NGHIÊN cứu xây DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN và ĐỊNH LƯỢNG một số KHÁNG SINH TRONG mỹ PHẨM LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

(chữ in hoa thẳng, không in đậm cỡ 16)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

(cỡ 4,0 cm x 4,0 cm)

ĐỚI HẢI LINH
(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT
HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH
TRONG MỸ PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

HÀ NỘI 2019
(chữ in hoa thẳng, in đậm


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

(chữ in hoa thẳng, không in đậm cỡ 16)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

ĐỚI HẢI LINH
(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN
VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG
MỸ PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
(chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

CHUYÊN NGÀNH:KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hường Hoa
GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
(chữ in thường thẳng, in thường và đậm cỡ 16)

HÀ NỘI 2019
(chữ in hoa thẳng, cỡ 16)


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Lê Thị Hường Hoa
và GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu - những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình
và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
Khoa kiểm nghiệm Mỹ phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành việc học và
làm đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích
đã cho tôi một môi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi bồi đắp kiến thức và hoàn thiện
bản thân.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn yêu thương, động
viên để tôi có thể hoàn thành cuốn luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2019
Học viên

Đới Hải Linh


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Danh mu ̣c các kí hiêu,
̣ các từ viế t tắ t
Danh mu ̣c các bảng
Danh mu ̣c các hin
̀ h
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 ..................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU........................................... 3
1.1.1. Clindamycin........................................................................................................... 3
1.1.1.1. Tên khoa học, công thức cấu tạo và một số đặc điểm ........................................ 3
1.1.1.2. Dược lí và cơ chế tác dụng ................................................................................. 4
1.1.1.3. Chỉ định .............................................................................................................. 4
1.1.1.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................... 5
1.1.1.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin ...................................... 5
1.1.2. Lincomycin hydroclorid ........................................................................................ 6

1.1.2.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo .................................................................... 6
1.1.2.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................................ 6
1.1.2.3. Chỉ định .............................................................................................................. 7
1.1.2.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................... 7
1.1.2.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin ....................................... 7
1.1.3. Tetracyclin hydroclorid ......................................................................................... 8
1.1.3.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo .................................................................... 8
1.1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................................ 8
1.1.3.3. Chỉ định .............................................................................................................. 9
1.1.3.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................. 10
1.1.3.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin....................................... 10
1.2. PHƯƠNG PHÁP HPLC ......................................................................................... 11
1.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 11
1.2.2. Cấu tạo ................................................................................................................. 11


1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu.......................................................................... 11
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí ........................................................ 12
1.2.5. Ứng dụng ............................................................................................................. 13
1.2.6. Kĩ thuật HPLC với detector DAD ....................................................................... 15
CHƯƠNG 2 ................................................................................................................... 16
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 16
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 16
2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .................................................................................... 16
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 16
2.2.2. Dung môi và hóa chất .......................................................................................... 17
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 18
2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ............................................... 21
CHƯƠNG 3 ................................................................................................................... 22

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................................................. 22
3.1. Khảo sát điều kiện xây dựng quy trình ................................................................... 22
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc kí ..................................................................................... 22
3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu ............................................................................... 25
3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
LINCOMYCIN VÀ TETRACYCLIN .......................................................................... 26
3.2.1. Điều kiện sắc kí ................................................................................................... 26
3.2.2. Điều kiện xử lí mẫu ............................................................................................. 26
3.2.3. Thẩm định phương pháp 1 ................................................................................... 27
3.3. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC
DẠNG MUỐI CỦA CLINDAMYCIN ......................................................................... 41
3.3.1. Điều kiện sắc kí ................................................................................................... 41
3.3.2. Điều kiện xử lí mẫu ............................................................................................. 41
3.3.3. Thẩm định phương pháp 2 ................................................................................... 42
3.4. ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................................... 54
CHƯƠNG 4 ................................................................................................................... 59
BÀN LUẬN ................................................................................................................... 59


4.1. VỀ CÁC KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU .............................................................. 59
4.2. VỀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................. 59
4.2.1. Về phương pháp xử lí mẫu .................................................................................. 59
4.2.2. Về xây dựng các phương pháp phân tích và thẩm định ...................................... 60
4.3. VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM ............................................................... 61
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 62
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 62
Tài liêụ tham khảo
Phu ̣ lu ̣c 1: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Lincomycin
hydroclorid, Tetracyclin hydroclorid.
Phu ̣ lu ̣c 2: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Clindamycin

hydroclorid, Clindamycin phosphat.


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên tiếng Việt (tiếng Anh)

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official
Analytical Chemists)

Linco HCl

Lincomycin hydroclorid

Clinda HCl

Clindamycin hydroclorid

Clinda PO4

Clindamycin phosphat

DMPM

Dung môi pha mẫu

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

Mẫu M1

Kem tẩy trang chiết xuất từ Trà xanh

Mẫu M1’

Mẫu M1 thêm chuẩn

Mẫu M2

Sữa rửa mặt sạch sâu Eveline Skincare 360º

Mẫu M2’

Mẫu M2 thêm chuẩn

MeOH

Methanol

ppm

Phần triệu (parts per million)

r

Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SKĐ

Sắc kí đồ

Tetra HCl

Tetracyclin hydroclorid

UV-VIS

Tử ngoại- khả kiến (Ultraviolet-visible)

log P

Hệ số phân tán octanol/nước


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin ............. 4
Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích.................. 16
Bảng 2.2. Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC ............................... 20
Bảng 3.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của Linco HCl và Tetra HCl ................... 27
Bảng 3.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Linco HCl và Tetra HCl ................ 32
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Linco HCl và Tetra HCl. .............. 33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl
trên nền kem. ................................................................................................................. 35
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl
trên nền sữa rửa mặt. ..................................................................................................... 35
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl
và Tetra HCl trên nền kem ............................................................................................ 37
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl
và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt ................................................................................ 37
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl
trên nền kem .................................................................................................................. 39
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl
trên nền sữa rửa mặt ...................................................................................................... 40
Bảng 3.10. LOD và LOQ của Linco HCl và Tetra HCl ................................................ 41
Bảng 3.11. Độ thích hợp hệ thống sắc kí của Clinda HCl và Clinda PO4 ..................... 43
Bảng 3.12. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Clinda HCl và Clinda PO4 .......... 46
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Clinda HCl và Clinda PO4. ........ 46
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda
PO4 trên nền kem .......................................................................................................... 48
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda

PO4 trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................. 49
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl
và Clinda PO4 trên nền kem .......................................................................................... 50
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl
và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt .............................................................................. 51


Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4
trên nền kem .................................................................................................................. 53
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4
trên nền sữa rửa mặt ...................................................................................................... 53
Bảng 3.20. LOD và LOQ của Clinda HCl và Clinda PO4 ............................................ 54
Bảng 3.21. Kết quả phân tích các kháng sinh của các mẫu mỹ phẩm trên thị trường .. 56


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Clinda HCl .................................................................. 3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Clinda PO4.................................................................. 3
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Linco HCl ................................................................... 6
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Tetra HCl .................................................................... 8
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC ................................................................... 11
Hình 1.6. Cấu tạo detector mảng diod (DAD)............................................................... 15
Hình 3.1. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 4 kháng sinh nghiên cứu sử dụng pha động
MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 40 : 60 (a), tỉ lệ 35 : 65 (b) và tỉ lệ 30 : 70 (c) ............... 22
Hình 3.2. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 2 kháng sinh Linco HCl và Tetra HCl sử dụng
pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 27 : 73 ............................................................. 23
Hình 3.3. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 2 kháng sinh Clinda HCl và Clinda PO4 sử dụng
pha động ACN - đệm pH 2,5 với tỉ lệ 23 : 77 ............................................................... 23
Hình 3.4. Phổ hấp thụ UV-VIS của Linco HCl (a), Clinda HCl (b), Clinda PO4 (c) và
Tetra HCl (d) ................................................................................................................. 24

Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là Methanol ............. 25
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là hỗn hợp MeOH : đệm
amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70)....................................................................... 25
Hình 3.7. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so
với mẫu chuẩn................................................................................................................ 29
Hình 3.8. So sánh phổ UV – VIS của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu
chuẩn. ............................................................................................................................. 30
Hình 3.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với
mẫu chuẩn ...................................................................................................................... 31
Hình 3.10. So sánh phổ UV - VIS của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu
chuẩn. ............................................................................................................................. 31
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Linco
HCl................................................................................................................................. 33
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Tetra
HCl................................................................................................................................. 34
Hình 3.13. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Clinda HCl và Clinda PO4 trên 2 nền mẫu
nghiên cứu so với mẫu chuẩn ........................................................................................ 44


Hình 3.14. So sánh phổ UV – VIS của Clinda HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu
chuẩn. ............................................................................................................................. 45
Hình 3.15. So sánh phổ UV - VIS của Clinda PO4 trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu
chuẩn ............................................................................................................................. 45
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda
HCl................................................................................................................................. 47
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda
PO4.... ............................................................................................................................ 47
Hình 3.18. Khảo sát thời gian lưu của Linco HCl và Tetra HCl trong điều kiện sắc ký của
phương pháp 2..... .......................................................................................................... 55
Hình 3.19. So sánh phổ UV – VIS của píc Clinda HCl trên mẫu “Kem mụn Elza” ..... 57

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, nhu
cầu chăm sóc cho bản thân càng trở nên thiết yếu, do đó mỹ phẩm trở thành sản
phẩm tiêu dùng quen thuộc. “Sản phẩm mỹ phẩm” theo định nghĩa của ASEAN là
“bất kỳ một chất hoặc một chế phẩm được dùng tiếp xúc với những bộ phận bên
ngoài cơ thể con người (biểu bì, hệ thống lông tóc, móng tay/chân, môi và các bộ
phận sinh dục ngoài) hoặc tiếp xúc với răng và niêm mạc miệng, với mục đích duy
nhất hay chủ yêu là làm sạch, làm thơm, thay đổi diện mạo và/ hoặc cải thiện mùi
cơ thể và/hoặc bảo vệ hay duy trì chúng trong điều kiện tốt” [1], [5], [14], [22]. Do
đó chất lượng mỹ phẩm là một vấn đề phải được quan tâm bởi vì mỹ phẩm được sử
dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài của cơ thể, không qui định về
thời gian và liều lượng sử dụng, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe và vẻ đẹp của cơ
thể.
Theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm mà Việt
Nam đã tham gia kí kết từ năm 2003, trong bản bổ sung mới nhất vào năm 2018 có
qui định danh sách 1383 chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản
phẩm mỹ phẩm (phụ lục II, phần 1) cũng như 323 chất và nhóm chất được phép sử
dụng nhưng phải tuân theo các giới hạn và điều kiện qui định (phụ lục III, phần 1)
[1], [13]. Kháng sinh thuộc danh sách chất và nhóm chất không được phép có mặt
trong các sản phẩm mỹ phẩm [1], [13]. Tuy kháng sinh nằm trong danh mục chất bị
cấm có mặt trong mỹ phẩm nhưng các sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường vẫn có
thể bị trộn trái phép vào để đạt được lợi ích điều trị các bệnh về da và thu lợi về
kinh tế.
Các sản phẩm mỹ phẩm trị mụn, tàn nhang, chống nhăn, làm trắng da, làm se
lỗ chân lông có hiệu quả tốt trong thời gian ngắn thường dễ bị thêm kháng sinh và
các steroids vào mà nhà sản xuất lại không công bố trong thành phần mỹ phẩm, do
đó ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và dễ gây ra tình trạng kháng

kháng sinh vì không có qui định về liều lượng và thời gian sử dụng [10], [18], [20],
-1-


[21]. Kháng sinh clindamycin, lincomycin và tetracyclin là những kháng sinh hay
được trộn vào các sản phẩm mỹ phẩm như kem, sữa rửa mặt…với mục đích trị
mụn trứng cá [4], [21], [24].
Ở Việt nam hiện nay chưa có qui trình phân tích kháng sinh trong mỹ phẩm
mà mới chỉ có một số nghiên cứu phân tích các chất cấm thuộc nhóm chất màu,
chất bảo quản, corticoid… [3], [11], [14]. Nếu ở nước ngoài đã có các nghiên cứu
tương tự thì khi triển khai trên thực tế ở Việt nam cũng cần phải được đánh giá lại
bằng thực nghiệm về việc áp dụng trên các mẫu mỹ phẩm đang có mặt tại Việt nam
cũng như điều kiện thực tế trang thiết bị của nước ta.
Trên cơ sở đó, nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện và định
lượng một số kháng sinh trong mỹ phẩm với các mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình phân tích các kháng sinh Lincomycin
hydroclorid, Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat và Tetracyclin
hydroclorid trong nền mẫu kem và sữa rửa mặt trị mụn bằng phương pháp sắc kí
lỏng hiệu năng cao.
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được với một số mẫu mỹ phẩm trên thị
trường để kiểm tra khả năng áp dụng của phương pháp và sơ bộ đánh giá sự có
mặt các chất này trong mỹ phẩm.

-2-


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU

1.1.1. Clindamycin
1.1.1.1. Tên khoa học, công thức cấu tạo và một số đặc điểm
❖ Clindamycin hydroclorid:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Clinda HCl
Tên khoa học:
(2S,4R)-N-[(1S,2S)-2-chloro-1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-methylsulfanyloxan
-2-yl]propyl]-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-carboxamide;hydrochloride

❖ Clindamycin phosphat:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Clinda PO4
Tên khoa học:
[(2R,3R,4S,5R,6R)-6-[(1S,2S)-2-chloro-1-[[(2S,4R)-1-methyl-4-propylpyrrolidine2-carbonyl]

amino]propyl]-4,5-dihydroxy-2-methylsulfanyloxan-3-yl]

phosphate

-3-

dihydrogen


Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin
Tên

Clinda HCl

Clinda PO4

C18H34Cl2N2O5S

C18H34ClN2O8PS

Khối lượng mol

461,439

504,96

Thể chất

Tinh thể

Tinh thể

Nhiệt độ nóng chảy (°C)

141-143

114

Độ tan trong nước ở 25°C

30,61 mg/l

∞

log P

2,16

1,25

pKa

7,79

0,96; 6,06

Công thức phân tử

Các muối hydroclorid và phosphat đều tan tốt trong nước, methanol, khó tan
trong ethanol; hầu như không tan trong aceton, chloroform, ether [8].
1.1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
- Cơ chế tác dụng:
Clindamycin ức chế tổng hợp protein ở vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn
với tiểu đơn vị 50S ribosom, tác dụng chính là ức chế sự tạo thành các liên kết
peptid. [4], [6].
- Phổ tác dụng:
Nhạy cảm: Vi khuẩn Gram dương ưa khí: Streptococci, Staphylococci,
Bacillus anthracis và Corynebacterium diphteriae. Vi khuẩn Gram dương kỵ khí:
Eubacterium, Propionibacterium, Peptococcus và Peptostreptococcus spp., nhiều
chủng Clostridium perfringens và C. tetani. Một số chủng Actinomyces spp. và
Nocardia asteroids. [4], [6].
1.1.1.3. Chỉ định
Clindamycin được dùng điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn kỵ
khí, đặc biệt do Bacteroides fragilis. Clindamycin cũng được dùng điều trị các
bệnh do nhiễm vi khuẩn Gram dương như Streptococci, Staphylococci (gồm cả

chủng đã kháng meticilin) và Pneumococci. Tuy nhiên, do nguy cơ cao gây viêm
-4-


đại tràng giả mạc, clindamycin không phải là thuốc lựa chọn đầu tiên; chỉ nên cho
dùng khi không có thuốc thay thế phù hợp.
Clindamycin được dùng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm
trong những trường hợp sau: Tai mũi họng do S.pneumoniae kháng penicilin, viêm
phế quản phổi, răng hàm mặt, da, trứng cá, sinh dục, xương khớp, nhiễm khuẩn
huyết (trừ viêm màng não). Nhiễm khuẩn trong ổ bụng như viêm phúc mạc và áp
xe trong ổ bụng.
Dùng tại chỗ chữa trứng cá và trứng cá đỏ [4], [6].
1.1.1.4. Độc tính và tác dụng phụ
Dùng clindamycin có thể làm các vi khuẩn không nhạy cảm với thuốc phát
triển quá mức.
Clindamycin có nguy cơ cao gây viêm đại tràng giả mạc do độc tố của
Clostridium difficile tăng quá mức. Điều này xảy ra khi những vi khuẩn thường có
ở đường ruột bị clindamycin phá hủy (đặc biệt ở người cao tuổi và những người có
chức năng thận giảm). Ở một số người bệnh viêm đại tràng giả mạc có thể phát
triển rất nặng và dẫn đến tử vong.
Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4],
[6].

-5-


1.1.1.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin
Xác định clindamycin trong “kem cuolingshuang” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao, cột C18, pha động: ammonium dihydrogen phosphat pH 3,0 –
methanol (1:1), nhiệt độ: 30°C, bước sóng: 214nm [19].

Xác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin,
clindamycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3propanediol, sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ
phẩm trị mụn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x
250mm, 5µm), pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l,
nhiệt độ: 40°C, bước sóng: 210nm và 277nm [16].
1.1.2. Lincomycin hydroclorid
1.1.2.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo

R = CH3
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Linco HCl
Công thức phân tử: C18H35ClN2O6S
Khối lượng mol: 442,996
Tên khoa học:
(2S,4R)-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6methylsulfanyloxan-2-yl]propyl]-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-carboxamide;
chloride;hydrate

-6-


Lincomycin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 156-158°C. Độ tan
trong nước ở 25°C: 50 mg/l, log P = 0,56 và pKa = 7,6.
1.1.2.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
- Cơ chế tác dụng
Lincomycin, cũng như các lincosamid khác gắn vào tiểu thể 50S của ribosom
vi khuẩn giống các macrolid như erythromycin và cản trở giai đoạn đầu của tổng
hợp protein. Tác dụng chủ yếu của lincomycin là kìm khuẩn, tuy vậy ở nồng độ cao
có thể diệt khuẩn từ từ đối với các chủng nhạy cảm. [4], [6].
- Phổ tác dụng
Thuốc có tác dụng đối với nhiều vi khuẩn ưa khí Gram dương, bao gồm các
Staphylococcus,

Streptococcus,

Pneumococcus,

Bacillus

anthracis,

Corynebacterium diphtheriae. Tuy nhiên, không có tác dụng với Enterococcus.
Phần lớn các vi khuẩn ưa khí Gram âm, như Enterobacteriaceae kháng lincomycin;
khác với erythromycin, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis và Haemophilus
influenzae thường kháng lincomycin. [4], [6].
Lincomycin có phổ tác dụng rộng đối với các vi khuẩn kỵ khí. Các vi khuẩn
kỵ khí Gram dương nhạy cảm bao gồm Eubacterium, Propionibacterium,
Peptococcus, Peptostreptococcus và nhiều chủng Clostridium perfringens và
Clostridium tetani. Với liều cao, lincomycin có tác dụng đối với các vi khuẩn kỵ
khí Gram âm, trong đó có Bacteroides spp.
Thuốc cũng có một vài tác dụng đối với sinh vật đơn bào, nên đã được dùng
thử trong điều trị bệnh viêm phổi do Pneumocystis carinii và bệnh nhiễm
Toxoplasma.
1.1.2.3. Chỉ định
Nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt Staphylococcus,
Streptococcus, Pneumococcus ở người bệnh có dị ứng với penicilin như áp xe gan;
nhiễm khuẩn xương do Staphylococcus; nhiễm khuẩn phụ khoa như nhiễm khuẩn ở
âm đạo, viêm màng trong tử cung, viêm vùng chậu; viêm màng bụng thứ phát; áp
-7-


xe phổi; nhiễm khuẩn huyết; mụn nhọt biến chứng và loét do nhiễm khuẩn kỵ

khí…[4], [6].
1.1.2.4. Độc tính và tác dụng phụ
Phải thận trọng khi dùng cho người có bệnh đường tiêu hóa, đặc biệt người có
tiền sử viêm đại tràng. Người bệnh cao tuổi và nữ có thể dễ bị tiêu chảy nặng hoặc
viêm đại tràng có màng giả.
Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4],
[6].
1.1.2.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin
SINXác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin,
clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3-propanediol,
sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ phẩm trị mụn
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x 250mm, 5µm),
pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l, nhiệt độ: 40°C,
bước sóng: 210nm và 277nm [16].
1.1.3. Tetracyclin hydroclorid
1.1.3.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Tetra HCl
Công thức phân tử: C22H25ClN2O8
Khối lượng mol: 480,898
Tên khoa học:
(4S,4aS,5aS,6S,12aR)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride
-8-


Tetracyclin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 170-173°C. Độ tan
trong nước ở 25°C: 231 mg/l, log P = -1,37 và pKa = 3,3.
1.1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
- Cơ chế tác dụng
Tetracyclin là một kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do ức chế quá

trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Cơ chế tác dụng của tetracyclin là do khả năng
gắn vào và ức chế chức năng ribosom của vi khuẩn. Khi vào trong tế bào vi khuẩn,
tetracyclin gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom, ngăn cản sự gắn kết aminoacyl tRNA làm ức chế quá trình tổng hợp protein. Khi vi khuẩn kháng tetracyclin, vị trí
gắn tetracyclin trên ribosom bị thay đổi. Do vậy, tetracyclin không gắn được vào
ribosom của vi khuẩn và mất tác dụng. [4], [6].
- Phổ tác dụng
Tetracyclin cơ bản có tác dụng trên nhiều vi khuẩn gây bệnh cả Gram âm và
Gram dương, cả hiếu khí và kỵ khí; thuốc cũng có tác dụng trên Chlamydia,
Mycoplasma, Rickettsia, Spirochaete. Các loại nấm, nấm men, virus không nhạy
cảm với tetracyclin.
Gần đây, sử dụng tetracyclin trong điều trị phụ trợ cho các trường hợp trứng
cá viêm (trứng cá bọc, trứng cá đỏ) có hiệu quả khả quan. Quá trình điều trị cần
được thầy thuốc theo dõi chuyển biến lâm sàng và điều chỉnh kịp thời. Thời gian
điều trị thường phải bắt đầu một vài tuần, sau đó điều chỉnh hoặc duy trì cho đến
khi các tình trạng bệnh được cải thiện rõ ràng. [4], [6].
1.1.3.3. Chỉ định
Do mức độ kháng thuốc của vi khuẩn nghiêm trọng và hiện nay có nhiều loại
thuốc kháng khuẩn khác nên hạn chế việc sử dụng tetracyclin trong điều trị. Tuy
nhiên, thuốc vẫn còn được chỉ định trong một số nhiễm khuẩn khi xác định vi
khuẩn còn nhạy cảm như: nhiễm khuẩn do Chlamydia, trứng cá bọc, trứng cá đỏ,
bệnh giang mai, bệnh dịch hạch, bệnh than…

-9-


Phối hợp trong một số phác đồ điều trị H. pylori trong bệnh loét dạ dày tá
tràng. Phối hợp với thuốc chống sốt rét như quinin để điều trị sốt rét do
Plasmodium falciparum kháng thuốc.
Sợi tetracyclin được dùng trong điều trị phụ trợ bệnh nha chu để giảm chảy
máu và làm sâu thêm các hốc quanh chân răng khi lấy cao răng và làm sạch chân

răng.
Chỉ nên dùng tetracyclin khi đã chứng minh được vi khuẩn gây bệnh còn
nhạy cảm [4], [6].
1.1.3.4. Độc tính và tác dụng phụ
Không dùng tetracyclin cho phụ nữ mang thai và trẻ em dưới 8 tuổi, do việc
sử dụng các thuốc nhóm tetracyclin trong quá trình phát triển của răng (nửa cuối
thai kỳ và trẻ dưới 8 tuổi) có thể gây biến màu răng vĩnh viễn (vàng, xám, nâu) và
thuốc có thể gắn vào và ảnh hưởng tới sự phát triển của xương.
Một vài trường hợp dùng tetracyclin thấy có phản ứng nhạy cảm với ánh sáng
biểu hiện bằng bỏng nắng khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. Những người bệnh
dùng tetracyclin nếu phải tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời hay tia tử ngoại
cần được cảnh báo về nguy cơ này và cần ngừng thuốc ngay khi có những triệu
chứng đầu tiên của ban đỏ.
Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, bội nhiễm nấm ở miệng,
thực quản; mày đay, ban đỏ, viêm gan, tổn thương ống thận, sai lệch công thức
máu do các sản phẩm chuyển hóa của thuốc gây ra…[4], [6].
1.1.3.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin
Xác định đồng thời 7 kháng sinh nhóm tetracyclin bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao, pha đảo, cột Diamonsil C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), pha động:
methanol - acetonitril - acid oxalic 0,01 mol/l (pH 2,0) (11:22:67), bước sóng
267nm [23].
Xác định đồng thời 6 kháng sinh tetracyclin (minocycline hydroclorid,
oxytetracyclin, tetracyclin hydroclorid, clotetracyclin hydroclorid, doxycyclin
- 10 -


hydroclorid, chloramphenicol) trong sản phẩm mỹ phẩm trị mụn bằng phương pháp
HPLC cột C18 (4,6mm x150mm, 5µm), pha động: acetonitril - methanol - acid
trifluoroacetic 10mmol/l, tốc độ: 1,0ml/phút, nhiệt độ cột: 30°C, bước sóng 268nm
[15], [17].

1.2. PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.2.1. Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tách trong đó các chất
phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di duyển khác nhau liên
quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương
đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột
vì vậy phụ thuốc và các yếu tố đó.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2], [3], [7], [9].
1.2.2. Cấu tạo
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Hệ thống cấp pha
động, bơm sắc kí lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột và pha tĩnh, detector, hệ thu nhận và
xử lý dữ liệu.
Hệ thống cấp
. dung môi

Bộ phận
tiêm mẫu

Bơm

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu
Detector

Cột sắc ký

Thải

Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.

- 11 -


1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ
thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).
- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát
huỳnh quang.
- Detector điện hóa: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation,
anion, các hợp chất có tính dẫn điện…
- Detector chỉ số khúc xạ: sử dụng với hầu hết chất phân tích nhưng độ nhạy
kém hơn detector hấp thụ UV.
- Detector tán xạ bay hơi: thường được dùng để phân tích các chất kém bay
hơi hơn so với pha động của sắc kí lỏng.
Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính.
Để phân tích các kháng sinh có các phương pháp phổ biến như: phương
pháp sắc kí lỏng (sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV-VIS; sắc kí lỏng
khối phổ LC-MS/MS; sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ UPLCMS/MS.
Phương pháp HPLC là một phương pháp đơn giản, với độ lặp lại tốt là một
kỹ thuật phù hợp để phân tích các kháng sinh. Tuy nhiên phương pháp sắc kí lỏng
hiệu năng cao với detector UV-VIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng lấp
các píc khi phân tích kháng sinh trong nền mẫu phức tạp. Những hạn chế này có
thể được khắc phục khi kết hợp sắc kí lỏng với đầu dò khối phổ. Tuy nhiên kỹ
thuật này giá thành cao hơn đáng kể và thiết bị vẫn chưa có ở nhiều phòng thí
nghiệm. Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực tế của phòng thí
nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC kết hợp với detector DAD để phân
tích kháng sinh. Đây là thiết bị khá phổ biến ở các phòng phân tích, kiểm nghiệm.

- 12 -


Detector DAD là công cụ hữu hiệu để giúp loại trù các trường hợp dương tính giả
do xuất hiện các pic trùng thời gian lưu với các chất cần phân tích.
1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí
1.2.4.1. Thời gian lưu
Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detector được gọi
là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chất
không lưu gọi là thời gian chết.
1.2.4.2. Độ phân giải
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột
sắc ký:
Rs =
trong đó:

RS : độ phân giải
(tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2
W1, W2 : lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic
RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn.

1.2.4.3. Tính đối xứng của píc sắc kí
- Hệ số bất đối:

b
AF = a

b: nửa chiều rộng phía sau píc.
a: nửa chiều rộng phía trước píc

a+b
- Hệ số kéo đuôi: As = 2a
1.2.4.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Cột sắc kí được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý
thuyết.
- 13 -