơi vàng, tan ít trong các
dung môi hữu cơ khác và không tan trong nước.

Tính chất hóa học
-

Tính chất tạo bọt: tạo bọt trong môi trường kiềm

-

Các phản ứng tạo màu:
o

Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu thay đổi từ vàng,
đỏ, lơ xanh lá hay lơ tím. (phản ứng Salkowski)

o

Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc cho màu
xanh lá (phản ứng Liebermann Bouchardat)

1.2.2. Tác dụng sinh học
-

Gây giãn mạch thông qua thụ thể, tác dụng này do hoạt hóa eNOS/CG/kênh kali.

Chuột đã cắt bỏ buồng trứng được dùng diosgenin với liều 50mg/kg trong 28 ngày thấy
có sự giảm MDA - sản phẩm của quá trình peroxid hóa lipid, tăng nồng độ GSH
(glutathion), giảm quá trình oxy hóa trong các tế bào tim mạch, đồng thời với sự tăng
nồng độ các enzym làm bất hoạt các gốc tự do [49].

4


-

Làm giảm thiểu tổn thương tim mạch do thiếu máu cục bộ trong mô hình sử dụng

tế bào H9c2 có nguồn gốc từ tim chuột. Tác dụng này được đánh giá thông qua cải thiện
khả năng sống sót của tế bào và xét nghiệm giải phóng lactat dehydrogenase (LDH).
Đặc biệt, dioscin – dạng glycosid của diosgenin được phát hiện có ảnh hưởng trên quá
trình phát triển của các khối u phổi, cũng như bảo vệ tim mạch thông qua tăng khả năng
thích ứng với tình trạng thiếu máu cục bộ [43]. Cải thiện tình trạng nhồi máu cơ tim
[37].
-

Chống kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin

(APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PTT), do đó có tác dụng trong
điều trị các bệnh lý mạch vành, đau thắt ngực [36].
-

Một dẫn chất của diosgenin có tác dụng ngăn ngừa huyết khối động mạch, tĩnh

mạch tương đương aspirin và còn giảm tổn thương niêm mạc dạ dày, nguy cơ chảy máu
trên chuột so với aspirin [60].
-

Duy trì ổn định mức cholesterol máu, kiểm soát chuyển hóa lipid và cải thiện sự

hấp thu glucose và cholesterol ở ruột trong mô hình thí nghiệm trên chuột [47].
-

Chống viêm ở chuột, ngăn ngừa mất xương tương tự estrogen do đó được sử

dụng cho phụ nữ mãn kinh để làm chậm tiến triển của loãng xương [38].
-

Ngăn chăn việc sản sinh quá mức NO, PGE2, ức chế biểu hiện của iNOS, MMP-

3, MMP-13 và COX-2 nên rất có tiềm năng trong điều trị viêm khớp [56].
-

Trong các tế bào ung thư vú Her2–overexpressing người ta thấy có sự tăng lên

rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS), diosgenin có tác dụng ngăn chặn sự xuất hiện
của FAS trong các tế bào ung thư vú, ức chế sự tăng sinh và gây độc tế bào ung thư
Her2–overexpressing. Ngoài ra, diosgenin còn ức chế quá trình phosphoryl hóa Akt,
mTOR, JNK. Diosgenin có khả năng ức chế sự tồn tại ,phát triển và gia tăng của các tế
bào ung thư vú [31], [46]. Tác dụng ức chế ung thư vú và ưng thư vú di căn xa trên 3
dòng tế bào MDA-MB-231, T47D, MCF7 và cho thấy không có hoặc ít độc tính trên

các cơ quan quan trọng của chuột [29]. Kết hợp methotrexat với diosgenin có thể giúp
tăng cường tác dụng ức chế khối u tăng sinh trên các tế bào ung thư kháng vận chuyển
methotrexat [30].
-

Làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết thanh, tăng nồng độ insulin và tính

nhạy cảm insulin thông qua làm giảm tress lưới nội chất, tress oxy hóa gây tổn thương
tuyến tụy. Diosgenin có tác dụng làm giảm nồng độ acid béo tự do, TNF-α, IL-6, tăng
5


khối lượng mô mỡ và mức độ leptin. Diosgenin hoạt động như một chất chủ vận của
PPARγ – cơ quan chịu trách nhiệm sản xuất các tế bào mô mỡ nhạy cảm insulin, chất
điều hòa trung tâm chuyển hóa insulin và glucose nên cải thiện tình trạng kháng insulin
[54].
-

