Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây ô đầu (aconitum carmichaelii debx)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ TẠO RỄ TƠ
Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichaelii Debx.)
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn đây là kết quả
nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn
Trần Thị Hồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, em
đã được tạo điều kiện và nhận được sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, cơ quan,
bạn bè đồng nghiệp và gia đình.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan,
người hướng dẫn khoa học đã tận tâm chỉ bảo giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên
cứu và hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới Quý thầy cô khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,
truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Ban
giám hiệu trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Hội đồng Khoa
học của trường và Quý thầy, cô các phòng ban chức năng đã tạo điều kiện và
giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã
tạo điều kiện giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp,
bạn bè và gia đình đã luôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi.
Dù đã rất cố gắng, tuy nhiên không tránh khỏi những thiếu sót trong luận
văn, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Quý thầy/cô để luận văn
thêm hoàn thiện.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn
Trần Thị Hồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1

1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu .........................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3

1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu ......................................................................3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái của cây Ô đầu .........................................3
1.1.2. Thu hái, chế biến và bảo quản cây Ô đầu...................................................4
1.1.3. Thành phần hóa học, giá trị dược liệu và công dụng của cây Ô đầu .........4
1.1.4. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam ..................................5
1.1.5. Vai trò của cây Ô đầu .................................................................................6
1.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới và ở Việt Nam .................7
1.2.1. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới .......................................7
1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro ở Việt Nam........................................8
1.3. Các nghiên cứu tạo rễ tơ và ứng dụng ........................................................ 14
1.3.1. Tạo sinh khối rễ tơ ................................................................................... 14
1.3.2. Một số nghiên cứu tạo rễ tơ ..................................................................... 14
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18

2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 18
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 18
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19
2.3.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy............................................... 19
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ................................................................ 19
2.4. Phương pháp nuôi cấy tạo rễ tơ ở cây Ô đầu ............................................. 21
2.4.1. Chuẩn bị mẫu lây nhiễm .......................................................................... 21
2.4.2. Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes .................................... 22
2.4.3. Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn ................................................................... 22
2.4.4. Diệt khuẩn và cảm ứng rễ tơ.................................................................... 22
2.4.5. Nhân nuôi rễ tơ ........................................................................................ 22
2.4.6. Xác định khối lượng rễ khô ..................................................................... 22
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 23
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 24

3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro cây Ô đầu ......................... 24
3.2. Kết quả tái sinh chồi in vitro ở cây Ô đầu .................................................. 25
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh và sinh trưởng của
chồi in vitro ở cây Ô đầu ......................................................................... 25
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh và sinh trưởng của
chồi in vitro ở cây Ô đầu ......................................................................... 29
3.3. Kết quả tạo cây Ô đầu in vitro hoàn chỉnh ................................................. 31

3.3.1. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ........... 31
3.3.2. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ................ 33
3.4. Kết quả trồng và ra cây ngoài vườn ươm ................................................... 35
3.5. Tạo dòng rễ tơ ở cây ô đầu ......................................................................... 37
3.5.1. Kết quả tạo dòng rễ tơ ở cây Ô đầu ......................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

: 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid

AS

: Acetosyringone

BAP

: 6-Benzyl Amino Purin

ĐC

: Đối chứng

IAA

: Indoly Acetic Acid

IBA

: Indoly Butyric Acid

Kinetin

: 6-furturylamino purine

LB

: Luria Bertani

MS

: Murashige – Skoog

NAA

: α - Napthalen Acetic Acid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1.

Kết quả tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro từ đoạn thân
cây Ô đầu (n = 100 sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................... 24

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh và sự sinh
trưởng của chồi ở cây Ô đầu (n = 30) ........................................... 26
Bảng 3.3

Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh
trưởng ở cây Ô đầu (n = 30) .......................................................... 29

Bảng 3.4.

Ảnh hưởng α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ....... 32

Bảng 3.5.

Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu ...... 34

Bảng 3.6.

Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Ô đầu giai
đoạn vườn ươm (n = 30) ............................................................... 36

Bảng 3.7.

Kết quả khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Ô đầu

(n=150, sau 6 tuần) ........................................................................ 38

Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes, nồng độ AS,
thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả
tạo rễ tơ từ đoạn rễ cây Ô đầu (n=150, sau 6 tuần) ....................... 41

Bảng 3.9.

Xác định ngưỡng diệt khuẩn của cefotaxime sau 6 tuần .............. 42

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng trưởng rễ tơ ở
cây Ô đầu sau 6 tuần ....................................................................... 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Cây Ô đầu ........................................................................................ 3

Hình 3.1.

Hình ảnh chồi tái sinh khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 9 phút ...... 24

Hình 3.2.

Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi ở cây Ô đầu sau 8
tuần nuôi cấy ................................................................................. 27

Hình 3.3.

Ảnh hưởng của Kinetin tới sự phát sinh chồi ở cây Ô đầu sau 8
tuần nuôi cấy ................................................................................. 30

Hình 3.4.

Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô
đầu sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................. 33

Hình 3.5.

Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ in vitro ở cây Ô đầu
sau 8 tuần nuôi cấy ........................................................................ 35

Hình 3.6.

Hình ảnh cây Ô đầu trên giá thể đất phù sa + trấu hun ................. 36

Hình 3.7.

Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ ở cây Ô đầu sau 6 tuần
biến nạp ......................................................................................... 38

Hình 3.8.

Hình ảnh cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ ở cây Ô đầu ......................... 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước nhiệt đới có hệ thực vật phong phú và đa dạng.
Trong đó có nhiều loài thực vật được sử dụng làm thuốc hoặc làm nguyên liệu
để sản xuất thuốc chữa bệnh như: cây Xạ đen, Bình vôi, Diệp hạ châu, Giảo cổ
lam và Ô đầu… Tuy nhiên, nguồn dược liệu ngoài tự nhiên đang bị suy giảm
với tốc độ nhanh chóng cả về số lượng và chất lượng. Nhiều loài dược liệu quý
ở trong tình trạng khan hiếm và có đang nguy cơ bị tuyệt chủng làm ảnh hưởng
đến đa dạng sinh học và nguồn cung cấp dược liệu cho con người, trong đó có
cây Ô đầu. Nguyên nhân chủ yếu của vấn đề này là do việc khai thác quá mức,
cùng với các điều kiện bất lợi từ môi trường, sự biến đổi khí hậu và sự thu hẹp
của diện tích rừng tự nhiên... Vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp bảo vệ
cũng như phát triển nguồn gen cây dược liệu nói chung và cây Ô đầu nói riêng.
Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) có chứa aconitin là một loại
alkaloid có độc tính cao, tập trung chủ yếu trong củ Ô đầu. Ngoài ra, trong Ô
đầu còn chứa nhiều hợp chất khác như các polysaccharide, flavonoid và các
acid hữu cơ… Đối với con người, những hợp chất trong Ô đầu có tác dụng
giảm đau, chống oxy hoá, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn cản sự tăng sinh tế
bào, chống ung thư, tác động lên tim mạch... Hiện nay, cây Ô đầu được nhân
giống bằng củ con (phụ tử) hoặc cành giâm, nếu trồng bằng cành giâm thì tỷ lệ
mọc thành cây cũng không cao. Vì vậy, cần có nghiên cứu tạo ra nguồn đồng
đều, sạch bệnh để đáp ứng nhu cầu trồng và phát triển cây Ô đầu. Thực tiễn cho

thấy việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây trồng
là một sự lựa chọn hiệu quả với nhiều ưu điểm nổi bật là nhân giống nhanh, chủ
động, với số lượng lớn, thu được nguồn giống sạch bệnh và giảm chi phí.
Bên cạnh đó, để đáp ứng nhu cầu về thu hợp chất thứ cấp từ cây Ô đầu,
việc sản xuất sinh khối thông qua nuôi cấy rễ tơ đang là một hướng đi mới.
Nuôi cấy rễ tơ có tính ổn định di truyền, sinh hóa, tốc độ sinh trưởng nhanh và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




khả năng tổng hợp các hợp chất tự nhiên ở mức tương đương so với cây còn
nguyên vẹn. Do đó, nuôi cấy rễ tơ của cây dược liệu sẽ là một hệ thống hữu ích
cho việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh dược cao, đặc biệt là cây Ô
đầu. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum
carmichaelii Debx.)’’.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được môi trường thích hợp trong nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở
cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.).
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro cây Ô đầu
3.2. Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây Ô đầu
3.3. Nghiên cứu tạo cây Ô đầu in vitro hoàn chỉnh
3.4. Nghiên cứu trồng và ra cây ngoài vườn ươm
3.5. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ cây Ô đầu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Ô đầu
1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái của cây Ô đầu
Cây Ô đầu có tên gọi khác là Ấu tàu, Cố y, Gấu tàu. Về phân loại khoa
học, cây Ô đầu có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx, thuộc họ Hoàng
Liên (Mao Lương, Ranuculaceae) [4].
Cây Ô đầu thuộc chi Aconitum
Họ Mao lương (Ranunculaceae)
Bộ Mao lương (Ranunculales)
Phân lớp Mao lương (Ranunculidae)
Lớp Mộc lan (Magnoliopsida)
Ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [10].

Hình 1.1. Cây Ô đầu [42]
Mô tả về thực vật học, cây Ô đầu là cây thân thảo sống lâu năm, cao
chừng 0,6 – 1 m, rễ phát triển thành củ mập, hình con quay, có củ mẹ, củ con.
Rễ cái to mang nhiều rễ nhỏ (nên có tên là phụ tử). Thân mọc thẳng đứng, ít
phân nhánh. Lá mọc so le, lá có gân hình chân vịt, lá của cây có hình tim tròn,
có răng cưa to, phiến lá rộng 5 - 12 cm, xẻ thành 3 - 5 thùy to không đều nhau,
2 thùy 2 bên lại xẻ làm 3, thùy giữa lại xẻ thành 3 thùy con nữa. Mép các thùy
đều có răng cửa thô, to. Hai mặt lá có lông ngắn, mặt trên lục bóng, mặt dưới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




nhạt. Cụm hoa ở ngọn thân thành từng chù. Hoa lớn màu xanh tím mọc thành

chùm dày dài 10 – 20 cm. Bao hoa gồm 5 lá đài, lá đài trên thẳng và cong hình
mũi chụp kín tràng hoa đã tiêu giảm, nhị nhiều, bầu có 3 ô chứa nhiều lá noãn.
Hoa nở vào tháng 6 - 7. Quả thu hoạch vào tháng 7 - 8, quả gồm 5 đài mỏng,
hạt nhiều, trên mặt có nhiều vẩy nhỏ [42].
1.1.2. Thu hái, chế biến và bảo quản cây Ô đầu
Củ cây Ô đầu thường được thu hái vào cuối tháng 6, đầu tháng 7 hàng
năm. Tùy theo yêu cầu muốn có ô đầu, phụ tử thì việc lựa chọn những củ và
chế biến khác nhau. Theo hướng dẫn của Viện dược liệu chế biến ô đầu, phụ tử,
bạch phụ gồm các bước như sau [42]:
(1) Ô đầu là phần rễ củ. Muốn thu phần Ô đầu lựa chọn những củ mẹ, cắt
bỏ rễ con, rửa sạch, sấy hay phơi khô.
(2) Chế biến phụ tử tiến hành chọn những nhánh rễ con, to trung bình,
rửa sạch đất cát, cho vào vại có chứa Mg ngâm vài ngày (bước 1). Thông
thường, cứ 100 kg phụ tử sống ngâm 40 kg MgCl2 và 20 kg nước. Bước 2, đun
sôi vại phụ tử khoảng 2 - 3 phút, lấy ra rửa sạch, thái thành từng miếng mỏng
khoảng 5 mm. Bước 3, ngâm miếng phụ tử vào nước MgCl2, bổ sung đường đỏ
và dầu hạt cải, sao cho đến khi có màu nước chè đặc. Bước 4, rửa nguyên liệu
bằng nước sạch đến hết vị cay tê, phơi hoặc sấy khô trước khi bảo quản.
(3) Bạch phụ là những nhánh rễ con, nhỏ. Chế biến bạch phụ tiến hành
bằng cách rửa sạch, ngâm như chế biến phụ tử ở trên. Sau khi luộc sôi, bóc vỏ
đen, thái thành từng miếng mỏng 3 mm. Rửa đến khi hết cay, sau đó mới hấp
chín, phơi khô, xông hơi với diêm sinh và cuối cùng phơi khô là được.
Tất cả Ô đầu, phụ tử và bạch phụ sau khi chế biến được bảo quản ở nơi
khô ráo và thoáng mát [42].
1.1.3. Thành phần hóa học, giá trị dược liệu và công dụng của cây Ô đầu
Thành phần hóa học của cây Ô đầu trồng ở Việt Nam đã được nhiều tác
giả nghiên cứu [1], [3], [4]. Cây Ô đầu trồng ở Sa Pa có hàm lượng alkaloid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

toàn phần ở củ mẹ 0,36 - 0,8 %, củ con 0,78 - 1,17 %. Trong thành phần
alkaloid có aconitin và hypaconitin, ngoài ra còn 8 vết hiện màu với thuốc thử
Dragendorff trên sắc ký lớp mỏng. Aconitin dễ bị thủy phân thành acid acetic
và benzoylaconin. Độ độc benzoylaconin chỉ bằng 1/400 - 1/500 aconitin. Thủy
phân tiếp benzoylaconin cho một phân tử acid acetic và aconin, độ độc của
aconin bằng 1/10 benzoylaconin. Với cây Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai. Trong
các bộ phận của cây như: thân cây, củ, lá, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alkaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Từ phụ tử phân lập được các
chất là: karacolin, neolin, benzoylmesaconitin (nhóm alkaloid), acid benzoic, ßsitosterol. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong phụ tử là: 0,91 - 1,1 % [1].
Cây Ô đầu trồng ở huyện Quản Bạ, Hà Giang có hàm lượng alkaloid toàn
phần trong phụ tử sống là 0,93 %, trong Ô đầu là 0,70 %. Như vậy hàm lượng
alkaloid toàn phần trong Ô đầu (củ mẹ) lại thấp hơn phụ tử (củ con). Điều này
có thể do alkaloid trong Ô đầu, một phần chuyển sang phụ tử, một phần bị
chuyển hóa thành hợp chất khác hoặc một phần tự phân hủy. Hàm lượng
flavonid toàn phần trong lá tính theo quercetin bằng phương pháp đo quang là
1,60 % [4].
Về giá trị dược liệu, Ô đầu là một loại thuốc có tính độc thuộc bảng A.
Nhưng Ô đầu cũng là thuốc quý ở vùng cao dân địa phương thường hái thái
mỏng, ngâm rượu dùng để xoa bóp những nơi nhức mỏi, sai khớp, dập gãy
chân tay. Nếu uống quá nhiều sẽ gây ngộ độc. Theo Tây y, Ô đầu được sử dụng
làm thuốc trị ho, sưng đau, ra mồ hôi; trị đau nhức, mỏi chân tay, đau các khớp,
(dùng ngoài) đặc biệt dùng uống trong chứng bán thân bất toại, chân tay co
quắp, mụn nhọt lâu ngày [4]. Dùng trong trường hợp mạch gần như không có,
mồ hôi ra nhiều, vong dương, chân tay quờ quạng, thủy thũng [42].
1.1.4. Nguồn gốc và phân bố của cây Ô đầu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, hiện nay cây Ô đầu được trồng có nguồn gốc từ Trung Quốc
vào những năm 70 của thế kỷ trước. Cây Ô đầu thường mọc ở nơi có điều kiện
khí hậu lạnh, mát. Diện tích trồng cây Ô đầu đang được phát triển góp phần đa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




dạng hóa loại cây dược liệu và cây đặc sản ở vùng núi phía Bắc, dẫn đến nhiều
triển vọng lớn cho ngành y học nói riêng và nền kinh tế nói chung. Cây Ô đầu
hiện nay được trồng nhiều ở những vùng núi cao thuộc các tỉnh như: Hà Giang,
Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [21], [3].
1.1.5. Vai trò của cây Ô đầu
Ở trong cây Ô đầu có 3 thành phần hóa học chủ yếu là: alkaloid,
polysaccharide, flavonoid, trong đó alkaloid là thành phần chính. Trong các bộ
phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất
alkaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin. Aconitin là một loại alkaloid
chính có trong củ Ô đầu. Ngoài ra, ở trong củ Ô đầu còn có tinh bột, đường,
manit, chất nhựa, các acid hữu cơ, chất béo và sterol. Trong thân, lá và hoa cây
Ô đầu có chất carotenoid, sterol và flavonoid, ở hạt có thêm chất béo [35].
Cây Ô đầu là loại dược liệu có tính độc cao [10], [36]. Trong Cây Ô đầu
còn chứa chất gây độc ở hầu hết các bộ phận, nhiều nhất đó là ở củ. Ở trong
Dược thư Việt Nam, củ của cây Ô đầu được chia thành hai loại là củ lớn và củ
nhỏ. Củ nhỏ được gọi là phụ tử, củ lớn được gọi là Ô đầu. Phụ tử có độc tính
kém hơn Ô đầu. Ô đầu có tác dụng giảm đau, tăng cường miễn dịch, chống oxy
hóa, gây hạ đường huyết, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác dụng trên
tim mạch, chống viêm, chống tiêu chảy, kháng nấm và kháng virus [14]. Theo y
học dân tộc thì cây Ô đầu có vị cay tê, tính nóng, rất độc, có tác dụng trợ dương
bổ hoả, trừ phong hàn, táo thấp. Trong đông y, Ô đầu được dùng để chữa các
chứng phong tê, chân tay nhức mỏi, tê bại... Thường chỉ dùng làm thuốc uống
khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ định và theo
dõi thận trọng của thầy thuốc. Tây y dùng làm thuốc ho và chữa chứng ra mồ hôi
nhiều [40]. Vì vậy, trên thị trường hiện nay đã có một số sản phẩm làm từ cây Ô

đầu như: Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty Cổ phần Traphaco
dùng để trị đau nhức xương khớp [40].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Các nghiên cứu nhân giống in vitro trên thế giới
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính
của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm
sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu
thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp
đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch
bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [2]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên
cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để phát triển nguồn giống cây
trồng. Cristiano và cộng sự (2015) đã đánh giá hiệu quả của 2,4-D và BAP trên
sự hình thành protocorm ở một số vùng của rễ và lá cây Miltonia spectabilis
moreliana, cũng như nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sucrose và nồng độ
pH đến sự tăng trưởng của protocorms. Phân đoạn rễ và lá của cây trồng trong
ống nghiệm được nuôi trong môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D và
BAP, và giữ trong bóng tối trong 210 ngày. Sự kết hợp của 2,4-D 3 mg/l và
BAP 1 hoặc 3 mg/l cung cấp kết quả tốt nhất. Nồng độ sucrose 15 và 30 g/l,
không liên quan với pH, có hiệu quả hơn cho việc nuôi cấy trong ống nghiệm
của loài này. Nhưng chúng lại làm tăng về số lượng và chiều dài của rễ, chiều
cao và trọng lượng tươi của cây con. Độ pH chỉ có ý nghĩa kết hợp với sucrose
15 g/l cho chiều dài của rễ lớn nhất và trọng lượng tươi [31]. Ritu Mahajan và
cộng sự (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng,
phát triển thực vật đến nuôi cấy in vitro cây Aconitum heterophyllum. Kết quả
đã xác định được quy trình khử trùng hiệu quả đạt tỷ lệ mẫu sạch là 73,3 %.

Đồng thời xác định được môi trường tối ưu cho việc tạo mô sẹo, tạo đa chồi và
ra rễ cây Aconitum heterophyllum [35]. Ayyadurai và cộng sự (2016) đã tiến
hành nghiên cứu tái sinh đa chồi ở cây Cà hôi (Solanum pubescens) từ mẫu lá
cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP,
NAA, GA3. Số chồi lớn nhất đạt được là 3,5 chồi/mẫu ở nồng độ BAP 3,0 mg/l
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




+ GA31,0 mg/l [36]. Jahan và cộng sự (2009) đã tiến hành xây dựng hệ thống
tái sinh đa chồi ở cây Tam phỏng (xoan leo-Cardiospermum halicacabum L.)
từ đoạn thân mang mắt chồi bên trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP,
kinetin, TDZ và 2-isopentenyladenine. Kết quả cho thấy, chồi xuất hiện nhiều
nhất (14,83 chồi/mẫu) trên môi trường MS cơ bản có bổ sung TDZ 0,3 μM.
Môi trường ra rễ tối ưu của các chồi là môi trường 1/3 MS cơ bản có bổ sung
IAA 0,5 μM [37]. Autade và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu nhân
giống in vitro loài Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) từ đoạn thân mang mắt
chồi bên. Mẫu được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với các
nồng độ khác nhau kết hợp với kinetin. Sau 5 tuần cấy mẫu, hiệu quả đa chồi
tốt nhất (5,16 chồi/mẫu) là môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1,0 mg/l +
kinetin 1,0 mg/l. Chiều dài chồi tốt nhất (7,0 cm) được quan sát thấy trên môi
trường MS cơ bản có chứa BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,5 mg/l. Các chồi đơn được
cấy chuyển sang môi trường ra rễ là ½ MS cơ bản bổ sung IBA. Phản ứng tạo
rễ hiệu quả nhất với chiều dài 1,68 cm và số rễ (3,6 rễ/mẫu) được quan sát thấy
ở môi trường ½ MS cơ bản có bổ sung IBA 1,0 mg/l. Các cây con được chuyển
sang vườn ươm với tỷ lệ sống là 90 % [29].
1.2.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ nhân giống
cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay. Hiện nay, nhân giống thương mại

quy mô lớn ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu
cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, các giống mía mới nhập nội
năng suất cao, các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm.
Ngoài ra, kỹ thuật nhân giống in vitro cũng được áp dụng trên nhiều cây
trồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan
và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả… Từ việc thương mại hóa các quy trình nuôi
cấy trên là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng cho công nghiệp
vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [12]. Đối với các nguồn tài nguyên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng. Nhiều loài cây thuốc đang
trong tình trạng nguy cơ bị tuyệt chủng do con người khai thác quá mức. Vì vậy,
công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã giúp cho việc bảo tồn nguồn gen các
giống cây trồng, cây dược liệu đã được nhiều tác giả quan tâm như:
Tác giả Khuất Thị Hải Ninh và cộng sự (2017) khi nghiên cứu nhân giống
in vitro cây Re hương (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) đã xác định
được các bước nhân giống Re hương sử dụng chồi non làm vật liệu nuôi cấy
khởi đầu gồm: (1) khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút chia 2 lần (lần 1: 3
phút, lần 2: 2 phút) cho tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi đạt 38,9 %. Môi trường MS +
BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,1 mg/l là thích hợp nhất để tái sinh chồi lần một (tỉ lệ
mẫu nảy chồi đạt 100 % (với 3,2 chồi/nách lá); môi trường MS + BAP 2,2 mg/l
+ kinetin 0,1 mg/l + NAA 0,1 mg/l thích hợp nhất cho tạo cụm chồi (hệ số nhân
chồi 3,5 lần và chiều cao trung bình chồi 2,2 cm). Môi trường tạo rễ thích hợp
cho chồi Re hương in vitro là MS + NAA 0,4 mg/l (tỉ lệ chồi ra rễ trên 94,4 %,
rễ có chất lượng tốt) [15].
Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã xác định được môi
trường tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS cơ bản có bổ sung Kinetin

0,25 mg/l, môi trường nhân chồi là MS cơ bản có bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA
0,2 mg/l, môi trường tạo rễ là MS cơ bản có bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [27].
Tác giả Lê Tiến Vinh và cộng sự (2014) đã đưa ra quy trình nhân giống in
vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge). Nhằm xây dựng quy trình nhân
giống in vitro cây Đan sâm với mục đích bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý
này. Khử trùng mẫu hạt và cấy trên môi trường MS + GA3 1,0 mg/l, cho tỷ lệ
hạt nảy mầm 40,43 % sau 2 tuần nuôi cấy. Đoạn thân (kích thước 2 – 3 cm và có
một cặp lá), cắt từ cây Đan sâm nảy mầm được sử dụng làm vật liệu nhân nhanh.
Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (5,05 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường
MS + BA 0,5mg/l, α-NAA, IAA, IBA đều ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành
rễ của chồi cây Đan sâm. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




bổ sung IAA 0,75 mg/l, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100 %, số rễ trung bình đạt 6,19
rễ/cây sau 4 tuần nuôi cấy. Cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích
hợp để chuyển ra thích nghi ngoài vườn ươm. Trên giá thể chứa 50 % xơ dừa và
50 % cát, tỷ lệ cây sống đạt 100 %, cây sinh trưởng, phát triển tốt [28].
Tác giả Vũ Thị Lan và cộng sự (2011) đã xác định được môi trường thích
hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là:
SB1 (MS + NAA 2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0
mg/l BAP); SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA
2,0 mg/l + kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10 % nước dừa) và
SN10 (MS + NAA 2,0 mg/l + 20 % nước dừa) [9].
Tác giả Nguyễn Văn Hồng và Cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu
nhân giống cây Sa nhân tím. Xác định được các bước khử trùng bằng HgCl2
0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp
cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường nền (MS + sucrose 30 g/l + agar 5,2

g/l + inositol 100 mg/l) bổ sung BAP ở nồng độ 4 mg/l kết hợp với IAA ở nồng
độ 0,1 mg/l; môi trường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS +
sucrose 30 g/l + agar 5,2 g/l + inositol 100 mg/l) bổ sung IBA 0,1 mg/l [6].
Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu
nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam
thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa
cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời
xác định được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [17].
Tác giả Trần Ngọc Truồi và cộng sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của hệ thống chiếu sáng đơn sắc đến quá trình nhân giống in vitro cây
hoa chuông (Sinningia speciosa). Ở nghiên cứu này, đã xác định được hệ thống
chiếu sáng đơn sắc với hai loại đèn LED: Ánh sáng đơn sắc đỏ có bước sóng
650 nm (R), ánh sáng đơn sắc xanh có bước sóng 450 nm (B), kết hợp ánh sáng
đơn sắc đỏ và ánh sáng đơn sắc xanh theo các tỷ lệ khác nhau đã đưa ra quy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




trình nhân giống vô tính in vitro cây hoa chuông, nhằm tìm ra được nguồn
chiếu sáng đơn sắc phù hợp với từng giai đoạn trong quy trình nhân giống, để
nâng cao chất lượng cây giống và hạ giá thành trong sản xuất thương mại ở
quy mô lớn. Kết quả thu được cho thấy: Trong quy trình nhân giống in vitro
cây hoa chuông, hệ thống chiếu sáng đơn sắc sử dụng đèn LED có tính vượt
trội hơn so với sử dụng đèn huỳnh quang. Giai đoạn tái sinh chồi từ mô lá
dưới điều kiện chiếu sáng sử dụng đèn LED kết hợp tỷ lệ 70 % R + 30 % B
cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi/mẫu đạt giá trị cao nhất lần lượt là: 75,33
%; 1,96 chồi. Sử dụng ánh sáng đơn sắc đèn LED tỷ lệ 80 % R + 20 % B thích
hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi với hệ số nhân chồi đạt được là 7,87
lần, chiều cao chồi là 1,95 cm. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, sử dụng ánh

