Thực tập vi Sinh thực phẩm

Bài 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRUỜNG NUÔI CẤY
Câu 1: Các nguyên tắc cơ bản của việc xử lí và bao gói dụng cụ
- Xử lí dụng cụ: Về nguyên tắc, các dụng cụ để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt
độ trung tính, sạch. Vì vậy, khâu xử lí dụng cụ bao gồm hai giai đoạn: trung
tính dụng cụ và rửa dụng cụ.
- Trung tính dụng cụ:
• Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH=7 để kiểm tra độ
trung tính
• Nếu pH>7 ngâm vào tring dung dịch HCl 2%, rửa lại
thật kỹ bằng nuớc sạch.
• Nếu pH<7 ngâm vào trong xà phòng, rửa lại thật kỹ
bằng nước sạch.
- Rửa dụng cụ:
• Nếu dụng cụ có dính dầu, hoặc vazoline phải dùng vải
chùi sạch, sau đó ngâm trong nước xà phòng, đun sôi 15
phút. Sau đó, rửa lại bằng nước sạch, để ráo rồi ngâm
vào trong cồn 90
o
, lấy ra lau khô.
• Nếu dụng cụ bị nhiễm khuẩn, phải tiệt trùng ở 121
o
C
trong 30 phút, sau đó ngâm trong nước ấm, rửa lại bằng
xà phòng và bằng nuớc sạch, cuối cùng sấy khô ở 37
o
C.
- Bao gói dụng cụ: Dụng cụ sử dụng trong kiểm tra vi sinh vật phải thật sạch
và khô. Nên việc bao gói dụng cụ phải được thực hiện, bao gói phải thật kín
và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp
giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
Câu 2: Cơ sở vi sinh vật của các phuơng pháp khử trùng

- Phương pháp khử trùng Pasteur: Đây là phương pháp khử trùng nhiệt ướt,
thường được tiến hành ở nhiệt độ 56 - 60
o
C trong 30 phút hay ở 70-90
o
C
trong thời gian 5-10 phút tùy theo loại sản phẩm. Phương pháp này chỉ tiêu
diệt được thể sinh dưỡng, còn thể sinh sản và bao tử vẫn có thể sống sót.
Phương pháp này dùng để thanh trùng các loại thực phẩm dễ bị hư hỏng hay
giảm phẩm chất bởi nhiệt độ cao như sữa, bia, nước rau quả, rượu vang.
- Phương pháp khử trùng Tyndal: Còn gọi là phuơng pháp hấp gián đoạn.
Được sử dụng đối với môi trường và vật liệu có thể bị phá hủy ở nhiệt độ
cao hơn 100
o
C, lần thứ nhất hấp ở 75
o
C, thể dinh dưỡng bị chết, còn lại các
bào tử. Để môi truờng ở nhiệt độ 30-37
o
C cho bào tử phát triển thành thể
dinh duỡng, 24 giờ hấp lại như lần đầu. Quá trình này đuợc tiến hành từ 3-7
lần, có thể tiêu diệt được hầu hết vi sinh vật và bào tử của vi sinh vật trong
môi trường.
- Phương pháp tủ sấy: là phương pháp khử trùng bằng nhiệt khô, có thể dùng
lò Pasteur hay các tủ sấy điện khử trùng ở nhiệt độ 160-170
o
C từ 30-120
phút. Phưong pháp này dùng để khử trùng các dụng cụ kim loại, thủy tinh
chịu nhiệt cao, bông băng...
Câu 3: Cách sử dụng nồi hấp áp suất cao

Nồi hấp áp suất cao thường dùng để khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
- Cho nước vào ngập điện trở của autoclave.nh
- Xếp dụng cụ vào hộp inox và đưa vào thiết bị khử trùng.
- Điều chỉnh nhiệt độ và thời gian khử trùng, thời gian sấy (thông thường nhiệt
độ khử là 121
o
C, thời gian là 15 phút, thời gian sấy là 15 phút).
- Sau khi khử trùng xong chờ kim áp kế về 0 mới mở nắp thiết bị khử trùng rồi
lấy dụng cụ, vật liệu đã khử trùng ra.
Câu 4: Nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của tủ cấy vô trùng
- Nguyên tắc hoạt động:Bầu không khí bên trong tủ cấy luôn được bảo đảm
về sự vô trùng hay ít nhất cũng hạn chế tối đa sự tồn tại của các vi sinh vật
không mong muốn cũng như các bào tử của chúng.
- Cấu tạo:gồm 3 bộ phận chính
+Tủ kính có cửa để đưa vào hay lấy ra các dụng cụ.
+Phía trước tủ có đôi găng tay bằng chất dẻo tổng hợp, mềm được gắn
với 2 lỗ tròn giúp cho người thí nghiệm tiến hành các thao tác dễ dàng mà
vẫn đảm bảo vô trùng cho không khí trong tủ cũng như sự an tòan cho họ khi
tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh.
+Hệ thống bơm và lọc không khí bên ngoài thành không khí vô trùng
thổi vào tủ đồng thời với bộ phận hút khí ra để đảm bảo sự cân bằng áp suất
trong và ngoài tủ.
Câu 5: Các bước tiến hành pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Cân chính xác lượng môi truờng theo hướng dẫn trên bao bì
- Dùng bình định mức để đong thể tích nước cần sử dụng
- Sử dụng một luợng nhỏ nước để hòa tan lượng môi trường vừa cân, chuyển
huyền phù này vào trong bình đựng môi trường. Phần nuớc còn lại dùng để
tráng dụng cụ chứa môi trường nhiều lần sao cho không còn môi trường dính
trên thành dụng cụ
- Đun cách thủy cho đến khi môi trường trong bình tan hoàn toàn.

- Chuyển môi trường vừa pha vào các bình chứa với thể tích thông thường
khoảng 300ml rồi đem đi khử trùng.
Câu 6: Phương pháp khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Môi trường nuôi cấy vi sinh có thể sử dụng các biện pháp khử trùng như:
Phương pháp hấp Pasteur, phương pháp hấp gián đoạn Tyndal, phương pháp
hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao, phuơng pháp lọc...
- Bảo quản: môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần được bảo quản nơi thoáng
mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng và nhiệt độ làm cho môi truờng bị khô.
BÀI 2: KIỂM TRA SỐ LUỢNG NẤM MEN BẰNG KÍNH HIỂN VI VÀ
QUAN SÁT CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT

I. MỤC ĐÍCH:
- Bài thực tập giúp sinh viên biết đựoc cấu tạo và chức năng của các bộ phận
của kính hiển vi quang học. Từ đó, nắm được kĩ năng sử dụng kính
- Rèn luyện kĩ năng đếm số lượng vi sinh vật trên đơn vị mẫu bằng buồng đếm
hồng cầu nhờ vào sử dụng kính hiển vi
II. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
1. chuẩn bị mẫu:
khóm → xử lí → ép → lọc → phối chế → thanh trùng → lên men → kiểm tra
mật số tế bào nấm men ở 6 ngày liên tiếp để vẽ đường cong sinh trưởng.
- ở giai đoạn phối chế cần đảm bảo nồng độ đường là 22%, pH = 4.5, thanh
trùng dịch lên men bằng NaHSO
3
144mg/l, để 2giờ cho SO
2
bay hơi, sau đó
cấy 0.1% men giống để tiến hành lên men.
- Dịch lên men được quan sát ở 0, 1,2,3,5,6 ngày
2. quan sát và đếm tế bào nấm men
- Dùng đũa thủy tinh nhúng và cho một giọt dịch lên men trên mặt lam có các

ô đếm, đậy lamen và đưa tiêu bản lên kính hiển vi quan sát.
- Đếm đủ 10 ô theo hình Z
- Mỗi ô có chiều sâu là 0.01mm, diện tích là 0.25 mm
2
> thể tích = Sxh=
0.01x 0.25= mm
3

- từ đó, tính số tế bào /1ml mẫu.
III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
BÀI 3: KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
RẮN
I. MỤC ĐÍCH
Bài thực tập giúp sinh viên biết phưong pháp chuẩn bị môi trường, mẫu,
cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong các sản
phẩm thực phẩm rắn.
Biết sử dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để đếm số lượng
vi sinh vật. Nguyên tắc của phưong pháp này là đếm số khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở
mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất.
II. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
- Môi trường nuôi cấy: môi trường PGA để nuôi cấy vi sinh tổng số, môi
trường Endo nuôi cấy vi khuẩn Coliorms, môi trường Sabouraud để nuôi cấy
nấm men, nấm mốc.
- Nguyên liệu thí nghiệm: Thịt, bánh, tôm khô, nho
- Tiến hành:
- thịt được xay nhuyễn, cân 10 gam pha loãng trong 90 ml nước muối sinh lí
0.85% và tiếp tục được pha loãng ra đến nồng độ 10
-6
, 10

-7
.
- bánh cân 10 gam và pha loãng trong 90ml nước muối sinh lí 0.85% và pha
loãng ra đến nồng độ 10
-4
, 10
-7
.
- Hai nồng độ cuối ở mỗi nguyên liệu được sử dụng để nuôi cấy định luợng vi
sinh tổng số và vi khuẩn Coliforms. Dùng pipet hút 1ml mẫu pha loãng cho
vào giữa đĩa, cho vào 15ml môi truờng nuôi cấy, lắc tròn xuôi và ngược
chiều kim đồng hồ. Khi môi trường đông lại lật úp đĩa và ủ ở nhiệt độ 37
o
C
trong 24-36 giờ.
- Đếm số khuẩn lạc trên đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng
và quy ra lượng vi sinh vật trong 1ml mẫu. Riêng khuẩn lạc của Coliforms có
màu đỏ đặc trưng dễ nhận diện.
- Tôm khô và nấm men được đặt trực tiếp lên môi trường Sabouraud, ủ ở nhiệt
độ phòng, quan sát khuẩn ty nấm mốc và nấm men phát triển trên môi
trường.
III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
BÀI 4: KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ THỰC
PHẨM LỎNG
I. MỤC ĐÍCH
- Giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường, mẫu, cách lấy mẫu,
phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật và xác đinh mức độ nhiễm của vi
sinh vật trong thực phẩm lỏng bằng phương pháp đếm đĩa.
II. PHƯONG PHÁP THÍ NGHIỆM
- môi trường nuôi cấy: Môi trường PGA nuôi cấy vi sinh tổng số, môi trường

Endo nuôi cấy Coliforms, môi trường BGBL nuôi cấy tăng sinh E.coli và
môi truờng EMB để phân lập vi khuẩn E.coli.
- nguyên liệu: Sữa, nước ép rau má
- Tiến hành:
- Sữa được lấy 10ml pha loãng trong 90ml nước muối sinh lí 0.85% và tiếp tục
pha loãng ra nồng độ 10
-2
.
- Nước rau má được lấy 10ml và pha loãng trong 90ml nước muối sinh lí
0.85% và tiếp tục được pha loãng ra nồng độ 10
-6
, 10
-7.
- Hai nồng độ cuối được sử dụng để nuôi cấy định lượng vi sinh tổng số và
Coliforms.
- Dùng pipet hut 1 ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri và thêm 15ml môi
trường nuôi cấy lắc xuôi và ngựoc chiều kim đồng hồ, khi môi trường đông
lại, lật úp đĩa và ủ ở 37
o
C, sau 24 -36 giờ, đếm khuẩn lạc và xác định lượng
vi sinh vật trong 1 ml mẫu.
- Nước rau má, và sữa ở độ pha loãng 10
-1
được lấy 1ml cho vào ống nghiệm
có môi trường BGBL, trong ống nghiệm có đặt một chuông thủy tinh. Nuôi
cấy ở 37
o
C , sau 24 giờ nếu mẫu bị nhiễm E.coli thì chúng sẽ phát triển và
sinh hơi đẩy chuông thủy tinh nổi lên. ống nghiệm dương tính được chọn để
nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli trên môi trường EMB, lật úp đĩa, ủ ở 37

o
C,
sau 24 – 36 giờ quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E.coli phát triển trên môi trường
có màu xanh tím, có ánh kim.
III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN