Nghiên cứu khả năng phân giải độc tố vi khuẩn lam của vi khuẩn trong môi trường nước hồ phú dưỡng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN

■

Nghiên cứu khả năng phản giải độc tồ vi
khuẩn lam của vi khuẩn trong môi trường
nước hồ phú dưỡng

MÃ SÔ:QT-07-53
CHỦ TRÌ ĐỂ TẢI: THS. PHAM TH I MAI

63.7
«-M
007
M00001

I

,

HÀ NỘI - 2007


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI
KHOA HỌC
T ự• NHIÊN
• HỌC
*
•

Nghiên cứu khả năng phân giải độc tô vi
khuẩn lam của vi khuẩn trong môi trường
nước hồ phú dưỡng

MÃ SỐ:QT-07' 51
CHỦ TR Ì ĐỂ TÀI: THS. PHAM TH I MAI
CÁC CÁN BỘ THAM GIA: THS. NGUYÊN KIỂU BẢNG TÂM
KTV. ĐẶNG M INH HÀ

HÀ NỘI - 2007
c Ạl H Ọ C Q U Ộ C GIA HA NỘI
TPUNG TÁM THÔNG tin thư VIỆN

d 0 0 b ũ C C Ít'C J


BÁO CÁO TÓM TẮT

Đ ề tài:

Nghiên cứu khả năng phân giải độc tố vỉ khuẩn lam của
vỉ khuẩn trong môi trường nước hồ phú dưỡng
Mã sỐ:QT-07-53
Chủ trì đề tài: ThS. Pham Thi Mai
Các cán bộ tham gia: Ths. Nguyễn kiều băng tâm
KTV. Đặng Minh hà

Mục tiêu nghiên cứu:
Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, nhưng

kèm theo đó là sự ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng. Nhiều thủy vực
của thủ đô cũng đã và đang bị phú dưỡng. Quá trình này diễn ra bởi môi
trường nước dư thừa muối dinh dưỡng, dẫn tới sự phát triển quá mức của các
loài tảo và gây ra sự biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ sinh thái hồ. Sự
gia tăng thành phần và mật độ của một số loài tảo, đặc biệt là những loài tảo
lam gây độc đã tạo nên sự lo ngại về môi trường sống cho khu hệ động thực
vật trong hồ. Trong số các loài tảo gây ra hiện tượng nở hoa nước hổ có một
số loài tảo lam gây độc như Microcystis aemginosa Kutzing. Thực tế đã cho
thấy hiện tượng nước nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh,
động vật và con người. Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng phân giải
độc tố vi khuẩn lam trong các hổ phú dưỡng bằng các chung vi khuẩn để
góp phần bảo vệ môi trường nước và khu hệ thủy sinh vật trong đó.

Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập một số chủng vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa trong nước hồ
Hoàn Kiếm và lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp
- Phân lập và tuyển chọn 1 số chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải độc tố
cao từ môi trường đât và nước hồ.
- Thư nghiệm khả năng phân giải độc tố của các chủng vi khuẩn phân lập
được

Các kết quả đạt được:
1. Từ các mẫu nước ở Hồ Hoàn Kiếm, đã phân lập thuần khiết được 6
chủng vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis.
2. Môi trường thạch agarose B I2 thích hợp nhất cho việc phân lâp
Microcystis.


3. Microcystis phát triển tốt nhất trong môi trường dịch thể J với mật
độ đạt 26 X 106 tế bào/ml ở ngày thứ 12, sau đó đến môi trường Bold 3N với

mật độ đạt 24 X 106tế bào/ml và cuối cùng đến môi trường B I2 với mật độ
10,9 X 10è tế bào/ml.
4. Hàm lượng độc tố microcystin có trong các chủng vi khuẩn lam thu
được ở hồ Hoàn Kiếm là 10 |ug/800mg sinh khối khô.
5. Đã tuyển chọn từ các mẫu đất và nước hồ được 3 chủng vi khuẩn
MM, NN1 và NN2 có khả năng phân giải độc tố microcystin. Trong đó
chủng MM có khả năng phân giải mạnh nhất. Với nồng độ 2 |ug/l, thời gian
bán phân giải là 0,052 ngày (tương đương 1 giờ 14 phút). Với nồng độ
microcystin lớn gấp 5 lần (10 p.g/1) thời gian bán phân giải là 0,128 ngày
(tương đương 3 giờ 4 phút). Như vậy chủng MM có khả năng phân giải độc
tố microcystin mạnh nhất.
6.
Dựa vào các đặc điểm nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa và đồng dựa vào
khóa phân loại của Bergey chúng tôi sơ bộ phân loại 2 chủng NN1, NN2
thuộc chi Bacillus còn chủng MM thuộc chi Sphingomonas.

Tinh hình kinh phí của đề tài:
Đã chi theo dự toán và đã quyết toán xong với phòng tài vụ của trường.
KHOA QUẢN LÝ
(Ký và ghi rõ họ tên)

CHỦ TR Ì ĐỂ TÀI
(Ký và ghi rõ họ tên)

C ơ QUAN CHỦ T R Ì ĐỂ TÀI


ABSTRACT OF PROJECT

1. INTRODUCTION

Hanoi city has been developing rapidly in recently. Beyond of developing
industrial that improved quality of life living, the pollution of this city is being
serious as garbage, waste of animal and human, waste water... espeđally, water
sources are also polluted very seriously.

Hoan kiem lake, where is one of famous

places in the city was also as stated above. In where, water quality is changing from
bad to worse. That leads to disordered development of Cyanobacteria species inside
micro -Algal flora. The rapid development of toxic Cyanobacteria has been
replacing endemic algal species. Thus, the toxic in the lake has been increasing, that
will threaten to the đestabilization of bio-ecology in there.
Among these blooming algal species, there is one toxic Cyanobacterìa species
as Microcystis aeruginos (Kutzin), which can produce hepatotoxin composed cyclicchains peptide so-called “microcystin”. It is accumulated within intemal algal cells
or is released into water. Microcystin enables to inhibit the PP1 and PP2A
phosphatases enzymes as well as serine and threonine phosphatase enzymes. There
are some researches that have demonstrated blooming phenomena of Cyanobacteria
in water, which caused harmful to aquatic organisms as well as animal and human.
To investigate to study of Cyanobacteria species, we focus on study on toxin ỉysis in
blue-green algae

by some straỉns bacteria isolated in euthophic lake water

envỉroment

2. THE AIM OF PROJECT
Investigation into toxin lysis in blue-green algae by some bacteria, at eutrophic lake
aiming at the protection of water enviroment and it’s aquatic system.

3. BRIEF RESULT
- Isolation of some strains of blue-green algae in Hoankiem lake and selection of
suitable culture medium.
- Isolation and screening of some strains o f bacteria possessing high toxin lysis
activity from soil and water
- Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated.
- Identiílcation of Microcystis isolated.
- Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC.
- Capacity of toxin degradation by fresh bacteria

4. RESƯLTS
- Pure isolation 6 strain blue-green algae belonged to Microcystis from Hoan
Kiem lake.
- J medium were the well growth Microcystis with density yielded 2 6 x l0 6/ml
at the 12 day.
- Microcystin toxin content in Microcystis in Hoan Kiem lake water, was 10
microgram/800dried biomass.
- Screening of 3 bacteria strains prossessing microcystin toxin lysis. Among
which, MM strain was best with 2 microgram density, and time for hole
decomposition was 0.052 day (Equivalent 1 our and 14 minute).


Muc luc
Muc luc
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.

1.5.
1.6.
1.7

Hiện tượng phú dưỡng
Vi khuẩn lam gây độc
Các loại độc to của vi khuẩn lam
Anh hưởng của độc tổ vi khuẩn lam tới người và gia súc
Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân giảiđộc tố microcystin
Cơ chế phân giải độc tố microcystins của vi khuẩn
Những nghiên cứu về khả năng phân giải microcystins

1
2
3

3
3
5
8
9
11
14

Chương 2. Đối tượng và phương pháp Nghiên cứu

15

2.1. Đối tượng Nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu

15
15

Chương 3. kết quả và thảo luận

18

3.1. Nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn lam Microcystis
3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả
năng phân giải microcystin

18
22

Kết luận và kiến nghị

27

Kết luận
Khuyến Nghị:
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

27
27
28
30

1

Mở đầu

Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, nhưng kèm theo đó
là sự ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng. Nhiều thủy vực của thủ đô cũng đã và đang bị phú
dưỡng. Quá trình này diễn ra bởi môi trường nước dư thừa muối dinh dưỡng, dẫn tới sự phát triển
quá mức của các loài tảo và gây ra sự biến đổi cấu trúc thành phần loài của hệ sinh thái hồ. Sự gia
tăng thành phần và mật độ của một số loài tảo, đặc biệt là những loài tảo lam gây độc đã gây nên
sự lo ngại về môi trường sống cho khu hệ động thực vật trong hồ [1, 2, 5,7, 10, 12]. Trong số các
loài tảo gây ra hiện tượng nở hoa ,nước hồ có một số loài tảo lam có khả nãng_gây độc như
Microcystis aeruginosa Kutzing. Loài M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin(độc tố
gan), cấu tạo từ các peptiđ mạch vòng được gọi là microcystin [18, 19, 25, 28, 31]. Thực tế đã
cho thấy hiện tượng nước nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con
người [20,21,22,25,26]. Để góp phần bảo vệ môi trường nước và khu hệ thủy sinh vật trong các
lìồ phú dưỡng, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiền cứu khả năng phân giải độc tố vi khuẩn lam
của vi khuẩn trong môi trường nước hồ phủ dưỡng “

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.Hiện tượng phú dưỡng
Sự phú dưỡng được nhận biết vào giữa thế kỷ 20 như là vấn đề gây ra ô nhiêm nguôn nước
tại các hồ và hồ chứa vùng Đông âu và Bắc Mỹ. Kể từ đó vấn đề này ngày càng trở nên rộng khắp
trên khắp thế giới. Nó không những làm giảm giá trị môi trường sống trong các thuỷ vực mà còn
ảnh hưởng trực tiếp tới việc sử dụng nguồn nước. Những nghiên cứu gần đây cho thây ở vùng
Châu á - Thái Bình Dương có 54% hồ bị phú dưỡng. Tỷ lộ đó theo thứ tự ở Châu âu, Châu Phi,
Bắc Mỹ và Nam Phi là 53%, 28%, 48%, và 41% [20]. ở bất cứ thủy vực nào có^điều kiện nhiệt
độ, ánh sáng và hàm lượng chất dinh dưỡng cao đều có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của

một số loài tảo, tạo ra hiện tượng nở hoa nước [22, 23, 38]. Tại các thuỷ vực phú dưỡng, vi khuẩn
lam thưòng chiếm ưu thế trong các loài thực vật nổi vào mùa hè. Sinh khối của vi khuẩn lam khi
phát triển mạnh có thể làm ảnh hưởng đến vấn đề thẩm mỹ và giải trí{ tạo váng trên bề mặt và
mùi khó chịu), ảnh hưởng đến vị khi xử lý nước hồ chứa thành nước sinh hoạt. Mặt khác, các hoạt
động sống của vi tảo cũng như sự phân huỷ sinh khối của chúng đã tiêu tốn oxy trong nước, đồng
thời hình thành các khí NH,, H2S gây hại đến các thuỷ sinh vật [20].
Trong tế bào nhiều loài vi khuẩn lam sống phù du trong nước có chứa không bào khí nội
bào đặc biệt, cho phép điều chỉnh được khả nãng nổi của chúng và như vậy chúng có thể tìm được
độ sâu cột nước thích hợp tối ưu cho sinh trưởng [20]. Như vậy, đặc biệt khi thời tiết thay đổi từ
bão tố sang biển lặng, nhiều tế bào hoặc tập đoàn tảo nổi lên trên và gió đưa chúng vào vùng ven
bờ, tập trung với mật độ cao tạo thành đám trông như màu sơn xanh. Hiện tượng này có thể thay
đổi nhanh chóng trong vài giờ hoặc có thể giữ không đổi trong vài tuần, thậm chí đến hàng tháng,
đặc biệt tại các thuỷ vực tĩnh hoặc kín gió. Khi các tế bào bị khô hoặc chết đi, sẽ giải phóng ra
nội chất vào trong nước [2 0 ].

1.2.

vi khuẩn lam gây độc

Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xưa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau như: thực vật phân
cắt (Sclùzophyceơe), tảo nhầy (Myxophyceơe), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam
(iCvcinobacteriơ). Từ năm 1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm sinh vật chưa có
cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình.
Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trên trái đất, đa số sống trong nước ngọt, một sô trong thuỷ vực
nước mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nước lợ [8 ]. v ề mặt phân loại, vi khuẩn lam được chia
thành 4 bộ (Cliroococcales, Chamaesiphonaỉes, Nostocơles, Srigonematơles)[8]. Các chi vi
khuẩn lam có khả năng gây độc là: Coelosphaerium, Gomphosphaevia, Microcystis,
Synechococcus, Synechocystis, Lyngbya, Osciìỉatoria, Schizothrix, Anabaena, Anabcienopsis,
Cyìindropermum, Scytonema[6,8 ] , trong đó chi thường gập khi nước hổ nở hoa là Microcystis.
Có ít nhất 46 loài đã được chứng minh là gây độc cho động vật có xương sống. Các loài vi khuẩn

lam gây độc phân bô' trong nước ngọt chủ yếu là Microcystis aeruginosa, Cyỉindrospermopsis
raciborskii, Planktothrix (hay còn gọi là Oscillatovia) rubescens, Planktoíhrix agavdhn,
Osciììatoria ỉimosa, Anabaena fìos-aquae, Lyngbya woìlei. [19, 20].

2


Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân b ố của chúng ỉ 20]
Tham khảo từ
Nơi phát
các tác giả
Loại độc tố
sinh
Loài
Anabaena
spp.
(jĩosaquae,
lemmermannii,
circinalis)

Microcystins

Fỉnland

Sivonen et a i, 1990b; 1992a

Attabaena circinalis

Microcystins

France

Vezie et a ỉ 1998

Anabaena flo$-aquae

Microcystins

Norway

Sivonen et al., 1992a

Microcystis aeruginosa

Microcystins

Worldwide Several; see Rinehart et al.,
1994 for a summary

M. virìdỉs

Microcystins

Japan

Kusumi
et
al.,
Watanabe et al., 1986

M. botrys

Microcystins

Denmark

Henrikseii et al., 1996b

Planktothrìx agardhii

Microcystins

China

Ueno et al., 1996a

p. agardhii

Microcystins

Norway

Krishnamurthy et al., 1989;
Meriluoto et al., 1989

Oscillatoria limosa

Microcystins

Switzerland Mez et aỉ.f 1996

Nostoc sp.

Microcystins

England

Beattie et ah, 1998

Anabaenopsis millerii

Microcystins

Greece

Lanaras and Cook, 1994

Haphalosiphon hibernicus
(soil isolate)

Microcystins

USA

Prinsep et a i, 1992

Australia

Baker and Humpage, 1994;
Jones et al., 1994

Nodularia spumigena

Nodularins

1987;

Áphaniiom enon
ovalisporum

Cylindrosperm opsin Israel

Banker et aỉ., 1997

Cylindrospermopsis
raciborskii

Cylindrospermopsin Australia

Hawkins et al., 1985; 1997

Umeiakia natans

Cylindrospermopsin Japan

Harada et a l, 1994

Anabaena flos-aquae

Anatoxin-a

Canada

Carmichael et aL,
Devlin et aỉ., 1977

Anabaena blooms

Anatoxin-a

Germany

Bumke-Vogt, 1998

Anabaena sp.

Anatoxin-a

Japan

Park et a i, 1993a

Á pham tom enon sp.

Anatoxin-a

Pinland

Sivonen et a l, 1989a

Aphanizom enon bloorns

Anatoxin-a

Germany

Bumke-Vogt, 1998

Cyỉindrospermum sp.

Anatoxin-a

Finland

Sivonen et ai., 1989a

Microcystis sp.

Anatoxin-a

Japan

Park et a l, 1993a

Pỉanktothrix sp.

Anatoxin-a

Finland

Sivonen etal., 1989a

Homơanatoxin-a

Norway

Skulberg et al., 1992

Pỉanktothrix / 'ormosa

1975;

3


Nơi phát
sinh

Loại độc tố

Loài

Tham khảo từ
các tác giả

Anatoxin-a(S)

Canada

Matsunaga et al., 1989;

Mahmood and Carmỉchael,
1987

Anatoxin-a(S)

Denmark

Henrỉksen et al., 1997;
Onodera et al., 1997a

Saxitoxins

Australía

Humpage et al., 1994; Negri
et al., 1995; 1997

Saxitoxins

USA

Jackỉm and Gentile, 1968;
Ikawa et a l 1982; Mahmood
and Carmichael, 1986

Cylindrospermopsis
raciborskii

Saxitoxins

|6razil
ị

Lagos et al., 1997

Lyngbya wollei

Saxitoxins

ÌUSA

Carmichael et al.,
Onodera et al., 1997b

‘A rtabaena flos-aquae

A. lem mermannii

I

Anabaena cỉrcỉnaỉis
i
Aphanizom enon
aquae

flo s -

1

1997;

1.3. Các loại độc tố của vỉ khuẩn lam
Độc tô' vi khuẩn lam phổ biến nhất là độc tố gan (hepatotoxin) và độc tố thần kinh
(neurotoxin). Một số loài vi khuẩn lam có chứa cả hai loại độc tố trên.
1.3.1. Microcystins (MC) [20,42]

MH
\
//
HN

NH?

Hình ỉ .l . Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố Microcystin

4


MC là độc tố vi khuẩn lam được gặp phổ biến và rộng rãi nhất. Hợp chất này được tách ra đầu
tiên từ loài vi khuẩn lam Microcystis aeruginos, do vậy được gọi là microcystins. Chúng la cac
heptapeptide mạch vòng có chứa 1 amino axit đặc hiệu (ADDA) chuôi bên [28]. Cho đen nay,
đây là những dạng cấu trúc chỉ gặp ở Microcystins và Nodularin- một loại pentapeptit vong cua VI
khuẩn lam ở trong nước lợ. Người ta đã biết khoảng 70 loại độc tố microcỵstins khác nhau, trong
đó microcytin LR (MLR) được tìm thấy phổ biến nhất ở các loài vi khuẩn lam. Các tài liệu đã
chứng minh rằng việc nở hoa của Microcystis aeruginosa chứa độc tô microcystin có mặt trên
toàn cầu. Độc tô được tổng hợp và tích luỹ trong tê bào vi khuẩn lam nhưng khi nở hoa và tiêu
giảm tế bào thì chúng được giải phóng vào những vùng nước xung quanh. Các kênh gãn axit mật
được tìm thấy trong tế bào gan là con đường cho phép MC đi vào trong cơ thể. Đối với động vật
có xương sống, liều lượng gây chết của MC sẽ làm cho gan bị hoại tử trong thời gian vài giờ hoặc
vài ngày, Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nước uống là nhân tô gây ra ung

thư gan ở người [17]. Các nghiên cứu cơ chê độc học tế bào đã cho biêt MC ảnh hưởng đến các
cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung
thư của chúng. Độc tô cũng gây ảnh hưởng xấu đến hai loại emzyme là serine - photphatase và
threonin - photphatase liên quan đến sự điều hoà phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote) ơ
mức độ phân tử. Trong trường hợp nước nở hoa bởi Microcystis, thì microcystin ở dạng không
hoà tan, khá bền vững, sẽ có thể tồn tại vài tuần trước khi bị phân giải sinh hoc
1.3.2. Độc tồ thần kinh (Neurotoxins) [20,42]

NH
Ị
HN

ỷ

\

NH2

Hình 1.2. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tố thần kinh Neurotoxins
Dựa theo đặc tính tác động, người ta chia làm ba loại độc tố thần kinh có tiềm năng gâv tử
vong do chúng làm cho nạn nhân bị nghẹt thở. Đó là anatoxin-a., anatoxin-s gây ra chứng chuột
lút (cramp) và saxitoxin gây ra chứng liệt (paralysis). Saxitoxin và anatoxin-a(s) là các chất độc
thần kinh tiêu biểu đã được nhận biết. Tuy nhiên, chúng thường không có mặt và tích luỹ liên tục
như MC. Cho đến nay người ta mới chỉ phát hiện ra anatoxin-a trong 1 số ít tảo Anơbaena nở hoa
ở Bắc Mỹ. Hơn nữa độc tố của chúng cũng hiếm khi đạt mức gây hại nặng cho người thông qua
dường ăn uống. Nếu hấp thụ phải một lượng độc tô' thần kinh dưới ngưỡng chết thì hoàn toàn có
thể phục hổi được và cho đến nay người ta không thấy có các di chứng ảnh hưởng lâu dài. Vì lý
do này mà dộc tố thẩn kinh được sử dụng làm chỉ tiêu báo động cho khả năng sử dụng nước có

5

chứa vi khuẩn lam dùng cho mục đích bơi, lội, lặn. Ngược lại, tính độc thần kinh đã được kiểm
chứng ở gia súc và các con vật nuôi, đặc biệt là chó do chúng uống phải nhiều nước nhiễm bẩn.

Hình ỉ .3. Mô hình cấu trúc hoá học của
độc tố thần kinh Anatoxin-a (s)
H.

.0 .

0

p.2n;

V

+■
:N ĩb

Y

Hình 1.4. Mô hlnh cấu trúc hoá học của độc
tố thần kinh Anatoxin-a
Anatoxin-a
(s) là
chất
ức chế
organophosphate cholinesterase duy nhất
gặp được trong tự nhiên và chúng gây cho

bệnh nhân bị chảy nước bọt (salivation)
(chữ "s" là chữ cái đầu trong từ
salivation), chuột rút, run, ỉa chảy, nôn
mửa và đặc biệt là gây chết nhanh chỉ
trong vài phút.

ưH
12

/Ỹ -O H

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hoá học của độc
tố thần kinh Saxitoxin
1.3.3 Cylindrospermopsin (CP) [20,42]
CP là một loại Alkaloit ổn định trong bosng tối. Đây là loại độc tố tế bào thường gắn với quá
trình tổng hợp protein, triệu chứng lâm sàng đầu tiên là gây tai biến ở thận, gan và tro nên nguy
cấp chỉ sau vài ngày tiếp xúc với chất độc.

6


H

OH
H Ị1

0

O3SO

Me
H \---- NH

0

Hìnhl.6. Mô hình cấu trúc hoá học của độc tô' Cylindrospermopsin
1.3.4 Dermatotoxic alkaloids - aplysiatoxins và lyngbyatoxin[20, 42]
Vi khuẩn lam sống ở biển như Lyngbya, Osciỉlatoria và Schiĩothrix có thể sản sinh độc tố gây
ra bệnh viêm da cấp cho người bơi khi tiếp xúc với roi của chúng. Hoạt động gây ra viêm của
Lyngbya được gây ra bởi aplysiatoxins và debromoaplysiatoxin, độc tố có khả năng làm cho phát
triển mạnh các khối u và kích hoạt proteinase c (Mynderse et aì., 1977; Fujiki et ơ i, 1990).
Debromoaplysiatoxin cùng với các hợp chất độc tố khác cũng đã được phân lập từ các chủng
khác thuộc bộ Oscillatoriaceae, như Sclĩizothrix cơlcicoỉa và Osciìlatoria nigrovìridìs.
1.3.5. Độc tố gây kích thích Lipopolysaccharides (LPS) [20]
Weise là nhóm nghiên cứu đầu tiên tách được LPS từ vi khuẩn lam Anacystis nidnìans.
Lipopolysaccharides thường được tìm thấy ở màng ngoài của thành tế bào của vi khuẩn Gram âm,
bao gồm cả Vi khuẩn lam. Chúng là chất gây sốt và chất có độc. Lipopolysaccharides là sản
phẩm cô đặc từ 1 đường, thường là hexose, và 1 lipid, thông thường là 1 hydroxy C l4 - C |S acid
béo. Lipopolysaccharides gây kích thích, phản ứng gây dị ứng cho con người và mô động vật khi
tiếp xúc với các hợp chất của chúng tiết ra.

1.4. Anh hưởng của độc tô vi khuẩn lam tới người và gia súc
Có rất nhiều nghiên cứu cho thấy động vật bị ngộ độc do uống nước có chứa vi khuẩn lam gây
độc. Báo cáo đầu tiên vào năm 1800 về hiện trạng gia súc bị chết do uống phải nước có chứa vi
khuẩn lam gây độc. Chất độc này tác động lên đường bài tiết, gây dị ứng da, ảnh hưởng tới màng
nhầy ruột hoặc làm con vật bị ốm. Hiện tượng dị ứng qua da hoặc kích thích da nổi ngứa do nước
chứa các loài vi khuẩn lam khác nhau như Anabaena, Aphơnizomerzon, Nodularia, Oscillơtoria,
Gỉoeotncìùa cũng đã được biết đến. Các vận động viên khi bơi, đã giữ lại các tế bào vi khuẩn
lam trên da, khi cọ sát, các tế bào bị vỡ và giải phóng độc tố, gây tác động lên da [2 0 ].
Năm 1959, ở Canada mặc dù đã có gia súc bị chết và được cảnh báo về nguồn nước sử dụng,

song người ta vẫn bơi trong một hồ có chứa nhiều vi khuẩn lam. Kết quả có 13 người bị ốm, đau
đầu, đau cơ, ỉa chảy nặng. Trong dịch tiết của một bệnh nhân người ta đã phát hiện ra một sô'
lượng lớn tế bào Microcystis spp., và một số đoạn sợi tảo Anabaena circinơlis [23].
Nãm 1979, ờ úc để ngăn chặn sự nở hoa của Cylindropermopsis raciborskii trong nguồn
nước uống ở Palm Island, người ta đã xử lý chúng bằng đồng sunfat. Điều này đã làm cho độc tố
trong tế bào được giải phóng gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng và làm 141 người phải nhập viện
[36]:

7


Năm 1988, ở Brazil tiếp sau trận lụt do vỡ con đập Itaparica thuộc bang Bahia, có khoảng
2000 ca bệnh về đường tiêu hoá sau 42 ngày và có 88 người đã chết. Các điều tra nguyên nhân
sau đó cho biết có hàm lượng độc tố vi khuẩn lam rất cao [20].
Năm 1989, ở Anh có 10 trong số 20 lính đã bị ốm sau khi bơi và tập trong nước bị ô

nhiễm bởi vi khuẩn lam Microcystis spp., hai trong số họ đã bị viêm phổi nặng do hít phải độc
tố từ Mỉcrocystis và đã phải nhập viện [21].
Nãm 1993, ở Trung Quốc một số ca bệnh ung thư gan được chẩn đoán là cóliên quanđến việc
sử dụng nước uống trên bề mặt bị nhiễm nhiều vi khuẩn lam [2 0 , 2 2 ].
Năm 1994, ở Thuỵ Điển do quản lý không tốt nguồn nước chưa được xử lý nhà máy đường,
nên khi chảy ra nó hoà lẫn vào nước sông. Điều này khiến loài vi khuẩn lam Pỉanktothrix
agơrđhii đã phát triển mạnh tạo nên hiện tượng nở hoa nước. Kết quả phân tích cho thấy rằng loài
này chứa độc tố microcystin. Trong tổng số 304 nông dân sử dụng nguồn nước này thì có 121
người, kể cả động vật nuôi của họ đã bị tiêu chảy, viêm cơ [2 0 , 2 2 ].
Năm 1995, ở úc, kết quả điều tra với 852 bệnh nhân tiếp xúc với nước có chứa vi khuẩn
lam
cho Ihấy rằng sau 2 -7 ngày nhiều bệnh nhân bị mắc tiêu chảy, sốt dị ứng da, cúm, các triệu
chứng tăng dần lên nếu bệnh nhân tiếp xúc nhiều với nước và mật độ vi khuẩn lam caot. ở Monte
Hermosa (Achentina) vào tháng 11/1995 đã có 45 triệu con ngao Mesoderma marcoides đã bị

chết do sự nở hoa của tảo gây hại gây nên. Cũng vào năm này ở Việt Nam, loài Noctiluca
scintilans nở hoa ở khu vực vịnh Vân Phong - Khánh Hoà vào tháng 5 và ố đã làm chết 20 tấn
tôm hùm với thiệt hại lên đến 6 tỷ đồng [5, 6 , 12].

1.5. Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải độc tô microcystin
1.5.1. Sphingomonas
Spìùngomonas là một vi khuẩn gram âm, dị dưỡng, hoàn toàn hiếu khí và sinh sắc tố màu xanh
hoặc vàng nhạt. Chúng có khả năng di động rất nhanh nhờ các lông roi và đa số có khả năng phát
quang dưới ánh sáng cực tím. Sphingomonas được tìm thấy phổ biến trong môi trường tự nhiên
bao gồm trong nước (nước ngọt và nước mặn), trong rễ cây, các mẫu xét nghiệm bệnh và nhiều
nơi khác.
Sphingomonas bao gồm hơn 20 loài, các loài
khác nhau ở đặc tính phát sinh chủng loại, sinh thái
học và sinh lý học. Sphỉngomonas được chia nhỏ ra
thành 4 chi là Shingomonas, Sphingobium,
Novosphingobium và Sphingopyxis. Sphingomonas
khác biệt với 3 chi kia bởi thành phần lipit của nó.
Sphỉngomonas không những làm suy biến mono - và
disaccarit mà còn có thể làm suy biến polysaccarit.

ảnh 1.1. Sphingomonơs
Sphingomonas là chi duy nhất sở hữu ubiquinone 10 như là quinone để hô hấp và
glycosphingolipiđs (GDLs) thay thế cho lipopolysacchharide (LPS) trong màng tế bào. Màng tế

8


bào của Sphingomonas bao gồm protein, photpholipid, quinone để hô hấp và màng ngoài chứa
glycosphingoỉipid (GSLs) (theo Balkwill). GSLs giữ một vị trí giống như LPS trong vi khuẩn gam
âm và xuất hiện với nhiểu chức năng giống nhau như là một trở ngại đối với các thực thê kháng

khuẩn, Cũng do phần hyđrocacbon của GSL ngắn hơn của LPS nên bề mặt tê bào của
Sphingomonas có nhiều hydrophobic hơn của vi khuẩn gam âm khác. Đây có thể là một lý do
giải thích cho việc loài vi khuẩn này có khả nãng làm giảm các hydrocacbon thơm đa
hydrophobic và tính nhạy cảm của nó đối vói việc ngăn các kháng khuẩn hydrophobic. Nhiểu
nghiên cứu đã cho thấy trong môi trường bị ô nhiễm, Sphingomonas có khả năng sử dụng chất
gây ô nhiễm và làm nguồn năng lượng để có thể cạnh tranh được với các sinh vật khác trong các
môi trường khác nhau. Sự phân bố rộng rãi của Sphingomonas là do có khả năng sử dụng nhiểu
các hợp chất hữu cơ, đo vậy, chúng có thể sinh trưởng và sống sót dưới các điều kiện dinh dưỡng
thấp.
1.5.2. Bacillus
Vi khuẩn Bacillus thuộc họ Bacillaceae. Bacillus là vi khuẩn gram dương, hình que, kích thước
khoảng 0,5 - 2,5 X 1,2 - 10|am, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, có khả nãng di động bởi
màng lông rung. Chúng thường sắp xếp thành cặp hoặc thành chuỗi. Đặc điểm phân biệt họ vi
khuẩn này ỉà sự sinh nội bào tử, có dạng cấu trúc không hoạt động khi khúc xạ cao trong tế bào vi
khuẩn.
Baeilìus là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, chiếm ưu thế trong môi trường đất, có
khả năng ký sinh và tạo ra các chất kháng sinh. Ngoài ra chúng còn có thể chống lại những điểu
kiện bất lợi về nhiệt độ, pH và độ mặn cũng như là có tính độc đối với các loại côn trùng và mầm
bệnh.

B.ọlveli.

•

B.brevis

.

B.cereus,

.'Btcircula/ỉs
% ciI

- B.cọagulans ,

ảnh 1.2. Các loài vi khuẩn Baciỉhis
Bacillus brevis
Bacillus brevis là vi khuẩn BaciUus gram dương được tìm thấy phổ biến trong đất, không
khí, nước và chất đang phân huỷ. Chúng có cấu tạo hình que dài, sinh nội bào tử với chiều dài 3,5
- 6,0j.im, đường kính 0,7}im. Nội bào tử có hình elip và nằm ở cuối nang bào tử phình ra. Khuẩn
lạc màu đực, tròn và phẳng với rìa nham nhở [14].
Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của Baciỉỉus brevis là 35 - 55nc. Nội bào tử của chúng có thể di
động với hoạt tính catalaza và oxidaza. Loài này liên quan đặc biệt đến các bệnh lây nhiễm.
Baàlỉus brevis có khả nãng sinh các chất kháng sinh, bao gồm Gramicidin và Tyrocidine.
Gramicidin có tác dụng chống lại các vi khuẩn gram dương. Chúng được cấu tạo từ một chuỗi
protein dài gồm 15 amino axit. Gramicidin tạo thành các đường dẫn nước ở ngoài màng của vi
khuẩn, chúng là các protein nối các màng lipid sinh học và cho phép các phân tử hay ion đặc biệt

9


đi từ mặt này sang mạt kia. Mặc dù Gramicidin có thể có rất nhiều dạng xoắn ốc khác nhau phụ
thuộc vao cac điều kiện dung môi nhưng nó thường tồn tại dưới các dạng cấu tạo đơn với cấu
trúc khá bền trong màng lipid và mixen. Những hoạt động của vi khuẩn có Gramicidin là kết quả
của việc tãng khả năng thâm của thành tế bào cho phép các cation vô cơ đi qua, từ đó làm giảm

Sự chênh lệnh nồng độ ion giữa tế bào chất và môi trường ngoại bào.

ảnh ỉ 3. Bacillus brevis

Hình 1.4. Gramicidỉn

1.6. Cơ chế phân giải độc tô microcystins của vi khuẩn
Microcystins là chuỗi peptide mạch vòng, có độ ổn định và có thể chịu được thuỷ phân hoá học
hoặc oxy hoá tại độ pH gần trung tính. Trong nước tự nhiên và trong bóng tối, microcystins có
thể tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm. ở nhiệt độ cao khoảng 40°c và độ pH cao hoặc thấp, chúng
bị thuỷ phân đần dần, thời gian để phá vỡ 90% microcystin là xấp xỉ 10 tuần tại pH = 1 và hơn 12
tuần tại pH = 9 [23]. Microcystins có thể bị oxy hoá bởi ozon và các lác nhân oxy hoá mạnh
khác, hoặc bị giảm mạnh bởi ánh sáng cực tím.
1.6.1. Sự phân giải microcystin của vi khuẩn Baciỉlus
Baciiỉus chủ yếu sinh ra các chất kháng sinh có tác dụng ức chế độc tố microcystin, làm
giảm tính độc của các loài vi khuẩn lam thông qua con đường tiếp xúc tế bào với tế bào. Theo Shi
Shunyu và cộng sự, vi khuẩn Baciìlus là loài có khả năng dung giải thực vật nổi, phân giải các
loài vi khuẩn lam nở hoa, bao gồm Aphanizomenon flo$-aquae, Microcystin viiìTÌdis,
Microcystin wwesenbergi, Microcysĩin aegurỉnosa, Cìúorella eỉỉipsoỉứea, Osciỉlatorỉa temús,
Notos punctiffonm , Anaebaena fỉos-aquae, Spiruìina maxima và Selenastrum capricornutum
[22]. Vi khuẩn Baciìỉus tấn công nhanh chóng tế bào vi khuẩn lam, bắt đầu bằng việc phá vỡ
thành tế bào của chúng, do đó sự tiếp xúc chặt chẽ giữa vi khuẩn và vi khuẩn lam là cần thiết.
Dịch nhót sản sinh từ Bacììlus giúp cho các tế bào vi khuẩn có thể gắn chật khi phân giải các tế
bào vi khuẩn lam. Theo Costerton và Irwin tế bào vi khuẩn tạo thành sợi glycocalyx, tạo cầu ở
khoảng trống giữa vi khuẩn và vi khuẩn lam. Chúng có thể xây dựng một lực hấp dẫn nhất định
như là liên kết hydro và liên kết ion. Cuối cùng, tế bào vi khuẩn lam sẽ bị phân giải hoàn toàn, sót
lại chỉ còn là những mảnh vụn tế bào của vi khuẩn lam [22]. Rõ ràng loài vi khuẩn này có vai trò
quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng nước nở hoa bởi vi khuẩn lam.
1.6.2. Sự phân giải microcystin của Shingomonas

10


£

v c”
ò

Mtcrocystiri LH

X
RH ‘M

MW «t 994

Enzyme I * Microcystinase

" H

ctli ọ MlC. IIV H

t V ' *'* ^ìí

L>>s ,-H 0

ĩ

i 'I

>

x1ỉ\1/ \ Ỹị M Mx' *iM
v "
-V

>c 1'• ** H

V
MicrocystÌQ LR m ạch thẳng MW = 1012

Enzyrr»e 2

Ị K COQ
II CJt

M.r-

11

,1

<■> HI.

Ị

„11

í», M ỊỊ

Tetrĩi-Peptíde (NM/-A<)đa-lsoủlu-Mdha-Aia-OH) MW.-= 614

Enzyrne 3

C ác amino axit

H ình 1.4. Con đường phân giải microcystin của Sphingomonas


Sphingomonas là vi khuẩn đã sử dụng MLR làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất cho sinh trựơng.
Dịch chiết tế bào cùa chủng này có hoạt tính enzyme, liên quan đến hoạt tính microcystinase
tham gia vào con đường phân giải MLR nhưng lại không liên quan đến nodularin - một loại
pentapeptide độc khác. Hoạt tính enzyme được thể hiện liên tục trong điêu kiện VI khuân mọc
trên môi trường chứa peptone - dịch chiết nấm men hoặc dịch chiết nấm men glucose.
Sự làm giảm MLR được thông qua con dường trung gian bởi ít nhất 3 enzyme phân giải ngoại
bào. Vị trí đầu tiên để phân giải được peptide mạch vòng bằng enzyme microcystinase ở liên kết
peptide 3-amino-9 methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyl-deca-4,6-dienoic acid (Adda)-Arg. Hai
enzyme trung gian làm giảm MLR đã được xác định, một là chuyển peptide mạch vòng thành
mạch thẳng (acylo) microcystin LR, NH2-Adda-Glu (iso)-methyldehydroalanine-Ala-Leu-betamethylaspartate-Arg-OH, loại enzyme thứ hai phá vỡ cấu trúc peptide ờ đoạn tetrapeptide NH2Adda-Glu (iso)-methyldehydroalanine-Ala-OH. Hiện tượng mở vòng độc tố MLR nhờ enzyme
microcystinase của vi khuẩn khiến chất này trở nên không độc do đó giảm đáng kê tương tác VỚI
các protein photphatase.Con đường phân huỷ MLR bởi Sphingomonas được đề xuất như hình sau:

1.7 Những nghiên cứu về khả năng phân giải microcystins
Những quan sát và phát hiện sớm nhất về vi tảo (trong đó có vi khuẩn lam) dã được các nhà thực
vật học (Linne, 1755; Vaucher, 1803; Geither, 1932) mô tả. Những biện pháp xử lý chúng với
các phương pháp khác nhau đã được đề xuất bởi Anagnostidis và Komarek (1985). Các nhà
nghiên cứu cho rằng nhận thức của con người về sự nở hoa gây độc của vi khuẩn lam được biết
đến từ thế kỷ 12, xuất phát từ Tu viện Hồ Xanh (gần hồ Soulseat) có nguồn nước ngọt phú dưỡng
ở vùng Đông - Nam Scotland. Gần đây, họ đã cảnh báo các cư dân thuộc nhiều địa phương ở
Trung Quốc, Bắc Phi, Nam Phi và Australia về việc sử dụng nước từ các thuỷ vực có váng tảo
màu xanh. Các biện pháp phân giải độc tố microcystin đã được nghiên cứu bởi Harada, ông đã
đưa ra các biện pháp làm giảm hàm lượng microcystin trong nước bằng các quá trình pha loãng,
hấp thụ những hạt vật chất, sự phân giải phụ thuộc nhiệt độ, pH, sự quang phân và sự phân giải
sinh học [23]. MLR bền trong nước bị ion hoá khoảng 27 ngày và trong nguồn nước vô trùng là
12 ngày. Kết quả này đã chỉ ra khả năng phàn giải sinh học microcystin trong các nguồn nước tự
nhiên có thể là do sự phá gẫy liên kết trong chuỗi bên Adda. Takenaka và Watanabe (1997) dã

kiểm tra các loài vi khuẩn phân lập từ một hồ ở Nhật Bản và phát hiện ra rằng thông qua hoạt
động của enzyme alkaline protease, Pseudomonas aeruginosa (,Sphingomonas) có khả năng làm
giảm MLR. Đó là loài có khả năng mở vòng độc tố và tạo ra dạng mạch thẳng dẫn đến lượng độc
tố giảm 200 lần. Nhiều nghiên cứu về tính ổn định của microcystin dưới tác động của tia u v đã
cho Ihấy độc tố bị phân giải nhanh bởi tia u v ở bước sóng đài tương ứng với sự hấp thu tối đa
lượng độc tố [25].
Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật, đặc biệt các vi khuẩn nước đóng vai trò quan trọng
trong việc phân giải độc tố không hoà tan được giải phóng vào nước. Người ta đã chứng minh
lằng microcystin có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật có trong hệ sinh thái thuỷ vực tự nhiên
[20]. Ngoài ra, sự phân giải sinh học microcystin xảy ra nhanh hơn ở các thuỷ vực mà thường có
nước nở hoa bởi vi khuẩn lam. Thực tế cho thấy các biện pháp cơ học nhằm lọc, vớt bỏ tảo tiêu
tốn nhiều thời gian, công sức và không đem lại hiệu quả mấy. Trong khi đó, phương pháp lý hóa
học cũng không khả thi khi áp dụng đối với nguồn nước uống [27]. Theo một số nhà nghiên cứu
tro của lúa mạch, gỗ mục và một số loại lá, đặc biệt là lá sồi có tác đụng ức chế một cách đáng
ke sự sinh trưởng vi khuẩn lam gây độc [26]. Dịch chiết từ vỏ quýt và vỏ quả chuối lùn cũng co
khả năng ức chế hiện tượng nước nở hoa bởi vi khuẩn lam [15]. Theo kết quả nghiên cứu mới
nhất của Shi Shunyu thì vi khuẩn Baciỉlus cereus được phàn lập từ hồ Dianchi, tỉnh Vân Nam
Trung Quốc có khả năng phân giải thực vật nổi cũng như phân giải vi khuẩn lam khi nước nở hoa.

12


Chương 2. Đối tượng và phương pháp Nghiên cứu
2.1 Đối tượng Nghiên cứu
- Vi khuẩn lam Microcystis được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội.
- Các loài vi khuẩn đất và nước có khả nãng phân giải độc tô' microcystin.
- Địa điểm thu mẫu: Hồ Hoàn Kiếm. Thời điểm thu mẫu: 10/2/2007 và 10/4/2007.
-Thu mẫu tại các vị trí như trong hình sau:
D l: Giữa hồ
D2: Chân tháp Rùa

D3: Cửa cống phô' hàng Khay.
D4: Cửa cống đối diện Tổng Cty
Điện lực Việt Nam
D5: Nhà hàng Thủy tạ
D6 : Ngã tư Cầu Gỗ - Hàng Dầu

SO’ ĐỒ VỊ TRÍ LẤY MAU

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm
Thu mẫu vi khuẩn lam bằng lưới chuyên dụng vớt phù du thực vật với kích thước mắt
lưới cỡ No 75.
2.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis
2.2.2.1. Phương pháp nuôi tĩnh làm giàu mẩu
Hút 45ml mẫu nước hồ, cho vào ống Fancol (cỡ 50ml), ly tâm ở 9000 vòng/phút trong 20 phút ở
nhiệt độ phòng và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm mục đích loại bỏ bớt các loài
tảo khác. Lớp dịch nổi bên trên là vi khuẩn lam, sau đó hút 100f.ll dịch nổi cho vào 60ml môi
tnrờng. Nuòi giữ trong điều kiện nhiệt độ 30°c dưới ánh sáng đèn neon với cường dộ ánh sáng là

13

mắt


*k

1500- 2500 lux theo quang chu kỳ là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối. Sau 3 tuần nuôi cấy, quan
sát khả nãng sinh trưởng của vi khuẩn lam bằng kính hiển vi quang học ở độ phong đại 400-1000
lần. Nuôi vi khuẩn lam Microcỵsíis trên 4 loại môi trường là Bold 3N, B12, J, BG11 (phụ lục 2).
22.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa

Quy trình phân lập được tiến hành theo phương pháp của Shirai có cải tiến [18]. Các tập đoan VI
khuẩn lam sau khi làm giàu được xác định dưới kính hiển vi là các chủng thuộc chi Microcystis.
Hút 100 ỊJ.l dịch vi khuẩn ỉam cấy trang trên các môi trường dinh dưỡng agarose với nông độ
0,4%, cấc hộp đĩa thạch được quấn paraíln và đặt dưới đèn neon với cường độ ánh sáng 15002500 Lux ở nhiệt độ 30°c. Sau7-15 ngày, quan sát khuẩn lạc bằng kính lúp Olympus. Những
khuẩn lạc sạch sau khi mọc trên môi trường thạch agarose được tách sang các lọ Penicillin chứa
5ml môi trưòng dịch thể. Theo dõi sự phát triển của tế bào vi khuẩn lam, quy trình được tiên hành
lặp đi lặp lại cho đến khi thu được các chủng thuần khiết.
2.2.3. Phương pháp xác định mật độ tê bào
Sô lượng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tích nưóc được xác định bằng cách đếm sô tê bào
trên 400 ô nhỏ thuộc 25 ô lớn của buồng đếm Thoma. Mỗi ô nhỏ có diện tích l/16mm2 và chiêu
cao l/10mm, Như vậy, thể tích của 1 ô nhỏ là 1/lố X 1/10 (mm1) và thể tích của 25 ô lớn là:
1/16 X 1/10 X 25 (m m ))

Nếu a là sô lượng tế bào vi khuẩn lam đếm được trên buồng đếm thì số lượng tế bào tảo trong 1
ml là:
X = a X 104 (tế bào).
2.2.4. Phương pháp tách chiết độc tô microcystin từ tế bào Microcystis
Microcystin được tách chiết theo phương pháp đông tan (freeze - thavving) [20]. Thu sinh
khối vi lảo Microcystis thô bằng cách ly tâm với tốc độ 9000 vòng/phút trong 15 phút, lửa 2 lấn
bằng nước muối sinh lý. Sinh khối thu được đông khô ở nhiệt độ - 83°c, sau đó được chiết rút
bằng hỗn hợp dung môi methanol : n - Hexan ( theo tỷ lệ 85 : 15) để qua đêm. Xác tê bào
Microcystis được lọc qua giấy lọc. Tiếp tục tiến hành cô quay mẫu. Lấy 100fil dịch mẫu cho chạy
qua sắc ký bản mỏng (TLC) với dung môi phân tách là ethyl acetat : isopropanol : nước (theo tỷ
lệ 8 : 5 : 3). Sau 30 phút làm khô ở nhiệt độ phòng, nhuộm TLC bằng Nihyđrin (2% trong butanol
bão hòa). Tái chiết rút độc tố bằng hỗn hợp đung môi methanol : nước theo tỷ lệ 80 : 20. Xác
định nồng độ của dịch chiết trên máy quang phổ ở bước sóng 242nm.
Phương pháp xãy dựng đường chuẩn hàm lượng microcystỉn theo mật độ quang: Dịch chiết
microcystin LR chuẩn có nồng độ 10 ng/ml được pha loãng gấp 1000, 3000, 5000, 7000, 9000,
] 1000 lần với hỗn hợp dung môi methanol : nước theo tỷ lệ 80 : 20. Tiến hành so màu ở bước
sóng 242nm trên máy so màu quang điện ERMA 11 TOKYO. Căn cứ vào các giá trị mật độ

quang đo được ta lập đường chuẩn.
2.2.5. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi khuẩn đất và nước
Phân lập các chủng vi khuẩn: các chủng vi khuẩn nước được phân lập từ mẫu nước hồ, còn
các chủng vi khuẩn đất được phân lập từ hỗn hợp M. aevuginosa và đất vườn. Lấy lml nước
hoặc lgam hỗn hợp Microcystis và đất vườn pha loãng ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Nhỏ
100 J.il dịch pha loãng lên trên môi trường thạch NA, M7, (p h ụ lục 3). Cấy trang đều trên mặt
thạch. Sau 24 giờ xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ, tách và cấy lặp lại nhiều lần cho đến khi thu

14


được các chủng thuần khiết. Nuôi giữ các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng, bao
quản ở nhiệt độ 4°c được dùng cho các nghiên cứu sau
2.2.6. Phương pháp ức chế sinh trưởng của Microcystis bằng các chủng vi khuân

Khả nãng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn lam bằng các chủng vi khuẩn được xác định theo
phương phap của Reim, sử dụng kỹ thuật giếng - khuếch tán (well-diffusion).
Hút 100 |J,1 dịch nuôi vi khuẩn lam Microcystis cấy gạt trên mặt thạch chứa môi trường BỊ2. Sau
đó, dùng dụng cụ khoan nút chai vô trùng (đường kính lOmm) tạo ra 5 giếng trên giá thê thạch
thẻo mô hình một giếng ở trung tâm, 4 giếng còn lại nằm đối xứng qua giếng trung tâm. Giếng ở
chính giữa sẽ được bổ sung 2 0 0 fil nước cất vô trùng làm đôi chứng, đông thời cho vao 2 cạp
giếng còn lại dung dịch lỏng NB có chứa vi khuẩn (nuôi cấy từ 24 giờ trước đó). Đĩa thạch được
nuôi cấy trong trong thời gian 5 ngày ở nhiệt độ 30°c, với cường độ ánh sáng từ 1500 —2500 Lux
theo quang chu kỳ là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tôi. Xác định khả năng ức chế sự phát triên cua
vi khuẩn lam Microcystis bằng sự có mặt của vòng ức chế xung quanh giêng.
2.2.7. Phương pháp xác định khả năng phân giải microcystin không hoà tan
Sự phân giải được bắt đầu bằng cách bổ sung dịch chiết microcystin thô vào các mâu nước
vô trùng (đùng tnnh có thể tích lOOOml bổ sung 6 ml) để thu được nồng độ microcystin tổng số là
10 |ig/L Các chủng vi khuẩn ly giải vi khuẩn lam được đưa vào bình với mật độ 10fi tế bào/ml.
Các bình sau đó được nuôi tĩnh trong điều kiện phòng thí nghiệm (25°C). Kiểm tra mãu sau 1 giờ

một lần bằng cách lấy 50ml dịch dem lọc qua màng lọc kích thước 0,22|am. Đo mật độ quang
(OD. 242 nm) để xác định nồng độ dộc tô' còn lại. Mẫu đối chứng (không có vi khuẩn) được tiến
hành song song. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Hiệu quả phân giải microcystin được xác định
nhờ phương pháp bán thời gian như mô tả của Keneíick và cs (1993):

c ,= c 0.e‘-k”
trong đó: c, - hàm lượng microcystin tại thời điểm đo (|ig);
C0 hàm lượng microcystin trưóc phân huỷ;
k - hằng số phân hủy bậc đầu tiên (tính trên ngày);
t - thời gian bán phân huỷ (ngày).
2.2.8. Phương pháp xác định đặc điểm của các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
microcystin
Chủng vi khuẩn được phân lập và xác định theo khoá phân loại của Bergey (Krieng và Holt,
1984). Các đặc điểm sinh hoá của các chủng được kiểm tra bằng hệ thống nhận diện API (bio
Merieux). Sinh lý và hình thái tế bào được nghiên cứu dưới kính hiển vi quang học và kính hiển
vi đối pha (Phụ lục 3).

15


chương 3. kết quả và thảo luận
3.1. Nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn lam Microcystis
Tảo sau khi thu từ hồ về được nuôi cấy làm giàu trong môi trường dịch thể B3N, trong các lọ
nhỏ có thể tích 2 0 ml, để ờ nhiệt độ phòng và được chiếu sáng với cường độ ánh sáng là 2 0 0 0 2500 Lux.
3.1.1. Môi trường thạch
Lấy 1lượng mẫu nhất định từ các lọ đựng mẫu trong môi trường nuôi cấy làm giàu, cho vào ống
Eppendoff sạch, ly tâm ở tốc độ 9000 vòng/phút trong 20 phút, Sau đó, tiến hành cấy mẫu: nhỏ
100|J.1 mẫu, trang đều trên 4 loại môi trường: thạch agarose 0,4%, Bold 3N, BI 2, và BG11. ở thí
nghiệm này với mỗi loại môi trường chúng tôi lại tiến hành thử nghiệm trên 2 loại thạch khác
nhau đó là agarose và thạch tinh khiết. Các đĩa thạch sau khi cấy được quấn parafin, đật dưới

cường độ ánh sáng 2000 Lux. Sau 10 - 15 ngày quan sát khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch.

ảnh 3 .Ỉ . Hình thái khuẩn lạc của Microcystìs
trên môi trường thạch agarose 0,4%

ánh 3.2. Hình thái khuân lạc của
Microcystỉs trên môi trường Boìd 3N

. ' 'Tl

ảnh 3.3. Hình thái khuẩn lạc của Microcvstis
trên mỏi trường B ỉ2

ảnh 3.4. Hình lììái khuẩn lạc của
Mìcrocyslìs trẽn môi trường BG1 ì

Kết quả cho thấy trên các đĩa Petri chứa mồi trường có bổ sung agaro.se, khuẩn lạc vi
khuẩn lam phát triển nhanh hơn so với môi trường thạch tinh khiết. Đặc biêt ờ đĩa chứa mỏi

16


trường thạch agarose B12 tảo mọc rất nhanh, sau 10 ngày đã thấy xuất hiện nhiều cụm khuân lạc
mọc nêng rẽ. Như vậy, vi khuẩn lam có thể mọc tốt trên các môi trường Bold 3N, B12. Còn trên
môi trưòng BG11 và môi trường thạch tinh khiết, chúng phát triển chậm hơn.
3.1.2. M ôi trường dịch thể
Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa thạch, khuẩn lạc được tách và kiểm tra độ thuần
khiết dưới kính hiển vi. Quá trình được lặp đi lặp lại cho đến khi thu được chủng thuần khiết. Các
chủng vi khuẩn được tiến hành nuôi thừ nghiệm trên 4 môi trường địch thể khác nhau là BI 2, J,
BN3, và BG11. Tỷ lệ giống ban đầu đưa vào là 4 X 105 tế bào/ml. Cứ sau 2 ngày lấy mẫu kiểm tra

sô' lượng vi khuẩn lam cho đến hết 15 ngày kết thúc thời kỳ nuôi cấy. Sự phát triển của chúng
trên các loại môi trường khác nhau được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2. Tốc độ phát triền của Micvocyslis trên các môi trường khác nhau
Thời
gian
(ngày)

Mật độ tế bào (tế bào Ì106/ml)
B12

J

B3N

BG11

3

0 ,2

0,4

0,3

0,20

6

6,2

7,2

6,8

5.,3

9

10,9

18,6

18,0

6,7

12

17,9

26,0

22,0

28,0

24,0

15

Hình 3. ỉ. Biểu đồ mật độ tế bào
Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.ỉ cho thấy Microcystis sinh trưởng tốt trên cả 4 môi trường, mật
độ tê bào đạt từ 6,7-18,6 X 106/ ml sau 9 ngày nuôi cấy. Đặc biệt trong môi trường J mật độ tế bào
đạt 28,0 X 10fi tế bào/ml sau ngày thứ 15.Trên môi trường Bold 3N cũng là mồi trường nuôi cấy
thích hợp cho vi khuẩn lam, mật độ tế bào đạt 24 X 10* tế bào/ml, còn môi trường B12 mát do
17.9 X 10* t ế b à o / m l .
Trong môi trường BG1 1 vi khuẩn lam Microcystis cũng phát triển nhưng không hiệu quà bằng 3
loại môi trường trẽn.

CAI HỌC Quọc GIA HA NOl
TPỤNG TÂM THÔNG TIN THƯ VIÊN

17


Điều đáng chú ý từ các kết quả trên chúng
tôi nhận thấy là khi nuôi cấy trên môi trường thạch
agarose tảo phát triển trong môi trường BI2 tốt hơn
các môi trường Bold 3N và J. Mậc dù vậy nhưng
đến khi chuyển sang nuôi dịch thể thì ngược lại,
Microcystis phát triển tốt hơn trong môi trường
Bold 3N và J, đặc biệt là trong môi trường B3N tảo
phát triển mạnh.

ảnh 3.5. Lựa chọn môi trường nuôi cấy dịch
thể tối ưu
3.1.3. Nuôi sinh khôi
Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi tiến hành
chọn 2 môi trường dinh dưỡng là Bold 3N và J
dùng làm môi trường nuôi thu sinh khối vi khuẩn

lam dùng cho những nghiên cứu tiếp theo. Đây là
những môi trường dịch thể tối ưu cho sự phát triển
của vi khuẩn lam Microcystis.

\ Kỉ
ảnh 3.6. Thu sinh khối vi khuẩn lam
Microcystis trên các môi trường dịch thể
chọn lọc
3.1.4. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lam Microcystis
Từ các mẫu tảo lấy ở hồ Hoàn Kiếm chúng tôi bước đầu phân lập và tuyển chọn được 6 chủng
Microcystis có khả nãng mọc tốt trẽn môi trường agarose và dịch thể đã lựa chọn. Trong đó có 2
chủng H3 và H5 tốc độ sinh trưởng nhanh, mọc tốt trên cả 2 loại môi trường dịch thể và trên
agarose.
Chủng H3 sống tập đoàn có dạng hình cầu hoặc trứng, ở trong một khối nhày có giới hạn
rõ. Các tế bào hình cẩu, chứa đầy không bào khí, thường sắp xếp dày đặc trong tập đoàn.
Chủng H5 có tế bào hình cầu, tập hợp thành các khối nhỏ hình cầu hoặc thấu kính hơi dẹt
hay đôi khi thành vòng tròn rộng từ 80 - 1 2 0 mm.
Kết quả được minh họa ở ảnh 3.7, 3.8, 3.9,3.10, 3.11, 3.12

18