sáng đơn sắc đèn LED tỷ lệ 70 % R + 30 % B là thích hợp nhất. Chiều cao
cây đạt được là 7,54 cm, số lá 6,80 lá, số rễ 6,13 rễ, chiều dài rễ 2,07 cm, khối
lượng tươi 1,24 g/cây. Cây giống hoa chuông in vitro được nuôi cấy dưới điều
kiện chiếu sáng đơn sắc LED tỷ lệ 70 % R + 30 % B khi đưa ra trồng ở giai
đoạn vườn ươm thích nghi rất tốt với điều kiện tự nhiên. Tỷ lệ sống đạt 96,67
%, thời gian ra rễ sau trồng 5 ngày [25].
Tác giả Phan Xuân Huyên và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu
nhân giống in vitro và nuôi trồng cây lan gấm (Anoectochilus Llylei Rolfe ex
downies) ở điều kiện ex vitro. Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung BA
1mg/l là tốt nhất đến sự tái sinh chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy, với số chồi
5,70 chồi/mẫu, chiều cao chồi 3,72 cm. Môi trường MS có bổ sung NAA 0 – 2
mg/l đều thích hợp đến sự tái sinh rễ in vitro sau 30 ngày nuôi cấy, với tỉ lệ tái
sinh rễ 100 %. Chuyển cây lan gấm in vitro ra điều kiện ex vitro, giá thể 90 %
vụn xơ dừa phối trộn 10 % tro trấu là tốt nhất đến sự thích nghi của cây con sau
60 ngày nuôi trồng, với chiều cao cây 7,00 cm, chiều dài rễ 4,74 cm và tỉ lệ
sống đạt 100 %. Nuôi trồng cây lan ở điều kiện ex vitro, sau 120 ngày nuôi
trồng, phun phân Nitrophoska®Foliar với nồng độ 2 g/l (chiều cao cây đạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




11,00 cm, chiều dài rễ 7,60 cm, khối lượng tươi 1,81 g/cây, tỉ lệ sống đạt 100
%) tốt hơn nồng độ 1 g/l (chiều cao cây đạt 9,80 cm, chiều dài rễ 6,70 cm, khối
lượng tươi 1,64 g/cây, tỉ lệ sống đạt 100 %) [7].
Tác giả Bùi Văn Thắng (2017) đã tiến hành nhân giống in vitro cây Hà thủ
ô đỏ (Polygonum Multiforum Thunb) tuyển chọn tại tỉnh Hà Giang, đã đưa ra
được kết quả nghiên cứu thành công việc sát khuẩn bề mặt chồi bằng cồn 70 %
trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % trong 6 phút và cấy nuôi
mẫu trên môi trường MS có bổ sung BAP 0,2 mg/l + sucrose 30g/l, cho tỷ lệ

mẫu sạch nảy chồi là 48,53 %, chồi vươn cao, thân và lá xanh đậm. Cảm ứng
tái sinh cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l + 0,3 mg/l +
kinetin + NAA 0,2 mg/l và sucrose 30 g/l cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu
hiệu đạt cao nhất [23].
Tác giả Vũ Thị Hoài và Ninh Thị Nhíp (2019) đã tiến hành nhân giống in
vitro cây rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) DC.) nhằm xây dựng được
quy trình khử trùng mẫu, nuôi cấy khởi động, nhân nhanh chồi, tạo rễ và ra
cây ngoài giá thể. Đã xác định được thời gian khử trùng 10 phút bằng Johnson
(1%) cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 76,67 %. Nồng độ BA 0,5 mg/l
là tốt nhất cho sự hình thành và sinh trưởng của chồi cây (5,45 chồi/mẫu).
Giai đoạn nhân nhanh chồi, tổ hợp BA (0,5 mg/l) và α-NAA/IAA (0,5 mg/l)
cho kết quả tốt nhất với số chồi là 8,57/8,5 chồi; số lá TB là 4,97/4,93 lá và
chiều cao TB là 2,33/2,24 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Bổ sung 0,5 mg/l α-NAA
vào môi trường ra rễ đem lại hiệu quả cao với tỷ lệ ra rễ đạt 100 %. Sử dụng
giá thể vụn xơ dừa cho chất lượng cây con tốt nhất, tỷ lệ xuất vườn đạt 86,67
% tại 40 ngày sau trồng [5].
Tác giả Trần Trung Hiếu và cộng sự (2017) đã tiến hành nhân giống in
vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guil l) đưa ra được quy trình
nhân giống in vitro để bảo tồn loài dược liệu này. Các cụm chồi bất định (5 – 8
chồi/cụm) được tái sinh từ các đoạn thân mang chồi bên (cây 1 – 3 năm tuổi)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




sau 3 tháng nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy cây thân gỗ - WPM (Woody
Plant Medium) có chứa STS (silver thiosulfate) BA 3 và 5 – 7 mg/l. STS được
sử dụng để ngăn chặn sự rụng lá. Các cụm chồi con tăng trưởng chậm và đạt
chiều cao từ 1 – 3 cm sau 4 tháng nuôi cấy. Các cụm chồi này không thành lập
rễ sau 2 tháng nuôi cấy trên môi trường tạo rễ chứa IBA hoặc NAA 1–5 mg/l.

Có 51 % cụm chồi (đã được xử lý trên môi trường tạo rễ) có khả năng thích
nghi và tạo thân và lá mới sau 2 tháng nuôi trồng trong vườn ươm. Môi trường
WPM có STS 3, BA 5 và IBA 5mg/l cho sự thành lập mô sẹo nhiều nhất từ các
mẫu lá trưởng thành sau 3 tháng nuôi cấy. Trong số các loại mô sẹo, mô sẹo
chắc màu trắng đục được tạo ra tại mặt cắt của mô lá sau 3 tháng nuôi cấy và
phát triển thành mô sẹo chắc dạng nốt sau 4 tuần [8].
Tác giả Vũ Hoài Sâm và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu nhân
giống in vitro cây Bách hợp (Lilium Brownii F.E. Brown), đưa được quy trình
nhân giống in vitro thành công sử dụng vật liệu ban đầu là đoạn thân và vẩy củ.
Vật liệu sau khi khử trùng 10 phút bằng dung dịch HgCl2 trên môi trường BAP
0,5 mg/l và NAA 0,5 mg/l tương ứng với mỗi loại mẫu. Môi trường tốt nhất để
tạo củ là MS + 0,5 mg/l α-NAA. Số củ mới tạo thành trên một mẫu đạt cao nhất
(4,5 củ) thu được trên môi trường MS + sucrose 60 g/l + NAA 0,5 mg/l + BAP
0,2 mg/l sau 60 ngày nuôi cấy. Môi trường thích hợp để tạo rễ là 1/2 MS có bổ
sung tổ hợp NAA 1,0 mg/l và BAP 0,2 mg/l. Cây Bách hợp in vitro được đưa
thành công ra vườn ươm trên nền giá thể TN1[18].
Tác giả Ngô Thanh Tài và cộng sự (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác
động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành
cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng
sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng; ánh sáng đèn
LED đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự
hình thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [19].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.3. Các nghiên cứu tạo rễ tơ và ứng dụng
1.3.1. Tạo sinh khối rễ tơ
Rễ tơ hiện nay đang là hướng nghiên cứu mới, được ứng dụng rất lớn do

chúng có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng,
dễ dàng nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đơn giản, giá thành rẻ, dễ dàng sản xuất
một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn, có thể tạo sinh khối liên
tục nên được xem là một trong những xu hướng mới được sử dụng để biểu hiện
các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Một ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ thực vật so
với các hệ thống nuôi cấy thực vật chuyển gen khác là chúng không đòi hỏi diện
tích canh tác, không chịu ảnh hưởng của môi trường, mùa vụ, sản phẩm protein
thu được không mang các yếu tố độc hại từ thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và rút
ngắn được thời gian sản xuất. Ngoài ra, sản phẩm sinh học tái tổ hợp thu được
thường được biểu hiện ra môi trường nuôi cấy, điều này giúp cho quá trình tinh
sạch các sản phẩm sinh học được thuận lợi và đạt độ tinh sạch cao [33]. Những
kết quả khoa học trên của các tác giả nghiên cứu cho thấy có triển vọng ứng
dụng thực tiễn cao. Các dòng rễ tơ chuyển gen sinh trưởng nhanh đã tạo được
trên hai đối tượng trên có thể tiếp tục nghiên cứu nuôi cấy bổ sung các elicitor
nâng cao hàm lượng hoạt chất trong rễ, đồng thời thiết lập quy trình nuôi cấy
sinh khối ở quy mô lớn (bioreactor) làm nguyên liệu sản xuất cho các xí nghiệp
dược phẩm nghiên cứu ứng dụng sản xuất các chế phẩm phục vụ sức khỏe cộng
đồng. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ nuôi rễ tơ sẽ góp phần tạo nguồn dược
liệu quý phục vụ sức khỏe cộng đồng và đóng góp cho công tác bảo tồn các cây
dược liệu quý ở Việt Nam. Ngoài ra còn tạo ra nguồn dược liệu quý, giảm khai
thác trong tự nhiên và góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Cung cấp nguồn
nguyên liệu sạch cho ngành dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm.
1.3.2. Một số nghiên cứu tạo rễ tơ
Hiện nay, ở Việt Nam hay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên
cứu tạo rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ để tăng cường sản xuất các chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

chuyển hóa thứ cấp tự nhiên có trong rễ. Vì vậy, một số tác giả đã và đang
được quan tâm đến như:
Tác giả Vũ Thị Như Trang và Chu Hoàng Mậu (2017) đã tiến hành nghiên
cứu tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm Việt Nam (Talinum paniculatum Gaertn). Do
đó một phương pháp đã được đề xuất để tăng cường hàm lượng flavonoid trong
cây Thổ nhân sâm là ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tạo dòng rễ tơ tăng sinh
khối. Nghiên cứu này trình bày kết quả tối ưu hóa quy trình tạo dòng rễ tơ
thông qua Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes) ở cây Thổ nhân sâm.
Trong 3 loại vật liệu lây nhiễm với Agrobacterium rhizogenes (lá mầm, đoạn
thân mang mắt chồi bên, mô lá) thì mô lá là vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ.
Mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l;
thời gian nhiễm khuẩn 10 phút; thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày; nồng độ
cefotaxime 500 mg/l là những điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ từ mô
lá. Môi trường MS ở trạng thái lỏng, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,
nuôi trong điều kiện lắc là thích hợp cho sự tăng trưởng rễ tơ. Kết quả kiểm tra
sự có mặt gen rolC bằng phương pháp PCR và sự vắng mặt của gen virD2 đã
khẳng định 5 dòng rễ tơ được tạo ra từ cây Thổ nhân sâm [25].
Tác giả Ninh Thị Thảo và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm
ứng và nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge). Đã tiến hành
nhằm cảm ứng tạo dòng rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 và để khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ. Trong ba loại vật liệu lây nhiễm với vi
khuẩn (lá, cuống lá và đoạn thân), mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng rễ tơ
Đan sâm. Với mật độ vi khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất
(53,85%) tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2. Kết quả kiểm tra sự
có mặt của gen rolA bằng phương pháp PCR khẳng định 4 dòng rễ tơ đã được
cảm ứng thành công. Các dòng rễ tơ có khả năng tăng trưởng nhanh và ổn định
khi nuôi cấy trong môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Tốc độ
tăng trưởng của dòng rễ tơ A5.14 khi được nuôi cấy trên môi trường B5 cao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

