Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN MINH THU

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ
BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ
ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hà Nội – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN MINH THU

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ
BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ
ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG

Chuyên ngành: Y Sinh học - Di truyền
Mã số: 60720102

LUẬN VĂN THẠC SỸ

HƯỚNG DẪN 1: TS. NGUYỄN THỊ TRANG
HƯỚNG DẪN 2: TS. TRIỆU TIẾN SANG


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Nguyễn Thị Trang, giảng viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường
Đại học Y Hà Nội và TS. Triệu Tiến Sang, Bộ môn Sinh học và Di truyền y
học , Học viện Quân Y, những người thầy đã hướng dẫn tận tình, quan tâm,
động viên, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và học tập để em hoàn
thành luận văn.
Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên, các anh chị em nội
trú trong Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp
đỡ và chỉ bảo cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện
trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành luận
văn này.
Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh
ủng hộ, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho em không chỉ trong thời gian
thực hiện luận văn mà còn trong suốt quá trình học tập và làm việc.
Hà Nội, ngày

tháng

Nguyễn Minh Thu

năm 2019

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn “Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng
bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng” dưới sự hướng dẫn
của TS. Nguyễn Thị Trang và TS. Triệu Tiến Sang là hoàn toàn do tôi thực
hiện. Các số liệu và kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công
bố trước đây.

Hà Nội, ngày

tháng

Nguyễn Minh Thu

năm 2019


MỤC LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
WHO
DFI
IUI
IVF
ICSI
AOT
SCSA

TB
TUNEL
SCD
TCVN

Deoxyribonucleic acide
World Health Organization
DNA fragmentation index
intrauterine insemination
in vitro fertilization
intracytoplasmic sperm injection
Acridine Orange Test
Sperm Chromatin Structure Assay
Toluidine Blue
Terminal
deoxynucleotidyl
tranferase
mediated dUTP nick end labeling assay
Sperm Chromatin Dispersion test
Tiêu Chuẩn Việt Nam


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình vẽ
Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng
Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997)
Hình 1.3. Độ chính xác
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu
Hình 2.2. Hình ảnh tinh trùng có quầng halo và không có
quầng halo

Hình 3.1. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch của bộ
kit Halosperm
Hình 3.2. Hình ảnh lam kính với tiêu bản bằng thạch tự pha
Hình 3.3. Hình ảnh tiêu bản của bộ xét nghiệm Halosperm
Hình 3.4. Tiêu bản làm bằng bộ xét nghiệm tự pha
Hình 3.5. Tiêu bản làm bằng bộ xét nghiệm thương mại
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng bằng
kit tự pha và kit thương mại Halosperm
Hình 3.7. Biểu đồ Bland Altman đánh giá mối tương quan
giữa 2 phương pháp

Trang
6
8
17
21
24
31
31
32
38
38
39
42


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng biểu
Bảng 2.1. Bảng quy ước xác định độ đặc hiệu của bộ xét
nghiệm

Bảng 3.1. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch agarose.
Bảng 3.2. So sánh kết quả giữa các nồng độ thạch phủ lam
kính.
Bảng 3.3. Kết quả tạo tiêu bản tinh dịch - thạch trên các loại
lam kính
Bảng 3.4. So sánh DFI giữa các dung dịch biến tính.
Bảng 3.5. So sánh DFI giữa các dung dịch ly giải
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm xác định độ chụm của bộ xét
nghiệm tự pha.
Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm mức độ đứt gãy DNA tinh
trùng.
Bảng 3.8. Bảng kiểm định hệ số tương quan giữa 2 phương
pháp
Bảng 3.9. Bảng kiểm định T - test của chênh lệch giữa 2
phương pháp
Bảng 4.1. So sánh quy trình xét nghiệm của kit Halosperm và
kit tự pha.

Trang
28
30
31
32
33 - 34
34 - 35
36 - 37
40
41
41
54 - 55

9

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đứt gãy DNA tinh trùng là một trong những rối loạn vật chất di truyền
dẫn tới khả năng thụ tinh kém, thai kém phát triển hoặc thai dị tật bẩm sinh,
dễ sảy thai. Theo ước tính, khoảng 25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ
đứt gãy DNA tinh trùng cao [1]. Có rất nhiều mối liên quan giữa đứt gãy
DNA tinh trùng và kết quả tinh dịch đồ. Nam giới có kết quả xét nghiệm tinh
dịch đồ với tinh trùng có khả năng di động kém thường có tỷ lệ đứt gãy DNA
cao. Tuy nhiên, có khoảng 10% bệnh nhân vô sinh nam có vấn đề về đứt gãy
DNA tinh trùng lại cho kết quả tinh dịch đồ hoàn toàn bình thường [2].
Ngoài ra, ở những cặp vợ chồng vô sinh, đứt gãy DNA tinh trùng còn
liên quan đến tiền sử sảy thai, thai lưu nếu đứt gãy xảy ra ở các vị trí gen liên
quan đến làm tổ [3]. Chỉ số đứt gãy DNA tinh trùng cũng có giá trị rất cao
trong việc tiên lượng khả năng sinh sản của nam giới, giúp lựa chọn phương
pháp hỗ trợ sinh sản thích hợp và dự đoán tỷ lệ thành công của phương pháp
hỗ trợ sinh sản đó [4].
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp đánh giá mức độ đứt
gãy DNA tinh trùng, phổ biến nhất là khảo sát mức độ phân tán chất nhiễm
sắc của tinh trùng. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với chi phí
thấp so với những phương pháp khác và hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện
hiện nay [5]. Tuy nhiên, bộ kit xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng hiện nay
phải nhập ngoại hoàn toàn, tại Việt Nam chưa có bộ kit riêng. Vì vậy, xét
nghiệm này ở nước ta phụ thuộc nhiều vào nhà cung cấp cũng như nhà vận
chuyển không chỉ về giá thành mà còn cả thời gian làm xét nghiệm. Để hạn
chế nhược điểm này, góp phần đưa xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đến
gần hơn với bệnh nhân, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu "Hoàn thiện quy
trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh

trùng" với các mục tiêu sau:


10

1. Hoàn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy
DNA tinh trùng.
2. So sánh kết quả xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới
bằng bộ xét nghiệm tự pha với bộ xét nghiệm thương mại Halosperm.


11

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đứt gãy DNA tinh trùng
Tinh trùng là tế bào sinh sản của nam giới, mang bộ nhiễm sắc thể đơn
bội, 23 nhiễm sắc thể. Mỗi tinh trùng có kích thước 65 - 70 µm. Tinh trùng
gồm ba phần: đầu, cổ và đuôi. Tinh trùng được biệt hóa cao độ để thực hiện
chức năng sinh sản là di chuyển trong đường sinh dục nữ, nhận biết trứng và
thụ tinh cho trứng [6].
Tinh trùng là tế bào đảm nhận chức năng sinh sản ở nam giới. Bình
thường tinh trùng được sinh ra từ các ống sinh tinh trong tinh hoàn, và trải
qua nhiều giai đoạn để có thể trưởng thành, hoàn thiện về cấu trúc và các
chức năng để có thể thụ tinh. Tinh trùng bình thường sẽ có cấu tạo ba phần cơ
bản là: đầu tinh trùng, cổ tinh trùng và đuôi tinh trùng. Đầu tinh trùng thường
có hình trứng, có "mũ" acrosome đảm nhận chức năng ly giải màng trứng để
giúp tinh trùng kết hợp với trứng khi thụ thai, bên trong đầu tinh trùng chứa
nhân, và trong nhân chứa bộ gen (DNA) chính là vật liệu di truyền căn bản
nhất để kết hợp với bộ gen của trứng để tạo ra hợp tử. Cổ tinh trùng chứa các

ty thể có nhiệm vụ giải phóng năng lượng để giúp tinh trùng di chuyển, đuôi
tinh trùng có nhiệm vụ giúp tinh trùng "bơi" để có thể vào được vòi trứng và
thụ tinh [6].
Đứt gãy DNA tinh trùng là sự tổn thương một hoặc hai mạch của phân
tử DNA, đây là sự tách rời hoặc phá vỡ các sợi DNA thành từng mẩu nhỏ, có
thể xảy ra với cả DNA trong nhân và DNA của ty thể tinh trùng. Đứt gãy
DNA tinh trùng cũng giống như với các tế bào khác, đó là sự tích tụ dần dần
ảnh hưởng do các tác nhân bên trong cũng như bên ngoài cơ thể. Tuy nhiên,


12

DNA tinh trùng có cơ chế tự sửa chữa kém và do đó đứt gãy DNA tinh trùng
có ảnh hưởng lớn tới chất lượng tinh trùng [7], [8].
1.2. Lịch sử nghiên cứu đứt gãy DNA tinh trùng
Năm 1946, Pollister và Mirsky đã phát hiện ra phần lớn các protein bao
quanh DNA trong tinh trùng không phải histones mà là các protamine. Sau đó
các nhà khoa học ước tính chỉ có 5 - 15% protein của chất nhiễm sắc trong
tinh trùng là histones, còn lại là các protamine [9]. Năm 1953, Leuchtenberger
đã phát hiện ra rằng chất lượng của một mẫu tinh trùng không chỉ là vấn đề về
số lượng và khả năng vận động của tinh trùng, và có sự khác biệt giữa chất
lượng DNA tinh trùng của nam giới vô sinh và nam giới bình thường về khả
năng sinh sản [10].
Vào những năm bảy mươi, sự quan tâm ngày càng tăng về mối liên hệ có
thể có giữa phơi nhiễm các tác nhân gây tổn hại DNA và giảm khả năng sinh
sản. Năm 1970, Ringertz và cộng sự đã thực hiện một xét nghiệm trong đó
tinh trùng bò bị đốt nóng và sự tổn thương DNA tinh trùng sau đó được phát
hiện khi nhuộm màu cam acridine. Ringertz cũng nhận ra `rằng các tinh trùng
có sự ổn định về DNA tăng dần trong quá trình trưởng thành [11].
Mười năm sau, năm 1980, Evenson và cộng sự, nhờ sự tiến bộ của công

nghệ sinh học phân tử, đã phát triển một xét nghiệm tế bào học dòng chảy để
phát hiện sự đứt gãy DNA trong tinh trùng, gọi là phương pháp khảo sát cấu
trúc chromatin tinh trùng (Sperm Chromatin Structure Assay - SCSA) [12].
Sau đó, trong nhiều thập kỷ, hàng loạt các phương pháp giúp phát hiện
sự đứt gãy DNA tinh trùng ra đời như COMET (1980), TUNEL (1990), DBD
- FISH (2000) hay SCD (2003) chứng tỏ tầm quan trọng cũng như sự quan
tâm của giới khoa học cho vấn đề đứt gãy DNA tinh trùng nói chung và sức
khỏe sinh sản nói riêng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp mới xác định đứt
gãy DNA tinh trùng vẫn đang được nghiên cứu và phát triển [5].


13

Song song với việc xây dựng các phương pháp xác định đứt gãy DNA
tinh trùng, các nghiên cứu về nguyên nhân đứt gãy DNA tinh trùng, mối liên
hệ giữa đứt gãy DNA tinh trùng và sức khỏe sinh sản, lựa chọn các phương
pháp hỗ trợ sinh sản phù hợp với cặp vợ chồng khi người chồng có tỷ lệ đứt
gãy DNA tinh trùng cao cũng được tiến hành và cho nhiều kết quả khả quan
[5].
1.3. Nguyên nhân gây đứt gãy DNA tinh trùng
1.3.1. Nguyên nhân bên trong cơ thể
- Quá trình tái tổ hợp không hoàn chỉnh trong quá trình sinh tinh trùng.
- Bất thường trong quá trình trưởng thành tiền tinh trùng.
- Bất thường tỉ lệ protamine.
- Chết tế bào theo chương trình không hoàn toàn.
- Tác động của các chất oxy hoá trong cơ thể [5],[13].
1.3.2. Nguyên nhân từ bên ngoài cơ thể
- Khoảng thời gian kể từ lúc xuất tinh.
- Tác động của các chất oxy hoá sau khi xuất tinh.
- Giãn tĩnh mạch tinh.

- Nhiễm khuẩn.
- Nhiệt độ tinh hoàn.
- Do thuốc, vaccine và các phương pháp trị liệu khác.
- Tiếp xúc hoá chất độc hại [5],[13].
1.4. Cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng
Đứt gãy DNA tinh trùng do nhiều nguyên nhân gây ra, các nguyên nhân
trên được phân loại thành 6 cơ chế chính, có thể xảy ra trong quá trình sản
xuất hoặc vận chuyển tinh trùng, xuất hiện riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau


14

gây nên đứt gãy DNA tinh trùng [14]. Các cơ chế này được mô tả trong hình
1.1 như sau:

Hình 1.1. Các cơ chế gây đứt gãy DNA tinh trùng [14].
1.4.1. Rối loạn quá trình chết theo chương trình trong sản xuất tinh trùng
Trong quá trình sản sinh tinh trùng, cơ chế loại bỏ tế bào mầm bất
thường được điều chỉnh bởi tế bào Sertoli. Có 50 - 60% tế bào bất thường
được loại bỏ theo cơ chế này. Ban đầu, các tế bào mầm bất thường được nhận
biết, đánh dấu và sau đó bị thực bào bởi tế bào Sertoli [7], [14], [15], [16].
Khi cơ chế trên bị rối loạn, các tế bào mầm bất thường không được tiêu
diệt, tạo ra tinh trùng có DNA bất thường trong tinh dịch người bệnh. Hậu quả
của sự rối loạn này, gây ra sự thay đổi chất lượng DNA giữa tế bào mầm và tế
bào tinh trùng qua quá trình phân chia và biệt hóa. Do vậy, hình thái tinh
trùng có hình thái bình thường thì không có nghĩa là chất lượng DNA tinh
trùng đó cũng bình thường [7], [14], [16].


15

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng ở bệnh nhân nam giới có
oligospermia - ít tinh trùng - thì xác suất một tinh trùng có hình thái bình
thường nhưng DNA đứt gãy cao hơn rất nhiều so với nam giới có số lượng
tinh trùng bình thường. Từ đó có thể kết luận có mối liên quan giữa sự toàn
vẹn của DNA tinh trùng và sự trưởng thành, biệt hóa của tinh trùng đó [14].
1.4.2. Quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng không hoàn chỉnh
Sự rối loạn quá trình tái tổ hợp trong sản sinh tinh trùng có thể là nguyên
nhân dẫn đến sự đứt gãy DNA tinh trùng. Chất nhiễm sắc chứa trong hạt nhân
tinh trùng con người nói riêng và động vật có vú nói chung là một cấu trúc
cực kỳ nhỏ gọn và ổn định. DNA tinh trùng phải được tổ chức một cách đặc
biệt, khác biệt đáng kể so với các tế bào soma, để đạt được trạng thái ngưng tụ
này. Tác giả Ward L. (1997) đã đề nghị một mô hình DNA tinh trùng trong đó
cấu trúc DNA tinh trùng ban đầu bị phá vỡ, các protein histon sẽ được thay
thế bằng protamin [6].

Hình 1.2. Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L. (1997) [6].


16

Do đó, trong quá trình trưởng thành, sự phá vỡ cấu trúc DNA tinh trùng
là hoàn toàn cần thiết, tuy nhiên các vết nứt từ quá trình này nếu không được
phục hồi có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng sau này. Cơ chế này thường
xảy ra ở thời kỳ tiền tinh trùng và làm tinh trùng dễ tổn thương hơn trong quá
trình vận chuyển sau tinh hoàn [14], [17], [18], [19].
1.4.3. Đứt gãy DNA tinh trùng trong quá trình vận chuyển sau tinh hoàn
Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ đứt gãy DNA của tinh trùng
sau xuất tinh cao hơn nhiều so với tinh trùng trong tinh hoàn. Chính bản thân
tinh trùng chưa trưởng thành sản xuất ra một hàm lượng gốc oxi tự do cao, có

thể gây tổn thương DNA ở tinh trùng trưởng thành. Ảnh hưởng của các gốc
oxi tự do này tác động lên tinh trùng chủ yếu trong quá trình vận chuyển sau
tinh hoàn. Vì mặc dù thời gian bán hủy của các gốc oxi tự do rất ngắn, chỉ từ
nano giây đến micro giây, nhưng sự tiếp xúc giữa tinh trùng chưa trưởng
thành và tinh trùng trưởng thành trong ống dẫn tinh và mào tinh đã tạo điều
kiện cho DNA tinh trùng cảm ứng với các gốc oxi tự do [14], [15], [20], [21].
1.4.4. Tác động của caspase nội sinh và enzym endonuclease
Caspase (cysteine - aspartic protease) là enzym đóng vai trò quan trọng
trong quá trình chết tế bào theo chương trình. Endonuclease là enzym giới
hạn, phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không
gây tổn hại đến bases. Sự hoạt hóa enzym caspase và endonuclease bởi các
gốc oxi tự do và các yếu tố lý hóa cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh trùng
[14], [20], [22].
1.4.5. Tác động của tia xạ và hóa chất
Việc tiếp xúc với tia xạ và hóa chất cũng có thể gây ra đứt gãy DNA tinh
trùng. Các phương pháp điều trị ung thư được cho là có ảnh hưởng bất lợi đến
khả năng sinh sản nam và làm giảm số lượng tinh trùng, phát sinh từ các tác


17

dụng độc tế bào của hóa trị hoặc xạ trị trên biểu mô tinh trùng [14], [23]. Một
nghiên cứu của O’Flaherty cho thấy rằng sự toàn vẹn của DNA tinh trùng bị
ảnh hưởng ở bệnh nhân ung thư tinh hoàn và u lympho Hodgkin sau khi hóa
trị [24].
1.4.6. Tác động của chất độc trong môi trường
Nam giới sống trong môi trường có ô nhiễm không khí, nguồn nước... có
tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao hơn do có sự phơi nhiễm với các chất độc
trong môi trường. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng càng tăng khi thời gian phơi
nhiễm càng kéo dài [14].

1.5. Ảnh hưởng của đứt gãy DNA tinh trùng đến khả năng sinh sản ở
nam giới
Theo Sheena Lewis (2013), 80% số cặp vợ chồng vô sinh không rõ
nguyên nhân là do chất lượng tinh trùng quá yếu hay đứt gãy DNA tinh trùng.
Khi DNA đứt gãy tại những vị trí chứa gen liên quan đến khả năng sinh sản
hay sự phát triển, làm tổ của phôi thì khả năng có con rất thấp. Khoảng 25%
bệnh nhân nam vô sinh có mức độ đứt gãy DNA cao [1].
Có 3 mức độ đứt gãy DNA tinh trùng:
- DFI < 15% là tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp.
- DFI 15 – 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng trung bình.
- DFI > 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao [25].
Erenpreiss J. (2006) nhận thấy tỷ lệ có thai tự nhiên gần như bằng không
ở nam giới có DFI > 30% [26].
Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 bệnh nhân vô sinh
nam cho thấy DFI trung bình là 34,0 ± 24,9%, trong đó 79% bệnh nhân có
DFI >15% [27].
Tình hình vô sinh hiện nay đang là vấn đề cấp thiết của xã hội và đang
có xu hướng gia tăng. Theo nghiên cứu của Nguyễn Viết Tiến (2009) thực


18

hiện trên 14.936 cặp vợ chồng trong độ tuổi 15 - 49 ở 8 tỉnh với 8 vùng sinh
thái khác nhau, tỉ lệ vô sinh chung trên toàn quốc hiện ở mức 7,7%, trong đó
vô sinh nguyên phát là 3,9% và vô sinh thứ phát là 3,8%. Nghiên cứu cũng
chỉ ra rằng tỉ lệ vô sinh cao nhất ở Khánh Hoà (13,9%) và thấp nhất là Hải
Phòng (3,8%) [28].
Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Lê Văn Vệ (2009) cho biết tỉ lệ
vô sinh do nguyên nhân hoàn toàn từ phía người chồng là khoảng 40,8%, từ
cả 2 phía là 10,3% và còn 11,5% chưa rõ nguyên nhân [29].

- Mối liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ
Nghiên cứu của Utsuno H. (2013) đã chứng minh đứt gãy DNA có liên
quan đến hình thái bất thường của tinh trùng [30].
Cassuto N.G. (2012) phân tích 10.400 tinh trùng của 26 bệnh nhân và
thấy tồn tại mối tương quan thuận giữa đứt gãy DNA tinh trùng và các thông
số bất thường hình thái tinh trùng [31].
Irvine (2000) cũng nhận định các thông số tinh dịch, đặc biệt là mật độ
tinh trùng có mối tương quan nghịch với tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng [32].
Tuy nhiên, nghiên cứu của Nasrin Sheikh (2008) cho rằng ở nhóm bệnh
nhân vô sinh có mối tương quan nghịch rõ giữa tỷ lệ đứt gãy DNA với khả
năng di động của tinh trùng. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cũng tương quan
nghịch với hình thái bình thường của tinh trùng nhưng không có tương quan
đáng kể với mật độ tinh trùng [33].
Tại Việt Nam, Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Sơn (2017) trên 80 nam
giới vô sinh cho thấy có sự khác biệt về DFI có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm
bệnh nhân có tinh dịch đồ bình thường và bất thường. Cụ thể có mối tương
quan nghịch giữa tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng và tỷ lệ di động tiến tới, vận
tốc trung bình, đồng thời có mối tương quan thuận với bất thường hình thái
tinh trùng. Tuy nhiên các mối tương quan này chỉ ở mức thấp [27].


19

Mã Phạm Quế Mai, Nguyễn Thị Thuý An và cộng sự (2014) nghiên cứu
trên 29 mẫu tinh dịch kết luận tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng tương quan
nghịch với mật độ, tỷ lệ di động tiến tới, tỷ lệ sống và tỷ lệ hình thái bình
thường của tinh trùng [2].
- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng với thất bại của hỗ trợ sinh sản
Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng của bệnh nhân càng cao thì khả năng thụ
thai sau các chu trình hỗ trợ sinh sản càng thấp. Khi DFI > 20%, khả năng

sinh sản của nam giới giảm. Khi DFI > 30%, cơ hội để thụ tinh tự nhiên, thụ
tinh nhân tạo (IVF) hoặc bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) gần như
bằng không, thay vào đó nên lựa chọn phương pháp tiêm tinh trùng vào bào
tương trứng (ICSI) [4].
Qua nghiên cứu, Avendano và cộng sự (2009) nhận thấy tinh trùng di
động tốt và có tỷ lệ hình thái bình thường cao vẫn có nhiều khả năng bị đứt
gãy DNA, đồng thời phát hiện tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường nhưng bị
đứt gãy DNA có mối tương quan nghịch với kết quả thụ thai sau ICSI cũng
như chất lượng phôi [34].
Virro M.R và cộng sự (2004) cho rằng nam giới có DFI > 30% khi thực
hiện hỗ trợ sinh sản có khả năng tạo phôi thấp và có tỷ lệ thất bại cao khi làm
IUI/IVF [35].
Như vậy, DFI có giá trị cao dự đoán vô sinh nam cũng như tỷ lệ thành
công của các phương pháp hỗ trợ sinh sản. Tuy nhiên, việc xác định khả năng
sinh sản của nam giới lại đang được đánh giá chủ yếu bởi những chỉ số trong
tinh dịch đồ như hình thái tinh trùng, mật độ, độ di động… ở hầu hết các bệnh
viện và trung tâm hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam. Điều này giải thích vì sao
bệnh nhân với kết quả tinh dịch đồ bình thường vẫn có khả năng vô sinh cũng
như tỷ lệ có thai sau điều trị còn thấp.


20

- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng đến giãn tĩnh mạch tinh ở nam
giới
A. Zini (2011) cho rằng giãn tĩnh mạch tinh có liên quan đến tỷ lệ đứt
gãy DNA tinh trùng ở nam giới. Bệnh lý này được cho là nguyên nhân dẫn
đến tăng nhiệt độ ở tinh hoàn, gây xơ hóa tĩnh mạch tinh và teo nhỏ tinh hoàn,
gia tăng stress oxi hóa thứ phát, ảnh hưởng đến chất lượng DNA tinh trùng
[36].

C. G. Blumer và cộng sự (2008) đã tiến hành khảo sát trên 16 bệnh nhân
nam giới được chẩn đoán giãn tĩnh mạch tinh độ II và độ III và nhóm chứng.
Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa các chỉ số về tinh dịch đồ giữa
nhóm bệnh và nhóm chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng ở nhóm
bệnh tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [37].
R. P. Bertolla và cộng sự trong một nghiên cứu năm 2006 cũng đồng ý
khi cho rằng không có sự khác biệt về tinh dịch đồ trên bệnh nhân giãn tĩnh
mạch tinh, tuy nhiên tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng lại tăng cao ở nhóm bệnh
nhân này. Từ các kết luận trên, các tác giả đề nghị tăng tỷ lệ đứt gãy DNA tinh
trùng là một yếu tố để hướng đến chẩn đoán và theo dõi điều trị giãn tĩnh
mạch tinh [38].
- Liên quan giữa đứt gãy DNA tinh trùng ở nam giới với sảy thai, thai lưu
Calini T. và cộng sự (2017) nghiên cứu trên 112 cặp vợ chồng có tiền sử
sảy thai nhiều lần nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa tỷ lệ đứt gãy DNA
tinh trùng của nam giới trong nhóm nghiên cứu với nhóm chứng. Chỉ số DFI
có mối tương quan tỷ lệ thuận với tuổi của nam giới và số lần sảy thai. Tuy
nhiên chưa thể khẳng định chắc chắn đứt gãy DNA tinh trùng là nguyên nhân
của sảy thai hay thai lưu tái diễn [3].
Phạm Thị Xuân (2016) đã đánh giá trên 152 cặp vợ chồng có tiền sử sẩy
thai, thai lưu cho thấy 79,3% mẫu tinh dịch của người chồng có DFI > 15%.


21

Nhóm sẩy thai > 2 lần có 100% trường hợp tỷ lệ đứt gãy DNA trung bình
hoặc cao. Tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng tỷ lệ thuận với số lần sẩy thai, thai
lưu và tăng theo tuổi của bệnh nhân [39].
Một nghiên cứu của Robinson L. và cộng sự (2012) trên 2969 cặp vợ
chồng kết luận: ở nhóm nam giới có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng cao thì tỷ lệ
sảy thai cao gấp 3,94 lần so với nhóm có tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp

[40].
1.6. Các phương pháp xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng trên thế
giới
1.6.1. Phương pháp sử dụng các probe thuộc cấu trúc chất nhiễm sắc
- Acridine Orange test (AOT) - phương pháp sử dụng chất nhuộm acridine
orange
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của acridine orange từ màu
xanh (khi liên kết với DNA mạch đôi, không bị biến tính) sang màu đỏ (khi
liên kết với DNA mạch đơn bị biến tính hoặc DNA đứt gãy mạch đơn) [41],
[42].
Ưu điểm: giá rẻ, thao tác đơn giản.
Nhược điểm: Tín hiệu huỳnh quang nhanh mất màu [42].
- Sperm chromatin Structure Assay (SCSA) - phương pháp khảo sát cấu trúc
chromatin tinh trùng
Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này tương tự AOT [12],[42].
Ưu điểm: Có thể định lượng tinh trùng bị đứt gãy DNA hoặc có nhiễm
sắc chất đóng gói chưa hoàn chỉnh, giá rẻ, thao tác đơn giản, được phổ biến
rộng rãi [42].
Nhược điểm: Máy đo dòng tế bào và phần mềm đọc kết quả chuyên dụng
đắt tiền [42].


22

- Toluidine blue (TB) - phương pháp sử dụng chất nhuộm toluidine blue
Nguyên tắc: Khi toluidine blue gắn vào vùng giàu lysine của histone
(tinh trùng chưa trưởng thành) sẽ tạo màu tím đậm, còn khi gắn kết với
protamine toluidine tạo màu xanh nhạt.
Ưu điểm: giá rẻ, thao tác đơn giản.
Nhược điểm: thiết bị đắt tiền, kết quả mang tính chủ quan cao [42].

1.6.2. Các phương pháp phát hiện trực tiếp tinh trùng có DNA bị đứt gẫy
- Terminal deoxynucleotidyl tranferase mediated dUTP nick end labeling
assay (TUNEL) - phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dUTP được
xúc tác bởi enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase
Nguyên tắc: Phương pháp TUNEL định lượng sự gắn kết của dUTP tại
các mạch đôi hoặc mạch đơn DNA bị đứt gãy trong phản ứng được xúc tác
bởi enzyme TdT (terminal deoxynucleotidyl tranferase) [41], [43], [44].
Ưu điểm: Có tính nhạy cao với trường hợp đứt gãy DNA mạch đôi và
mạch đơn.
Nhược điểm: Cần trang thiết bị đắt tiền, độ đặc hiệu thấp [41].
- Phương pháp điện di tế bào đơn (single-cell gel electrophoresis) hay
phương pháp COMET
Nguyên tắc: Điện di tế bào đơn để xác định tỷ lệ và mức độ đứt gẫy
DNA tinh trùng. Hình ảnh tinh trùng bị đứt gẫy DNA thu được dưới kính hiển
vi huỳnh quang có dạng giống hình sao chổi (comet) nên còn được gọi là
phương pháp Comet [45], [46].
Ưu điểm: độ nhạy cao.
Nhược điểm: Tốn nhiều thời gian cho việc phân tích kết quả hình ảnh.
a) Alkaline COMET assay (pH ≥ 12) - phương pháp điện di tế bào đơn
trong môi trường kiềm: Độ nhạy cao, đặc hiệu sự đứt gãy DNA mạch đơn.


23

b) Neutral COMET assay (pH < 9) - phương pháp điện di tế bào đơn
trong môi trường trung tính: Đặc hiệu với đứt gãy DNA mạch đôi
c) 2T - COMET assay: Kết hợp hai phương pháp Alkaline COMET và
Neutral COMET. Đồng thời phát hiện và phân biệt đứt gãy DNA mạch đơn và
mạch đôi trên cùng một cá thể tế bào [46].
1.6.3. Các phương pháp kiểm tra tính ổn định của chất nền nhân tế bào

tinh trùng
- Phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất của tinh trùng (Sperm
chromatin dispersion test - SCD)
Nguyên tắc: Mẫu tinh dịch được cố định trên gel agarose và xử lý bằng
dung dịch acid và muối để loại bỏ các protein nhân. Khi đó DNA của tinh
trùng không bị đứt gẫy sẽ tạo quầng sáng xung quanh lõi nhân tinh trùng khi
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Ngược lại, các tế bào có DNA đứt
gẫy sẽ không tạo quầng sáng [46],[47],[48].
Ưu điểm: Giá thành rẻ, thao tác đơn giản.
Nhược điểm: Kết quả quan sát mang tính chủ quan [46].
Bộ xét nghiệm thương mại Halosperm của hãng Halotech (Tây Ban Nha)
dựa trên nguyên lý SCD, được Fernandez và cộng sự xây dựng năm 2003[47]
và cải tiến vào năm 2005 [48]. Bộ xét nghiệm sử dụng lam kính và thạch để
tạo tiêu bản cố định tinh trùng, sau các bước biến tính DNA, ly giải protein
nhân, rửa nước và khử bằng cồn, tiêu bản cuối cùng sẽ được nhuộm và đánh
giá trên kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần [48]. Đây là một phương pháp
đơn giản, dễ thực hiện, có chi phí thấp hơn so với các phương pháp khác mà
hiệu quả vẫn được đảm bảo. Phương pháp xác định đứt gãy DNA tinh trùng
bằng bộ xét nghiệm Halosperm hiện nay đã được phổ biến rộng rãi ở nhiều
bệnh viện, trung tâm hỗ trợ sinh sản như: Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh


24

viện Phụ sản Trung ương, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Bệnh viện Từ Dũ...
nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn trong chẩn đoán vô sinh nam, các
trường hợp cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai thai lưu nhiều lần, sàng lọc sức
khỏe sinh sản nam giới, kiểm tra trước khi thực hiện hỗ trợ sinh sản, chẩn
đoán và theo dõi điều trị giãn tĩnh mạch tinh... Tuy nhiên, bộ xét nghiệm này
hiện tại vẫn phải nhập ngoại hoàn toàn, chi phí phụ thuộc rất nhiều vào nhà

cung cấp cũng như vận chuyển. Do đó, khi đến với bệnh nhân, xét nghiệm
này có giá thành khá cao so với mặt bằng bệnh nhân Việt Nam [49].
1.7. Các tiêu chí đánh giá bộ xét nghiệm theo Tiêu chuẩn Việt Nam hiện
nay
1.7.1. Độ chính xác
Độ chính xác bao gồm độ đúng và độ chụm:

Hình 1.3: Độ chính xác [50]
 Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập

quanh trị giá trung bình.
Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ
lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ
số biến thiên càng lớn.


25

Độ chụm có thể được phân ra thành ba trường hợp sau:
- Độ lặp lại (repeatability)
Thể hiện mức độ chính xác hay mức độ lặp lại, mức độ dao động giữa
các kết quả thực nghiệm được thực hiện trong:
Cùng một phòng thí nghiệm.
Cùng một mẫu thử đồng nhất.
Cùng một kỹ thuật viên.
Cùng một khoảng thời gian.
- Độ chụm trung gian (intermediate precision)
Biểu thị độ chính xác của phương pháp theo các biến số của phòng thí
nghiệm tại:
Trong nhiều ngày.

Với kỹ thuật viên khác nhau.
Với các dụng cụ khác nhau.
- Độ tái lập (reproducibility)
Biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu
trên cùng một mẫu đồng nhất. Tương tự như độ lặp lại với điều kiện:
Phòng thí nghiệm thay đổi.
Thay đổi phương pháp [50].
 Độ đúng: chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm

và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng μ [50].
1.7.2. Độ nhạy và độ đặc hiệu
Giá trị của một phương pháp chẩn đoán luôn luôn liên quan tới phương
pháp đối chiếu (thường là phương pháp tốt nhất hiện có dùng để chẩn đoán
xác định). Chất lượng của phương pháp phát hiện bệnh không hoàn toàn cố
định mà có sự thay đổi, tùy thuộc vào tỷ lệ hiện mắc bệnh của quần thể, tùy
thuộc vào sự phối hợp của các xét nghiệm khác nhau.