Tác dụng trên các rối loạn chuyển hóa: diosgenin làm giảm đáng kể nồng độ

glucose máu, ngăn chặn tích lũy, biệt hóa, mở rộng mô mỡ và tình trạng tăng nồng độ
TG, FFAs, TC trên chuột có chế độ ăn giàu chất béo [49].
1.2.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin
Khoảng 90% các dẫn chất steroid làm thuốc được sản xuất đều đi từ diosgenin.
Mặc dù diosgenin có trong một số chi Trillium L. (Melanthiaceae), Costus L.
(Costaceae), Tacca Forst. & Forst. f. (Taccaceae),... nhưng chỉ có chi Dioscorea mới có
giá trị thực tế [19].
Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài Dioscorea có
chứa diosgenin [51]. Những loài Dioscorea có hàm lượng diosgenin đáng kể thường có
thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [19]. Phần lớn diosgenin được sản xuất trên thế giới

từ các loài Trung Mỹ, chủ yếu là: D. floribunda M., D. composita Hemsl., cả hai đều
mọc hoang ở bản địa [51]. Trong thân rễ của D. floribunda M., D. composita Hemsl.
thành phần diosgenin và yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần, cả hai đều là
những tiền chất steroid có giá trị. D. deltoidea Wall. ex Griseb. chứa diosgenin ở trạng
thái tinh khiết nhất nên có giá trị cao trên thị trường steroid [55].
- D. nipponica Makino. và D. zingiberensis C.H. Wright. chứa diosgenin và được
trồng nhiều ở Trung Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [28].

6


Bảng 1.1. Các loài Dioscorea quan trọng để sản xuất diosgenin trong công nghiệp
Tên loài

STT

Phân bố

1

D. composita Hemsl.

2

D. mexacana Dcheidw.

3

D. floribunda M. Martens & Galeotti

4

D. deltoidea Wall. ex Griseb.

Ấn Độ

6

D. sylatica Eckl.

Nam Phi, Zimbabwe

7

D. collettii Hook. f.

8

D. pathaica Prain & Burkill.

9

D. nipponica Makino.

10

D. zingiberensis C.H. Wright.

Mexico

Trung Quốc

Tại Việt Nam, vào những năm 1980 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Nguyễn Bá
Hoạt và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ bản nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ở
Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea), Costaceae (chi Costus),
Melanthiaceae (chi Trillium L.), Taccaceae (chi Tacca Forst. & Forst. f.). Qua đó, phát
hiện 4 loài triển vọng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin [12], [13].
1. D. dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)
2. D. membranacea (hàm lượng diosgenin 2-2,3%)
3. D. collettii (hàm lượng diosgenin 2,5-4,4%)
4. D. zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1,4-2,4%)
Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành phần hóa học, các loài
Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam ngoài có dây leo quấn trái
đều có những cặp gai cong ở cuống lá [12].
Cũng trong thời gian này, Viện Dược liệu đã di thực 3 loài Dioscorea vào
Việt Nam: D. composita Hemsl., D. floribunda M., D. deltoidea Wall. ex Griseb.,
đã xác định điều kiện trồng và chăm sóc phù hợp với 3 loài trên [25], [26]. Tuy
nhiên, sapogenin thu được từ D. composita Hemsl.và D. floribunda M. đều có tạp
pentogenin (hàm lượng pentogenin trong D. composita Hemsl. có thể lên tới 35%,
từ 1-5% đối với D. floribunda M.) nghiên cứu xử lý loại tạp pentogenin nhưng chưa
thành công. Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn hợp diosgenin và pentogenin
7


chiết từ D. composita Hemsl.và D. floribunda M. cho thấy hiệu suất chỉ bằng ½
hiệu suất khi sử dụng diosgenin hàm lượng trên 90%.
Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết diosgenin từ dược
liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D. floribunda M. trên quy mô phòng thí nghiệm và
quy mô công nghiệp. Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16-DPA và các dẫn chất
steroid [26].

- Năm 1987, Nguyễn Bá Hoạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát, đánh giá nguồn nguyên
liệu cung cấp diosgenin ở Việt Nam. Kết quả thu được tương tự những nghiên cứu
trước đó, một số loài thuộc chi Dioscorea L. phân bố tại Việt Nam có hàm lượng
diosgenin khá cao: D. zingiberensis C.H. Wright. (1,4-2,4%), D. collettii Hook. f.
(2,5%) [13].
- Năm1999, Nguyễn Minh Khởi, Lê Đình Bích đã xác định hàm lượng diosgenin trong
một số loài thuộc chi Dioscorea L. bằng phương pháp sắc ký khí [14].
Bảng 1.2. Hàm lượng diosgenin trong một số loài Dioscorea [14].
STT

Tên loài

Hàm lượng diosgenin (%)

1

D. collettii Hook. f.

3,8-4,2

2

D. aff. collettii Hook. f.

1,8-2,4

3

D. zingiberensis C. H. Wright.

1,7-2,3

4

D. simulans Prain et Burkill.

1,8-2,1

5

D. dissimulans Prain et Burkill.

2,1-2,4

6

D. membrancaea Pierre et Craib.

1,3-1,8

7

D. paradoxa Prain et Burkill.

1,2-1,5

8

D. subcalva Prain et Burkill.

2,0-2,3

Những năm gần đây, tiếp tục có nhiều nghiên cứu về hàm lượng diosgenin trong
các loài thuộc chi Dioscorea L.:
-

Năm 2011, Đoàn Phương Hạnh đã tiến hành khảo sát hàm lượng diosgenin
trong 4 mẫu nần nghệ ở Mường Tè (Lai Châu), Tân Lạc (Hòa Bình), Ngổ
Luông (Hòa Bình), Mộc Châu (Sơn La) với hàm lượng diosgenin lần lượt là
2,72%; 2,55%; 2,74%; 3,07% [8].

8


-

Năm 2012, Nguyễn Thị Tuyết đã nghiên cứu và xác định hàm lượng diosgenin
trong cây nần đũa (Dioscorea poilanei Prain & Burk.) là 0,17% bằng phương
pháp HPTLC [22].

-

Năm 2014, Nguyễn Hoàng Tuấn đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu
nần trắng thu hái ở Mộc Châu, Sơn La vào tháng 8 năm 2012 là 0,3016 ±
0,0051, độ tin cậy 95% bằng phương pháp HPLC [20].

-

Năm 2015, Vương Minh Việt đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu
nần vàng (Dioscorea collettii Hook.f.) là 1,91% bằng phương pháp sử dụng

dung môi siêu tới hạn [27].

-

Năm 2016, Nguyễn Thị Tươi đã xác định hàm lượng diosgenin trong mẫu
Dioscorea sp. (Rận trâu) ở Đà Nẵng là 0,8% [21].

1.2.4. Ứng dụng của diosgenin
Diosgenin là nguồn nguyên liệu để tổng hợp các thuốc chống viêm corticoid
(prednisolon, hydrocortison, dexamethason, betamethason,…), bán tổng hợp 16dehydro pregnenolon acetat (16-DPA) – chất trung gian để tổng hợp các dẫn chất steroid.
Khoảng 50-60% các dẫn chất steroid được sử dụng làm thuốc trên toàn cầu được sản
xuất từ diosgenin. Ước tính hàng năm ngành dược cần khoảng 10.000 tấn thân rễ
Dioscorea để sản xuất diosgenin [35], [48].
Trong số hàng trăm saponin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ 10
chất có giá trị kinh tế lớn vì hai lý do:
- Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ có năng suất cao.
- Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất
trung gian là dehydro pregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các
thuốc steroid.
Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [6].
1.2.5. Các phương pháp định lượng diosgenin
(i) Phương pháp cân: Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung
môi hữu cơ sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [18].
(ii) Phương pháp đo quang: Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng
dung môi hữu cơ sau đó tiến hành sắc kí lớp mỏng để xác minh diosgenin. Diosgenin
được chiết bằng chloroform, hiện màu FeCl3 và H3PO4 (10:1), đo quang tại bước sóng
485nm [18].
9

(iii) Phương pháp sắc ký khí: Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính
hóa, sấy khô, hòa tan trong dung môi với chất chuẩn nội cholesterol rồi phân tích bằng
máy sắc ký khí [14].
(iv) Phương pháp HPLC: Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi
hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong methanol và tiến hành phân tích trên máy HPLC
[52].
(v) Phương pháp HPTLC: Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi
hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong chloroform, chấm sắc kí mẫu thử và dãy
diosgenin đối chiếu. Sau đó đo mật độ quang của vết sắc ký bằng Densitometer [1], [31].
Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp sai
số lớn trong quá trình chiết tách mẫu. Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ bền màu
của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử. Phương pháp sắc ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu
phức tạp. Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer nhanh, dễ thực hiện và
cho kết quả khá chính xác. Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay.

10


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị.
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu được thu vào tháng 9/2018, tháng 4, 5/2019 tại xã Tả Phìn, huyện
Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
Một phần thân, lá, thân rễ và rễ được bảo quản trong cồn 60° để nghiên cứu đặc
điểm vi phẫu. Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại
học Dược Hà Nội với số hiệu mẫu: HNIP/18561/19 (mẫu mang quả); HNIP/18562/19
(mẫu mang hoa đực); HNIP/18563/19, HNIP/18564/19 (mẫu mang hoa cái).
Phần thân rễ còn lại được cắt bỏ rễ xơ, rửa sạch, sấy khô ở 60°C, xay thành bột,
rây qua rây 700 µm; 250 µm, bảo quản nơi khô thoáng. Bột có kích thước trong khoảng
250-700 µm đem tiến hành bán định lượng.

2.1.2. Thiết bị và hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm
- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu nâng cao CAMAG bao gồm: bộ máy phun
mẫu bán tự động (dùng cho hệ thống sắc ký bản mỏng) Camag Limonat 5; máy triển
khai sắc ký bản mỏng Camag ADC 2; máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu
Camag TLC Visualizer, 2 phần mềm winCATS và Videoscan.
- Bộ dụng cụ chiết hồi lưu.
- Bình triển khai sắc ký.
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck).
- Máy xác định hàm ẩm.
- Bể siêu âm WISD.
- Cân kỹ thuật Sartorius (TE3102S).
- Cân phân tích Shimadzu (AY220).
- Kính hiển vi Leica.
- Rây 700, 250 µm.
- Bếp điện, nồi đun cách thủy.
- Bát sứ, chổi lông.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống đong, pipet, đũa thủy
tinh, phễu thủy tinh, bình nón.

11


2.1.2.2. Hóa chất
- Diosgenin chuẩn được cung cấp bởi hãng Biopurify Phytochemicals Ltd. độ
tinh khiết 99,39%.
- Aid sulfuric, methanol công nghiệp, methnol Merck.
- Các thuốc thử dùng trong các phản ứng định tính: thuốc thử Mayer, Bouchardat,
Dragendroff, Diazo, Ninhydrin, natri carbonat, natri hydroxyd, acid
clohydric,…

- Hóa chất dùng trong làm vi phẫu: javen, cloral hydrat, acid acetic, xanh
methylen, đỏ son phèn.
- Dung môi: Cloroform, aceton, nước cất, methanol, n-hexan, ethyl acetat, nbutanol.
- Thuốc thử hiện màu vết sắc ký: vanilin 1% trong acid sulfuric đặc.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mô tả đặc điểm thực vật, so sánh với các tài liệu về thực vật, khóa phân loại,
tiêu bản để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
- Mô tả đặc điểm vi học:
o Vi phẫu: lá, thân, thân rễ, rễ.
o Soi bột: thân rễ.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong thân rễ mẫu nghiên cứu.
- Chiết xuất, định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng.
- Thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin trong bột thân rễ mẫu nghiên
cứu bằng HPTLC khi áp dụng để bán định lượng diosgenin trong dịch chiết
dược liệu: đánh giá độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp
lại, độ đúng của phương pháp bán định lượng diosgenin trong bột dược liệu
bằng HPTLC.
- Bán định lượng diosgenin sau chiết xuất bằng HPTLC theo phương pháp đã
thẩm định.
- Xử lý thống kê kết quả.

12


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
-

Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật:
o Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo
phương pháp mô tả phân tích.
o Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô.

-

Nghiên cứu đặc điểm vi học:
o Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt, tẩy và nhuộm bằng phương pháp
nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi, xác định đặc điểm vi phẫu và chụp
ảnh dưới kính hiển vi [17].
o Đặc điểm soi bột: thân rễ được rửa sạch, thái thành lát mỏng, sấy khô ở
60°C, xay thành bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác
định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi.

-

Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
o Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình
thái, so sánh với các tài liệu về thực vật, các khóa phân loại, tiêu bản [2],
[7], [16], [58] cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để
xác định tên khoa học.

2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
2.3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ (chất béo, caroten, sterol, flavonoid,
alcaloid, glycosid tim, coumarin, tanin, anthranoid, đường khử, acid hữa cơ, acid amin,
polysaccarid, saponin) trong thân rễ mẫu nghiên cứu theo phương pháp thường quy ghi
trong các tài liệu [6], [15].
2.3.2.2. Định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn dung môi khai triển,

phương pháp chiết xuất.
(i) Định tính diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng, lựa chọn dung môi khai triển
Nghiên cứu có tham khảo quy trình chiết xuất diosgenin trong chuyên luận
“Nần nghệ” - Dược Điển Việt Nam V [4]:
-

Chuẩn bị bột dược liệu: Cân chính xác khoảng 1,5g bột dược liệu, hồi lưu
cách thủy 100°C trong 5h bằng 25 ml acid sulfuric 10%. Lọc, rửa tủa bằng

13


nước cất đến khi dịch rửa trung tính. Bột dược liệu thu được sấy đến khô ở
60°C.
Dung dịch thử: bột dược liệu đã chuẩn bị ở trên được chiết Soxhlet bằng 100

-

ml methanol. Dịch chiết thu được đem cô đến cắn, hòa tan cắn bằng methanol
trong bình định mức 50 ml, ly tâm dung dịch thu được ở tốc độ 13 rpm/5 phút,
lấy dịch trong phía trên để chấm sắc ký.
Dung dịch diosgenin chuẩn nồng độ 0.989 mg/ml: cân chính xác khoảng 9,95

-

mg diosgenin chuẩn độ tinh khiết 99,39%, hòa tan bằng methanol trong bình
định mức 10 ml.
Sắc ký lớp mỏng:
o Bản mỏng Silica gel F254: hoạt hóa ở 110°C/30 phút
o Dung dịch chuẩn diosgenin, dung dịch thử

o Dung môi khai triển: khảo sát 2 hệ dung môi (thời gian bão hòa dung môi 15
phút)
Hệ 1: cloroform – aceton (95:5)
Hệ 2: cloroform – aceton – n-hexan (90:5:5)
o Quãng đường dung môi: 8 cm
Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch chuẩn diosgenin 0,989
mg/ml, dung dịch thử. Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng, lấy bản mỏng ra để khô ở
nhiệt độ phòng, quan sát bản mỏng ở các bước sóng 366 nm, ánh sáng trắng. Phun dung
dịch vanilin 1%/acid sulfuric đặc (TT), sấy bản mỏng ở 105°C trong 3,5 phút sau đó
quan sát lại tại các bước sóng ánh sáng trên, nhận xét kết quả và lựa chọn hệ dung môi
phù hợp.
(ii) Xác định hàm ẩm
Lấy khoảng 2g bột dược liệu, bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C. Trải
đều bột dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân, bật máy chạy tự động và hiển thị kết quả.
Tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình.
(iii) Lựa chọn phương pháp chiết xuất diosgenin
-

Chuẩn bị bột dược liệu (phần (i))

-

Chiết xuất diosgenin:
(1) Chiết Soxhlet bằng 100 ml methanol

14


(2)Chiết siêu âm bằng methanol: 30 phút/lần x 3 lần, thể tích methanol lần
lượt là 50; 30; 20 ml.

- Gộp dịch chiết, cô đến cắn, hòa tan cắn bằng methanol trong bình định mức 50
ml.
-

Triển khai sắc ký lớp mỏng dịch chiết siêu âm và dịch chiết Soxhlet, thể tích
chấm 3 µl với hệ dung môi đã được lựa chọn, so sánh, nhận xét kết quả, lựa
chọn phương pháp chiết xuất diosgenin phù hợp.

Dung dịch thử thu được từ phương pháp chiết được lựa chọn kí hiệu là (T*)
2.3.2.3. Thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin trong dược liệu bằng
HPTLC khi áp dụng để bán định lượng diosgenin trong bột thân rễ mẫu nghiên cứu.
Điều kiện triển khai HPTLC:
o Bản mỏng: bản mỏng TLC Silica gel F254: hoạt hóa ở 110°C/30 phút, kích
thước 20 x 9,8 cm.
o Môi trường: nhiệt độ 24°C, độ ẩm tương đối 65%.
o Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được phun lên bản mỏng nhờ máy chấm mẫu
Limonat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép bản mỏng 1 cm, cách mép dung môi
0,8 cm, khoảng cách giữa 2 vết liên tiếp 0,35 cm, độ dài băng chấm 0,8 cm.
o Hệ dung môi: đã lựa chọn ở trên, thể tích dung môi bão hòa 25 ml, thể tích
dung môi khai triển 10 ml.
o Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút.
o Quãng đường di chuyển pha động: 8 cm.
o Thuốc thử hiện màu: vanillin 1% trong acid sulfuric đặc (TT), sấy hiện màu
ở 105°C trong 3,5 phút.
Xử lý kết quả:
Chụp ảnh bản mỏng sau khi sấy hiện màu ở bước sóng ánh sáng 366 nm, sử dụng
phần mềm VideoScan phân tích cường độ màu vết sắc ký, xử lý số liệu trên exel.
(i) Thẩm định phương pháp bán định lượng diosgenin bằng HPTLC áp dụng cho bán
định lượng diosgenin trong dịch chiết
(a) Độ đặc hiệu

- Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác
định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác
có trong mẫu thử.
15


- Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:
1) Mẫu trắng: dung dịch MeOH.
2) Mẫu thử (T*)
3) Mẫu chuẩn: dung dịch diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml.
Triển khai HPTLC, xử lý kết quả [23].
Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân
tích nếu:
(1) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị
Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
(2) Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện vết tương ứng với các vết chính trên
sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
(b) Độ thích hợp hệ thống
- Khái niệm: Độ thích hợp hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị,
dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích. Độ thích hợp của hệ thống
cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử
nghiệm [11].
- Cách tiến hành: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml,
thể tích 2 µl/vết, triển khai HPTLC, xử lý kết quả.
- Đánh giá kết quả: Tính RSD của diện tích pic, Rf. Giá trị RSD của diệc tích pic,
Rf giữa các lần tiêm mẫu (n>5) nên nhỏ hơn 2% [23].
(c) Khoảng tuyến tính
- Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân
tích thu được tỷ lệ với lượng chất phân tích (trong khoảng nhất định) có trong mẫu [11].
- Cách tiến hành: Tiêm chính xác lần lượt các thể tích 1; 2; 4; 6; 8 µl dung dịch

chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml, triển khai HPTLC, xử lý kết quả. Xây dựng
phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa lượng diosgenin chuẩn trên vết và
đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [23].
- Đánh giá kết quả: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ
tuyến tính. Thông thường với giá trị r > 0,9 có thể kết luận phương pháp có tương quan
tuyến tính tốt [11].
(d) Độ lặp lại

16


Tiến hành khảo sát hàm lượng diosgenin trong 5 mẫu thử (T*) khác nhau, thể
tích chấm 4 µl/vết. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua RSD giữa các
giá trị hàm lượng diosgenin thu được.
(e) Độ đúng
- Khái niệm: độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá
trị thực của mẫu đã biết.
- Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt
chất trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.
Chuẩn bị mẫu thử đã xác định hàm lượng diosgenin, 3 bình định mức 10 ml, thêm vào
mỗi bình 4 ml dung dịch thử (T*), dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0,989 mg/ml với
thể tích lần lượt là 1,5; 2,5; 4 ml, bổ sung methanol đến vạch. Triển khai HPTLC với 3
dung dịch đã thêm chuẩn ở trên, thể tích chấm 5 µl/vết. Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất
của phương pháp theo công thức sau:
Tỷ lệ thu hồi (%) =

tổng lượng tìm lại được
tổng lượng thêm vào

. 100%

- Đánh giá kết quả: đánh giá độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và
giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi. Không có giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương
pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ %
và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử. Nói chung, đối với phương
pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể
được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức
tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2 đến ± 10% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện
giải về giới hạn này [23].
(ii) Bán định lượng diosgenin bằng HPTLC
Quy trình bán định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPTLC bao gồm những
bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thử (T*) (mục 2.3.2.2)
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch chuẩn diosgenin nồng độ 0.989 mg/ml
Bước 3: Triển khai HPTLC, xử lý kết quả
Bước 4: Xây dựng đường chuẩn bán định lượng dựa trên Spic và lượng diosgenin
tương ứng. Xác định lượng diosgenin trên vết mẫu thử từ đó tính ra hàm lượng
diosgenin trong dược liệu theo công thức:
17