hơn, khi được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản. Trong bốn phương thức
nuôi cấy thử nghiệm gồm môi trường B5 đặc, lỏng, bán lỏng và phân lớp, khối
lượng rễ tơ tăng so với khối lượng rễ ban đầu đạt cao nhất (7,67 lần) sau 4 tuần
khi nuôi cấy rễ tơ trên môi trường B5 đặc [21].
Tác giả Trà Đông Phương và cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu cảm
ứng tạo rễ tơ cây cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.) từ bốn
chủng Agrobacterium rhizogenes. Cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.)
A. DC.), loài duy nhất trong chi Platycodon (Campanulaceae), chúng phân bố
chủ yếu ở vùng Đông Á. Rễ cát cánh được coi là một vị thuốc sử dụng rộng rãi
trong y học có tác dụng chữa ho, đau họng, suyễn, lao, tiểu đường và một số
bệnh viêm nhiễm. Hiện nay, các nghiên cứu đã chứng minh rằng rễ cát cánh
chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Để nghiên cứu và thu nhận các hợp
chất có giá trị từ rễ cát cánh, bằng kĩ thuật cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tạo nguồn
nguyên liệu ban đầu ổn định, có khả năng tăng sinh khối nhanh (trong môi
trường không có hormone) và sản xuất nhiều hợp chất thứ cấp đã được xây
dựng trên loài thực vật này. Lá cát cánh là nguyên liệu được cảm ứng tốt nhất
với 100 % số mẫu có khả năng tạo rễ tơ. Đã đưa ra được quy trình tối ưu hóa
thời gian ngâm mẫu và thời gian đồng nuôi cấy với kết quả tốt nhất tương ứng
là 10 và 15 phút (10 phút cho chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và 15 phút cho
chủng A. rhizogenes C34) và 72 giờ. Vì vậy, kĩ thuật cảm ứng tạo rễ tơ cát cánh
được mô tả trong nghiên cứu này là một kĩ thuật hữu ích, có thể được áp dụng
cho nghiên cứu và thu nhận các hợp chất thứ cấp có giá trị từ nuôi cấy rễ tơ cát
cánh [16].
Tác giả Bùi Đình Thạch và cộng sự (2012) đã tiến hành tạo nguyên liệu in
vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago
zeylanica L.) đưa ra kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian khử trùng 20 phút,

10 % dung dịch javel là điều kiện tối ưu cho tạo mẫu in vitro (41,29 %), môi
trường MS có bổ sung BA 1,5 mg/l và IBA 0,1 mg/l tạo được chồi tối ưu (4,67
chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy, chồi in vitro phát triển thành cây tốt nhất ở môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l. Hai chủng vi khuẩn Agrobacterium
rhizogen 11325 và 15834 được sử dụng trong công thức chuyển gen tạo rễ tơ,
kết quả bước đầu đã chọn lọc 5 dòng rễ được cho là thể chuyển gen [22]. Tác
giả Dhakulkar và cộng sự (2005) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ ở
cây Lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.) để sản xuất hợp chất verbascoside bằng
cách lây nhiễm với chủng A. rhizogenes ATTCC 15834 hoang dại vào lá mầm.
Kết quả của nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mẫu cấy hình thành rễ tơ là 32 %. Kiểm
tra các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu RolB và phân
tích các sản phẩm PCR bằng kĩ thuật Southern blot cho thấy 6 dòng rễ tơ được
chuyển gen có khối lượng rễ tơ tăng gấp 7 lần sau 4 tuần nuôi cấy so với rễ cây
non không chuyển gen. Đồng thời, rễ tơ có khả năng tổng hợp verbascoside, là
một phenylpropanoid glycoside có giá trị về y học [32].
Tác giả Hà Thị Loan và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu tạo rễ tơ
ở Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) từ lá và cuống lá nhờ A. rhizogenes.
Kết quả cho thấy, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ từ mô cuống lá (14,8 %) cao hơn
mô lá (3,3 %); số rễ tạo ra trên mẫu cuống lá (2,8 rễ/mẫu) cao hơn so với mẫu
lá (1,6 rễ/mẫu). Thời gian để cuống lá cảm ứng tạo rễ là 5 tuần, trong khi đó
với mẫu lá là trên 6 tuần. Kết quả phân tích rễ tơ trên sắc kí UFLC cũng khẳng
định sự hiện diện của 3 hoạt chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh là
MR2, Rb1 và Rg1. Rễ tơ sinh trưởng tốt trong môi trường nuôi lỏng lắc và
không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, do đó giúp giảm được những ảnh
hưởng không mong muốn đến sức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản

phẩm [11]. Như vậy, trong thời gian gần đây trên thế giới và Việt Nam đã có
nhiều công trình nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật. Sự thành công trong tạo dòng
rễ tơ, nuôi cấy sinh khối rễ tơ và tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp, sản
xuất các protein tái tổ hợp có trong rễ tơ ở cây dược liệu đã đóng góp đáng kể
cho công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN