Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matk, ITS của cây lan một lá (nervilia fordii)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS
CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS
CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii)
Ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NguyễnThị Tâm

Thái Nguyên - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Linh

C
Ủ
A

C
Ủ
A

P
S.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn
Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô và cán bộ Bộ môn
Di truyền học hiện đại, Khoa Sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào
tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt
thời gian học tập và hoàn thành luận văn.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn

Trần Thị Thùy Linh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................. v

MỞ ĐẦU........................................................................................................... v
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá ...................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học................................................................................... 4
1.1.3. Phân bố.................................................................................................... 5
1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá ................................................. 6
1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá ................................................................ 7
1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode) .................................................................. 8
1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu ............................ 10
1.3.1. Đặc điểm vùng ITS................................................................................ 10
1.3.2. Đặc điểm gen matK............................................................................... 11
1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới.. 11
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 14
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu.................................. 15
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15
2.1.2 Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 15
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................ 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................... 15
2.2.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm hình thái ................................ 16
2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử....................................................... 16

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 20
3.1. Đặc điểm hình thái của mẫu lan Một lá thu thập tại Thái Nguyên và Cao
Bằng................................................................................................................. 20
3.2. Đặc điểm của gen matK và ITS phân lập từ cây lan Một lá.................... 22
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây lan Một lá........................................ 22
3.2.2. Kết quả nhân gen matK và ITS bằng phản ứng PCR ............................ 23
3.2.3. Kết quả xác định trình tự nucleotit đoạn gen matK và ITS phân lập từ
các mẫu lan Một lá .......................................................................................... 24
3.3. Sự đa dạng về trình tự nucleotit của vùng ITS và matK của cây lan Một lá
......................................................................................................................... 32
3.3.1. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của vùng ITS của cây lan Một lá .........
32
3.3.2. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của đoạn gen matK của cây lan Một lá.
34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................. 37
1. Kết luận ....................................................................................................... 37
2. Đề nghị ........................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá (Nervilia fordii)......................... 4
Bảng 2.1.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen ITS và matK ............................ 17
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................
17
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen ITS và matK..................... 18

Bảng 3.1. Số lượng và tỉ lệ từng loại nucleotit của vùng ITS từ mẫu LML-01TN (ITS-01-TN) và mẫu LML-02-CB (ITS-02-CB)..................................... 24
Bảng 3.2. Các vị trí nucleotit sai khác giữa trình tự nucleotit của đoạn gen
matK của mẫu lan Một lá matK-02-CB với JX865503 và JN004498. .......... 32
Bảng 3.3. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự vùng ITS
trên GenBank................................................................................................... 33
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng ITS từ
mẫu LML-01-TN và LML-02-CB với trình tự vùng ITS trên GenBank........ 33
Bảng 3.5. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự gen matK
trên GenBank................................................................................................... 35
Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự đoạn gen matK
từ mẫu LML-02-CB với các trình tự đoạn gen matK trên GenBank............. 35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao Bằng và
Định Hóa - Thái Nguyên. ................................................................................... 5
Hình 3.1. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Hòa An
tỉnh Cao Bằng (LML-02-CB).......................................................................... 21
Hình 3.2. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Định
Hóa tỉnh Thái Nguyên (LML-01-TN)............................................................. 21
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số ........................... 23
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen matK và ITS từ
hai mẫu lan Một lá........................................................................................... 24
Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan
Một lá mẫu LML-02-CB với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng
BLAST trong NCBI ........................................................................................ 26

Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan
Một lá LML-01-TN với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST
trong NCBI...................................................................................................... 26
Hình 3.7. Trình tự vùng ITS của mẫu LML-01-TN, LML-02-CB và hai trình
tự mang mã số JX011630 và JX011631 trên GenBank .................................. 28
Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự gen matK của mẫu
lan Một lá LML-02-CB với một số trình tự gen matK trên GenBank bằng
BLAST trong NCBI. ....................................................................................... 29
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen matK của mẫu LML02-CB và hai trình tự mang
mã số JX865503 và JN004498 trên GenBank ................................................ 31
Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình
tự nucleotit của vùng ITS. ............................................................................... 34
Hình 3.11. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình
tự nucleotit của đoạn gen matK....................................................................... 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới có hệ thực vật vô cùng
đa dạng và phong phú. Theo thống kê, ở nước ta hiện có gần 12.000 loài thực
vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ, 69 loài thực vật hạt trần,
12.000 loài thực vật hạt kín, 2.200 loài nấm, 2.176 loài tảo, 481 loài rêu, 368
loài vi khuẩn lam, 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [1], [7]. Trong số các
loài thực vật ở nước ta có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Trải
qua nhiều năm điều tra nghiên cứu, thống kê cho thấy ở Việt Nam có khoảng
hơn
3.800 loài thực vật được dùng làm thuốc. Đó là nguồn tài nguyên vô cùng quý

giá [2],[8]. Hiện nay nhiều loài có giá trị đang bị người dân khai thác và thu
hái để bán vì lợi ích kinh tế. Trong đó, loài lan Một lá (Nervilia fordii) thuộc
họ Lan (Orchidaceae) có nhiều công dụng như: làm thuốc giải độc nhất là ngộ
độc nấm, làm mát phổi, chữa ho lao, ho lâu năm, viêm phế quản…[2]. Ở nước
ta hiện có 5 loài thuộc chi Nervilia đó là: Nervilia aragoana, Nervilia
crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata và Nervilia prainiana mang một số
đặc điểm hình thái tương tự nhau [2],[6].
Trước đây, việc phân biệt các giống, loài chủ yếu thông qua đặc điểm
hình thái. Tuy nhiên, một số loài có đặc điểm hình thái rất giống nhau, do vậy
khó có thể nhận biết và phân biệt một cách chính xác nếu chỉ dựa trên các đặc
điểm hình thái giải phẫu. Để khắc phục được khó khăn trong phân loại hình
thái thì phương pháp phân loại học phân tử là phương pháp mang lại hiệu quả.
Phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại
chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích DNA cho những kết quả chính xác,
giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




loại. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ
thuộc vào các yếu tố môi trường.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Trong các phương pháp phân loại phân tử, mã vạch DNA (DNA

barcode) là phương pháp phổ biến nhất dựa trên những đoạn trình tự DNA
ngắn có tốc độ tiến hóa đủ nhanh để hỗ trợ giải quyết những khó khăn trong
phân loại hình thái. Trên đối tượng thực vật, các vùng mã vạch DNA thường
được sử dụng trong phân loại phân tử thường là các trình tự thuộc hệ gen nhân
như ITS (Internal transcribed spacer) và hệ gen lục lạp như psbAtrnH, matK,
rbcL, rpoC1...
Đối với các loài thuộc chi Nervilia, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra xu
thế phân loại của vùng gen matK so với 3 vùng gen ITS2, rbcL và LSU D1D3. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA đã chỉ ra rằng việc sử
dụng kết hợp hai mã vạch DNA cho kết quả phân loại tốt hơn so với từng
mã vạch đơn lẻ. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào
nghiên cứu đặc điểm hình thái chi tiết và mã vạch DNA của loài lan Một lá
Nervilia fordii.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu:
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây Lan
một lá (Nervilia fordii)” nhằm mô tả, xác định các đặc điểm hình thái đặc
trưng và phân tích trình tự hai vùng gen có độ biến thiên cao, thích hợp cho
định loại phân tử là ITS và matK của loài Lan một lá (Nervilia fordii) ở Việt
Nam, góp phần tư liệu hóa nguồn gen của cây Lan một lá và xây dựng mã
vạch DNA.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân tích được đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu thập ở
địa phương khác nhau.
- Dựa trên phân tích trình tự gen ITS và matK để xác định được mối quan
hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu và phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho
lan Một lá (Nervilia fordii).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu được ở
một số địa phương khác nhau.
- Phân lập và giải trình tự vùng ITS và đoạn gen matK từ một số mẫu lan
Một lá.
- Phân tích, so sánh trình tự nucleotit của vùng ITS và đoạn gen matK từ
các mẫu lan Một lá thu được và lập cây phát sinh chủng loại.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Chi lan Một lá (Nervilia) gồm các loài sống sát mặt đất. Chi Nervilia
có khoảng 65 loài đã được ghi nhận. Ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Nervilia
đó là: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata
và Nervilia prainiana. Cây đầu tiên thuộc chi Nervilia được Roptrostemom
phát hiện vào năm 1828. Sở dĩ cây này có tên là Nervilia do chữ Nerve
nói về những đường gân trên lá. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ đặt tên là Trân
Châu và Trần Hợp gọi là Thanh Thiên Quỳ [8].
Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá
(Nervilia fordii (Hance) Schlechter)
N Ma
à g
L L
si

O
d
O
i
Ne
a
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Theo tài liệu "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” - của Đỗ Tất
Lợi, lan Một lá còn có tên Thanh thiên quỳ hay Bầu thoọc (bầu nghĩa là lá,
thoọc là một) hay Trân châu diệp. Lan Một lá thường mọc ở kẽ núi đá, nơi
thấp và ẩm ướt, dưới bóng cây to hoặc dưới đám cỏ dày đặc. Hầu như không
thấy mọc ở bờ ruộng hay ở những môi trường khác. Lan Một lá là loại cây
địa sinh, sống lâu, cao từ 10 - 20cm. Thân rất ngắn, củ tròn to, có thể nặng tới
1,5
- 20g. Thẳng từ củ, chỉ mọc lên có một lá riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




tròn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đường kính 10 - 25cm mép uốn lượn.
Gân lá toả đều từ cuống lá, cuống lá dài 10 - 20cm, màu tím hồng. Cụm hoa
có cán dài 20 - 30cm, hoa thưa 15- 20 cái, mọc thành chùm hay bông màu
trắng, đốm tím hồng hay màu vàng hơi xanh lục. Lá đài và cánh hoa giống
nhau. Cánh môi 3 thuỳ, có rất nhiều gân, có lông ở quãng giữa, thuỳ bên và
thuỳ tận cùng hình ba cạnh, cột dài 6mm, phồng ở đỉnh. Ra hoa tháng 3 - 4 5, quả nang vào các tháng 4 - 5 - 6. Khi hoa nở, đầu cánh hoa phía trên chụm
lại làm toàn hoa giống như chiếc đèn lồng. Quả hình thoi, trên có múi trông
giống như quả khế con, dài 2 - 3cm. Thường sau khi hoa tàn rồi lá mới phát
triển do đó hoặc ta chỉ thấy cây mang hoa, hoặc quả, không có lá, hoặc chỉ
thấy cây có lá, thường một lá [8].

Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao
Bằng và Định Hóa - Thái
Nguyên.
1.1.3. Phân bố
Lan Một lá được tìm thấy tại các vùng châu Phi, châu Úc và Châu Á,
Trung và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, lan Một lá phân bố ở các tỉnh Hà Giang,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng,
Lạng
Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Tây, Thanh Hóa…
Trước đây, cây lan Một lá ít được chú ý khai thác ở nước ta nhưng trong
những năm gần đây, do loài cây này có giá trị lớn nên bị khai thác nhiều để
bán qua biên giới cho Trung Quốc. Người Trung Quốc tìm mua cây lan Một lá
với giá cao từ 1 - 2 triệu đồng/1 kg. Do lượng cây lan Một lá trong tự nhiên
không nhiều cùng với tốc độ khai thác của người dân để bán và làm thuốc
khiến cho loài cây này trở nên quý hiếm và có nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng.
Cây lan Một lá được ghi vào danh sách các loài cây cần được bảo vệ trong
“Sách đỏ Việt Nam”.
1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá
Hiện nay, ở nước ta chưa có các công trình nghiên cứu về thành phần
hóa học của cây lan Một lá (Nervilia fordii). Tuy nhiên, trên thế giới đã có
một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh
học của các hợp chất chiết xuất từ cây lan Một lá. Kết quả nghiên cứu về
thành phần hóa học cho thấy, lan Một lá (Nervilia fordii) chứa terpenoids,
flavonoid, axit amin và một số loại dầu dễ bay hơi. Các hợp chất này có hoạt

tính dược lý chống viêm, chống vi rút và giảm đau, giảm ho, hen suyễn và
viêm phế quản mãn tính [19].
Năm 2012, Zhang Li và cộng sự tiến hành nghiên cứu về thành phần
hóa học trên toàn bộ cây lan Một lá (Nervilia fordii). Kết quả, Zhang Li đã
phân lập được 10 chất và xác định được đó là các chất như: rhamnetin,
rhamnazin, rhamnocitrin, rhamnazin-3O-β-D-glucoside, rhamnocitrin-4'- Dglucoside,

rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-Dglucopyranoside,

oblanatuoside, stigmastero, stigmasterol-3 -D-glucoside và cerevistero [23].
Trong một công trình nghiên cứu khác Zhang Li và cộng sự còn phát hiện ra
ba loại flavonol glycoside mới được phân lập từ cây lan Một lá (Nervilia fordii)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




là rhamnazin 3-O-β-d- xylopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranoside,rhamnazin3O-d-glucopyranosyl-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




(1→4) d-glucopyranoside và rhamnazin 3-O-β-d-xylopyranosyl- (1 → 4) -βd- glucopyranoside-4′-O-d-glucopyranoside [25].
Hiện nay, các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu về thành phần hóa
học và hoạt tính ức chế khối u của các chất chiết xuất từ cây lan Một lá
(Nervilia fordii). Kết quả sàng lọc hoạt tính chống ung thư trong ống nghiệm
chỉ ra rằng dịch chiết từ cây lan Một lá có tác động ức chế đáng kể đối với sự
phát triển của tế bào ung thư. Các cấu trúc hóa học đã được làm sáng tỏ trên cơ

sở các tính chất hóa lý và dữ liệu quang phổ và được xác định là
cycloeucalenol; stigmaterol; sitosterol; axit ursolic; aurantiamide; (20S, 22E,
24R)-ergosta-7,22-dien-3β, 5α,
6β-triol; 6 methoxy-cerevisterol; và-daucosterol
[13].
1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá
Ở Việt Nam, chưa có các công trình nghiên cứu về cây lan Một lá cũng
như thành phần hoá học có trong thân lá và củ của loài này. Tuy nhiên, từ lâu
cây lan Một lá đã được sử dụng như một loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế.
Về tính vị và tác dụng: Cây lan Một lá có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính
bình, có tác dụng thanh nhiệt, nhuận phế, giảm ho, làm dịu cơn đau, tán ứ. Ở
nước ta, đồng bào dân tộc ở miền núi thường sử dụng lá của cây làm thuốc
giải
độc, nhất là ngộ độc nấm. Người ta dùng 2 - 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với
nước sôi trong ít phút rồi chiết nước uống 2 lần/ngày. Cây lan Một lá cũng
được dùng làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, làm thuốc bổ phổi và mát phổi, chữa
lao phổi, ho lâu ngày. Liều dùng thông thường là dùng 10 - 20 lá dưới dạng
thuốc sắc, thuốc hãm, hấp đường hoặc chế biến thành cao lỏng để uống hàng
ngày. Ngoài ra, loài cây này còn dùng để chữa các bệnh như mụn nhọt, lở,
ngứa bằng cách lấy lá tươi giã nát, đắp lên các chỗ đau nhức hoặc đắp lên
mụn, nhọt hoặc các vết lở [2],[8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn bộ cây để trị các bệnh: ho, lao phổi,
viêm phế quản, viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao; trẻ em hấp thụ kém
và nuôi dưỡng kém; rối loạn kinh nguyệt; đòn ngã tổn thương, viêm mủ da.

Liều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




dùng 10 - 15 gam dạng thuốc hoặc ngâm rượu. Dùng ngoài bằng cách giã củ
tươi
vừa đủ đắp vào chỗ đau [8].
Một số bài thuốc dùng cây lan Một lá như:
- Viêm miệng, viêm họng cấp tính: cây tươi một lá dùng nhai.
- Tạng lao: lan Một lá 15 gam nấu với thịt lợn làm canh ăn.
- Trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém: Củ lan Một lá 5 - 10 gam nấu
với thịt lợn nạc hoặc trứng gia cầm và ăn như thức ăn.
1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode)
Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định
loài sinh vật. Khi tiến hành phân loại hay giám định sinh vật theo phương
pháp truyền thống thì chủ yếu là dựa trên các chỉ thị về hình thái hoặc các đặc
tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn.
Phân loại theo phương pháp truyền thống trong nhiều trường hợp còn gặp phải
khó khăn và hạn chế như: có nhiều sinh vật mang những đặc điểm hình thái
rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ
gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng
lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Một hạn chế
khác của phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái
đó là rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài.
Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về
hình thái, như: những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất hoặc đã qua
chế biến thì không thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Gần đây nhờ vào

sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân
tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về
vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật
trong cùng loài. Từ đó có thể định danh được sinh vật và xác định được mối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp
giữa chỉ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác
biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ
thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân
tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã vạch DNA được xem như là
một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các
loài.
Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh
loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có
những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay
đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là
gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA
18S,

5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật.
So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao
hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào.
Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm mã vạch DNA (DNA barcode),
nhằm giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA
ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân
biệt hai loài sinh vật với nhau [17]. Xác định loài bằng mã vạch DNA sẽ cho
mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những
quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc
phân biệt loài [9]. Taberlet và cs (2007) cho rằng, hệ thống mã vạch DNA lý
tưởng phải đáp ứng các yêu cầu là: (i) Đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên
để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa
các cá thể trong cùng loài; (ii) Hệ thống định danh bằng DNA phải được
chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân
loại khác nhau; (iii) Đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại; (iv) Có khả năng áp
dụng với các mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản
ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA [21].

1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu
Đối với các loài thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp
độ loài, xác định chính xác loài đóng vai trò quan trọng để đảm bảo về chất
lượng sản phẩm. Hiện nay với sự phát triển của thị trường thảo dược vấn đề giả
mạo các nguyên liệu thảo dược càng trở nên phổ biến. Các nguyên liệu thảo
dược bị thay thế bằng các loại thảo dược khác có quan hệ họ hàng gần gũi
mang những đặc điểm hình thái tương tự do vậy rất khó có thể phân biệt bằng
mắt thường. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược bằng phương pháp mã
vạch DNA sẽ mang lại kết quả chính xác và giúp bảo vệ người tiêu dùng trước
nguy cơ sử dụng phải các dược liệu giả mạo.
Một số trình tự, vùng gen thường được nghiên cứu và sử dụng phổ biến
trong phân loại thực vật nói chung và nhận biết cây dược liệu nói riêng như
trình tự vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân, trình tự gen matK, rbcL, rpoB,
rpoC1, trnH – psbA,… thuộc hệ gen lục lạp,...
1.3.1. Đặc điểm vùng ITS
Vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn DNA nằm
giữa các gen mã hóa RNA cấu trúc của ribosome. Vùng gen ITS bao gồm 2
vùng riêng biệt là ITS1 và ITS2 và được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng
5.8S khá bảo thủ do đó vùng gen này có thể được sử dụng để nghiên cứu phát
sinh loài và nhận diện loài [18].
Các vùng ITS có độ dài 600 đến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên
có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo
thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS. Số
bản sao các đoạn lặp lại của DNA mã hóa ribosome lên tới 30 000 trong một
tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Điều này làm cho ITS trở thành đối tượng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa,
phát sinh loài [17] và đa dạng di truyền [12].
1.3.2. Đặc điểm gen matK
Gen matK mã hóa cho maturaseK được phát hiện lần đầu tiên trên cây
thuốc lá (Nicotiana tabacum). Gen matK là một trong những gen tiến hoá
nhanh nhất, có kích thước khoảng 1500 bp, nằm trong hệ gen lục lạp.
MaturaseK liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình
phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên
đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài
và phát sinh loài ở thực vật. Hiệp hội mã vạch CBOL (Consortium for the
Barcode of Life) đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng
90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một
cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode
chuẩn cho thực vật [22], [23].
Sử dụng trình tự gen matK đã đạt được một số thành công trong việc
xác định các loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum
palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex
Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội
bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng
để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [12],
[15].
Từ các kết quả phân tích trình tự gen matK trên Genbank cho thấy gen
này có tính đa dạng rất cao [11]. Gen matK được dùng để phân biệt loài và
nhận diện loài một cách dễ dàng vì gen matK khác nhau giữa các loài nhưng
lại gần như trùng khớp trong cùng một loài. Gen matK giúp chúng ta có thể
dễ dàng phân biệt những loài có hình thái giống nhau mà bằng phương pháp
phân loại truyền thống khó có thể phân biệt được.
1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Ở Việt Nam, đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về mã vạch
DNA như: Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) đã nhân bản thành công
đoạn gen matK từ nguồn DNA tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật
PCR. Đã xác định được trình tự nucleotit của đoạn gen matK của các mẫu
nghiên cứu, sản phẩm PCR có kích thước 951 bp, kết quả so sánh cho thấy
không có sự khác biệt về trình tự nucleotit của đoạn gen matK ở các lần lặp lại
và các mẫu trong cùng một loài. Trình tự đoạn gen matK phân lập được có thể
là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng của Việt Nam
[6].
Để hỗ trợ cho việc định danh loài Bảy lá một hoa Việt Nam - Paris
vietnamensis phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống và nhân trồng nhóm các tác
giả nghiên cứu đã tiến hành phân tích mã vạch DNA dựa trên hai vùng gen là
ITS và psbA-trnH. Kết quả phân tích các mã vạch DNA cho thấy vùng gen
ITS có thể sử dụng để phân biệt cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam với các loài
thuộc chi Paris với độ tin cậy cao (giá trị bootstrap là 100) [4].
Nguyễn Như Hoa (2017) đã tiến hành phân tích trình tự vùng ITS của
loài Lan hoàng thảo thủy tiên nhằm phân biệt, nhận diện nhanh, chính xác, chỉ
ra mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong nhóm Thủy tiên và tạo tiền đề cho
việc xác định DNA barcode cho nhóm lan Hoàng Thảo. Trình tự vùng ITS của
15 mẫu thuộc 5 loài Hoàng thảo Thủy Tiên đã được xác định có kích thước từ
674-702bp. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy việc sử dụng trình tự vùng ITS
có thể giúp phân tách rõ ràng các loài trong nhóm Hoàng Thảo Thủy Tiên [5].
Lê Đình Chắc , Nguyễn Thị Hiền (2017) đã tiến hành phân tích trình tự
vùng ITS của 4 mẫu Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu
tại Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và Pù Luông, Thanh Hóa nhằm cung
cấp một quy trình hiệu quả cho việc xác định trình tự gen ITS loài Lan kim
tuyến và có thể áp dụng cho những loài cùng chi. Kết quả, trình tự DNA vùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN