Đánh giá khả năng chống oxi hóa và chống viêm của dịch chiết nấm linh chi ganoderma lucidum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HOÁ VÀ
CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIẾT NẤM LINH CHI
GANODERMA LUCIDUM

Chủ trì đề tài:

Th.s Tạ Bích Thuận

Cán bộ tham gia: CN Nguyễn Thanh Hương
CN Nguyễn Thuỳ Trang

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ô C G IA H A N Ọ I
TRUNG TÂM THÒNG TIN THƯ VIỀN

Hà Nội - 2 0 0 8


Báo cáo tóm tắt:
a. Tên đề tài: Đánh giá khả năng chống oxi hoá và chống viêm của dịch chiết
nấm Linh chi Ganoderma lucidum
M ã số:
b. Chủ trì đề tài:

Q T - 0 8 - 34
Ths Tạ Bích Thuận

c. Các cán bộ tham gia CN. Nguyễn Thanh Hương
CN. Nguyễn Thuỳ Trang
d. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
Mục tiêu:
Đánh giá khả năng chống viêm trên động vật thực nghiệm, chống oxi hoá trên
đối tượng vi sinh vật và động vật thực nghiệm của nấm Linh chi Ganoderma
ỉucidum .
Nội dung:
-

Đánh giá khả năng chống oxi hoá của dịch chiết từ nấm Linh chi trên đối
tượng vi sinh vật và động vật thực nghiệm

-

Đánh giá khả năng chống viêm của dịch chiết nấm Linh chi trên đối tượng
động vật thực nghiệm

e. Các kết quả đạt được:
-

Thu dịch chiết Ganoderma lucidum từ sinh khối sợi nấm , sử dụng làm
nguyên liệu trong các thí nghiệm của đề tài.

-

Đánh giá khả năng chống viêm thực nghiệm trên chuột nhắt trắng khi cho
uống và tiêm dịch chiết Ganoderma lucidum.

-

Khả năng bảo vệ peroxit hoá lipit tế bào gan chuột của dịch chiết
Ganoderma lucidum, khi sử dụng CC14 làm tác nhân gây độc. Các kết quả
thu được như xem xét chỉ số men gan, đọc hình ảnh tiêu bản mô học...

f. Tinh hình kinh p h í :
Tổng kinh phí đề tài là:

20.000.000 VNĐ

Thanh toán dịch vụ công cộng:

1.700.000 VNĐ

Hội nghị:

1.000.000 VNĐ

Chi phí thuê mướn:

8.000.000 VNĐ

Chi phí nghiệp vụ chuyên môn:

9.300.000 VNĐ


Summary
a) The title of subject: Evaluation of anti oxidative and anti inflamable activities of
extract from Ganoderma lucidum

Numerical code:
b) The grant holder:

QT - 08 - 34
M.Sc. Ta Bich Thuan

c) The Participants:

B.Sc Nguyen Thanh Huong

B.Sc. Nguyen Thuy Trang
d) Objectives and contents.
* Objectives:
Investigate the biomedical activities of Garnoderma lucidum extract (GLE)
including anti-inflammatory on mice , and anti oxidation on microorganism, anti­
lipid peroxidation on mice
* Contents :
> Evaluate the anti-inflammatory of GLE on the animal in laboratorial
condition.
> Evaluate the anti-lipidperoxidation of GLE on mice liver cells.
e) The obtained results:
y

Prepare extract of Ganoderma lucidum.

> Data about the anti-inflammatory activity of GLE on white mice through oral
and injection route.
> Data about the anti oxidation on microorganism

, and resuls anti-

Iipidperoxitdation of GLE against carbon tetrachloride induced liver mice
injury.

XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA
(ký và ghi rõ họ tên)

CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
(ký và ghi rõ họ tên)


MỤC LỤC
MỞ ĐẨU.................................................... ’.........!................................................................... Ị
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 2
1.1. Giói thiệu về Ganoderma lucidum .....................................................

2

1.1.1. Vị trí của Ganoderma lucidum trong hệ thống phân loại................................... 2
1.1.2. Đặc điểm sinh học của Ganoderma lucidum.........................................................2
1.1.2.1. Đặc điểm hình th á i....................................................................................

2

1.1.2.2. Chu trình sống và đặc điểm sinh sản ................................................................ 3
1.1.2.3. Các yếu tố sinh th á i...............................................................................

4

1.1.2.4. Thành phần hoá dược cơ bản.....................................................................

4

1.1.3. Giới thiệu một số tác dụng sinh y dược của Ganoderma lucidum .................... 4
1.2. Tác dụng chống viêm của Ganoderma lucidum ...................................................... 5
1.2.1. Phản ứng viêm trong cơ thể sinh vật........................................................................ 5
1.2.2. Nguyên nhân gây viêm ........................................................................

6

1.2.3. Các giai đoạn của phản ứng viêm ......................................................................

6

1.2.4. Những nghiên cứu về tác dụng chống viêm của Ganoderma ỉucidum .............. 8
1.3. Tác dụng chống oxy hoá của Ganoderma lucidum .................................................9
1.3.1. Quá trình tạo các gốc tự do trong cơ thể sinh v ật.................................................. 9
1.3.2. Tác hại của các gốc tự do đối với cơ thể sinh v ật................................................10
1.3.3. Những nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá của Ganoderma lucidum.... 11
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .............................. 1 3
2.1. Nguyên liệu........................................................................................................

13

2.2. Hoá chất và thiết b ị ........................................................................

13

2.2.1. Hoá chất....................................................................................

13

2.2.2. Thiết b ị ......................................................................................

13

2.3. Phương pháp nghiên c ứ u .......................................................................................... 1 4
2.3.1. Nuôi cấy và tách chiết Ganordema lucid u m .....................................................14
2.3.2. Phương pháp chống viêm thực ng h iệm ............................................................. 14


MỞ ĐẨU
Trong cơ thể sinh vật, viêm và oxy hoá là hai quá trình có nhiều ảnh hưởng
lớn. Viêm tuy là một đáp ứng bảo vệ nhằm đưa cơ thể trở lại tình trạng bình thường
trước khi bị tổn thương nhưng khi đáp ứng viêm không phù hợp hoặc có sự gia tăng
quá mức thì sẽ trở thành có hại, gây đau đớn, tổn thương mô lành, rối loạn các chức
năng. Bên cạnh đó, quá trình oxy hóa với sự tham gia của các gốc tự do hình thành
trong quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng là nguyên nhân dẫn đến các tổn
thương oxy hoá của cơ thể sinh vật. Do đó các cơ quan, tổ chức mô bị phá hoại
nghiêm trọng gây ra những biến đổi bệnh lý như : ung thư, hoại tử, polymer hoá, lão
h ó a ... Vì vậy việc sử dụng các hợp chất tự nhiên tách chiết chủ yếu từ thực vật có khả
năng chống viêm, chống oxy hoá cao mà không gây tác dụng phụ đang là yêu cầu cấp
thiết của ngành y và dược học.
Ganoderma lucidum từ lâu đã được biết đến như một thảo dược quý, một vị
thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh. Ngoài ra
G. lucidum còn làm tăng sự thải độc ở gan, cắt cơn ho suyễn, điều hoà huyết áp, giảm
cholesteron, chống viêm, chống lão hoá và chống oxy hoá cao.
Với tiềm năng chữa bệnh đa dạng trên, ỏ các nước Châu Á như Trung Quốc,
Hàn Quốc, Ấn Đ ộ... việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng G. lucidum đang được
triển khai với quy mô rộng lớn cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ

động, nghiên cứu về thành phần hoá học, tác dụng dược liệu và điều trị lâm sàng.
Những nghiên cứu y, dược học đã đưa ra kết luận cho thấy rõ các loài G. lucidum ở
nhiều vùng khác nhau có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có tính chất biệt
dược quý khác nhau.
Hiện nay, việc nghiên cứu tác dụng dược liệu của G. lucỉdum - chủng được
phàn lập và nuôi trồng thành công tại Việt Nam đã và đang được nhiều nhà khoa học
quan tâm đến. Tuy nhiên nguyên nhân, tác dụng và khả năng chữa bệnh, đặc biệt là
khả năng chống viêm, chống oxy hoá của G. lucidum cho đến nay chưa được nghiên
cứu nhiều và sâu. Bởi vậy chúng tôi được giao thực hiện đề tài: “ Đánh giá khả năng
chống viêm và chống oxy hoá của dịch chiết Ganoderma lucidum ” với hi vọng
góp phần tạo cơ sở cho việc khai thác và ứng dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên quý
này trong các sản phẩm chống viêm, chống oxy hoá, phục vụ đời sống con người.

1


C h ư ơ n g 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VÊ G a n o d e r m a ỉu c id u m
1.1.1. Vị trí của G anoderm a lucidum trong hệ thống phân loại
Trong tiếng Latinh, G anoderm a là một danh từ ghép, trong đó gano là láng
bóng, còn derm a nghĩa là lớp vỏ, thể hiện nét chủ đạo về hình thái quả thể bên ngoài
của đa số các loài trong họ G anoderm ataceace. Tuy nhiên, tính đổng nhất cao về cấu
trúc bào tử của các loài trong họ này vẫn là yếu tố cơ bản nhất để phân loại. Do đó
lịch sử nghiên cứu hệ thống tự nhiên của họ G anoderm ataceace được coi là quá trình
nghiên cứu cấu trúc bào tử đảm của chúng.
K hoảng 120 năm trước, Karten - nhà nấm học Phần Lan lần đầu tiên đã tách từ
các nấm Polypore ra m ột nhóm nấm đặc biệt, xây dựng nên chi nấm mới độc lập là
chi G anoderm a theo kiểu bào tử đảm đặc trưng. Đó là kiểu bào tử đảm có lớp vỏ kép,
hình trứng cụt, bề m ặt sần sùi m ụn cóc, gờ nhỏ. Do đó, việc phân loại Ganoderma đã
có một bước tiến quan trọng [4], Người ta dễ dàng lọc ra từ các nhóm Poplypore,

Formes, B oletus... các loài mà vị trí tự nhiên của chúng thuộc về Ganoderma. Ngày
nay, G. lucidum đã được phân loại theo quy ước quốc tế như sau:
Loài G anoderm a ỉuciảum
Chi G anoderm a
Họ Linh Chi G anoderm ataceace
Bộ nấm lỗ A phyllophorales
Lớp nấm đảm Basidiom ycetes
N gành nấm đảm Basidiom ycota
Giới nấm M ycetalia
1.1.2. Đặc điểm sinh học của G anoderm a lucidum
1.1.2.1.

Đ ặc điểm hình thái

Nấm có tai nấm hoá gỗ, mũ xoè tròn, bầu dục hoặc hình thận. Quả thể có thể
có cuống dài, ngắn hay hầu như không có cuống.
M ũ nấm dính lệch hay dính bên, màu nâu đỏ, bóng láng. Trên mặt mũ có vân
gợn đổng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu đến vàng cam, đỏ cam,
đỏ nâu, nâu tím và nâu đen, mũ nấm sẫm m àu dần theo tuổi. Đường kính tán biến
động từ 2 - 30 cm , dày 0.8 - 2.5 cm .

2


Thịt nấm dày từ 0.4 - 2 cm, màu vàng kem - nâu nhạt - trắng. Hệ sợi nấm
kiểu trim itic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình trứng m àng dày đan xít vào nhau tạo
thành lớp vỏ láng phủ trên mặt mũ và cuống [9 ].

A

B

Hình 1. Hình thái đặc trưng của Ganoderma lucidum.
(Nguồn www.sinhhocvietnam.com)
A - Hình thái bên ngoài; B - Mặt cắt dọc
1.1.2.2. Chu trình sống và đặc điểm sinh sản
Các bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi nảy m ầm tạo ra hệ sợi sơ
cấp (prim ary hyphase). Hệ sợi sơ cấp đơn bội mau chóng phát triển, phối hợp với
nhau (plasm ogam ie) tạo ra hệ sợi thứ cấp hay còn gọi là sợi song hạch (dicargon
hyphase). Khi đó hệ sợi phát triển, phân nhánh rất m ạnh, lan khắp giá thể. Lúc này
thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày (gasterospores). Các bào tử
dễ dàng rơi ra và khi gặp điều kiện phù hợp sẽ nảy m ầm cho ra hệ sợi song hạch tái
sinh [39J.
Hệ sợi thứ cấp phát triển mạnh đạt tới giai đoạn cộng bào, tức là các vách ngăn
(septum ) được hoà tan. Tiếp theo là giai đoạn sợi bện kết (m ating) để chuẩn bị cho sự
hình thành m ầm m ống quả thể. Hệ sợi nguyên thuỷ phát triển thành các sợi cứng
(skeletal hyphase) có màng dày, ít phân nhánh rồi thành cấu trúc bó được gắn chặt
bởi các sợi bện thừng (binding) phân nhánh m ạnh [13], [39]. Từ đó phát triển thành
các m ầm m ống quả thể màu trắng mịn vươn dài đến các trụ tròn mập. Dần đần phần
đỉnh trục bắt đầu xoè thành tán, cùng lúc đó lớp vỏ láng đỏ da cam dần xuất hiện.
Tán lớn phát triển dần thành bào tầng (hym enium ) và bắt đầu phát tán bào tử
đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp lại và lụi dần trong vòng 3 - 4
tháng. Thể sinh sản dạng ống, gắn các ống nhỏ thẳng đứng, m iệng tròn trắng - vàng
ánh xanh, có bốn đảm bào tử hình trứng cụt. Bào tử giá có vỏ với lớp cấu trúc hai lớp
màng, m àng ngoài nhẵn không màu, màng trong m àu nâu gỉ sắt, phát triển thành
những gai nhọn vươn sát màng ngoài [9 ], [13].

3

1.1.2.3. Các yếu t ố sinh thái
G. ỉucidum là loài phân bố rộng. Trong quá trình phát triển, G. lucidum có thể
mọc trên gốc, rễ cây sống hoặc cây đã chết, trên rất nhiều loài cây gỗ mọc trong rừng
hay các cây ăn quả [5]. Điều kiện phát triển tốt của nấm ở dạng sợi là 26 - 30°c. Quả
thể gặp rộ vào m ùa mưa từ tháng 5 tới tháng 11. Nấm mọc tốt trong bóng rợp, có ánh
sáng khuyếch tán yếu. Do có lớp vỏ bóng láng m à nó có thể chịu nắng rọi và chịu
mưa liên tục. Đối với hệ sợi nấm, nuôi cấy trên môi trường dịch thể với nhiệt độ thích
hợp từ 26 - 28°c, phát triển tốt ở pH từ 7 - 8.5. Sau 15 - 20 ngày phần sợi già bắt đầu
ngả vàng và xuất hiện mầm quả thể [4].
1.1.2.4. Thành phần hoá dược cơ bản
Trong khoảng hai chục năm trở lại đây đã có nhiều khảo cứu trên thế giới và ở
Việt Nam tập trung phân tích, tìm hiểu các thành phần hoá học có hoạt tính trong G.
lucidum. Bằng các phương pháp thông dụng, người ta đã phân tích thấy G. lucidum có
chứa những hợp chất sau: nước (12 - 13%); cellulose (54 - 56%); lignine (13 - 14%);
hợp chất nitơ (1.6 - 2.1%); lipit (1.9 - 2%); hợp chất phenol (0.08 - 0.1%); hợp chất
sterol toàn phần (0.11 -0 .1 6 % ); hợp chất saponin toàn phần (0.3 -1.33%); akaloid và
glucosid tổng số (1.82 - 3.06%). Ngoài ra các hợp chất nhóm lacton cũng lên đến
trên 2%, cùng với một số các hợp chất khác [13], [27].
1.1.3. Giới thiệu một sô tác dụng sinh y dược của Ganoderma lucidum
G. lucidum là loại dược liệu dân gian rất có giá trị. Hàng nghìn năm nay, ở
Châu Á đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Đ ộ... G. lucidum cùng với một vài loại
nấm như nấm Hương (.Lentinus edodes), nấm Chân chim (Schizophyllum commune),
nấm Vân chi (Tram entes versicolor), nấm Kim châm (.Flammulina velutipes)... luôn
được đề cao như những thực phẩm vô cùng quý giá, những vị thuốc đầy tiềm năng vì
chúng có tác dụng phục hồi sinh lực, kéo dài tuổi thọ. Trong đó G. lucidum được coi
là số m ột, còn các loại nấm khác chỉ là thuốc bổ hoặc được dùng để chữa các bệnh
ốm đau thông thường.
Chính vì vậy, nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành với mục đích tinh
chế các hợp chất tự nhiên có hoạt tính dược liệu cao từ G. lucidum như nghiên cứu
của Hikino H. [27] và Min B. s. [35]. Các nghiên cứu này cho thấy G. lucidum gồm

những thành phần chủ yếu như: polysaccharide, triterpenoid, polysaccharide-protein,
polysaccharide-peptide. Các thành phần trên đều đã được chứng minh là những thành
phần chính để điều trị bệnh xơ vữa động mạch, điều hoà huyết áp, giảm cholesterol,
bệnh trĩ, sâu răng, nhiễm trùng răng, béo phì và nhiều bệnh nan y khác [10]. Ngoài ra

4


G. ìucidum cũng được cho là có ảnh hưởng tốt trong điều trị các trường hợp bị đột
quỵ, các bệnh liên quan đến não tuỷ, hẹp động mạch vành, nhồi máu cơ tim, các
trường hợp viêm tĩnh mạch, các bệnh nảy sinh do tắc nghẽn động mạch [41]. Hơn thế
nữa G. lucidum cũng có hiệu quả trong việc điều trị chứng viêm da điển hình, viêm
phế quản, hen suyễn, viêm mũi dị ứng, viêm gan mạn tính [10]. Đặc biệt, G. lucidum
có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, có khả năng chống ung thư,
chống lại quá trình oxy hoá [2], [41]. Các hợp chất tự nhiên có trong G. lucidum cũng
đã được chứng minh có khả năng chống phóng xạ, tia u v và các tác nhân gây đột
biến [7], [ 8 ], [33], Đặc biệt G. lucidum còn có tác dụng ngăn cản hoạt động của các
gốc tự do có khả năng làm thương tổn đến ADN - nguyên nhân gây ra các bất ổn về
đi truyền [40].
Với tiềm năng chữa bệnh rất đa dạng, G. lucidum thực sự là một loại thảo dược
có giá trị cao, có nhiều ứng dụng tốt trong y học và có giá trị thương phẩm lớn trong
đời sống của chúng ta.
1.2. TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA Ganoderma

lucidum

1.2.1. Phản ứng viêm trong cơ thể sinh vật
V iêm được xem là một phản ứng phức tạp, đặc trưng cho cơ thể động vật có hệ
thần kinh phát triển. Quá trình này xuất hiện khi có sự hiện diện của tế bào chết, vi
khuẩn hay do chấn thương, ma sát... song dù bất cứ nguyên nhân nào, viêm cũng có

các biểu hiện lâm sàng như sưng, nóng, đỏ, đau và kèm theo các rối loạn chức năng
của cơ quan bị viêm.
Từ thế kỷ XVIII, phản ứng viêm đã được nghiên cứu và từ đó đến nay khái
niệm viêm cũng có nhiều thay đổi. Đứng trên góc độ lâm sàng, người ta thường coi
viêm như là sự đáp ứng có hại cho cơ thể vì gây đau, nóng, sốt. Nhưng đứng trên quan
điểm sinh lý bệnh học, viêm là một đáp ứng bảo vệ nhằm đưa cơ thể trở lại tình trạng
bình thường trước khi bị tổn thương [12]. Viêm được phân thành hai loại là viêm cấp
tính và viêm m ạn tính. Diễn biến của quá trình thể hiện trên Hình 2.

5


Hình 2. Diễn biến quá trình viêm.
Ngày nay, với sự phát triển của miễn dịch học người ta thấy có sự liên quan
giữa hiện tượng viêm và quá trình mẫn cảm, viêm giúp cơ thể nhận biết được các yếu
tố xâm nhập nhờ vai trò của các đại thực bào trong việc trình diện kháng nguyên. Tuy
nhiên, khi đáp ứng viêm không phù hợp hoặc có sự gia tăng quá mức sẽ trở thành có
hại cho cơ thể vì gây đau đớn, tổn thương mô lành, rối loạn các chức năng. Bên cạnh
đó đáp ứng viêm có thể lan toả, ảnh hưởng tới nhiều cơ quan và hệ thống trong cơ thể.
Hậu quả sẽ dẫn tới hội chứng đáp ứng viêm hệ thống (systemic inflammatory
response syndrome) với các biểu hiện như giảm bạch cầu trầm trọng, tăng thân nhiệt,
tim đập mạnh, thở nhanh dẫn đến tử vong [24], [37],
1.2.2. Nguyên nhân gây viêm
Nguyên nhân bên ngoài gây viêm thường thấy như vi khuẩn, virut, một số loại
nấm, kí sinh trùng. Ngoài ra còn có các yếu tố gây viêm khác như hoá chất, thuốc, do
chấn thương, áp lực, ma sát, hay do nhiệt, tia phóng xạ, bức x ạ ...
Viêm còn có thể gây ra bởi các nguyên nhân bên trong cơ thể như sự hoại tử
do nghẽn mạch, xuất huyết, viêm tắc động mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng, bệnh
tự miễn, viêm xung quanh tổ chức ung thư.
1.2.3. Các giai đoạn của phản ứng viêm

Các nguyên nhân gây viêm tác động lên cơ thể sinh vật gây ra phản ứng viêm.
Phản ứng viêm điển hình gồm có ba giai đoạn chính:

6


a) Giai đoạn rối loạn chuyển hoá và tổn thương tổ chức
b) Giai đoạn rối loạn tuần hoàn và thoát dịch rỉ viêm
c) Giai đoạn tăng sinh và liền sẹo
Ba giai đoạn trên xảy ra tuần tự, đan xen vào nhau. Tuỳ thuộc vào các loại
phản ứng viêm mà có giai đoạn trội, biểu hiện rõ rệt. Ví dụ trong viêm cấp tính thì hai
giai đoạn đầu phát triển mạnh, gây viêm xuất tiết; còn trong viêm mạn tính giai đoạn
thứ ba mới là giai đoạn phát triển mạnh, gây viêm phì đại [ 1 2 ].
> Giai đoạn rối loạn chuyển hoá và tổn thương tổ chức
Các tác nhân gây viêm tác động lên cơ quan và mô gây tổn thương mô, tế bào
và làm giải phóng ra các chất trung gian hoá học như histamin, prostaglandin... gọi là
các mediator viêm. Ngoài ra, chúng còn gây rối loạn tuần hoàn và chuyển hoá tạo ra
các sản phẩm chuyển hóa trung gian, chính các sản phẩm này cũng đóng vai trò như
các mediator viêm.
> Giai đoạn rối loạn tuần hoàn và thoát dịch rì viêm
Sau khi được sinh ra các mediator này đóng vai trò như những tác nhân gây
viêm mới, gây ra những tổn thương tổ chức, rối loạn tuần hoàn và chuyển hoá.
Tác động của các mediator viêm:
•

Làm tăng cường tuần hoàn, gây giãn mạch tại chỗ viêm tạo thuận lợi cho
bạch cầu xuyên mạch và tăng thoát dịch từ lòng mạch vào tổ chức kẽ để
hoà loãng các tác nhân gây viêm. Hiện tượng giãn mạch làm vùng viêm đỏ,
thoát dịch viêm , gây phù nề sưng tấy tại chỗ.

•

Thu hút các bạch cầu đến chỗ viêm gọi là tác dụng hoá ứng động bạch cầu.
Đây là tác đụng có lợi để tăng cường quá trình chống viêm, loại trừ các tác
nhân gây viêm và hồi phục tổn thương viêm. Các mediator còn có tác dụng
kích thích sự di chuyển và xâm nhập của đại thực bào vào tổ chức viêm.

•

Làm tăng quá trình chuyển hóa tại chỗ, do đó làm tăng nhiệt độ tại ổ viêm
làm cho ổ viêm nóng hơn các vùng khác. Nhiệt độ tại ổ viêm tăng làm tăng
hiện tượng giãn mạch, tăng khả năng di chuyển và thực bào của bạch cầu.
Các m ediator vào máu và tác động lên trung khu điều nhiệt ở vùng dưới đồi
gây phản ứng sốt toàn thân.

•

Gây đau do kích thích các tận cùng thần kinh như các prostaglandin, kinin.
Ngoài ra đau còn do dịch phù viêm gây sưng và chèn ép vào các tận cùng

7


thần kinh. Đau có tác dụng thông báo cho thần kinh trung ương biết đang
có tổn thương tại chỗ viêm.
•

Gây tổn thương tổ chức tế bào dẫn đến hoại tử, làm ổ viêm lan rộng.

Thành phần của dịch rỉ viêm bao gồm huyết tương, tế bào viêm, tế bào hoại tử

và các tác nhân gây viêm. Ngoài ra trong dịch rỉ viêm còn có cả fibrinogen. Khi ra
khỏi lòng mạch, fibrinogen sẽ chuyển thành fibrin và tạo thành một hàng rào bao
quanh ổ viêm có tác dụng ngăn cản sự phát triển của ổ viêm [2 0 ],
Trong giai đoạn này xảy ra hiện tượng xuyên mạch và thực bào của bạch cầu:
các bạch cầu sẽ di chuyển theo kiểu amip, chui qua thành mạch đến ổ viêm do ảnh
hưởng của các chất hoá ứng động như leukotaxin, necroxin...
> Giai đoạn tăng sinh và liền sẹo
Các tác nhân gây viêm và các mediator giảm, rối loạn tuần hoàn và chuyển hoá
giảm. Một số sản phẩm viêm có tác dụng kích thích phân bào làm tăng sinh tế bào ở
khu vực viêm, tăng sinh tổ chức liên kết, tăng sinh các mao mạch và tổ chức hạt. Kết
quả là tổ chức hoại tử ở giai đoạn trước được thay thế bởi một tổ chức mới, làm liền
các vết thương do viêm gây ra.
1.2.4. Những nghiên cứu về tác dụng chống viêm của Ganoderma lucidum
Như đã đề cập, quá trình viêm cấp rất dễ xảy ra đối với cơ thể động vật có hệ
thần kinh phát triển. Nhờ sự bảo vệ của hệ miễn dịch, cơ thể có thể tự bình phục, trở
lại trạng thái bình thường trước khi bị tổn thương. Nhưng quá trình này kéo dài, gây
đau đớn, khó chịu cho cơ thể. Mặt khác, nếu phản ứng viêm không còn khu trú ở một
bộ phận mà lan toả tới các cơ quan, bộ phận khác thì sẽ gây ra hội chứng đáp ứng
viêm hệ thống. Hội chứng này rất nguy hiểm, nguy cơ dẫn tới tử vong cao. Chính vì
thế, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra các hợp chất có khả năng chống
viêm, kháng khuẩn, giảm đau cho cơ thể. Các thuốc chống viêm kinh điển được biết
đến như aspirin, ibuprofen, glucocorticoid và naproxen. Tuy nhiên, chúng đều là các
hợp chất tổng hợp hoá học nên khi sử dụng nhiều sẽ gây xuất huyết, viêm loét dạ dày
cùng những tác dụng phụ khác.
Trong tự nhiên có rất nhiều hợp chất có khả năng làm giảm viêm, kháng khuẩn
như polysaccharide, polysaccharide-peptide có trong Ganoderma lucidum [27], [29];
lectin, các axit béo không bão hoà đa nối đôi có trong Laminaria japonica [30]... Vì
vậy, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để tách chiết và sử dụng các hợp chất này
với mục đích chữa bệnh, chống lại các tác nhân gây viêm.

8


Một số công trình nghiên cứu đã sử dụng tác nhân gây viêm thực nghiệm để
phá huỷ hệ thống màng của tế bào biểu bì da chuột, sau đó điều trị bằng dịch chiết
G. lucidum. Kết quả mẫu thí nghiệm giảm viêm đáng kể so với mẫu đối chứng [22].
Ngoài ra đã có những thí nghiệm chứng minh khả năng chống viêm của G. lucidum
khi xử lý chế phẩm dịch chiết G.lucidum trên đối tượng chuột nhắt trắng. Chuột nhắt
trắng bị gây viêm bởi formaline và các dextran, khi xử lý với dịch chiết G. lucidum thì
tình trạng viêm được cải thiện rõ rệt [32].
Các thí nghiệm trên đã chứng minh rằng những hợp chất tự nhiên sẩn có trong
dịch chiết G. lucidum đã ức chế những tác nhân trung gian, các sản phẩm trao đổi
chất của axit archidonic, kinin, histamine, prostaglandin và sterotinine hoặc giải
phóng chúng. Đặc biệt các hợp chất này còn làm tăng lượng bạch cầu khi xảy ra phản
ứng viêm trong cơ thể. Đây cũng chính là cơ chế về hoạt tính chống viêm của dịch
chiết G. lucidum.
1.3. TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA G a n o d e r m a lu c id u m
1.3.1. Quá trình tạo các gốc tự do trong cơ thể sinh vật
Trong cơ thể sống, các phản ứng oxy hoá - khử xảy ra thường xuyên,gắn liền
với nhiều quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng. Điển hình nhất của các phản
ứng oxy hoá khử trong cơ thể chính là hệ thống chuỗi vận chuyển điện tử nằm trên
màng ty thể hoặc lục lạp và quá trình oxy hoá các chuỗi axit béo [15]. Chính từ những
quá trình oxy hoá khử này mà các dạng oxy hoạt động gồm gốc superoxide (0 2*),
peroxide hydro (H 20 2) và gốc hydroxyl (*OH) được hình thành. Ngoài ra các gốc tự
do còn có thể phát sinh bởi nguyên nhân bên ngoài như tia u v , chất kích thích sinh
trưởng, chất bảo quản thực phẩm và các chất thải của khu công nghiệp...
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng superoxiđe ( 0 2*) có thể hoạt động như một chất
oxy hoá hoặc một chất khử [15]. Nó có thể oxy hoá sulphur, axit ascorbic hay NADH
và có thể khử cytochrome c hay các ion kim loại. Ngoài ra superoxide có thể tạo ra
các gốc perthydroxyl là một chất oxy hoá rất mạnh [16].

Các peroxide hydro (H 20 2) rất dễ thấm qua màng tế bào để tham gia phản ứng
oxy hoá tạo gốc hydroxyl (OH*). Phản ứng này gọi là phản ứng Fenton.
F e2 +

H 20 2 — -----» OH + OH
Bên cạnh đó peroxide hydro cũng có thể kết hợp với superoxiđe để tạo nên
hydroxyl theo phản ứng sau :
*0 2 + H 20 2 ----- > 0 2 + *OH + OH'

9


N hư vậy chỉ với lượng nhỏ của Fe2+ thì superoxide và peroxide hydro đã có
khả năng tạo ra những chất oxy hoá và các gốc hydroxyl. Đây chính là tác nhân gây
oxy hoá m ạnh, làm phá huỷ các phân tử hữu cơ trong tế bào [2 1 ].
1.3.2. Tác hại của các gốc tự do đối với cơ thẻ sinh vật
Sự tăng số lượng các gốc tự do hoạt động trong tế bào làm các phân tử sinh
học biến đổi, xuất hiện những protein bất thường trong cơ thể. Đây là nguyên nhân
phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm, gây lão hoá, ung thư, hoại tử, polymer hoá. Mặt
khác các gốc tự do thường ít bền và có khả năng phản ứng rất lớn với các đại phân tử
như ADN, protein, lipit. Cơ ch ế phản ứng xảy ra như sau:
> Các gốc tự do ph ản ứng với A D N
N hiều nghiên cứu đã chứng m inh rằng chỉ riêng peroxide hydro và superoxide
thì không thể gây ra sự đứt gãy của ADN sợi đôi trong điều kiện sinh lý tế bào. Tuy
nhiên độc tính của chúng với ADN trong cơ thể sống chủ yếu do kết quả của phản
ứng Fenton với sự xúc tác của các ion kim loại (qua đó sản sinh ra gốc hydroxyl).
Gốc hydroxyl có thể tấn công và gây ra biến đổi ở bất kỳ base nào. Trong đó guanine
mẫn cảm với RO S (Reactive O xygen Species) hơn cả nên sản phẩm oxy hoá 8 hydroxyl-guanine ( 8 -OH Gua) làm tổn thương ADN phổ biến nhất. Trong quá trinh
sao chép, 8 -OH G ua có thể bắt cặp với adenine gây ra những đột biến thay thế cặp G-

c bằng cặp T-A [24].
Gốc hydroxyl còn có thể tấn công vào các phân tử đường ở vị trí c 4\ Đây là
điểm yếu nhất m à ở đó gốc hydroxyl có thể tách ra một nguyên tử hydro. Do vậy cấu
trúc không gian ở vị trí c 3’ bị thay đổi, kết quả liên kết phosphodiester với nucleotide
liền kề bị đứt gãy [23]. Ngoài ra gốc hydroxyl cũng có thể gây ra sự liên kết chéo
giữa ADN và protein.
> Các gốc tự do ph ản ứng với protein
Các gốc tự do tấn công vào protein theo cơ chế gốc hydroxyl tách một nguyên
tử a -H của m ột am ino axit trên chuỗi polypeptide tạo ra gốc hữu cơ. Tiếp đó nó lại
phản ứng với oxy để tạo ra các gốc trung gian như ankylperoxyl -> ankylperoxide ->
alkoxyl. Gốc alkoxyl có thể bị biến đổi thành một hydroxyl protein. Các gốc trung
gian trên có thể phản ứng với các am ino axit khác trong cùng một phân tử protein
hoặc của phân tử khác để tạo nên các gốc hữu cơ mới. Các gốc hữu cơ mới được tạo
ra lại tham gia vào các phản ứng tương tự.
Khi ở dạng alkoxyl thì chuỗi polipeptide dễ bị đứt gãy. Sự đứt gãy peptide
cũng có thể xảy ra khi ROS tấn công vào các mạch bên của các gốc glutamin,
10


asparin, prolin để tạo ra ankylperoxy và phản ứng lại diễn ra tương tự. Tuy nhiên
cystein và methionin (hai amino axit có chứa gốc sulphur) đặc biệt nhạy cảm với tất
cả các ROS theo cách ROS tách nguyên tử H từ cystein tạo ra gốc thyrin. Sau đó gốc
này liên kết chéo với gốc thyrin thứ hai để hình thành nên cầu di-sulphur. Còn
methinonin sẽ gắn vào nó hình thành dẫn xuất methionin-sulphur [14], [17].
Trong nhiều trường hợp sự biến đổi các axit amin trên phân tử protein bởi ROS
sẽ là dấu hiệu dẫn đến ung thư điển hình, Đây cũng là dấu hiệu để protease nhận ra và
thực hiện việc phân huỷ phân tử protein đó. Nhiều protease kiểu này được tìm thấy ở
Escherichia coìi [21], [26],
> Các gốc tự do phản ứng với lipit
Phản ứng của các gốc tự do với các axit béo không no là nguyên nhân dẫn đến

sự ôi của dầu, mỡ trong quá trình sản xuất và bảo quản thực phẩm. Quá trình peroxit
hoá lipit liên quan đến ba bước riêng b iệ t: khởi đầu, nhân lên, kết thúc [18].
•

Bước khởi đầu: phản ứng giữa axit béo không no với gốc hydroxyl làm một
nguyên tử H bị tách ra.

•

Bước nhân lên: phân tử oxy có thể gắn vào gốc cacbon tạo ra gốc peroxy theo
kiểu cộng hưởng. Gốc peroxy này lại tách ra một nguyên tử H từ một phân tử
axit béo khác, hình thành nên lipit hydro peroxit (ROOH) và một gốc hữu cơ
(R*). Gốc R* sẽ tham gia vào một chuỗi phản ứng mới, còn ROOH sẽ không
bền khi có mặt của sắt hoặc xúc tác kim loại khác. Trong điều kiện đó chất này
lại dễ dàng tham gia phản ứng Fenton để tạo ra các gốc alkoxy hoạt hoá (RO*).

•

Bước kết thúc: các gốc cacbon được các gốc peroxy liên kết chéo với nhau tạo
thành những sản phẩm không còn có điện tử tự do nữa. Sản phẩm của phản ứng
này là hỗn hợp các peroxit hydro, các peroxit của lipit bị phân huỷ thành nhiều
sản phẩm khác nhau, một trong số đó lại có thể tạo ra các gốc hữu cơ chứa oxy
tự do (RO*) trong các phản ứng tiếp theo.

1.3.3. Những nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá của Ganoderma lucidum
Để chống lại tác hại gây bởi gốc tự do, mọi cơ thể sống đều có những hệ thống
chống oxy hoá nội sinh: hệ thống enzym khử gốc tự do (catalase, proxidase, SOD); hệ
thống enzym sửa chữa ADN, phân huỷ protein, lipit. Tuy nhiên, hệ thống này không
thể bảo vệ cơ thể hoàn toàn mà cần phải có sự hỗ trợ của các hợp chất chống oxy hoá
ngoại sinh như vitamin E, lycopen, lutein, zeaxanthin, polysaccharide. Do đó nghiên

cứu các chất có khả năng chống oxy hoá cao thực sự là một yêu cầu cấp thiết.

11


Các sản phẩm chiết xuất từ G. lucỉdum đã cho thấy chúng có các thành phần
như : polysaccharide, triterpenoid, polysacchariđe-protein, polysaccharide-peptide...
ở các nồng độ khác nhau, các chất này có khả năng làm triệt tiêu các gốc tự do đang
hoạt động hoặc có tác dụng bất hoạt, trung hoà chúng, không cho tham gia vào các
phản ứng oxy hoá khử tiếp theo. Kết quả là hạn chế quá trình bệnh lý do cắt đứt dây
chuyền phản ứng oxy hoá khử [14].
Nhiều thí nghiệm đã chứng minh các peptide tách chiết từ G. lucidum có khả
năng chống oxy hoá khử, kiềm chế mức độ oxy hoá trong các cơ quan và tổ chức mồ
[31], Đặc biệt, peptide còn có tác dụng ức chế và loại bỏ các gốc tự do của ROS tạo ra
trong cơ thể [29]. Vì vậy đây là nhân tố đầy hứa hẹn làm giảm tác hại do oxy hoá đối
với các phân tử sinh học. Ngoài ra các peptide cũng có khả năng tạo phức với các ion
kim loại chuyển tiếp n h ư F e2+, Cu2+,... ngăn cản chúng xúc tác cho phản ứng sinh các
gốc tự do như *02, *OH đơn trị [18]. Bên cạnh đó còn có các thí nghiệm cho thấy
G. lucidum có khả năng chống oxy hoá khi được sử dụng để điều trị những bệnh nhân
bị tổn thương ở tim do chất độc ethanol gây ra [41]. G. lucidum đã cho kết quả rất tốt
trong việc lọc các thành phần peroxit tồn đọng ở tim.
Các công trình nghiên cứu trên cho thấy sử dụng các hợp chất tự nhiên chiết
rút từ G. lucidum có thể thay thế cho các chất chống oxy hoá tổng hợp. Do đó, việc
nghiên cứu và tìm hiểu kỹ về các hợp chất tự nhiên trong G. lucidum ngày càng được
quan tâm hơn.
*
*

*

Tóm lại G. lucidum thực sự là một loại dược liệu quý, là loại thượng dược xếp
trên cả nhân sâm. G. lucidum không chỉ có tác dụng phòng chữa đối với nhiều loại
bệnh mà còn có tác dụng tăng cường sức khoẻ, bồi bổ cơ thể, kéo dài tuổi thọ. Theo
quan điểm y học cổ truyền phương Đông, dược tính của G. lucidum không thu hẹp ở
phủ tạng, mà tỏa ra toàn cơ thể với những hướng chủ yếu như: kiện não, bảo can,
cường tâm, bình vị, cường phế, giải độc, giải cảm ... Chính vì vậy, hiện nay trên thế
giới, ngày càng có nhiều nước quan tâm đến nuôi trồng và chế biến loại thảo dược
này để phục vụ cho việc chăm sóc sức khoẻ con người, nhất là các nước thuộc khu
vực Đông Nam Á - quê hương của G. lucidum. Tại Việt Nam, việc tập trung tìm hiểu
tác dụng dược lý của các hợp chất tự nhiên có trong thảo dược G. lucidum đã và đang
là hướng nghiên cứu chính của các phòng thí nghiệm .

12


C h ư ơ n g 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. NGUYÊN LIỆU
•

Giống Ganoderma lucidum được cung cấp bởi Phòng Giống Nấm gốc thuộc
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội. Sinh khối
sợi G. lucidum (GAL) được thu hoạch và tiến hành chiết rút thu dịch cao G.
lucidum tại Phòng thí nghiệm Sinh Y học - Đại học Khoa học Tự nhiên, dịch
chiết rút này được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo của
đề tài

•

Động vật thí nghiệm : Chuột nhắt trắng dòng Swiss (20 ± 2 g/con) được cung
cấp tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương.

2.2. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1. Hoá chất
•

Glucose, NaCl, KC1, Nazide, axit ascobic của Merk (Đức).

•

Tryptone, cao nấm men, agar của Difco (Mỹ).

•

Dextran, Thiobarbituric, Trichloacetic (TCA) của Sigma (Mỹ).

•

Các hoá chất khác đều đạt độ tinh sạch phân tích.

2.2.2. Thiết bị
•

Tủ cấy Nuaire NU - 425 - 600E, tủ cấy Telstar AV - 100 (Mỹ).

•

Máy trộn Voltex Nickel - 73810 (Mỹ).

•

Máy đo quang phổ Jenway 6305 (Anh).

•

Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R (Đức).

•

Máy phá tế bào Sartorius (Đức).

•

Tủ ấm M emmert, máy trộn Voltex K ika (Đức).

•

Máy chiếu u v Vilber Lourmat BLX - E254 (Pháp).

•

Một số thiết bị chuyên dụng khác.

13


2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u

2.3.1. Nuôi cấy và tách chiết Ganoderma lucidum
Chuẩn bị môi trường lỏng (Glucose + dịch chiết khoai tây), cấy giống từ ống
thạch nghiêng. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng (24 - 26°C), thu sinh khối sợi sau 15

đến 2 0 ngày.
Sinh khối sợi G. lucidum thu hái được sấy khô, sau đó đem nghiền bằng máy
xay. Bột G. ỉucidum được ngâm trong cồn 70° theo tỷ lệ 1:7. Dịch chiết G. lucidum
được cô cạn và bảo quản trong lạnh để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Phương pháp chống viêm thực nghiệm
Dextran 5% được sử dụng gây phù nề cấp ở gan bàn chân chuột. Thí nghiệm
tiến hành nghiên cứu khả năng chống viêm của dịch chiết G.lucidum nồng độ 5% và
10%.

Chuột nhắt trắng dòng Swiss được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm từ 10
đến 14 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Sau đó, chuột được đánh dấu, phân ngẫu
nhiên làm 5 lô, trung bình mỗi lô 5 con. Thí nghiệm được lặp lại từ 3 đến 5 lần.
Lô 1: Tiêm 0.03 ml Dextran 5%
Lô 2: Tiêm 0.03 ml Dextran 5% + tiêm 0.06 ml GAL 5%
Lô 3: Tiêm 0.03 ml Dextran 5% + tiêm 0.06 ml GAL 10%
Lô 4: Tiêm 0.03 ml Dextran 5% + uống 0.2 ml GAL 5%
Lô 5: Tiêm 0.03 ml Dextran 5% + uống 0.2 ml GAL 10%
Chuột được tiêm và uống dịch chiết sau 30 phút bị tiêm Dextran 5%. Xác định
sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm. Đánh giá tác dụng chống viêm của G. lucidum
bằng cách đo thể tích chân chuột trước và sau khi xử lý Dextran 5% + dịch chiết
G. lucidum ờ các nồng độ tương ứng.
Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm của dịch chiết G. lucidum được tính
theo công thức [32] :
1-

(P)‘
-

xioo

Pc
Trong đó : PT: Thể tích chân chuột thay đổi sau khi xử lí dịch chiết G. lucidum
pc : Thể tích chân chuột thay đổi sau khi tiêm Dextran 5%

14


2.3.3. Xác định hoạt tính chống oxy hoá của dịch chiết G anoderm a lucidum
Gan chuột dạng huyền phù cho tác dụng với axit thiobarbituric để tạo
phức có màu hổng vói độ hấp thụ cực đại ở bước sóng Xmax= 532 nm. Đo cường độ
màu của phức ở bước sóng này sẽ suy ra lượng m alondialdehyde (M DA) - sản phẩm
chính của quá trình peroxit hoá lipit màng tế bào gan chuột có trong mẫu [36 38].
Lượng MDA được tính theo công thức sau :

8.1

Trong đó :

c

: số mol

1: chiều dày cuvet

D : mật độ quang
8

: hệ số tắt mol (1.56 X 10'5M em ')

Hoạt tinh chông oxy hoá (HTCO) của dịch chiết G. lucidum ở các nồng độ

tương ứng được đánh giá bằng tỷ lệ % MDA giảm đi ở mẫu có dịch chiết khi so sánh
với mẫu đối chứng không có dịch chiết [36],
HTCO = % ( MDAđối chứng - M DAthf nghlộm)
2.3.4. Phương pháp chống oxy hoá thực nghiệm
Chúng tôi sử dụng CC14 hoà tan trong đầu theo tỉ lệ 1/10 để gây oxy hoá lipit
nhumô gan chuột. Như đã biết, gan chịu trách nhiệm về sự chuyển hoá của một số
lớn chất thuốc tan trong lipit, nên khi cho chuột uống CC14 pha trong dầu thì dưới tác
dụng của NADPH và các microsomes gan chuột, CC14 sẽ bị tách đi một! nguyên
tử C1 tạo ra gốc tự do *CC13. Gốc tự do này sẽ tác dụng với lipit trên màng tế bào
gan chuột gây nên những rối loạn thẩm thấu màng tế bào, gia tăng quá trình peroxit
hoá lipit, làm hoại tử và phá huỷ tế bào gan [34]. Từ đó chúng tôi đánh giá khả năng
chống oxy hoá của dịch chiết G. lucidum thông qua tiêu bản mô gan chuột và các chỉ
tiêu men gan (GOT, GPT).
Sư dụng chuột nhắt trắng làm thí nghiệm. Hàng ngày chuột được cho uống vào
9 giờ sáng. Thí nghiệm kéo dài 14 ngày và lặp lại từ 3 đến 5 lần. Cho chuột nhịn ăn
24 giờ trước khi tiến hành giết. Sau đó lấy máu đi xét nghiệm chỉ tiêu men gan và lấy
thùy gan làm tiêu bản cố định.
2.3.5. Phương pháp làm tiêu bản cố định
•

Cố định mẫu vật: Mẫu được đưa vào trong dung dịch Bouin có thể tích gấp 30
đên 50 lần thể tích mẫu. Sau đó được rửa dưới vòi nước chảy trong 6 giờ.

•

Đúc parafin:

15

■ Chuyển mẫu qua các dung dịch cồn có nồng độ từ 70°, 80°, 90°, 100°, 100°
và các dung dịch cồn + xylen (1:1), xylen 1, xylen 2. Mỗi lần 45 phút.
■ Chuyển m ẫu vào hỗn hợp xylen + parafin (1:1) ở 37°c rồi chuyển sang
parafin 1, parafin 2 ở 58 - 60°c, mỗi lần 6 giờ. Sau đó chuyển vào parafin
nguyên chất có trộn thêm 5 - 10 % sáp ong để ở 58 - 60°c. Sau 12 giờ lấy
m ẫu ra đúc.
■ Khuôn đúc là đĩa đồng hổ có phủ 1 lớp glycerin mỏng. M ẫu sau khi đúc
phải để 24 giờ cho parafin ổn định rồi mới cắt.
•

Cắt lát: Khối parafin đã đúc được cắt thành m iếng nhỏ hình thang cân rồi gắn
lên đ ế cắt của m áy. Lưỡi dao được chỉnh nghiêng khoảng 45° và song song với
cạnh của khối. Điều chỉnh sao cho độ dày lát cắt từ 5 - 7 |im .

•

Gắn lát cắt lên lam kính bằng albumin. Sau đó để lam kính ở 37°c, 24 giờ.

•

Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm kép H em atoxylin và Eosin.

•

Loại nước và làm trong tiêu bản: Chuyển nhanh tiêu bản qua dung dịch cồn
nồng độ từ 70°, 90°, 96°, 100°, 100° và dung dịch cồn + xylen (1:1), xylen 1,
xyỉen 2. M ỗi lần từ 2 đến 3 phút.

•

Đậy lam en và gắn Bomme Canada.

2.3.6. Xét nghiệm m en gan
Các chỉ tiêu men gan (GOT, GPT) được xác định tại Phòng Hoá sinh - Bệnh
viện Bạch Mai. Đây là những chỉ số sinh học quan trọng, thể hiện mức độ thương tổn
của gan.

16


C h ư ơ n g 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO LUẬN

A - KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
Chủng G. lucidum của Việt Nam được chúng tôi nuôi cấy, sinh trưởng trong
điều kiện phòng thí nghiệm và tiến hành thu dịch chiết. Sau đó, dịch chiết được bảo
quản trong 4°c để phục vụ các thí nghiệm của đề tài.
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIẾT G a m o d e r m a
lu c id u m TRÊN ĐỐI TƯỢNG CHUỘT NHẮT TRẮNG
Như đã đề cập, chúng tôi sử đụng Dextran 5% làm chất xúc tác phản ứng gây
phù nề cấp ở gan bàn chân chuột. Dextran là một loại polysaccharide có khối lượng
phân tử rất lớn (10 - 150 kDa), khi được tiêm vào gan bàn chân chuột, Dextran ngay
lập tức sẽ gây ra phản ứng viêm cấp tính.
Với thí nghiệm đánh giá khả năng chống viêm của dịch chiết G. lucidum, trước
hết chúng tôi xác định thời gian tối ưu để Dextran 5% gây sưng phù nề cấp gan bàn
chân chuột nhắt trắng. Đây sẽ là cơ sở để chúng tôi chọn thời điểm sử dụng dịch chiết
thích hợp, theo hai con đường tiêm và uống.
3.1.1. Thời gian tối ưu gây viêm cấp của Dextran 5%
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được đo thể tích

chân ban đầu. Sau khi

tiêm Dextran 5% chúng tôi theo dõi quá trình gây viêm cấp của dextran trên chuột
trong 24 giờ, cứ 30 phút đo thể tích chân một lần. Kết quả được trình bày ở Bảng 1.
Bảng 1. Thòi gian gây viêm cấp của Dextran 5% ở gan bàn chân chuột.
Thời gian (giờ)
Trước khi tiêm Dextran 5%

Thể tích chân chuột (ml)
0.143 ±0.013

Sau khi tiêm Dextran 5%
0.0

0.213 ±0.017

0.5

0.380 ±0.015

1.0

0.421 ±0.035

1.5

0.582 ±0.018

2.0

0.649 ± 0.044

2.5

0.687 ±0.031

3.0

0.718 ± 0.047

3.5

0.709 ±0.021

4.0

0.650 ± 0.024

24.0

0.518 ± 0.011
Đ A I H Ọ C Q U Ô C G IA HA NỌ!
TRUNG TẨM THÔNG TIN THƯ VIÊN

(ĐOÓOOOỮCƠ3

17


Kết quả đánh giá khả năng gây viêm cấp của dextran 5% cho thấy 3 giờ sau
khi chuột bị tiêm Dextran 5%, chân chuột sưng tấy cực đại (0.718 ml). Sau đó nếu

không được xử lí thuốc chống viêm, thể tích sưng của chân chuột có giảm nhưng rất
chậm, xuất hiện trạng thái chuột bị đau đớn, lông xù, khó chịu kéo dài.
Như vậy, sau 3 giờ tiêm chính là thời gian tối ưu gây viêm cấp của Dextran
5% trên chuột nhắt trắng. Do đó, chúng tôi chọn thời điểm này để đánh giá khả năng
chống viêm của dịch chiết G. ỉucidum theo hai con đường tiêm và uống.
3.1.2. Khả năng chống viêm của dịch chiết
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dịch chiết G. ỉucidum nồng độ 5% và 10%.
Sau khi tiêm Dextran 5% được 30 phút chúng tôi mới cho chuột uống hoặc tiêm dịch
chiết để tránh gây sốc phản vệ.
Dịch chiết G. lucidum được tiêm trực tiếp vào bắp chân chuột. Kết quả theo dõi
sự thay đổi thể tích chân chuột trình bày tại Bảng 2.
Bảng 2. Tác dụng chống viêm của dịch chiết G. lucidum theo đường tiêm.
Lô 1 (đối chứng): tiêm Dextran 5%
Lô 2: tiêm Dextran 5% + tiêm GAL 5%
Lô 3: tiêm Dextran 5% + tiêm GAL 10%

Lô thí nghiệm

Thể tích chân
chuột ban đầu
(ml)

Thổ tích chân
chuột sau 3 giờ
(ml)

Thể tích chân
chuột tăng
(ml)

% chống viêm

Lô 1

0.144 ±0.015

0.718 ± 0.047

0.574 ± 0 .0 3 6

_

Lô 2

0.142 ±0.013

0.358 ± 0.045

0.216 ± 0.025

62%

Lô 3

0.144 ±0.011

0.241 ± 0.032

0.097 ± 0.018

83%

18


Hình 3. Chuột nhắt trắng khi được sử lý cho tiêm dịch chiết G. lucidum.
Đồng thời với thí nghiệm trên, chúng tôi cũng tiến hành các lô thí nghiệm cho
chuột uống dịch chiết G. lucidum để xác định khả năng chống viêm.

Hình 4. Chuột nhắt trắng khi được sử lý cho uống dịch chiết G. lucidum.

19


Khả năng chống viêm của dịch chiết Linh chi khi cho chuột uống được ghi
nhận ở Bảng 3.
Bảng 3. Tác dụng chống viêm của dịch chiết G. lucidum theo đường uống.
Lô l(đối chứng): tiêm Dextran 5%
Lô 4: tiêm Dextran 5% + uống GAL 5%
Lô 5: tiêm Dextran 5% + uống GAL 10%

Lô thí nghiệm

Thể tích chân
chuột ban đầu
(ml)

Thể tích chân
chuột sau 3 giờ
(ml)

Thể tích chân
chuột tăng
(ml)

Lô 1

0.144 ±0.015

0.718 ±0.047

0.574 ± 0 .0 3 6

Lô 4

0.145 ±0.011

0.390 ±0.019

0.245 ± 0.021

57%

Lô 5

0.143 ± 0.0 2 6

0.313 ± 0.012

0.170 ± 0 .0 3 8

70%

% chống viêm

Kết quả ở Bảng 2 và 3 cho thấy dịch chiết G. lucidum đã làm giảm đáng kể thể
tích sưng chân chuột khi bị gây viêm cấp bằng Dextran 5%. Tại thời điểm chân chuột
sưng cực đại, do sự có mặt của dịch chiết nên thể tích chân chuột ở các lô thí nghiệm
so với lô đối chứng đã giảm đi hơn 50%. Đặc biệt dịch chiết G. lucidum nồng độ 10%
đã có tác dụng chống viêm đạt khoảng 80%, cao hơn hẳn dịch chiết nồng độ 5 %.
Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi đã chọn hai con đường xử lí hiện
tượng sưng phù nề cấp ở chuột là tiêm và uống dịch chiết G. ỉucidum. Kết quả so sánh
tác dụng của tiêm và uống dịch chiết được thể hiện ở Hình 4.

s
>

ỵ

*JS

ỉ

90
80
70
60
50

40
30
20
10
0

1
-

■ Tiêm
□ U ống

GAL 5 %

G A L 10%

Hình 5. So sánh khả nãng chống viêm ở chuột nhắt trắng khi cho uống hoặc tiêm
dịch chiết G. lucidum.

20


3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHốNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CHUỘT
CỦA DỊCH CHIẾT Ganoderma

lucidum

3.2.1. Xác định hoạt tính chống oxy hoá
Trong quá trình peroxit hoá lipit xảy ra phản ứng của các dạng oxy hoạt động
với các chất hữu cơ trong cơ thể, chủ yếu là các axit béo chưa no ở các tổ chức màng.

Sản phẩm chính của quá trình này là malondialdehyde (MDA). Do đó, xác định lượng
MDA hình thành nhiều hay ít sẽ đánh giá được quá trình peroxit hoá lipit mạnh hay
yếu, từ đó suy ra sự tương quan giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy
hoá trong cơ thể tăng hay giảm.
Nồng độ dịch chiết G. lucidum được sử dụng trong các mẫu thí nghiệm là 5%
và 10%. M ẫu đối chứng không sử dụng dịch chiết và quá trình peroxit hóa lipit được
diễn ra tự nhiên, lượng sản phẩm MDA tạo thành trong quá trình đó coi là 100%. Kết
quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.
Bảng 4. Hoạt tính chống oxy hoá của dịch chiết G. lucidum.
Lượng MDA

Nồng độ dịch chiết
(%)

MDA (xlO '5 M)

% so với đối chứng

Đối chứng

0.079 ± 0.026

100

GAL 5%

0.033 ±0.014

41.13

58.87

GAL 10%

0.012 ±0.051

15.32

84.68

Hoạt tính chống
oxy hoá (%)

Kết quả này cho thấy dịch chiết G. lucidum của chúng tôi có hoạt tính chống
oxy hoá khi làm giảm đáng kể lượng MDA sinh ra sau thời gian phản ứng. Đồng thời
kết quả trên cũng cho thấy hoạt tính chống oxy hoá của dịch chiết phụ thuộc vào
nồng độ. Trong đó, hoạt tính chống oxi hoá của dịch chiết G. lucidum nồng độ 10%
đạt khá cao (84.68%). Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành
với dịch chiết G. lucidum nồng độ 10%.
3.2.2. Đánh giá khả năng chống oxy hoá, bảo vệ tế bào gan chuột của dịch chiết
Ganoderma lucidum
Để thực hiện mục tiêu của đề tài chúng tôi sử dụng CC14 làm chất gây hoại tử
gan. Như đã trình bày, CCI4 sẽ tạo ra gốc tự do *CC13. Gốc này tác dụng với lipit trong
hệ thống màng tế bào gan chuột làm gia tăng quá trình peroxit hoá lipit, gây phá huỷ
21