PHẠM THỊ THẮM xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SPIRONOLACTON TRONG VIÊN nén SPIRONOLACTON 25 MG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THẮM

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG SPIRONOLACTON TRONG VIÊN
NÉN SPIRONOLACTON 25 MG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THẮM
1401570

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG SPIRONOLACTON TRONG VIÊN
NÉN SPIRONOLACTON 25 MG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. ThS. Phạm Thị Hiền
Nơi thực hiện:
1. Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, ThS.
Phạm Thị Hiền – Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã luôn trực tiếp, hướng dẫn,
giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin trân thành cảm ơn các anh chị ở Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc
gia đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm và đóng góp nhiều ý kiến quý
báu giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các phòng
ban và các thầy cô đã tạo mọi điều kiện và dìu dắt tôi trong quá trình học tập tại trường
và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên,
khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2019.
Sinh viên
Phạm Thị Thắm


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG...............................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1.Đại cương về spironolacton ................................................................................ 2
1.1.1. Tính chất lý – hóa của spironolacton ............................................................. 2
1.1.2. Dược động học .............................................................................................. 3

1.1.3. Cơ chế và tác dụng dược lý ........................................................................... 3
1.1.4. Chỉ định ......................................................................................................... 3
1.1.5. Tác dụng không mong muốn ......................................................................... 3
1.1.6. Chống chỉ định .............................................................................................. 4
1.1.7. Thận trọng ..................................................................................................... 4
1.1.8. Liều lượng và cách dùng ............................................................................... 4
1.1.9. Quá liều và xử trí ........................................................................................... 4
1.1.10. Các dạng bào chế của Spironolacton ........................................................... 5
1.1.11. Một số nghiên cứu định lượng Spironolacton ............................................. 5
1.2.Tổng quan về phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – VIS) ......... 6
1.2.1. Nguyên tắc của phương pháp ........................................................................ 6
1.2.3. Máy quang phổ UV – VIS ............................................................................. 7
1.2.4. Ứng dụng UV – VIS trong định lượng .......................................................... 8
1.3.Ứng dụng thử độ hoà tan trong đánh giá sinh khả dụng in vitro.................... 9
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................... 10
1.3.2. Phương pháp thử.......................................................................................... 10
1.3.3. Ý nghĩa của sinh khả dụng in vitro .............................................................. 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12
2.1.Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................... 12
2.2.1. Dược phẩm .................................................................................................. 12
2.2.2. Hóa chất ....................................................................................................... 12
2.2.3. Thiết bị ...................................................................................................... 13
2.2.Nội dung nghiên cứu.......................................................................................... 13
2.3.Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 13


2.3.1. Phương pháp thử độ hòa tan ........................................................................ 13
2.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro ........................................... 14
2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng ........................................................... 15
2.3.4. Ứng dụng ..................................................................................................... 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 18
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng spironolacton trong đánh giá độ hoà
tan .............................................................................................................................. 18
3.1.1. Tính chọn lọc ............................................................................................... 18
3.1.2. Đánh giá độ phù hợp của hệ thống ............................................................. 18
3.1.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ......................................................................... 19
3.1.4. Độ đúng của phương pháp.......................................................................... 20
3.1.5. Độ chính xác ................................................................................................ 21
3.2. Thẩm định phương pháp định lượng Spironolacton trong đánh giá sinh
khả dụng in vitro ...................................................................................................... 22
3.2.1. Tính chọn lọc ............................................................................................... 22
3.2.2. Đánh giá độ phù hợp của hệ thống .............................................................. 23
3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ......................................................................... 24
3.2.4. Độ đúng của phương pháp........................................................................... 27
3.2.5. Độ chính xác ................................................................................................ 28
3.3. Ứng dụng ........................................................................................................... 30
3.3.1. Thử độ hoà tan các chế phẩm nghiên cứu ................................................... 30
3.3.2. So sánh độ hoà tan in vitro của các chế phẩm viên spironolacton .............. 32
3.4. Bàn luận ............................................................................................................. 39
3.4.1. Về phương pháp thử độ hoà tan viên nén Spironolacton 25 mg. ............ 39
3.4.2. Về đánh giá sinh khả dụng in vitro ........................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MeCN

Acetonitril

%AH

Phần trăm ảnh hưởng

Y%

Hệ số chắn

C

Nồng độ

D

Độ hấp thụ quang

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid
Chromatography)

HSTQ

Hệ số tương quan

HL

Hàm lượng

HLTB

Hàm lượng trung bình

MeOH

Methanol

PTHQ

Phương trình hồi quy

P

% Spironolacton giải phóng

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

UV VIS

Quang phổ tử ngoại khả kiến

SKD

Sinh khả dụng

SPI

Spironolacton

t

Thời gian

TLTK

Tài liệu tham khảo


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng Spironolacton ..............................................5

Bảng 2.1 Thành phần các tá dược trong công thức bào chế ..........................................12
Bảng 2.2 Danh mục các hoá chất đã sử dụng ................................................................13

Bảng 3.1 Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trong thử nghiệm độ hoà tan ...................18
Bảng 3.2 Khảo sát độ phù hợp của hệ thống trong đánh giá độ hoà tan .......................19
Bảng 3.3 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính trong khảo sát độ hoà tan ....................19
Bảng 3.4 Khảo sát độ đúng trong đánh giá độ hoà tan ..................................................21
Bảng 3.5 Đánh giá độ chính xác trong phép thử độ hoà tan .........................................22
Bảng 3.6 Đánh giá ảnh hưởng của các nền mẫu trong các môi trường.........................23
Bảng 3.7 Khảo sát độ phù hợp của hệ thống .................................................................24
Bảng 3.8 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của SPI ................................................25
Bảng 3.9 Khảo sát độ đúng ở pH 1,2.............................................................................27
Bảng 3.10 Khảo sát độ đúng ở pH 4,5...........................................................................27
Bảng 3.11 Khảo sát độ đúng ở pH 6,8...........................................................................28
Bảng 3.12 Khảo sát độ chính xác ở pH 1,2 ...................................................................29

Bảng 3.13 Khảo sát độ chính xác ở pH 4,5 ...................................................................29
Bảng 3.14 Khảo sát độ chính xác ở pH 6,8 ...................................................................30
Bảng 3.15 Đánh giá độ hoà tan của các chế phẩm (n=6) ..............................................31
Bảng 3.16 Kết quả đánh giá sinh khả dụng ở môi trường đệm pH 1,2 (n = 6) .............32
Bảng 3.17 Kết quả đánh giá sinh khả dụng ở môi trường đệm pH 4,5 (n = 6) .............35
Bảng 3.18 Kết quả đánh giá sinh khả dụng ở môi trường đệm pH 6,8 (n = 6) .............37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1 Công thức cấu tạo spironolacton ......................................................................2
Hình 1.2 Máy quang phổ hấp thụ một chùm tia ..............................................................7
Hình 1.3 Máy quang phổ hấp thụ hai chùm tia ...............................................................8
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ SPI
.......................................................................................................................................20
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ SPI
ở pH 1,2 .........................................................................................................................25
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ SPI
ở pH 4,5 .........................................................................................................................26
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ SPI
ở pH 6,8 .........................................................................................................................26
Hình 3. 5 Lượng SPI giải phóng của các mẫu nghiên cứu sau 60 phút ........................32
Hình 3. 6 Đồ thị biểu diễn hàm lượng SPI giải phóng theo thời gian ở môi trường pH
1,2 ..................................................................................................................................34
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hàm lượng SPI giải phóng theo thời gian ở môi trường pH
4,5 ..................................................................................................................................36
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hàm lượng SPI giải phóng theo thời gian ở môi trường pH
6,8 ..................................................................................................................................39


ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng huyết áp là một trong những nguy cơ gây tử vong hàng đầu trên thế giới.
Theo thốn kê của WHO, năm 2000, trên thế giới có khoảng 975 triệu người bị tăng huyết
áp, ước tính đến năm 2025 tăng lên 1,56 tỉ người. Ở Việt Nam, theo thống kê của Hội
Tim mạch học Việt Nam, năm 2000 có 16,8% người lớn bị tăng huyết áp, năm 2009 là
25,6%, và năm 2016 đã tăng lên 48,0%. Đây là con số đáng báo động.
Những năm gần đây, tỷ lệ người bị tăng huyết áp ngày càng gia tăng nên nhu cầu
sử dụng thuốc tăng huyết áp ngày càng lớn. Một nhóm thuốc hay được sử dụng để phối
hợp với thuốc điều trị tăng huyết áp là nhóm thuôc lợi tiểu.
Thuốc lợi tiểu là thuốc làm tăng khối lượng nước tiểu, chủ yếu bằng cách làm tăng
thải trừ Na+ và nước ở dịch ngoại bào gây lợi tiểu. Thuốc lợi tiểu dùng để lợi tiểu trong
các trường hợp có phù là chính. Tuy nhiên hiện nay, trong điều trị tăng huyết áp và suy
tim, thuốc lợi tiểu thường được phối hợp với thuốc điều trị tăng huyết áp và suy tim để
đạt được kết quả điều trị tốt hơn [1].
Thuốc lợi tiểu được chia làm 2 nhóm lớn là thuốc lợi tiểu giảm K+ máu và thuốc
lợi tiểu giữ K+ máu, ngoài ra còn có các thuốc lợi tiểu thẩm thấu và không gây rối loạn
ion [1].
Spironolacton là thuốc lợi tiểu giữ kali máu, được dùng để phối hợp với thuốc lợi
tiểu giảm K+ để điều trị phù do suy tim mạn, xơ gan, tăng huyết áp, bệnh thận; điều trị
tăng aldosterol huyết nguyên phát và thứ phát [1], [2]. Tuy nhiên, Spironolacton là một
chất ít tan trong nước nên đặt ra yêu cầu đối với các nhà bào chế chính là phải đảm bảo
độ tan của Spironolacton, do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp
định lượng Spironolacton trong viên nén Spironolacton 25 mg” phục vụ thử độ hoà
tan và đánh giá sinh khả dụng in vitro nhằm mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng spironolacton bằng quang phổ UV
VIS để xác định độ hòa tan và đánh giá độ hoà tan in vitro của viên nén Spironolacton
25 mg
2. Ứng dụng phương pháp định lượng để thử hòa tan và đánh giá độ hoà tan in vitro
của một số mẫu chế phẩm phục vụ phát triển công thức bào chế viên nén
Spironolacton 25 mg.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về spironolacton
1.1.1. Tính chất lý – hóa của spironolacton
•

Cấu tạo hóa học

Hình 1.1 Công thức cấu tạo spironolacton
- Công thức phân tử: C24H32O4S [11], [14], [15], [21].
- Khối lượng phân tử: 416,57 [11], [14], [15], [21].
- Tên khoa học: Pregn-4-en-21-carboxylic acid, 7-(acetylthio)-17-hydroxy-3-oxo-ɣlacton, (7α,17α)-; 17-Hydroxy-7α-mercapto-3-oxo-17α-pregn-4-en-21-carboxylic
acid ɣ-lacton acetat [11], [15], [21].
• Tính chất vật lý
- Cảm quan: Bột màu trắng hoặc hơi vàng [3], [11], [16].
- Độ tan: Là chất trung tính (do đó độ tan của SPI không bị ảnh hưởng bởi pH), không
tan trong nước. Tan tốt trong alcol, ethyl acetat; tan nhiều trong cloroform, benzen
[3], [11], [16].
- Nhiệt độ nóng chảy: 198 – 2070C [16], [20].
- Theo hệ thống phân loại của sinh dược học bào chế, spironolacton thuộc nhóm II, tức
là nhóm các chất có độ tan kém, tính thấm tốt [12], [22].
• Tính chất hoá học
- Tác dụng với dung dịch acid sulfuric 50% tạo màu vàng và huỳnh quang màu vàng
xanh. Đun nhẹ, màu chuyển sang màu đỏ thẫm, có khí H2S bay ra làm đen giấy tẩm
chì acetat [3].
2

- Tác dụng với natri hydroxyd và natri hydroxylamine tạo acid hydroxynamic. Acid
hoá thêm dung dịch sắt (III) clorid tạo màu tím [3].
- Đun chế phẩm với dung dịch NaOH 10 %, acid hoá bằng dung dịch acid acetic, thêm
dung dịch chì acetat cho tủa màu đen [3].
1.1.2. Dược động học
Spironolacton hấp thu dễ dàng qua đường uống (khoảng 70 – 90%), đạt nồng độ
đỉnh trong máu sau khi uống 2 – 4 giờ, liên kết với protein huyết tương 90%, tác dụng
xuất hiện chậm, sau uống 2 – 4 giờ, kéo dài 48 – 72 giờ.
- Qua được rau thai và sữa mẹ.
- Chuyển hóa qua gan lần đầu cao, chất chuyển hóa là canrenon có tác dụng tương tự
như chất mẹ, có chu kì gan – ruột.
- Thải qua thận, phân, thời gian bán thải khoảng 12 – 24 giờ [1], [2].
1.1.3. Cơ chế và tác dụng dược lý
Spironolacton có tác dụng lợi tiểu yếu, có tác dụng giảm bài tiết kali và tăng bài
tiết natri ở ống lượn xa. Spironolacton có có công thức tương tự aldosterol nên tranh
chấp với aldosterol tại receptor ở ống lượn xa (thuốc đối kháng với aldosteron), làm tăng
thải Na+ gây lợi tiểu. Sự tăng thải Na+ này phụ thuộc vào lượng aldosterol tăng hoặc
giảm bài tiết. Thuốc làm giảm thải K+ và H+, gây tăng K+ máu nên thường phối hợp với
thuốc lợi tiểu giảm K+ máu để giữ được tác dụng của thuốc và khắc phục tăng K+ máu
[1], [2].
1.1.4. Chỉ định
- Cổ trướng do xơ gan. Phù gan, phù thận, phù tim khi các thuốc chữa phù khác kém
tác dụng, đặc biệt khi có nghi ngờ chứng tăng aldosteron.
- Để bổ trợ cho thuốc ức chế enzym chuyển và thuốc lợi tiểu trong điều trị suy tim sung
huyết nặng; hội chứng thận hư; cổ trướng do u ác tính. Tăng aldosterol tiên phát, khi
không thể phẫu thuật [1], [2].
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
- Tác dụng không mong muốn toàn thân: Mệt mỏi, đau đầu, liệt dương, ngủ gà.
- Nội tiết: Tăng prolactin, to vú đàn ông, chảy sữa nhiều, rối loạn kinh nguyệt, mất
kinh, chảy máu sau mãn kinh.

3


- Tiêu hóa: ỉa chảy, buồn nôn.
- Da: Ban đỏ, ngoại ban, mày đay.
- Chuyển hóa: Tăng kali – huyết, giảm natri – huyết. Tăng creatinin huyết thanh.
- Thần kinh: Chuột rút/co thắt cơ, dị cảm.
- Máu: Mất bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu.
- Nhiễm acid chuyển hóa [1], [2].
1.1.6. Chống chỉ định
Mang thai, cho con bú. Suy thận cấp, suy thận nặng, vô niệu, tăng kali huyết, giảm
natri huyết, suy gan, loét dạ dày, tá tràng, mẫn cảm với spironolacton. Bệnh Addison
[1], [2].
1.1.7. Thận trọng
Tình trạng có nguy cơ tăng kali – huyết khi suy giảm chức năng thận hoặc đái tháo
đường. Khi phối hợp với các thuốc lợi tiểu giữ kali thông thường khác hoặc thuốc ức
chế enzym chuyển. Nhiễm acid chuyển hóa do tăng clo máu có thể hồi phục (thường đi
kèm với tăng kali huyết) có thể xảy ra trong xơ gan mất bù dù chức năng thận bình
thường. Spironolacton có thể dùng cho người mang thai khi bị bệnh tim [1], [2].
1.1.8. Liều lượng và cách dùng
- Phù: Uống, người lớn 100 – 200 mg mỗi ngày, tăng lên 400 mg mỗi ngày nếu cần,
khi bị phù dai dẳng; liều duy trì thông thường 75 – 200 mg mỗi ngày.
- Trẻ em, ban đầu 3 mg/kg mỗi ngày, chia thành liều nhỏ.
- Tăng tiết aldosteron nguyên phát: Uống, người lớn, để chẩn đoán: 400 mg mỗi ngày,
trong 3 – 4 tuần; điều trị trước phẫu thuật: 100 – 400 mg mỗi ngày; nếu không phẫu
thuật được, dùng liều thấp nhất có tác dụng để điều trị duy trì lâu dài.
- Thuốc bổ trợ dùng trong suy tim nặng: Uống, người lớn thường dùng liều 25 mg mỗi
ngày [1], [2].
1.1.9. Quá liều và xử trí
- Triệu chứng: Lo lắng, lẫn lộn, yếu cơ, khó thở.

- Xử trí: Rửa dạ dày, dùng than hoạt. Kiểm tra cân bằng điện giải và chức năng thận.

4


- Điều trị hỗ trợ: Nếu tăng kali huyết có thay đổi điện tâm đồ: Tiêm tĩnh mạch natri
bicarbonat, calci gluconat; cho uống nhựa trao đổi ion (natri polystyren sulfonat –
biệt dược Kayexalate...) để thu giữ các ion kali, làm giảm nồng độ kali máu [1], [2].
1.1.10. Các dạng bào chế của Spironolacton
- Viên nén spironolacton 25 mg, 50 mg, 100 mg,…
- Viên nang spironolacton 50 mg
- Viên nén bao phim Spironolacton và Furosemid
1.1.11. Một số nghiên cứu định lượng Spironolacton
Bảng 1. 1 Một số phương pháp định lượng Spironolacton
Kỹ thuật
Điều kiện phân tích
phân tích
Đo quang ở bước sóng 238
Quang phổ
nm.
Đo quang ở bước sóng 242
Quang phổ
nm.

STT Mẫu phân tích
1

Viên nén

2

Viên nén

3

4

5

6

7

Viên
nén
Spironolacton
và
Hydrochlorothiazid
Viên
nén
Spironolacton,
Furosemid,
và
hydroflumethiazid
Viên
nén
chứa
Spironolacton
và
Torsemid

Chế phẩm chứa
metolazon
và
spironolacton

Viên
Spironolacton
Furosemid

TLTK
[11], [14],
[15],[20]
[21]

Quang phổ

Tiến hành quét phổ từ
210,0 đến 289,8 nm

[10]

Quang phổ

Đo ở 3 bước sóng 278,
273, 238 nm

[17]

Quang phổ

Đo ở 3 bước sóng 255, 238
nm

[13]

Quang phổ
Bước sóng 241 nm
đạo hàm

nén
và HPLC

Pha động: Acetonitril:
dung dịch đệm amoni
acetat (pH= 5) = 50:50
Cột C18 (5 µm, 4,6x150
mm)
Tốc độ dòng 1,0 ml/min
Detector UV bước sóng
254 nm
5

[9]

[18]


8

Spironolacton

và
chất chuyển hoá HPLC
trong huyết thanh

9

Viên nén

1.2.

Pha động: MeOH: Nước =
60:40
Cột C18 (5 µm, 4,6x150
mm), cột bảo vệ C18 (5
µm, 3,9x20 mm)
Tốc độ dòng 1 ml/phút
Thể tích tiêm 40µl
Detector UV bước sóng
238 và 280 nm
Pha động: MeOH:Nước=
60:40
Cột C18 (5 µm, 4,6x150
mm)
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Thể tích tiêm 20 µl
Detector UV bước sóng
230 nm

HPLC

[19]

[21]

Tổng quan về phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – VIS)

1.2.1. Nguyên tắc của phương pháp
Khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua một môi trường có chứa chất hấp thụ thì độ hấp
thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và bề dày của môi trường hấp thụ
(dung dịch chất hấp thụ). Mối quan hệ này tuân theo định luật Lambert – Beer và được
biểu diễn bằng phương trình sau:
1

𝐼0

𝑇

𝐼

A = lg = lg

= K.C.L.

Trong đó:
T: Độ truyền qua
I0: Cường độ ánh sáng đơn sắc tới
I: Cường độ ánh sáng sau khi đã đi qua dung dịch
K: Hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ
L: Bề dày của lớp dung dịch
C: Nồng độ chất tan trong dung dịch [4], [5].

6


❖ Điều kiện áp dụng định luật Lambert – Beer:
- Ánh sáng phải đơn sắc
- Khoảng nồng độ phải thích hợp: Định luật Lambert – Beer chỉ đúng trong một giới
hạn nhất định của nồng độ
- Dung dịch phải trong suốt
- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sáng UV – VIS [4],
[5].
1.2.3. Máy quang phổ UV – VIS
Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng tử ngoại và khả kiến bao gồm:
nguồn sáng, bộ phận đơn sắc hóa, buồng chứa mẫu, bộ phận nhận và xử lý tín hiệu.

Hình 1.2 Máy quang phổ hấp thụ một chùm tia

7


Hình 1.3 Máy quang phổ hấp thụ hai chùm tia
Sơ đồ quang của máy một chùm tia (hình 1.2). Với máy một chùm tia, mẫu trắng
và mẫu đo phải được xử lý lần lượt. Dung môi hoặc mẫu trắng được đưa vào buồng đo
để chỉnh giá trị mật độ quang về 0. Sau đó dung dịch đo được đưa vào đo để xác định
giá trị.
Với máy hai chùm tia, cả mẫu trắng và mẫu đo được đặt cùng trong buồng đo và
chùm tia đơn sắc tuần tự đi qua mẫu trắng và mẫu đo nhờ các hệ thống gương quay.
Các máy quang phổ UV – VIS hiện nay đều có thể thực hiện đo ở chế độ đo điểm,
quét phổ [4].
1.2.4. Ứng dụng UV – VIS trong định lượng
- Phương pháp đo phổ trực tiếp

- Phương pháp gián tiếp
Các phương pháp gián tiếp như: phương pháp đường chuẩn, so sánh, thêm chuẩn,
thêm đường chuẩn, kĩ thuật đo quang vi sai theo bước sóng [4].
- Phương pháp đo phổ đạo hàm
Phổ đạo hàm là một kĩ thuật bao gồm sự chuyển đổi phổ hấp thụ thành phổ đạo
hàm bậc nhất, bậc hai hoặc bậc cao hơn.
Nếu độ hấp thụ tuân theo định luật Lambert – Beer thì đạo hàm bậc hai ở bước
sóng λ bất kì nào cũng được liên hệ với nồng độ bởi phương trình sau:
𝑑2 𝐴
𝑑2 𝐸
=
𝐶. 𝐿
𝑑𝜆2
𝑑𝜆2
Tại một bước sóng xác định, E là một hằng số.
Ở đây:
A: độ hấp thụ ở bước sóng λ
E: độ hấp thụ riêng ở bước sóng λ
C: nồng độ phần trăm (kl/tt) của chất hấp thụ
L: bề dày của lớp dung dịch chất hấp thụ[5].
8


- Phương pháp so sánh
Theo định luật Lambert Beer, sau khi đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn so sánh
(S) và dung dịch mẫu thử (X) ta có:
As = K.L.Cs
Ax = K.L.Cx
Ở đây:
+ As là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ Cs

+ Ax là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ Cx
Vì hệ số hấp thụ K và bề dày L của cuvet là như nhau nên ta có:
𝐴𝑥
𝐴𝑠

=

𝐶𝑥
𝐶𝑠

=> Cx = Cs x

𝐴𝑥
𝐴𝑠

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn không được chênh lệch nhau
quá nhiều. Các nồng độ này càng gần nhau, kết quả càng chính xác [4].
- Phương pháp đường chuẩn
Chuẩn bị một dãy chuẩn khoảng 5 dung dịch có các nồng độ chất chuẩn Cs khác
nhau.
Đo độ hấp thụ As của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C
Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch mẫu thử và dựa vào đường chuẩn ta xác định được
nồng độ mẫu thử Cx.
Chú ý: Khi xây dựng đường chuẩn nên khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ
với độ hấp thụ [5].
1.3.

Ứng dụng thử độ hoà tan trong đánh giá sinh khả dụng in vitro
Mỗi dạng thuốc gồm có dược chất và các tá dược. Tỷ lệ giữa dược chất – tá dược,

loại tá dược, kỹ thuật bào chế được lựa chọn dựa trên hàm lượng, tính chất hóa lý và
tính chất chung của thuốc và đặc tính hấp thu của nó. Toàn bộ các yếu tố này làm cho
mỗi chế phẩm có đặc tính hòa tan riêng [7].
Khi phát triển một chế phẩm thuốc, phép thử độ hòa tan được dùng như một công
cụ để xác định những yếu tố bào chế có thể ảnh hưởng quan trọng tới sinh khả dụng của
9


thuốc. Khi thành phần và phương pháp bào chế được xác định thì phép thử độ hòa tan
được dùng trong kiểm tra chất lượng của lô nâng cấp và lô sản xuất để đảm bảo sự đồng
nhất giữa các lô và biểu đồ hòa tan vẫn tương tự với độ hòa tan của lô đã thử lâm sàng
[7].
1.3.1. Khái niệm
Đánh giá độ hòa tan in vitro (hay sinh khả dụng in vitro, giải phóng hoạt chất in
vitro) là đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ dạng thuốc vào môi trường
hòa tan mô phỏng như môi trường dịch sinh học trong cơ thể người (nhiệt độ, pH, nhu
động,..) và bắt đầu được đưa vào Dược điển Mỹ 18 dưới dạng chuyên luận Thử hòa tan
(Dissolution test) khi có một loạt công trình nghiên cứu công bố sự liên quan giữa tốc
độ hòa tan và tác dụng của thuốc. Hai thiết bị thử hòa tan phổ biến nhất là thiết bị giỏ
quay và cánh khuấy dùng cho viên nén, viên nang và một số dạng thuốc khác [6].
1.3.2. Phương pháp thử
- Thiết bị: Máy thử độ hòa tan thích hợp
- Môi trường hòa tan: Tùy theo đặc điểm hòa tan của dược chất, khi cần có thể dùng
đệm Phosphat pH 4 – 8 hoặc acid hydrochloric loãng (0,001 – 0,1M). dung tích
thường dùng 500 – 1000 ml (không nhỏ hơn 3 lần độ bão hòa của dược chất). Một số
chất làm tăng độ hòa tan có thể cho vào môi trường hòa tan (như chất diện hoạt)
- Thời gian thử: Tuỳ thuộc vào chế phẩm
- Tốc độ khuấy: 50 – 100 vòng/phút
- Phương pháp định lượng: Tùy vào đặc tính của dược chất có thể dùng các phương
pháp khác nhau, thường dùng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS,

HPLC,… [21].
1.3.3. Ý nghĩa của sinh khả dụng in vitro
Sinh khả dụng in vitro là công cụ kiểm soát chất lượng các dạng thuốc rắn để uống
(viên nén, viên nang, pellet,…), đặc biệt là đảm bảo sự đồng nhất giữa các lô mẻ sản
xuất, giữa các nhà sản xuất.
SKD in vitro dùng để sàng lọc, định hướng, đánh giá SKD in vivo. Việc đánh giá
in vivo rất đắt tiền, tốn kém, không thể làm tràn lan do đó trước hết phải dùng in vitro
sàng lọc, định hướng cho cho việc thử in vivo để giảm bớt chi phí, thời gian.giải phóng
dược chất in vitro là công cụ cơ bản để xây dựng công thức, thiết kế dạng thuốc trên cơ
10


sở coi tỷ lệ hòa tan dược chất là thông số chất lượng của đầu ra, từ đó chọn lựa dạng
thuốc và công thức tối ưu.
SKD in vitro dùng để thay thế cho sinh khả dụng in vivo trong trường hợp đã chứng
minh được có sự tương quan đồng biến giữa sinh khả dụng in vitro và in vivo với điều
kiện công thức và quy trình sản xuất không thay đổi. Thực ra do tốn kém nên SKD in
vivo chỉ được đánh giá một lần khi lập hồ sơ xin phép sản xuất. Từ đó về sau phải dùng
SKD in vitro để kiểm soát quá trình sản xuất, để đảm bảo tính ổn định cho SKD in vivo.
SKD in vitro chưa phải là SKD thực sự, do đó chưa phản ánh được đầy đủ hiệu
quả lâm sàng của chế phẩm thử. Có những trường hợp dược chất hòa tan nhanh nhưng
chưa chắc hấp thu tốt. Tuy SKD in vitro mô phỏng một số điều kiện sinh học nhưng còn
khác xa so với điều kiện thực tế trên cơ thể sống [21].

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1. Dược phẩm
- Viên nén Spironolacton 25 mg nghiên cứu: 27 mẫu
- Viên nén Aldacton 25 mg của Pfizer, Thái Lan, số đăng kí VN-16854-13, ngày sản
xuất 30/1/2017, hạn sử dụng: 30/01/2020. Số lô: 1709003.
- Các thành phần tá dược trong công thức bào chế:
Bảng 2.1 Thành phần các tá dược trong công thức bào chế
STT

Tên tá dược

Khối lượng (g)

1

CaSO4.12H2O

12,0

2

PVPK30

2,0

3

Tinh bột

1,0

4

Natri laurylsulfat

0,6

5

Lactose

33,44

6

Magie sterat

0,28

7

Talc

1,68

- Spironolacton nguyên liệu do công ty dược phẩm Hà Tây cung cấp, nhà sản xuất là
công ty Tianjin jinjin, Trung Quốc, số kiểm soát SA0643, hàm lượng 99,27%.
2.2.2. Hóa chất

12


Bảng 2.2 Danh mục các hoá chất đã sử dụng
STT

Tên chất

Nguồn gốc

Hàm lượng

1

Methanol

Samchun, Hàn Quốc

98%

2

Natri laurylsulfat

Samchun, Hàn Quốc

85%

3

Acid clohydric

Trung quốc

36 – 38%

4

Natri dihydrophosphat

Trung Quốc

99%

5

Natri hydroxyd

Trung Quốc

96%

6

Acid phosphoric

Trung Quôc

85%

2.2.3. Thiết bị
- Máy thử độ hòa tan Pharmatest PTWS – 610, Đức.
- Máy đo quang Hitachi U – 5100, Nhật Bản.
- Máy đo pH Eutech pH510, Singapo.
- Cân phân tích Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ (d = 0,01 mg)
- Máy li tâm EBA 20 Hettich, Đức.
- Pipep chính xác, bình định mức các loại và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
2.2.

Nội dung nghiên cứu

✓ Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng spironolacton trong viên nén bằng quang
phổ UV VIS để xác định độ hòa tan và đánh giá độ hoà tan in vitro viên nén
Spironolacton 25 mg.
✓ Ứng dụng phương pháp định lượng để thử hòa tan và đánh giá hoà tan in vitro phục
vụ phát triển công thức bào chế của Spironolacton.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thử độ hòa tan
Tiến hành theo chuyên luận thử hoà tan trong USP 40 [21]
Chuẩn bị môi trường hòa tan pH 1,2: 12,5 ml HCl 6M + 1 g natri laurylsulfat, thêm
nước vừa đủ thể tích 1000ml, khuấy đều.
✓ Điều kiện thử:
Thiết bị kiểu cánh khuấy
Môi trường hòa tan: 1000 ml dung dịch đệm
Nhiệt độ: 37oC ± 0,5 oC
13


Tốc độ quay: 75 vòng/phút
✓ Thời gian lấy mẫu: 60 phút.

✓ Tiến hành:
- Mẫu thử: Hút 5 ml dung dịch thử, pha loãng với 5 ml môi trường (pha loãng 2 lần).
- Dung dịch chuẩn: : cân chính xác khoảng 25 mg spironolacton chuẩn vào bình định
mức 100 ml. Thêm 10 ml methanol, siêu âm cho tan hoàn toàn. Định mức bằng môi
trường hoà tan tương ứng vừa đủ 100ml. Lấy 1 ml dịch này cho vào bình định mức
20 ml. Định mức vừa đủ bằng môi trường hoà tan.
- Đo độ hấp thụ của các dung dịch ở bước sóng 242 nm, trong 1 cốc đo thạch anh dày
1 cm, dùng môi trường pha loãng làm mẫu trắng.
- Tính hàm lượng Spironolacton đã hòa tan trong mỗi viên dựa trên độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nồng độ C15H21N3O3S của dung dịch chuẩn.
- Tính lượng SPI giải phóng so với hàm lượng ghi trên nhãn bằng công thức:
𝐴𝑡. 𝑚𝑐. 𝐻𝐿𝑐. 𝐻𝑆𝑃𝐿𝑡
𝑥100
𝐴𝑐. 𝐻𝑆𝑃𝐿𝑐. 𝐻𝐿𝑁
Trong đó:
At: độ hấp thụ của dung dịch thử
Ac: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn
mc: khối lượng chuẩn (mg)
HLc: Hàm lượng chuẩn (%)
HSPLc: hệ số pha loãng dung dịch chuẩn
HSPLt: Hệ số pha loãng dung dịch thử
✓ Yêu cầu: Sau 60 phút, có không ít hơn 75,00% lượng SPI giải phóng so với hàm
lượng ghi trên nhãn [21].
2.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro
✓ Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử:
- Dung dịch HCl 6M: pha loãng 510 ml HCl đặc với nước vừa đủ 1000 ml.

14

- Dung dịch NaOH 1M: cân 4,0 g NaOH, hòa tan hoàn toàn với khoảng 90 ml nước,
thêm nước vừa đủ 100 ml.
✓ Chuẩn bị các dung dịch hoà tan mô phỏng dịch đường tiêu hoá pH 1,2; pH 4,5; pH
6,8.
- Dung dịch đệm pH 1,2: 12,5 ml HCl 6M + 1 g natri laurylsulfat, thêm nước vừa đủ
thể tích 1000ml, khuấy đều.
- Dung dịch đệm pH 4,5: 7,8 g NaH2PO4 + 1 g natri laurylsulfat, thêm nước vừa đủ thể
tích 1000 ml, khuấy đều.
- Dung dịch đệm pH 6,8: 7,8 g NaH2PO4 + 0,94 g NaOH + 1 g natri laurylsulfat, thêm
nước vừa đủ thể tích 1000 ml, khuấy đều.
✓ Điều kiện thử: giống với phương pháp thử độ hoà tan ở lần lượt 3 môi trường pH 1,2;
pH 4,5; pH 6,8..
✓ Thời gian lấy mẫu: 10, 20, 30, 45, 60 phút.
✓ Thể tích mẫu: 5 ml
✓ Tiến hành:
- Dung dịch thử: Lấy 5 ml môi trường hòa tan ở các thời điểm 10, 20, 30, 45, 60 phút;
pha loãng 2,0 lần (5,0 ml/10 ml) với môi trường pH 1,2; 4,5; Môi trường pH 6,8 đo
trực tiếp.
- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 25 mg spironolacton chuẩn vào bình định
mức 100 ml. Thêm 10 ml methanol, siêu âm cho tan hoàn toàn. Định mức bằng môi
trường hoà tan tương ứng vừa đủ 100ml. Lấy 1 ml dịch này cho vào bình định mức
20 ml. Định mức vừa đủ bằng môi trường hoà tan.
- Đo và tính toán hàm lượng SPI trong mỗi mẫu tương tự như phần thử hoà tan.
2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng
✓ Độ đặc hiệu
- Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi
các thành phần khác trong mẫu.
- Tiến hành:
+ Mẫu trắng: dung môi hòa tan mẫu (1 mẫu)
+ Dung dịch placebo: cân chính xác khối lượng placebo tương ứng với khối lượng của

1 viên vào bình định mức 1000ml. Thêm khoảng 900 ml môi trường hoà tan, lắc siêu
15


âm 10 phút. Để nguội. Định mức vừa đủ bằng môi trường hoà tan. Lọc, bỏ 50 ml dịch
lọc đầu, lấy 25 ml dịch này cho vào bình định mức 50ml, thêm dung môi vừa đủ, lắc
đều. (6 mẫu)
+ Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 25 mg spironolacton chuẩn vào bình định
mức 100 ml. Thêm 10 ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn. Định mức bằng dung môi
pha mẫu vừa đủ 100ml. Lấy 1 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 20 ml. Định
mức vừa đủ bằng dung môi pha mẫu.
+ Tiến hành đo quang các dung dịch với mẫu trắng là môi trường hoà tan.
- Yêu cầu:
Độ hấp thụ A của mẫu placebo phải ≤ 2,0% so với độ hấp thụ của mẫu chuẩn.
✓ Sự phù hợp của hệ thống
- Dung dịch chuẩn 1 mẫu: nồng độ 12,5 µg/ml
- Tiến hành đo mật độ quang 6 lần của dung dịch chuẩn trên. Tính RSD%
- Yêu cầu: RSD% ≤ 2,0%
✓ Khoảng tuyến tính
- Dung dịch chuẩn gốc 250 µg/ml: Cân chính xác khoảng 25 mg SPI chuẩn vào bình
định mức 100 ml. Thêm 10 ml MeOH, siêu âm cho tan hoàn toàn. Thêm môi trường
hòa tan vừa đủ 1 ml. Lắc đều.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn 1,25 µg/ml; 2,5 µg/ml; 5,0 µg/ml; 10,0 µg/ml; 12,5
µg/ml; 15,6 µg/ml.
- Dãy dung dịch của dãy chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính
- Tiến hành đo độ hấp thụ (A) của dãy dung dịch chuẩn, mỗi dung dịch đo 1 lần.
- Xây dựng đường hồi quy: Y = aX + b
- Yêu cầu:
+ Hệ số tương quan r ≥ 0,995
+ % Hệ số chắn tại nồng độ 100%:

Y% =

⎸ℎệ 𝑠ố 𝑐ℎắ𝑛 (𝑏)⎸
𝐴 𝑐 (100%)

x 100% (Y% ≤ 2,0%)

✓ Độ đúng
16


- Xác định độ đúng tại các mức nồng độ khác, mỗi nồng độ tiến hành 3 lần.
- Độ đúng (tỷ lệ thu hồi) (%) =

𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖
𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ℎê𝑚 𝑣à𝑜

x 100%

- Yêu cầu: tỷ lệ % thu hồi 95,00% - 105,00% với RSD ≤ 5,00%.
- Tiến hành:
+ Đối với độ hoà tan: Chuẩn bị các mẫu tự tạo có nồng độ tương ứng 40%, 60%, 80%,
100%, 120%: Cân chính xác khoảng 10,0 mg (40%), 15,0 mg (60%), 20 mg (80%),
25 mg (100%), 30 mg (120%) vào bình định mức 1000 ml đã có sẵn 255,0 mg
placebo. Thêm khoảng 900 ml môi trường, siêu âm trong 30 phút. Để nguội, thêm
môi trường vừa đủ 1000 ml. Lắc đều. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Hút chính
xác 25 ml vào bình định mức 50 ml, định mức vừa đủ bằng môi trường hoà tan, lắc
đều, đo quang. Mỗi nồng độ chuẩn bị 3 mẫu.
+ Đối với sinh khả dụng in vitro: Chuẩn bị các mẫu tự tạo có nồng độ 15%, 60%, 75%,
90%: Cân chính xác khoảng 3,75 mg (15%), 15,0 mg (60%), 18,75 mg (75%), 22,5

mg (90%) vào bình định mức 1000 ml. Tiến hành tương tự như thử độ hoà tan nhưng
trong 3 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8.
✓ Độ chính xác:
- Độ lặp: Tiến hành xử lý và đo mật độ quang dung dịch thử ở mức tương ứng 100%
(6 lần): Cân khối lượng 20 viên, tính khối lượng trung bình viên. Nghiền viên. Cân
khối lượng tương ứng với 1 viên cho vào bình định mức 1000 ml. Thêm 900 ml môi
trường hoà tan tương ứng, siêu âm 30 phút. Để nguội. Ly tâm 3000 vòng/phút trong
5 phút. Hút chính xác 25 ml vào bình định mức 50 ml, định mức vừa đủ bằng môi
trường hoà tan, lắc đều, đo quang.
- Độ chính xác trung gian: Tiến hành phân tích 6 mẫu song song tương tự như đối với
độ lặp lại nhưng ở ngày phân tích khác.
- Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng của mỗi ngày (n = 6) ≤ 5,00%, của cả
hai ngày (n = 12) phải ≤ 5,00 %[7].
2.3.4. Ứng dụng
- Ứng dụng phương pháp định lượng spironolacton bằng quang phổ UV VIS để định
lượng SPI giải phóng trong phép thử độ hoà tan và thử nghiệm hoà tan in vitro 27
công thức viên nén spironolacton 25 mg.
17