Giáo trình các phương pháp phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG
PHẠM THỊ NGỌC MAI

GIÁO TRÌNH

CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH

HÀ NỘI - 2019


LỜI MỞ ĐẦU
Hóa học phân tích là khoa học nghiên cứu về các phương pháp xác định thành
phần cấu tạo (định tính) và hàm lượng (định lượng) của một hoặc nhiều thành phần
của vật chất (mẫu phân tích), đáp ứng nhu cầu ngày càng đa dạng và phức tạp của
các ngành khoa học, kỹ thuật và đời sống. Cùng với sự phát triển của khoa học công
nghệ, nhiều phương pháp phân tích từ đơn giản đến phức tạp, tương ứng xác định ở
các mức hàm lượng khác nhau (từ lượng lớn đến lượng siêu vết) của chất phân tích
đã được ra đời. Trong đó, các phương pháp phân tích (còn có thể được gọi là các
phương pháp phân tích công cụ, các phương pháp phân tích hiện đại) được phát triển
trên cơ sở nguyên tắc của hóa lý hoặc công nghệ sinh học, đang được sử dụng phổ
biến và rộng rãi nhằm xác định lượng vết, siêu vết của chất phân tích. Các phương
pháp này đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực như phân tích môi trường,
y sinh, pháp y, thực phẩm, dược phẩm,…
Cuốn sách “Các phương pháp phân tích” được ra đời trong khuôn khổ
chương trình phát triển và hoàn thiện học liệu cho các môn học thuộc chương trình
đào tạo chuyên ngành và liên ngành của Trường Đại học Mở Hà Nội. Với mục đích
giới thiệu những kiến thức cơ bản, cũng như một số khả năng ứng dụng của các

phương pháp hiện đại thường dùng trong phân tích, đặc biệt là phân tích môi trường,
sinh học và thực phẩm, cuốn sách này được biên soạn với các nội dung chính là các
nhóm phương pháp phân tích được chia thành các chương tương ứng:

- Chương 1. Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích: giới thiệu chung,
các bước của quá trình phân tích, phân loại các phương pháp phân tích, các
thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích, các phương pháp
chuẩn hóa.

- Chương 2. Các phương pháp phân tích quang học: giới thiệu chung, đại
cương về các phương pháp phân tích quang học, phương pháp phân tích
quang phổ hấp thụ phân tử, phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang
phân tử, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử, phương pháp


phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử, phương pháp phân tích phổ hồng
ngoại.

- Chương 3. Các phương pháp phân tích sắc kí: giới thiệu chung, đại cương về
các phương pháp phân tích sắc kí, phương pháp phân tích sắc kí khí, phương
pháp phân tích sắc ký lỏng, phương pháp phân tích sắc ký ion và các phương
pháp sắc kí khác

- Chuơng 4. Phương pháp điện di mao quản: nguyên tắc của phương pháp, cơ
sở lí thuyết của phương pháp điện di mao quản, mao quản sử dụng trong CE,
dòng điện di thẩm thấu, các kĩ thuật bơm mẫu, một số detector thông dụng
trong CE, ứng dụng của CE.

- Chuơng 5. Các phương pháp phân tích điện hóa: giới thiệu chung, điện cực,
phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn.

- Chuơng 6. Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzym: giới thiệu chung,
kháng nguyên - kháng thể, nguyên tắc của phương pháp, các kỹ thuật ELISA,
ưu nhược điểm và ứng dụng của phương pháp ELISA.
Cuốn sách hy vọng sẽ hữu ích cho các bạn sinh viên trong quá trình học tập,
cũng như cho các đồng nghiệp, các nhà nghiên cứu trong công việc của mình. Trong
quá trình biên soạn chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Chúng tôi mong
nhận được những ý kiến đóng góp của các chuyên gia, bạn bè đồng nghiệp và các
bạn sinh viên để sửa chữa và bổ sung cho những lần tái bản sau.

Nhóm tác giả

Phạm Thị Ngọc Mai và Nguyễn Thị Ánh Hường


DANH MỤC VIẾT TẮT

Kí hiệu
viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AAS

Atomic absorption
spectroscopy

Phổ hấp thụ nguyên tử

Ab

Antibody

Kháng thể

AES

Atomic emission spectroscopy Phổ phát xạ nguyên tử

Ag

Antigen

Kháng nguyên

AOAC

Association of analytical
chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân
tích

ATR

Attenuated total reflectance

(đo) Giảm tổng độ phản xạ

BA

Benzoic acid

Acid benzoic

CCE

Chiral Capillary
Electrophoresis

Điện di mao quản tách đồng
phân đối quang

CE

Capillary Zone
Electrophoresis

Điện di mao quản

CEC

Capillary
Electrochromatography

Sắc kí điện mao quản

CGE

Capillary Gel Electrophoresis

Điện di mao quản gel

CIEF

Capillary Isoelectric Focusing

Điện di mao quản điểm đẳng
điện

CITP

Capillary Isotachophoresis

Điện di mao quản đẳng tốc độ

CRM

Certified reference material

Mẫu chuẩn so sánh

CTAB

Cetyltrimethylammonium
bromide

Cetyltrimethylammonium

bromua

CZE

Capillary Zone
Electrophoresis

Điện di mao quản vùng


Kí hiệu
viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

DSCE

Dynamic Sieving Capillary
Electrophoresis

Điện di mao quản rây động
học

E

Enzyme

Enzyme

ECD

Electron capture detector

Detector cộng kết điện tử

EDL

Electrodeless discharge lamp

Đèn phóng điện không điện
cực

ELISA

Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay

Hấp thụ miễn dịch gắn
enzyme

EOF

Electro-osmotic flow

Dòng điện di thẩm thấu

ESI

Electrospray ionization

Ion hóa phun điện tử

F-AAS

Flame atomic absorption
spectroscopy

Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn
lửa

FID

Flame ionization detector

Detector ion hóa ngọn lửa

FT-IR

Fourier transformationInfrared

Hồng ngoại chuyển hóa
Fourier

GC

Gas chromatography

Sắc kí khí

GC-MS

Gas chromatography-Mass
spectrometer

Sắc kí khí - khối phổ

GF-AAS

Graphite atomic absorption
spectroscopy

Phổ hấp thụ nguyên tử dùng
cuvet graphit

HCL

Hollow cathode lamp

Đèn catot rỗng

HPCE

High performance Capillary
Electrophoresis

Điện di mao quản hiệu năng
cao

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IC

Ion chromatography

Sắc kí ion


Kí hiệu
viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ICP

Inductively coupled plasma

Plasma cảm ứng cao tần

ICP-MS

Inductively coupled plasmaMass spectrometry

Khối phổ plasma cảm ứng cao
tần

ICP-OES Inductively coupled plasmaPhổ phát xạ plasma cảm ứng
Optical emission spectroscopy cao tần
ID

Inner diameter

Đường kính trong

IR

Infrared

Hồng ngoại

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MCEKC

Micellary Capillary ElectroKinetic Chromatography

Sắc ký điện động học mixen

MFS

Molecular fluorescence
spectroscopy

Phổ huỳnh quang phân tử

MS

Mass spectrometer

Khối phổ

MW

Molecular weight

Trọng lượng phân tử

PA

p-aminobenzoic acid

Acid p-aminobenzoic

PAH

Polycyclic aromatic
hydrocarbon

Hydrocacbon đa vòng thơm

PH

p-hydroxybenzoic acid

Acid p-hydroxybenzoic

PLOT

Porous layer open tubular

(cột) ống hở phủ lớp xốp

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SCOT

support-coated open tubular

(cột) ống hở chứa chất nhồi
phủ pha tĩnh

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Sodium dodecyl sulfate


Kí hiệu
viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt
Chế độ theo dõi ion chọn lọc

SIM

Selective ion monitoring

TCD

Thermal conductivity detector Detector độ dẫn nhiệt

TFE

Tetra fluoro ethylene

Tetra fluoro ethylen

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

TLC

Thin layer chromatography

Sắc kí lớp mỏng

TP

Terephthalic acid

Acid terephthalic

UV-VIs

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại-nhìn thấy

WCOT

Wall-coated open tubular

(Cột) ống hở có thành phủ pha
tĩnh


MỤC LỤC

Nội dung

Trang

Chương 1: Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích

1

1.1. Giới thiệu chung

1

1.2. Các bước của quá trình phân tích

2

1.3. Phân loại các phương pháp phân tích

4

1.4. Các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích

7

1.5. Các phương pháp chuẩn hóa

12

1.5.1. Khái niệm đường chuẩn

12

1.5.2. Phương pháp đường chuẩn (ngoại chuẩn)

12

1.5.3. Phương pháp nội chuẩn

13

1.5.4. Phương pháp thêm chuẩn

14

Câu hỏi ôn tập

16

Tài liệu tham khảo

17

Chương 2: Các phương pháp phân tích quang học

18

2.1. Giới thiệu chung

18

2.2. Đại cương về các phương pháp phân tích quang học

18

2.2.1. Ánh sáng và bức xạ điện từ

18

2.2.2. Tương tác của vật chất với ánh sáng

20

2.2.3. Sự xuất hiện của phổ

23

2.2.4. Phân loại các phương pháp phân tích quang học

24

2.2.5. Các thành phần cơ bản của thiết bị đo phổ

25

2.2.5.1. Nguồn năng lượng

25

2.2.5.2. Bộ phận phân giải quang học -chọn lọc bước sóng

26

2.2.5.3. Bộ phận phát hiện tín hiệu (Detector)

30

2.2.5.4. Bộ phận xử lí tín hiệu

32

2.3. Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử

32

2.3.1. Sự hình thành phổ hấp thụ phân tử

32

2.3.2. Độ hấp thụ quang và độ truyền qua

33


2.3.3. Định luật hấp thụ quang Lambert-Beer

34

2.3.3.1. Nội dung định luật

34

2.3.3.2. Tính cộng tính của độ hấp thụ quang

36

2.3.3.3. Những nguyên nhân làm sai lệch định luật
Lambert-Beer

37

2.3.4. Sơ đồ thiết bị

41

2.3.4.1. Thiết bị quang phổ một chùm tia

41

2.3.4.2. Thiết bị quang phổ hai chùm tia

42

2.3.4.3. Thiết bị quang phổ mảng diot

43

2.3.4.4. Cuvet đựng mẫu

44

2.3.5. Ứng dụng thực tế

45

2.3.5.1. Ứng dụng trong môi trường

45

2.3.5.2. Ứng dụng trong y sinh

47

2.3.5.3. Ứng dụng trong công nghiệp

48

2.3.5.4. Ứng dụng trong pháp y

48

2.4. Phương pháp phân tích quang phổ huỳnh quang phân tử
2.4.1. Sự hình thành của phổ phát quang

49
49

2.4.1.1. Phổ huỳnh quang và lân quang

50

2.4.1.2. Hồi phục thông qua huỳnh quang

50

2.4.1.3. Hồi phục thông qua lân quang

52

2.4.1.4. Phổ hồi phục và phổ phát xạ

53

2.4.2. Trang thiết bị đo phổ phát quang phân tử

53

2.4.2.1. Thiết bị đo huỳnh quang

53

2.4.2.2. Thiết bị đo lân quang

55

2.4.3. Phạm vi ứng dụng

56

2.4.3.1. Thuốc thử huỳnh quang

57

2.4.3.2. Phân tích chất vô cơ

58

2.4.3.3. Phân tích chất hữu cơ

58

2.5. Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử

60

2.5.1. Nguyên tắc của phương pháp

61

2.5.2. Định luật cơ bản về sự hấp thụ ánh sáng của nguyên tử
tự do

61


2.5.3. Sơ đồ thiết bị

62

2.5.3.1. Nguồn đơn sắc

63

2.5.3.2. Quá trình nguyên tử hóa mẫu

65

2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng

71

2.5.5. Ứng dụng thực tế

72

2.6. Phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử

73

2.6.1. Cơ sở lí thuyết của phương pháp

73

2.6.2. Trang thiết bị của phương pháp

74

2.6.3. Các nguồn năng lượng kích thích phổ

75

2.6.3.1. Ngọn lửa đèn khí

75

2.6.3.2. Plasma cao tần cảm ứng (ICP)

75

2.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng

76

2.6.4.1. Ảnh hưởng phổ

77

2.6.4.2. Ảnh hưởng hóa học

77

2.6.4.3. Ảnh hưởng ion hóa

77

2.6.5. Phạm vi ứng dụng của phương pháp

78

2.7. Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

79

2.7.1. Sự xuất hiện phổ hồng ngoại

80

2.7.2. Trang thiết bị của phương pháp

82

2.7.2.1. Thiết bị quang phổ hai chùm tia

82

2.7.2.2. Thiết bị quang phổ chuyển hóa Fourier

82

2.7.3. Các kĩ thuật chuẩn bị mẫu

83

2.7.4. Ứng dụng của phương pháp

85

Câu hỏi ôn tập

87

Bài tập

88

Tài liệu tham khảo

89

Chương 3: Các phương pháp phân tích sắc kí

90

3.1. Giới thiệu chung

90

3.2. Đại cương về các phương pháp phân tích sắc kí

90

3.2.1. Khái niệm về sắc kí

90

3.2.2. Cơ sở lí thuyết của phương pháp sắc kí

91


3.2.3. Phân loại các phương pháp phân tích sắc ký

92

3.2.3.1. Phân loại theo pha động

92

3.2.3.2. Phân loại theo cách thực hiện

92

3.2.3.3. Phân loại theo cơ chế

93

3.2.4. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

94

3.2.5. Hiệu quả của cột tách

99

3.3. Phương pháp phân tích sắc kí khí

105

3.3.1. Nguyên tắc của phương pháp

105

3.3.2. Các loại khí mang dùng trong sắc kí khí

106

3.3.3. Cột tách trong sắc kí khí

107

3.3.4. Cấu tạo hệ thiết bị sắc kí khí

112

3.3.5. Ứng dụng của phương pháp phân tích sắc kí khí

120

3.4. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng

121

3.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp

121

3.4.2. Sơ đồ thiết bị hệ sắc kí lỏng

122

3.4.3. Pha tĩnh và pha động trong sắc ký lỏng

125

3.4.3.1. Pha tĩnh

125

3.4.3.2. Pha động

126

3.4.4. Các loại detector trong sắc kí lỏng

131

3.4.4.1. Detector quang học

131

3.4.4.2. Detector điện hóa

132

3.4.4.3. Các loại detector khác

133

3.4.5. Ứng dụng của sắc kí lỏng
3.5. Phương pháp phân tích sắc ký ion

134
135

3.5.1. Nguyên tắc của phương pháp

135

3.5.2. Các loại nhựa trao đổi ion

136

3.5.3. Cơ chế trao đổi ion

138

3.5.4. Ứng dụng của sắc kí ion

140

3.6. Các phương pháp sắc kí khác
3.6.1. Sắc kí lớp mỏng
3.6.1.1. Nguyên tắc

141
141
141


3.6.1.2. Ưu nhược điểm của sắc kí lớp mỏng

143

3.6.1.3. Hiệu quả tách của sắc kí lớp mỏng

143

3.6.1.4. Tính giá trị Rf của chất phân tích

145

3.6.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf

145

3.6.2. Sắc kí gel (sắc kí rây phân tử)

146

Câu hỏi ôn tập

149

Bài tập

150

Tài liệu tham khảo

150

Chuơng 4. Phương pháp điện di mao quản

152

4.1. Nguyên tắc của phương pháp

152

4.2. Cơ sở lí thuyết của phương pháp điện di mao quản

154

4.3. Mao quản sử dụng trong CE

156

4.4. Dòng điện di thẩm thấu

157

4.5. Các kĩ thuật bơm mẫu

160

4.6. Một số detector thông dụng trong CE

162

4.6.1. Detector UV-VIS

162

4.6.2. Detector huỳnh quang

163

4.6.3. Detector Phổ khối (MS)

164

4.6.4. Detector điện hóa

165

4.7. Ứng dụng

168

Câu hỏi ôn tập

174

Tài liệu tham khảo

175

Chuơng 5. Các phương pháp phân tích điện hóa

177

5.1. Giới thiệu chung

177

5.2. Điện cực

177

5.2.1. Điện cực loại I

178

5.2.1.1. Điện cực kim loại – ion

178

5.2.1.2. Cực oxi hoá - khử

179

5.2.1.3. Điện cực hydro

179

5.2.2. Điện cực loại II
5.2.2.1. Điện cực calomen

180
180


5.2.2.2. Điện cực bạc clorua
5.2.3. Điện cực màng chọn lọc ion

181
182

5.2.3.1. Điện cực thuỷ tinh

183

5.2.3.2. Điện cực chọn lọc ion màng rắn, màng lỏng

185

5.3. Phương pháp đo thế

186

5.3.1. Phương trình Nernst

186

5.3.2. Phương pháp đo thế trực tiếp

187

5.3.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế

188

5.3.3.1. Nguyên tắc

188

5.3.3.2. Các phương pháp chuẩn độ đo điện thế

190

5.3.3.3. Cách xác định điểm tương đương trong phương
pháp chuẩn độ đo điện thế

191

5.4. Phương pháp đo độ dẫn

191

5.4.1. Giới thiệu chung

191

5.4.2. Phương pháp đo độ dẫn trực tiếp

193

5.4.3. Phương pháp chuẩn độ đo độ dẫn điện

193

5.4.3.1. Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng axit-bazơ

194

5.4.3.2. Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng tạo phức

195

5.4.3.3. Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng tạo kết
tủa

196

5.4.3.4. Chuẩn độ đo độ dẫn điện theo phản ứng oxi hóa –
khử

196

5.4.3.5. Cách xác định điểm tương đương trong chuẩn độ
đo độ dẫn điện

197

3.4.3.6. Các cách làm thay đổi độ dốc của các đường
chuẩn độ

197

Câu hỏi ôn tập

198

Bài tập

199

Tài liệu tham khảo

199

Chuơng 6. Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzym

201

6.1. Giới thiệu chung

201

6.2. Kháng nguyên - Kháng thể

202


6.2.1. Kháng nguyên

202

6.2.2. Kháng thể

203

6.3. Nguyên tắc của phương pháp

206

6.4. Các kỹ thuật ELISA

207

6.4.1. Kỹ thuật ELISA trực tiếp

208

6.4.2. Kỹ thuật ELISA gián tiếp

210

6.4.3. Kỹ thuật ELISA bánh kẹp (sandwich)

211

6.4.4. Kỹ thuật ELISA cạnh tranh

214

6.5. Ưu nhược điểm và ứng dụng của phương pháp ELISA

216

6.5.1. Ưu điểm

216

6.5.2. Nhược điểm

217

6.5.3. Ứng dụng

218

Câu hỏi ôn tập

219

Tài liệu tham khảo
Phụ lục A

219

Phụ lục B

222

220


Chương 1. Giới thiệu chung về các phương pháp phân tích

1.1. Giới thiệu chung
Mục tiêu của chương này nhằm giới thiệu các khái niệm chung nhất liên
quan đến phân tích công cụ, bao gồm các bước của một quá trình phân tích,
phân loại các phương pháp phân tích theo tín hiệu đo, ưu nhược điểm của từng
phương pháp, các thông số được sử dụng để đánh giá một qui trình phân tích,
cũng như các phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn được sử dụng trong phân
tích công cụ.
Hóa học phân tích nghiên cứu việc tách, nhận biết và định lượng thành
phần hóa học của các mẫu vật liệu tự nhiên và tổng hợp. Phân tích định tính
cung cấp các thông tin để định dạng các thành phần trong mẫu, còn phân tích
định lượng cho thông tin về hàm lượng của một hoặc nhiều thành phần của
mẫu.
Hóa học phân tích có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau
của cuộc sống, trong công nghiệp, y tế cũng như trong các ngành khoa học. Để
chẩn đoán và điều trị bệnh cho bệnh nhân, mỗi ngày cần xác định hàm lượng
O2, CO2 trong hàng nghìn mẫu máu tại các bệnh viện. Để đánh giá được mức
độ ô nhiễm không khí, cần xác định được hàm lượng các chất gây ô nhiễm như
NOx, CO, CO2, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) trong không khí. Để
đánh giá được giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, cần xác định được hàm lượng

protein hoặc các vitamin. Để đạt được các tính chất mong muốn như độ cứng,
độ bền ăn mòn, độ dẻo, cần phân tích thành phần của thép trong quá trình sản
xuất để điều chỉnh kịp thời hàm lượng của các nguyên tố thêm vào như C, Ni,
Cr,… Việc theo dõi hàm lượng mercaptan trong khí ga cung cấp cho gia đình
cho phép đảm bảo việc cảnh báo rò rỉ ga trong quá trình sử dụng. Để đảm bảo
bón phân cho đất trồng trọt phù hợp với cây trồng và vụ mùa, cần phân tích các
chỉ tiêu dinh dưỡng của cây và đất trồng,….
Các phép đo định lượng cũng đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều
lĩnh vực nghiên cứu như hóa học, hóa sinh, địa chất học, vật lí học và các ngành
khoa học khác. Tốc độ phản ứng được tính bằng cách đo chính xác nồng độ
chất tại các khoảng thời gian khác nhau. Các nhà địa chất học nhận biết các
nguồn thủy tinh từ núi lửa (khí núi lửa, đá núi lửa) thông qua việc đo nồng độ
1


các nguyên tố vi lượng trong mẫu lấy tại các địa điểm khác nhau. Thông tin
này cũng cho phép lần theo dấu vết các con đường buôn bán hàng hóa và vũ
khí làm bằng đá núi lửa từ thời cổ đại. Vai trò của hóa học phân tích trong công
nghiệp và các lĩnh vực khác được minh họa trong Hình 1.1.

Hình 1.1. Vai trò của hóa học phân tích đối với các ngành khoa học khác
1.2. Các bước của quá trình phân tích
Quá trình phân tích thường bắt đầu từ việc đặt các câu hỏi không mang
tính phân tích như “Nước này có an toàn để uống không?”, hoặc “Môi trường
không khí nơi làm việc của công nhân có đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh
lao động không?”,... Người phân tích sẽ chuyển các câu hỏi này thành các yêu
cầu phân tích cụ thể, sau đó sẽ lựa chọn hoặc phát triển các qui trình phân tích
phù hợp.
Khi kết thúc quá trình phân tích, người phân tích phải chuyển các kết
quả này lại thành các khái niệm mà ai cũng có thể hiểu được. Một trong các

đặc điểm quan trọng của kết quả phân tích là độ tin cậy của kết quả, để trả lời
những câu hỏi như: Độ không đảm bảo đo thống kê của kết quả là bao nhiêu?
Nếu lấy cùng một mẫu theo các cách khác nhau kết quả có giống nhau hay
2


không? Có thật sự tìm thấy một lượng rất nhỏ (lượng vết) của chất phân tích
không, hay đó là sự nhiễm bẩn?
Một quá trình phân tích thường gồm những bước sau:
Bước 1: Xác định vấn đề
Trong bước này, người phân tích cần trả lời được các câu hỏi sau:
-

Cần phân tích cái gì, trong đối tượng mẫu nào?
Định tính hay định lượng? Ai sẽ dùng thông tin, khi nào, để làm gì?
Cần độ chính xác như thế nào?
Kinh phí phân tích.

Bước 2: Lựa chọn phương pháp
Sau khi đã có câu trả lời cho các câu hỏi đặt ra ở bước 1, người phân tích
sẽ lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp, dựa trên các tiêu chí sau:
- Loại mẫu, lượng mẫu.
- Khoảng nồng độ chất trong mẫu, nền mẫu, các chất có thể gây ảnh hưởng
đến quá trình phân tích.
- Độ chính xác.
- Thiết bị đo sẵn có.
- Thời gian, tốc độ, chi phí,...
- Phương pháp có sẵn (tốt nhất nên dùng phương pháp tiêu chuẩn).
Bước 3. Chọn mẫu đại diện
Kết quả phân tích chỉ đúng khi chọn đúng mẫu đại diện, có nghĩa là mẫu

được chọn phản ánh trung thành đại diện cho đối tượng cần phân tích.
Bước 4. Chuẩn bị mẫu
Phụ thuộc vào trạng thái ban đầu của mẫu phân tích và phương pháp
phân tích lựa chọn, có thể có các cách xử lý mẫu khác nhau như:
-

Phân huỷ mẫu.
Tách hoặc che các chất gây ảnh hưởng bằng các phương pháp khác nhau:
chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, cộng kết, sắc kí, dùng chất che,...

3


-

-

Làm giàu nếu nồng độ chất phân tích quá nhỏ hoặc pha loãng nếu nồng độ
chất phân tích quá lớn, phù hợp với khoảng làm việc của phương pháp phân
tích lựa chọn.
Tạo môi trường phù hợp.

Bước 5. Giai đoạn đo
Tiến hành xác định nồng độ các chất có trong mẫu phân tích bằng
phương pháp (thiết bị) phân tích phù hợp. Chuẩn hóa phương pháp và xác nhận
giá trị sử dụng của phương pháp: giới hạn phát hiện của phương pháp, giới hạn
định lượng, độ đúng, độ lặp lại,…
Bước 6. Đánh giá kết quả phân tích:
-

Xử lí thống kê số liệu.
Báo cáo kết quả kèm theo thông tin về độ chính xác.

1.3. Phân loại các phương pháp phân tích
Các phương pháp phân tích thường được chia thành 2 loại là các phương
pháp phân tích hóa học và các phương pháp phân tích công cụ.
- Các phương pháp phân tích hóa học dựa trên các phản ứng hóa học, bao gồm
phương pháp trọng lượng và phương pháp chuẩn độ (hay còn gọi là phân tích
thể tích). Nhóm các phương pháp này có ưu điểm là trang thiết bị đơn giản,
chi phí thấp, độ chính xác cao nhưng lại có nhược điểm là chỉ xác định được
nồng độ lớn (> 10-4 M) và tốn nhiều thời gian.
- Các phương pháp phân tích công cụ sử dụng các thiết bị để đo các tín hiệu
vật lí của mẫu phân tích, ví dụ như độ hấp thụ quang, độ dẫn điện,... Các đại
lượng này thường tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích, nhờ đó sẽ xác định
được nồng độ của chất. Các phương pháp phân tích công cụ tuy đòi hỏi trang
thiết bị đắt tiền, độ chính xác không cao bằng phương pháp hóa học, nhưng
lại tiết kiệm được thời gian phân tích và đặc biệt là có thể xác định được lượng
rất nhỏ của chất phân tích (có thể xuống tới pg).
Ngày nay, các phương pháp phân tích công cụ đang dần dần thay thế các
phương pháp hóa học truyền thống. Với các phương pháp này, người phân tích
có thể mở rộng phạm vi phân tích, có thể phân tích mẫu mà không phá hủy
mẫu, định lượng chất phân tích trong các nền mẫu phức tạp, nghiên cứu cấu

4


trúc của các hợp chất hữu cơ, động học phản ứng, và thậm chí cả hóa sinh học
của các phân tử sống.
Các phương pháp phân tích công cụ thường được phân loại thành nhóm
các phương pháp sau:

- Phương pháp quang học: dựa trên việc đo các tín hiệu quang của chất phân
tích dưới tác động của ánh sáng như độ hấp thụ quang, cường độ tia phát xạ,..
Trong đó, các phương pháp tiêu biểu gồm: phương pháp phổ hấp thụ phân tử
(UV-Vis), phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phổ phát xạ nguyên tử (AES), phổ
huỳnh quang phân tử (MFS), phổ hồng ngoại (IR),….
- Phương pháp điện hóa: dựa trên việc đo các tín hiệu điện gây nên bởi phản
ứng hóa học như điện thế, dòng điện, điện lượng,… Các phương pháp điện
hóa thường gặp gồm có phương pháp đo điện thế, phương pháp cực phổ,
phương pháp Von-Ampe hòa tan, phương pháp điện lượng,…
- Phương pháp sắc kí: tách chất dựa trên sự tương tác khác nhau của các chất
tan với pha tĩnh và pha động khi được pha động mang theo chảy qua pha tĩnh.
- Ngoài ra còn một số phương pháp khác như phương pháp miễn dịch học,
động học, phương pháp phóng xạ, ,...
Một số phương pháp phân tích công cụ thường gặp được tóm tắt trong
Bảng 1.1, cùng với khoảng nồng độ chất có thể phát hiện tương ứng với mỗi
phương pháp.
Bảng 1.1. Các phương pháp phân tích công cụ thường gặp
Kĩ thuật

Phá hủy
mẫu

Siêu vết

Vết

(< 1 ppm) (1 ppm 0,1%)

Lượng
nhỏ

Lượng
lớn

(0,1 - 10
%)

(> 10 %)

Nhiễu xạ tia X

Không

Không

Không

Có

Có

Cộng hưởng từ
hạt nhân

Không

Không

Có

Có

Có

Huỳnh quang
tia X

Không

Không

Có

Có

Có

5


Kĩ thuật

Phá hủy
mẫu

Siêu vết

Vết

(< 1 ppm) (1 ppm 0,1%)

Lượng
nhỏ

Lượng
lớn

(0,1 - 10
%)

(> 10 %)

Phổ hồng ngoại
(IR)

Không

Không

Có

Có

Có

Phổ Raman

Không

Không

Có

Có

Có

Phổ UV-VIs

Không

Không

Có

Có

Có

So màu

Không

Có

Có

Có

Không

Huỳnh quang
phân tử

Không

Có

Có

Có

Có

Hấp thụ nguyên
tử

Có

Có

Có

Có

Không

Phát xạ nguyên
tử

Có

Có

Có

Có

Có

Huỳnh quang
nguyên tử

Có

Có

Có

Không

Không

ICP-MS

Có

Có

Có

Có

Không

GC-MS

Có

Có

Có

Có

Có

Điện thế

Không

Có

Có

Có

Có

Von-Ampe

Không

Có

Có

Có

Có

Sắc kí khí

Có thể

Có

Có

Có

Có

Sắc kí lỏng hiệu
năng cao

Có thể

Có

Có

Có

Có

Sắc kí ion

Có thể

Có

Có

Có

Có

Điện di mao
quản

Không

Có

Có

Có

Có

6


Kĩ thuật

Phân tích nhiệt

Phá hủy
mẫu

Có thể

Siêu vết

Vết

(< 1 ppm) (1 ppm 0,1%)
Có

Có

Lượng
nhỏ

Lượng
lớn

(0,1 - 10
%)

(> 10 %)

Không

Không

1.4. Các thông số quan trọng để đánh giá phương pháp phân tích
Để đảm bảo có thể áp dụng một phương pháp phân tích trong thực tế với
kết quả đáng tin cậy, cần đánh giá phương pháp thông qua một số thông số
quan trọng như: độ đúng, độ chụm, độ nhạy, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện
(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
* Độ đúng: sự giống nhau giữa giá trị thực nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị
mong đợi. Độ đúng có thể biểu diễn qua sai số tuyệt đối và sai số tương đối.
Sai số tuyệt đối: S = x − µ

(1.1)

trong đó S là sai số tuyệt đối, x là giá trị trung bình và µ là giá trị thực.
S

Sai số tương đối: S% = × 100%
µ

(1.2)

Để đánh giá độ đúng có thể thực hiện theo những cách sau:
1. Phân tích mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM - certified reference
material) hay mẫu chuẩn so sánh là mẫu có nền tương tự với nền mẫu cần
phân tích.

2. So sánh với kết quả đo của một hoặc nhiều phương pháp phân tích khác.
3. Phân tích mẫu trắng đã được thêm (spike) một lượng đã biết của chất phân
tích. Nền mẫu trắng phải giống với nền của mẫu phân tích. Nếu phân tích
thành phần chính, cần làm lặp 3 lần với 3 mức nồng độ thêm vào lớn gấp
từ 0,5 lần đến 1,5 lần so với giá trị dự đoán của chất trong mẫu cần phân
tích. Nếu phân tích các tạp chất (lượng nhỏ), lượng thêm vào cần bao trùm
được toàn bộ khoảng nồng độ dự đoán.
4. Nếu không thể chuẩn bị được mẫu trắng có cùng thành phần nền với mẫu
cần phân tích, khi đó có thể tiến hành phương pháp thêm chuẩn và đánh
giá qua hiệu suất thu hồi.

7


Thêm chuẩn (spike) là phương pháp phổ biến nhất để đánh giá độ đúng
của phương pháp do không phải lúc nào cũng có sẵn mẫu chuẩn so sánh, cũng
như không phải lúc nào cũng tìm được phương pháp phân tích thứ hai để đối
chứng. Thêm chuẩn đảm bảo nền mẫu gần như không thay đổi, và được thực
hiện bằng cách thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu
trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn này, làm lặp lại n lần, sau đó tính độ thu
hồi theo công thức:
R% =

Cm+c −Cm

Trong đó:

Cc

× 100

(1.3)

R%: Độ thu hồi (%)
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trên nền mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Thông
thường, độ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng cho phép của Hiệp hội các
nhà hóa phân tích (AOAC) ở nồng độ chất tương ứng (xem Phụ lục A).
* Độ chụm (độ lặp lại): sự giống nhau giữa các giá trị thực nghiệm được làm
lặp lại nhiều lần. Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn SD hoặc độ
lệch chuẩn tương đối RSD %.
( xi  xtb ) 2
n 1

SD =

RSD % 

SD
 100%
xtb

(1.4)

(1.5)

Trong đó xtb giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi
n là số lần thí nghiệm lặp lại.

Độ chụm thiết bị (precision): là độ lặp lại khi cùng một lượng mẫu phân tích
được đo lặp lại (thường là 10 lần) trên một thiết bị. Sự biến động về giá trị của
các lần đo có nguồn gốc từ sự biến động về lượng mẫu và đáp ứng của thiết bị.
Độ chụm giữa các lần phân tích (Intra-assay precision): phân tích một mẫu
vật liệu đồng nhất vài lần trong ngày bởi cùng một người trên cùng một thiết
bị. Mỗi lần phân tích là độc lập với nhau, do đó độ chụm giữa các lần phân tích
8


cho biết độ lặp lại của phương pháp phân tích. Độ chụm giữa các lần phân tích
thường lớn hơn so với độ chụm thiết bị. Ví dụ, độ chụm thiết bị là 1% thì độ
chụm giữa các lần phân tích có thể là 2%.
Độ chụm trung gian (Intermediate precision), trước kia còn được gọi là
ruggedness, là sự biến động về giá trị đo khi mẫu được phân tích bởi nhiều
người khác nhau trên các thiết bị đo khác nhau trong các ngày khác nhau, nhưng
trong cùng một thí nghiệm.
Độ chụm liên phòng (Interlaboratory precision), còn được gọi là độ tái lặp, thu
được khi phân tích cùng một mẫu bởi nhiều người khác nhau trong các phòng
thí nghiệm khác nhau. Độ chụm liên phòng sẽ tăng khi nồng độ chất phân tích
giảm.
Nếu phân tích theo một tiêu chuẩn hoặc một quy trình chính thống có
công bố RSD (%) thì RSD (%) tính được phải nhỏ hơn hoặc bằng RSD (%)
cho phép.
Nếu phân tích theo một tiêu chuẩn, một quy trình chính thống không công
bố thì RSD (%) tính được thường được so sánh với RSD (%) cho phép ở nồng
độ chất tương ứng theo AOAC (phụ lục A). Gía trị RSD (%) tính được phải
nhỏ hơn giá trị trong bảng ở khoảng hàm lượng tương ứng. Giá trị này thay đổi
theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất phân tích càng thấp thì kết quả càng
dao động nhiều (không chụm), nghĩa là RSD% càng lớn.

9


Ví dụ 1.1
Để đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi khi xác định Aspartam bằng phương pháp
HPLC trong thực phẩm, dung dịch chuẩn Aspartam ở mức nồng độ 40 ppm
được thêm vào mẫu thử được chọn là mẫu thạch. Mỗi mẫu thử được đo lặp lại
6 lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả thu được (ppm) của 6 lần đo lặp như
sau:
38,2

39,1

38,7

38,6

38,8

39,2

Tính độ thu hồi (R%) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của Aspartam.
Lời giải:
Đô lệch chuẩn tương đối của Aspartam ở mức nồng độ 40ppm là:
Xtb =

38,2+39,1+38,7+38,6+38,8+39,2

SD =

6

( xi  xtb ) 2
n 1

RSD % 

R% =

=√

= 38,77 ppm

(38,2−38,77)2 + (39,1−38,77)2 +⋯
5

= 0,3615

0,3615
SD
. 100% = 0,93%
100% =
38,77
xtb

Cm+c −Cm
Cc

× 100 =

38,77
40,00

.100% = 96,92%

* Độ nhạy (Sensitivity): Khả năng phát hiện sự thay đổi của tín hiệu khi có sự
thay đổi lượng chất. Cách đơn giản nhất để xác định độ nhạy của phương pháp
là đo độ dốc của đường chuẩn trong khoảng nồng độ quan tâm. Độ nhạy xác
định theo cách này được gọi là độ nhạy đường chuẩn. Do độ chính xác giảm
tại các giá trị nồng độ thấp, khả năng phân biệt sự khác nhau giữa các giá trị
nồng độ nhỏ cũng giảm, khi đó độ nhạy được biểu diễn dưới dạng độ nhạy
phân tích, tính bằng độ nhạy đường chuẩn chia cho độ lệch chuẩn của quá
trình phân tích mẫu.
* Độ đặc hiệu: Khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt được chất
phân tích với các thành phần còn lại có trong mẫu.

10


* Độ tuyến tính: Đo mức độ tín hiệu tỷ lệ tuyến tính với hàm lượng chất (đường
chuẩn có phải là một đường thẳng hay không?), thường hay được đánh giá
qua hệ số tương quan R2. R2 càng gần 1, độ tuyến tính càng cao. Ngoài ra, độ
tuyến tính còn được đánh giá qua mức độ đường chuẩn cắt gốc gần giá trị 0.
Khoảng tuyến tính (linear range): khoảng nồng độ mà tín hiệu tỷ lệ tuyến tính
với nồng độ (Hình 1.2).
Khoảng động học (dynamic range): khoảng nồng độ có thể đo được tín hiệu
của chất phân tích.

Hình 1.2. Khoảng động học và khoảng tuyến tính
*Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích mà vẫn khác đáng
kể so với mẫu trắng.Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân tích
mà phương pháp phân tích có thể định lượng được.
Có nhiều cách để xác định LOD, trong đó một trong các cách phổ biến là
thêm chuẩn vào mẫu phân tích với nồng độ thấp (gần giá trị LODước lượng),
phân tích lặp lại nhiều lần. Giá trị LOD, LOQ được xác định từ độ lệch chuẩn
SD theo công thức dưới đây:

11