PHÙNG THỊ HOA NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT CAO đặc GIÀU FLAVONOID từ vỏ hạt đậu XANH KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

PHÙNG THỊ HOA

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
CAO ĐẶC GIÀU FLAVONOID
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ HOA
Mã sinh viên: 1401232

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
CAO ĐẶC GIÀU FLAVONOID
TỪ VỎ HẠT ĐẬU XANH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng
2. NCS.ThS. Nguyễn Đình Dũng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS
NGUYỄN THU HẰNG (Trưởng bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội),
với tôi cô không chỉ là người thầy, người luôn giành thời gian, tâm huyết để tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn, động viên và khích lệ tôi trong suốt khoảng thời gian tôi thực hiện đề
tài tốt nghiệp này mà cô còn là người truyền cảm hứng cho tôi trong suốt quá trình làm
việc tại bộ môn.
Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến:
NCS.ThS. Nguyễn Đình Dũng người đã luôn ở bên hướng dẫn, giúp đỡ và động
viên tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
DS. Nguyễn Văn Phương là người động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
làm đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ
môn Dược liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình hoàn thành đề tài.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân yêu trong gia
đình tôi, các anh chị, các bạn và các em sinh viên làm đề tài tại Bộ môn Dược liệu đã
luôn ủng hộ, cổ vũ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong
thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Phùng Thị Hoa


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1.

Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Vigna radiata (L.) Wilczek ................ 2

1.2.

Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh ........................................................ 3

1.3.

Tác dụng sinh học của vỏ hạt đậu xanh ........................................................... 5

1.4.

Công dụng ...................................................................................................... 8

1.5.

Chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh .......................................................... 8

1.6.

Tổng quan về cao thuốc từ dược liệu .............................................................. 9

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 11

2.1.

Đối tượng, nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................... 11

2.1.1.

Nguyên liệu ............................................................................................ 11

2.1.2.

Dụng cụ và thiết bị ................................................................................. 11

2.1.3.

Hóa chất ................................................................................................ 12

2.2.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 12

2.3.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 12

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 19
3.1. Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isovitexin và vitexin
trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh .......................................................................... 19
3.2. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu
flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất. ............................... 31
3.3.

Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh
………………………………………………………………………………..36

3.3.1.

Mô tả ..................................................................................................... 36

3.3.2.

Độ đồng nhất ......................................................................................... 36

3.3.3.

pH .......................................................................................................... 37

3.3.4.

Định tính ................................................................................................ 38

3.3.5.

Mất khối lượng do làm khô..................................................................... 40

3.3.6.

Định lượng ............................................................................................. 41

3.4.

Bàn luận ....................................................................................................... 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Việt

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

ALT

alanin transaminase

AST

aspartat transaminase

Dd

dung dịch

EtOH

Ethanol

EtOAc

ethyl acetat

HPLC

sắc ký lỏng hiệu năng cao

HL

hàm lượng

IL

Interleukin

KL

khối lượng

LOD

giới hạn phát hiện

LOQ

giới hạn định lượng

MeOH

methanol

MDA

malonyl dialdehyd

RSD (%)

độ lệch chuẩn tương đối

TB

trung bình

TNF – α

yếu tố hoại tử khối u- alpha

S

diện tích pic

SD

độ lệch chuẩn

SKLM

sắc ký lớp mỏng

SOD

superoxid dismutase


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh

4

3.1

Cách pha dãy các dung dịch chuẩn

20

3.2

Kết quả khảo sát sự phù hợp của hệ thống

24

3.3

Kết quả khảo sát độ tuyến tính và khoảng xác định của phương pháp
định lượng

25

3.4

Kết quả khảo sát độ lặp lại của isovitexin

27

3.5

Kết quả thẩm định độ lặp lại của vitexin

28

3.6

Kết quả khảo sát độ đúng của isovitexin

29

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng của vitexin

30

3.8

Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ
của phương pháp

31

3.9

Thiết kế thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol và thời gian chiết xuất

32

3.10

Tỉ lệ cao thu được và hàm lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu
cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo dung môi và thời gian chiết xuất

33

3.11

Thiết kế thí nghiệm khảo sát số lần chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất

34

3.12

Tỉ lệ cao thu được và hàm lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu
cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo số lần chiết và nhiệt độ chiết

35

3.13

Kết quả xác định pH của 5 mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

37

3.14

Kết quả định tính thành phần hóa học của các mẫu cao chiết từ vỏ
hạt đậu xanh bằng phản ứng hóa học

38

3.15

Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của các mẫu cao chiết
từ vỏ hạt đậu xanh

41

3.16

Kết quả định lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu cao chiết từ
vỏ hạt đậu xanh

41


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Ảnh chụp cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)

2

2.1

Ảnh chụp mẫu dược liệu vỏ hạt đậu xanh nghiên cứu

11

3.1

Phổ hấp thụ UV-Vis của isovitexin, vitexin và dung dịch chuẩn
hỗn hợp

21

3.2

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 270 nm và
335 nm

22

3.3

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp định lượng

23

3.4

Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ
và diện tích pic của isovitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml 150 µg/ml.

26

3.5

Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ
và diện tích pic của vitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml – 150
µg/ml.

26

3.6

Ảnh chụp các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh quan sát dưới kính
hiển vi vật kính 10.

37

3.7

Ảnh chụp sắc ký đồ cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh quan sát ở bước
sóng 366nm sau khi phun thuốc thử NP

40


ĐẶT VẤN ĐỀ

Đậu xanh là loại lương thực khá gần gũi và quen thuộc với nhân dân ta. Ngoài giá
trị về dinh dưỡng, đậu xanh còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian ở dạng toàn
hạt hoặc vỏ hạt để làm thuốc chữa bệnh. Hạt đậu xanh để chữa sốt nóng, phiền khát, phù
thũng, tả lỵ, mụn nhọt sưng tấy, loét miệng lưỡi, các trường hợp ngộ độc [3]. Vỏ hạt đậu
xanh có tác dụng giải nhiệt, tiêu độc tốt hơn so với hai lá mầm. Tác giả Nguyễn Đình
Dũng và cộng sự đã công bố thành phần chủ yếu của vỏ hạt đậu xanh là flavonoid, trong
đó flavonoid chính là isovitexin và vitexin [5]. Flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh có
tác dụng bảo vệ tim mạch, bảo vệ tế bào gan, bảo vệ cơ thể chống phóng xạ [7] và chống
đột biến [26], chống u thực nghiệm [14]. Dịch chiết vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế
emzym xanthin oxidase in vitro [13]. Bên cạnh đó, vỏ hạt đậu xanh là dược liệu rẻ tiền,
dễ kiếm và là dư phẩm của quá trình sản xuất đậu xanh tách vỏ. Do đó, vỏ hạt đậu xanh
được đánh giá là nguồn nguyên liệu giàu flavonoid để nghiên cứu phát triển thuốc điều

trị. Tác giả Trần Vân Hiền đã xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh
[16], tuy nhiên quy trình này còn nhược điểm là sử dụng dung môi hữu cơ độc hại. Do
đó, việc xây dựng quy trình chiết xuất cao đặc giàu flavonoid sử dụng dung môi an toàn,
thân thiện với môi trường để phát triển thuốc điều trị từ vỏ hạt đậu xanh là cần thiết.
Vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu
flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh. Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu sau:
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu flavonoid
từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất.
2. Sơ bộ đánh giá một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Cây đậu xanh có tên khoa học là Vigna radiata (L.) Wilczek, họ Đậu (Fabaceae)
[41].
Tên đồng nghĩa: Phaseolus radiatus Lour. non L; Phaseolus mungo Gagnep. non
L; Phaseolus aureus Roxb.; Vigna aureus (Roxb.) Hepper; Vigna aurea Khôi; Vigna
aurea Roxb; Azukia radiata (L.) Ohwi, Cadelium radiatum (L.) S.Y.Hu, Phaseolus
aureus Wall., Phaseolus abysissinicus Savi, Phaseolus aureus Zuccagni, Vigna aureus
Piper [25], [3].
Tên nước ngoài: Green gram, Mung bean (Anh); Haricot mungo (Pháp); Xi dou,
Xiao dou (Trung Quốc); Fundou, Bundou (Nhật) [39].
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [33], chi Vigna thuộc Họ đậu
(Fabaceae), Bộ đậu (Fabales) Phân lớp hoa hồng (Rosidae), Lớp ngọc lan
(Magnoliopsida), Ngành ngọc lan (Magnoliophyta, Giới thực vật (Plantae).
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Vigna radiata (L.) Wilczek
Cây thảo sống hàng năm, mọc đứng, ít phân
nhánh, cao từ 50- 60 cm. thân và cành hơi có rãnh và

phủ đầy lông mềm. Lá kép mọc so le gồm 3 lá chét,
hình trái xoan tam giác, gốc tròn đầu nhọn, mặt trên
màu lục sẫm, mặt dưới màu nhạt, gân 3 tỏa từ gốc,
cuống dài 10-15 cm. Cụm hoa nhiều màu vàng hoặc
màu lục mọc thành chùm ở kẽ lá, đài hình chuông
ngắn, bộ nhị 9+1. Quả hình trụ mảnh, có lông trên bề
mặt. Hạt hình trụ ngắn, rốn hạt màu trắng hình elip dài
(Hình 1.1). Mùa ra hoa: 3-5, mùa ra quả: 6-8.
Đậu xanh được trồng ở khắp các nước nhiệt
đới và cận nhiệt đới châu Á và các châu khác trên

Hình 1.1. Ảnh chụp cây đậu xanh
(Vigna radiata (L.) Wilczek)

thế giới. Ở Việt Nam, cây cũng được trồng phổ biến ở khắp nơi.

2


1.2.

Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh
Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh gồm có flavonoid, tanin, acid hữu cơ,

đường khử, polysaccharid, trong đó thành phần chính là flavonoid [30].
Năm 1998, theo tác giả Trần Vân Hiền và cộng sự [17], hàm lượng flavonoid toàn
phần trong vỏ hạt đậu xanh là 0,8%, định lượng bằng HPLC cho thấy 2 flavonoid chính
trong vỏ hạt đậu xanh là isovitexin (9,5%) và vitexin (90,5%).
Năm 2014, từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh, tác giả Nguyễn Thu
Hằng đã phân lập và nhận dạng được hai flavonoid là quercitrin và vitexin [12].

Năm 2017, Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự đã phân lập được luteolin, taxifolin và
catechin từ vỏ hạt đậu xanh [11].
Năm 2017, Phạm Thị Thu Hằng và cộng sự đã phân lập được vitexin, isovitexin,
luteolin, taxifolin và catechin từ vỏ hạt đậu xanh [14].
Năm 2018, Nguyễn Đình Dũng và cộng sự đã định lượng flavonoid trong vỏ hạt
đậu xanh bằng HPLC cho thấy thành phần chính trong vỏ hạt đậu xanh là isovitexin và
vitexin [5].
Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh được trình bày ở bảng
1.1.
Một nghiên cứu về thành phần chất vô cơ bằng phương pháp quang phổ phát xạ
của tác giả Hoàng Quỳnh Hoa [18] cho thấy vỏ hạt đậu xanh có chứa 14 nguyên tố vô
cơ là Al, Si, Mg, Ca, Ba, Fe, Mn, Ni, Cu, P, Na, K, Sr và Ti. Nguyên tố K chiếm tỷ lệ
nhiều nhất trong vỏ hạt đậu xanh (5%).
Ngoài ra, trong vỏ hạt đậu xanh còn có D-chiro-inositol tự do [36].

3


Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh
Tên hợp chất

Cấu trúc hóa học

Luteolin

Tài liệu trích dẫn

[11], [14]

Catechin

[11], [14]

[14], [18]

Isovitexin

Vitexin

[12], [14]

Taxifolin

[11], [14]

Quercitrin

[12]

4


1.3.

Tác dụng sinh học của vỏ hạt đậu xanh

1.3.1. Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng và cộng sự [13], dịch chiết
ethanol toàn phần và các phân đoạn ethyl acetat, cloroform, n-hexan từ vỏ hạt đậu xanh
đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro (p<0,05). Ở 3 nồng độ thí nghiệm

(100 μg/ml; 50 μg/ml và 10 μg/ml), tỷ lệ phần trăm ức chế so với nhóm chứng (I%) của
dịch chiết ethanol toàn phần tương ứng là 52,96%; 37,89%; 10,08%; trong đó phân đoạn
dịch chiết ethyl acetat có tác dụng ức chế mạnh và rõ rệt (p<0,01) với I% tương ứng là
79,86%; 67,02%; 47,68%. Định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy phân đoạn này có
thành phần chính là flavonoid.
1.3.2. Tác dụng ức chế tyrosinase in vitro
Theo kết quả nghiên cứu của Yang Yao và cộng sự [41], dịch chiết ethanol 70%
và các phân đoạn dịch chiết ethyl acetat, cloroform, n-butanol của vỏ hạt đậu xanh đều
thể hiện tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro. Nồng độ ức chế 50% hoạt tính
tyrosinase của dịch chiết ethyl acetat, n-buthanol, ethanol 70%, cloroform lần lượt là
82,7 mg/ml; 207,4 mg/ml; > 500 mg/ml; > 500 mg/ml. Từ đó thấy rằng dịch chiết ethyl
acetat có tác dụng ức chế mạnh nhất.
Tiếp đó, nghiên cứu tiến hành phân lập hai flavonoid là isovitexin và vitexin từ
dịch chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh và đánh giá khả năng ức chế tyrosinase in vitro
so với arbutin - một chất ức chế tyrosinase. Kết quả cho thấy IC50 của 2 hợp chất
isovitexin và vitexin lần lượt là 6,3 mg/ml; 5,6 mg/ml; IC50 của arbutin là 2,0 mg/ml.
1.3.3. Tác dụng hạ đường huyết
Tác giả Yang-Hee Jang và cộng sự [43] đã tiến hành so sánh khả năng hạ đường
huyết thông qua con đường ức chế hoạt tính enzym α- glucosidase in vitro của dịch chiết
vỏ hạt đậu xanh với ethanol 95% và chất đối chứng acarbose. Kết quả cho thấy dịch
chiết vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh hơn so với acarbose với
I% tương ứng là 48,6% và 35,1% ở liều 0,5 mg/ml.
Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng tiến hành đánh giá tác dụng của dịch chiết ethanol
95% vỏ hạt đậu xanh đối với quá trình kiểm soát đường huyết và tình trạng kháng insulin
trên chuột bị tiểu đường typ 2 được thực hiện như sau:
5


Chia chuột làm 2 lô:
Lô 1: Ăn theo chế độ ăn kiêng: 39,8% bột bắp; 20% casein; 13,2% bột bắp cải

dextrinized; sucrose 10%; dầu đậu tương 7%; alphacel 5%; hỗn hợp khoáng chất 3,5%;
1% vitamin tổng hợp; 0,3% L-cystein; 0,25% cholin bitartrat và 0,0014% t-butyl
hydroquinon.
Lô 2: Chế độ ăn kiêng giống lô 1 và bổ sung 1% dịch chiết ethanol 95% vỏ hạt đậu
xanh thay cho bột bắp trong vòng 7 tuần.
Kết quả, nồng độ HbA1c và glucose trong máu ở lô 2 (6,81±0,19% và 344,8±16,2
mg/dL) thấp hơn rõ rệt so với lô 1 (8,07±0,29% và 481,6±22,0 mg/dL); p < 0,01.
1.3.4. Tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ
Flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế khá mạnh các phản ứng peroxy
hóa lipid trong gan, lách, ruột non chuột nhắt trắng sau chiếu xạ liều 7 Gy, và giảm tổn
thương rõ rệt ở các cơ quan này cả về đại thể lẫn vi thể [7], [8]. Flavonoid vỏ hạt đậu
xanh còn có tác dụng bảo vệ tế bào nội mạc động vật bò và nguyên bào sợi được gây
tổn thương bằng H2O2 hoặc hệ thống tạo gốc tự do Hypoxanthin/Xanthin oxidase.
Trên lâm sàng, viên nang vitexin với liều 400mg/ngày x 60 ngày có tác dụng thanh
nhiệt, giảm triệu chứng nhiệt, cân bằng lại tình trạng oxy hóa - chống oxy hóa đối với
bệnh nhân ung thư vú sau xạ trị [19], đồng thời còn giúp phục hồi sự đáp ứng chuyển
dạng của tế bào lympho ở máu ngoại vi của những bệnh nhân này [21], [23].
1.3.5. Tác dụng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào
Hỗn hợp flavonoid chiết xuất từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế phản ứng
peroxy hóa lipid màng tế bào gan trong dịch nghiền đồng thể. Tác dụng ức chế tương
quan tuyến tính với nồng độ flavonoid [8].
Đối với tế bào lympho người (in vitro) cho thấy khi tăng nồng độ flavonoid trong
hỗn hợp dịch nghiền đồng thể tế bào lympho người thì nồng độ MDA (malonyl
dialdehyd) - sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid các màng sinh học giảm rất nhanh
[8].

6


1.3.6. Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Tác giả Liu và cộng sự [38] đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của dịch chiết
ethanol 75% vỏ hạt đậu xanh và 2 flavonoid chính được phân lập từ dịch chiết này là
isovitexin và vitexin thông qua nồng độ enzym ALT (alanin transaminase), AST
(aspartat transaminase) trong máu, nồng độ MDA (malonyl dialdehyd) và SOD
(superoxid dismutase). Nghiên cứu thực hiện trên mô hình gây tổn thương gan chuột
bằng ethanol 56% in vivo cho kết quả: Tại liều tương ứng với 13 mg/kg isovitexin, 15
mg/kg vitexin và 1,28 g dịch chiết ethanol 75% của vỏ hạt đậu xanh, có tác dụng làm
giảm nồng độ ALT, AST, MDA và làm tăng SOD bảo vệ tế bào gan qua sự ức chế tích
tụ lipid ở gan và duy trì tình trạng chống oxy hóa. Hơn nữa, khi nghiên cứu tác dụng
bảo vệ tế bào gan của dịch chiết ethanol 75% và 2 flavonoid chính cho thấy isovitexin
và vitexin là các thành phần có liên quan đến tác dụng bảo vệ tế bào gan [38].
Một nghiên cứu khác trên chuột của Watnanabe và cộng sự [35] cho thấy protein
phân lập từ đậu xanh có thể đóng vai trò ngăn ngừa sự tiến triển của bệnh gan nhiễm mỡ
không do rượu bằng cách làm giảm tích tụ lipid ở gan.
1.3.7. Tác dụng chống viêm
Theo tác giả Inhae Kang và cộng sự [37], dịch chiết ethanol 80% vỏ hạt đậu xanh
làm giảm sự phát sinh phản ứng viêm, các đại thực bào kết hợp với mô mỡ đã liên quan
đến quá trình viêm mạn tính, viêm mô mức thấp ở mô mỡ trong bệnh béo phì, nguyên
nhân là liên quan đến sự đề kháng insulin. Đặc biệt, TNF-α tiết ra bởi các tế bào đóng
vai trò quan trọng trong phản ứng viêm, IL-6 có tác dụng gây viêm và chống viêm được
tiết ra bởi các tế bào T và các đại thực bào, MCP-1 là một cytokin viêm và nó ảnh hưởng
đến béo phì và khả năng kháng insulin. Nghiên cứu này đã phát hiện ra các cytokine
viêm như IL-6 và MCP-1 (protein hóa ứng động tế bào đơn nhân-1) đã giảm đáng kể
sau khi điều trị bằng vitexin trong 14 ngày.
1.3.8. Tác dụng chống đột biến
Năm 1998, Trần Đức Phấn đã đánh giá tác dụng chống đột biến của flavonoid vỏ
hạt đậu xanh và dịch chiết đậu xanh toàn phần trên chuột thực nghiệm bị nhiễm monitor
- một loại hóa chất bảo vệ thực vật. Kết quả cho thấy flavonoid vỏ hạt đậu xanh có tác

7

dụng hạn chế việc xuất hiện các đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể ở chuột bị nhiễm monitor
liều nhỏ dài ngày [26].
1.3.9. Tác dụng điều trị tại chỗ tổn thương bỏng trên thực nghiệm
Flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng làm se khô vết bỏng, kích thích liền
sẹo, kháng khuẩn tốt hơn dung dịch berberin 1% trên thỏ thí nghiệm [6].
1.3.10. Tác dụng chống u thực nghiệm
Dùng tác nhân benzo[a]pyren và dầu Ba đậu theo phương pháp của Ramanathan
R để gây khối u thực nghiệm trên chuột nhắt trắng. Theo dõi sự xuất hiện và phát triển
của khối u, so sánh kết quả của nhóm chứng và nhóm thử cho thấy flavonoid vitexin
chiết từ vỏ hạt đậu xanh với liều 150 mg/kg /ngày dùng đường uống và bôi trên da 7
ngày trước khi gây u thực nghiệm, sau đó cho chuột uống trong 13 tuần tiếp theo đã thể
hiện tác dụng ức chế sự hình thành và phát triển khối u trên da rõ rệt [14].
1.4.

Công dụng
Ngoài giá trị về dinh dưỡng, đậu xanh còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân

gian ở dạng toàn hạt hoặc vỏ hạt để làm thuốc chữa bệnh. Hạt đậu xanh để chữa sốt
nóng, phiền khát, phù thũng, tả lỵ, mụn nhọt sưng tấy, loét miệng lưỡi, các trường hợp
ngộ độc [30]. Vỏ hạt đậu xanh có tác dụng giải nhiệt, tiêu độc tốt hơn so với hai lá mầm
[29].
1.5.

Chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh
Quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh được tác giả Trần Vân Hiền và

cộng sự đề xuất tại Giải pháp hữu ích số 2-0000387 công bố ngày 26/04/2006 [16] gồm
các bước như sau:

- Tán vỏ hạt đậu xanh sau khi đã được loại bỏ tạp chất và rửa sạch sấy khô, tiếp đó rây
qua rây số 28; làm ẩm bột thu được bằng cồn 80-85% theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2
giờ, chiết bằng thiết bị chiết hồi lưu có gia nhiệt ở nhiệt độ 100°C trong thời gian 6 giờ,
công đoạn này được lặp lại 3 lần; thu gom toàn bộ dịch chiết cồn rồi cất thu hồi dung
môi trong điều kiện nhiệt độ thấp (từ 60 đến 70°C), áp suất giảm cho đến khi thu được
cao lỏng chứa 25-30% hàm ẩm.

8


- Chiết cao lỏng thu được bằng dung môi hữu cơ là xăng trắng hoặc n- hexan để loại các
chất không mong muốn như clorophyl, gôm, pectin, chất béo..., công đoạn này được lặp
lại ba lần, thu được dịch chiết nằm ở pha dưới.
- Cô đặc dịch chiết thu được cho đến khi xuất hiện chất kết tủa; hỗn hợp được làm lạnh
xuống nhiệt độ nằm trong khoảng từ 2 đến 8°C trong thời gian 24 giờ, sau đó lọc để thu
được chất kết tủa dạng bột nhão; rửa sạch chất kết tủa này bằng aceton theo tỷ lệ 1:2 (23 lần) để thu được kết tủa màu vàng sáng; sấy khô cho đến khi bay hết hơi dung môi để
thu được phần chiết thành phẩm dưới dạng bột.
1.6.

Tổng quan về cao thuốc từ dược liệu
Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định

các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp
[2].
Cao thuốc được chia làm 3 loại:
Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong
đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai). Nếu không
có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế
cao thuốc [2].

Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không
quá 20 % [2].
Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không được
có độ ẩm lớn hơn 5 % [2].
Yêu cầu chất lượng
Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung
sau đây:
Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao
[2].

9


Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô
tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng. Ngoài ra, cao
lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ [2].
Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác):
Cao đặc không quá 20% [2].
Cao khô không quá 5% [2].
Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho
cao lỏng và cao đặc) [2].
Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu không có chỉ dẫn khác [2].
Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn
hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Dược
điển Việt Nam V (Phụ lục 10.14 - Xác định dung môi tồn dư) [2].
Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Dược điển
Việt Nam V (Phụ lục 12.17- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật) [2].
Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Dược điển Việt Nam V
(Phụ lục 13.6-Thử giới hạn nhiễm khuẩn) [2].
Bảo quản

Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ
ít thay đổi.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng, nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu
Hạt đậu xanh giống ĐX208 được cung
cấp bởi một số đơn vị cung cấp giống cây
trồng thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn (Bộ NN & PTNT). Hạt đậu xanh
được đem về trồng tại Viện nghiên cứu Ngô Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam từ
ngày 10/3/2016 đến ngày 5/5/2016. Mẫu
nghiên cứu trong thời kỳ ra hoa đã được ép
tiêu bản và lưu giữ tại Bảo tàng Thực vật -

Hình 2.1. Ảnh chụp mẫu dược
liệu vỏ hạt đậu xanh nghiên cứu

Khoa Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội với
số hiệu tiêu bản là NDD002. Mẫu đã được PGS.TS. Trần Văn Ơn giám định tên khoa
học là Vigna radiata (L.) R. Wilczek, họ Đậu (Fabaceae).
Hạt đậu xanh được tách lấy vỏ, bảo quản trong túi nilon để nghiên cứu.
Định lượng hàm lượng isovitexin và vitexin trong vỏ hạt đậu xanh của các mẫu
nghiên cứu bằng HPLC [5], kết quả hàm lượng isovitexin là 5,85 mg/g và hàm lượng

vitexin là 6,81 mg/g.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Cân phân tích

Mettler- Toledo XS204

Thụy Sĩ

Độ chính xác 0,1mg
- Cân kỹ thuật

Satorious

Đức

- Tủ sấy

Memert

Đức

- Bể siêu âm

Elma Easy 180H

Đức

- Máy quang phổ UV- VIS

Lambda 12

Mỹ

- Hệ thống SKLM Limonat 5

CAMAG

Thụy sĩ

11


- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Shimadzu 10 Avp với detector

Nhật

UV, cột sắc ký Phenomenex
C18, 150 x 4,6 mm, 5 µm và
bảo vệ cột cùng loại.
2.1.3. Hóa chất
-

Chất chuẩn: Isovitexin hàm lượng 90,94%; Số lô: 01120590 (Sigma), Đức; Vitexin
hàm lượng 95,0%; Số lô: V757000 (TRC).

-

Dung môi, hóa chất: Acetonitril HPLC (Fischer chemical); methanol HPLC (Fischer

chemical); acid orthophosphoric PA (Merck); aceton PA (Merck); acid acetic; acid
formic; ethyl acetat; ethanol, nước cất.

-

Bản mỏng silicagel GF254 (Merck).

-

Các thuốc thử vô cơ: Thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử
Bouchardat, amoniac đặc, dung dịch HCl 10%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch
FeCl3 5%, dung dịch Pb(CH3COO)2 10%, Na2CO3, thuốc thử Fehling, H2SO4 đặc.

2.2.

Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isovitexin và vitexin

-

trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu

-

flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất.
Nội dung 3: Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh.

2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Quy trình chiết xuất dự kiến
Dự kiến các bước thực hiện chính của quy trình chiết xuất và điều chế cao đặc từ vỏ
hạt đậu xanh như sau:
Hạt đậu xanh được tách lấy vỏ, đem sấy khô, xay thành bột, rây qua rây có kích
thước mắt rây 1000 lấy phần bột lọt qua rây để chiết xuất.
Cân chính xác 15g bột vỏ hạt đậu xanh cho vào bình cầu, thấm ẩm dược liệu bằng
dung môi chiết xuất trong 15 phút. Thêm dung môi và tiến hành chiết xuất lần 1, lọc thu
lấy dịch chiết. Tiến hành chiết như trên vài lần. Gộp dịch lọc qua các lần chiết xuất thu
được dịch chiết ethanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết cô
đặc. Phân tán đều dịch chiết cô đặc trong nước nóng, siêu âm 15 phút, lọc nóng thu được
12


dịch chiết nước. Dịch chiết nước được đem cô cách thủy cho đến khi thu được sản phẩm
cao đặc (mất khối lượng do làm khô dưới 20%).
2.3.2. Phương pháp định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu
xanh
Hàm lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh được xác định
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2.3.2.1.

Điều kiện sắc ký

Xác định các điều kiện cho phân tích HPLC như: Cột sắc ký, pha động, bước sóng
phát hiện, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu.
2.3.2.2.

Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, thẩm định phương pháp định lượng với các
nội dung sau:
 Độ đặc hiệu.
 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn.
 Sự phù hợp của hệ thống.
 Độ lặp lại.
 Độ đúng.
 Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ
Hiện nay chưa có tài liệu chính thức nào đưa ra các yêu cầu về các giới hạn thông
số để đánh giá kỹ thuật định lượng, nên khóa luận chỉ xác định các thông số trên và đưa
ra cùng với giới hạn chấp nhận khi thẩm định kết quả định lượng theo hướng dẫn của
AOAC [27].
* Sự phù hợp của hệ thống
Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định
bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã xử lý xong.
Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn
hỗn hợp có nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu
13


và diện tích pic của các lần sắc ký. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch
chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một
mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2% theo hướng dẫn của AOAC [27].
Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc. Tính chọn lọc là
khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác
(tạp chất hoặc các chất cản trở khác).
Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc kí đồ thu được từ mẫu trắng và các
mẫu thử, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn các pic tạp.

Tiến hành: Tiêm lần lượt mẫu trắng và dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ
thống sắc ký, so sánh sắc ký đồ thu được.
Yêu cầu: Tại thời gian lưu các chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu
trắng, mẫu nền [27].
* Độ đặc hiệu
Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử và
mẫu thử thêm chuẩn vào hệ thống, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. So sánh các
pic trên các sắc ký đồ thu được.
Yêu cầu:
 Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, không được xuất hiện tín hiện pic của chất phân
tích [27].
 Trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn, xuất hiện tín hiệu của chất
phân tích tại thời gian lưu trùng với sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu chuẩn hỗn
hợp [27].
* Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại
lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị
bằng phương trình hồi quy Y = ax+b với hệ số tương quan R.

14


Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định
lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) và cần thực
hiện tối thiểu với 6 nồng độ khác nhau.
Tiến hành sắc ký các dãy dung dịch chuẩn, ghi lại các sắc ký đồ và xác định diện
tích pic. Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ chất
chuẩn có trong mẫu và diện tích pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình
phương tối thiểu.
Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu:

0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [27].
* Độ lặp lại
Độ lặp của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả
riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu,
được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần
lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu) đến công đoạn
cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại
nhiều lần rồi lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương
đối RSD của các kết quả phân tích (hàm lượng hoạt chất).
Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo hướng dẫn của AOAC
là RSD ≤ 2,7% nếu hàm lượng trong khoảng 1 – 10 % và RSD ≤ 3,7% nếu hàm lượng
trong khoảng 0,1 – 1 % [27].
* Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị
thực.
Tiến hành:
 Xác định độ đúng của phương pháp bằng phương pháp xác định độ thu hồi,
thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu thử.
 Chất chuẩn thêm vào ở ba mức nồng độ là 50%; 100% và 150% so với hàm
lượng có sẵn trong mẫu thử.

15


Công thức tính tỉ lệ thu hồi:
Lượng chất tìm thấy – Lượng chất có sẵn
x 100%

Tỉ lệ thu hồi (%) =

Lượng chất thêm vào

Yêu cầu: Theo tiêu chuẩn của AOAC, tỷ lệ thu hồi trong khoảng 97 - 103% nếu
hàm lượng thu hồi trong khoảng 1 - 10%; là 95 - 105% nếu hàm lượng trong khoảng 0,1
- 1% [27].
* Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện về mặt định
tính.
LOQ là lượng chất thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện
được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp.
LOD, LOQ có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch
chuẩn của tín hiệu đo (diện tích pic).
Công thức tính giá trị LOD [27]:

LOD = 3,3×SD/a

Công thức tính giá trị LOQ [27]:

LOQ= 10×SD/a

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của diện tích pic.
a: Độ dốc của đường chuẩn.
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc
giàu flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh
Các yếu tố khảo sát: dung môi chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, số lần chiết xuất, thời
gian chiết xuất.
Thông số đánh giá:
+ Hàm lượng isovitexin và vitexin trong sản phẩm: Hàm lượng isovitexin và
vitexin trong cao được định lượng bằng HPLC.

+ Tỷ lệ cao thu được (H%) của quy trình tính theo công thức:
mc × (100 – Ac)
H% =

x 100
mdl × (100 – Adl )
16


Trong đó:
mc: khối lượng cao thu được
mdl: khối lượng dược liệu ban đầu
Ac: hàm ẩm của cao
Adl: hàm ẩm của dược liệu.
Từ kết quả khảo sát lựa chọn các điều kiện thích hợp để chiết xuất cao đặc giàu
flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh.
2.3.4. Phương pháp khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu
xanh
Các chỉ tiêu khảo sát: Mô tả, độ đồng nhất, pH, định tính, mất khối lượng do làm
khô, định lượng.
2.3.4.1.

Mô tả

Quan sát cao ở ánh sáng thường. Mô tả thể chất, màu sắc, mùi vị của cao.
2.3.4.2.

Độ đồng nhất

Cho cao lên lam kính, đặt lamen lên áp sát, quan sát bằng kính hiển vi để kiểm tra

độ đồng nhất.
2.3.4.3.

pH

Xác định pH theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 6.2) [2].
2.3.4.4.

Định tính

Định tính các nhóm hợp chất trong các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng các
phản ứng hóa học thường quy theo phương pháp ở tài liệu [24] và [28].
Định tính các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng theo phương
pháp ghi trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 5.4) [2], sử dụng chất chuẩn đối chiếu là
isovitexin và vitexin.
2.3.4.5.

Mất khối lượng do làm khô

Xác định mất khối lượng do làm khô của các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo
phương pháp quy định trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6) [2].

17


2.3.4.6.

Định lượng

Hàm lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh được định lượng

bằng HPLC.
Phương pháp xử lý số liệu

2.3.5.

Sử dụng các phương pháp thống kê trong phân tích với sự hỗ trợ tính toán của
phần mềm Microsoft Excel.
 Tính giá trị trung bình

Ghi chú:

X trị trung bình.
X: Giá
Xi: Giá trị thứ i.
n: số giá trị.

 Tính độ lệch chuẩn

Ghi chú:

S: Độ lệch chuẩn.
X: Giá trị trung bình.

X

Xi: Giá trị thứ i.
n: số giá trị.
 Tính độ lệch chuẩn tương đối

Ghi chú:

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối.
S: Độ lệch chuẩn.

X

X: Giá trị trung bình.

X

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất: thể hiện mối tương quan giữa diện tích
pic sắc ký và nồng độ chất phân tích y = ax + b, sử dụng phần mềm Microsoft Excel để
xử lý và vẽ đồ thị.

X
18