NGHIÊN cứu tái CHẾ LAM KÍNH và PHA THẠCH để GIẢM GIÁ THÀNH bộ xét NGHIỆM HALOSPERM xác ĐỊNH mức độ đứt gãy ADN TINH TRÙNG

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
---***---

BỘ Y TẾ

TRẦN THỊ THÚY HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI CHẾ LAM KÍNH VÀ PHA THẠCH
ĐỂ GIẢM GIÁ THÀNH BỘ XÉT NGHIỆM HALOSPERM
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY ADN TINH TRÙNG

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2013-2019

HÀ NỘI - 2019


2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
---***---

BỘ Y TẾ

TRẦN THỊ THÚY HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁI CHẾ LAM KÍNH VÀ PHA THẠCH

ĐỂ GIẢM GIÁ THÀNH BỘ XÉT NGHIỆM HALOSPERM
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY ADN TINH TRÙNG
Ngành đào tạo : Bác sỹ đa khoa
Mã ngành
: 52720101

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2013-2019
Người hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ TRANG

HÀ NỘI - 2019


3

MỤC LỤC


4

DANH MỤC BẢNG


5

DANH MỤC HÌNH


6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
DBD-

Deoxyribonucleic acid
Phương pháp phát hiện phân

FISH

mảnh ADN tinh trùng bằng lai

COMET
DFI
ADN fragmentation index
ICSI
Intra-cytoplasmic sperm

huỳnh quang tại chỗ
Phương pháp điện di đơn tế bào
Độ phân mảnh DNA tinh trùng
Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào

IVF
IUI

injection
In vitro fertilisation

bào tương trứng

Thụ tinh trong ống nghiệm
Kỹ thuật bơm tinh trùng vào

Reactive oxygen species
Sperm Chromatin Dispersion

buồng tử cung
Nhiễm sắc thể
Chất gây phản ứng oxy hoá
Phương pháp khảo sát phân tán

SCSA

Sperm chromatin structure

chất nhiễm sắc của tinh trùng
Phương pháp khảo sát cấu trúc

TUNEL

assay
Terminal deoxynucleotidyl

chromatin tinh trùng
Phương pháp đánh dấu phân

NST
ROS
SCD

transferase mediated dutp nick mảnh DNA bằng dUTP
end labeling


7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vô sinh được chính thức công nhận là thành phần cốt lõi của sức khỏe
sinh sản vào năm 1994, tại Hội nghị quốc tế về Dân số và Phát triển
(UNPF,1994). Theo tổ chức Y tế Thế giới, tỉ lệ vô sinh ở các cặp đôi có sự
thay đổi không đáng kể trong khoảng thời gian từ 1991-2010. Tuy nhiên, cùng
với sự gia tăng dân số thế giới, số lượng cặp đôi vô sinh đã có sự gia tăng
tương ứng, do đó việc đi tìm nguyên nhân và cách giải quyết cho vấn đề này
đang trở thành một nhu cầu bức thiết của toàn xã hội.
Vô sinh có thể ảnh hưởng từ 8% đến 14% các cặp vợ chồng trong độ tuổi
sinh sản (15 đến 49 tuổi), với tỷ lệ trung bình là 9%, trên toàn thế giới
(Inhorn & Patrizio, 2015). Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Viện phụ sản
trung ương và đại học Y Hà Nội, tỉ lệ vô sinh ở mức khoảng 7,7% trong đó tỉ
lệ vô sinh nam và nữ gần tương đương [1]. Như vậy, vô sinh nam có tỉ lệ khá
cao nhưng vẫn chưa được coi trọng đúng mức do vấn đề cơ sở vật chất kĩ
thuật và định kiến xã hội.
Tinh dịch đồ là xét nghiệm thường quy để chẩn đoán vô sinh nam tại
Việt Nam. Tuy nhiên kết quả tinh dịch đồ nằm trong giới hạn bình thường vẫn
không loại trừ khả năng trường hợp đó bị vô sinh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, không chỉ những đặc điểm hình thái của tinh trùng đóng góp vào khả
năng thụ tinh mà còn bao gồm cả những đặc tính về mặt vật chất di truyền [2]
. Tại Việt Nam, khoảng 10% bệnh nhân vô sinh có kết quả xét nghiệm tinh
dịch đồ bình thường có vấn đề đứt gãy ADN tinh trùng [3].Đứt gãy ADN tinh
trùng gây hậu quả đặc biệt nghiêm trọng do làm giảm khả năng thụ tinh và
chất lượng phôi thai [4] [5]. Tỷ lệ đứt gãy ADN càng cao thì khả năng có con

sau khi sử dụng các phương pháp hỗ trợ sinh sản càng thấp. Do đó, xét


8

nghiệm đứt gãy ADN tinh trùng góp phần cải thiện tỷ lệ thành công của các
biện pháp hỗ trợ sinh sản và giảm chi phí điều trị vô sinh cho bệnh nhân.
Phương pháp xét nghiệm phổ biến nhất hiện nay là khảo sát mức độ
phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng (Sperm Chromatin Dispersion - SCD),
do đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với chi phí thấp so với những
phương pháp khác và hiệu quả cao. Quy trình đánh giá mức độ đứt gãy ADN
tinh trùng mới được ứng dụng gần đây tại Việt Nam và đã khẳng định được
vai trò của nó trong chẩn đoán vô sinh nam. Tuy nhiên, chi phí cho xét
nghiệm này ở nước ta hiện còn tương đối cao do phải nhập khẩu bộ xét
nghiệm Halosperm Test Kit (Hãng Halotech) từ nước ngoài. Để ứng dụng xét
nghiệm mức độ đứt gãy ADN tinh trùng trong cộng đồng, cần phải giảm tối
đa giá xét nghiệm. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tái
chế lam kính và pha thạch để giảm giá thành bộ xét nghiệm Halosperm xác
định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng” với các mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện kỹ thuật sản xuất lam kính để thực hiện xét nghiệm xác

định mức độ đứt gãy ADN tinh trùng, tối ưu nồng độ thạch phủ lam
kính tái chế và lam kính thường.
2. Hoàn thiện kỹ thuật pha chế thạch agarose để tạo hỗn hợp thạchtinh dịch.


9

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái niệm vô sinh và vô sinh nam
Vô sinh (infertility) là sự thất bại trong thụ thai ở cặp vợ chồng đang
trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổi) sau 12 tháng quan hệ tình dục đều đặn (2-3
lần/ tuần) mà không sử dụng biện pháp tránh thai nào.
Nguyên nhân vô sinh được chia làm 2 loại: vô sinh nguyên phát và vô
sinh thứ phát. Vô sinh nguyên phát, còn gọi là vô sinh I, là cặp đôi chưa từng
có thai. Vô sinh thứ phát, còn gọi là vô sinh II, là cặp đôi đã từng có thai ít
nhất 1 lần hiện không có khả năng mang thai.
Vô sinh nam là trường hợp vô sinh mà nguyên nhân là do người chồng.
Hiện có 2 nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam: do di truyền và không do
di truyền, trong đó phân mảnh ADN tinh trùng thuộc nhóm nguyên nhân
không do di truyền.
1.2. Phân mảnh ADN tinh trùng
1.2.1. Khái niệm
Phân mảnh ADN là sự tách rời hoặc phá vỡ các sợi ADN thành từng mẩu
nhỏ. Tinh trùng được sinh ra ở tinh hoàn, khi trưởng thành nó chỉ có một lớp
nguyên sinh chất vô cùng mỏng đủ để cung cấp năng lượng cần thiết di chuyển
đến trứng. Do đó ADN tinh trùng được bảo vệ kém hơn, va chạm nhiều hơn và
dễ bị chịu ảnh hưởng của các tác nhân lý hoá nhiều hơn. Chính điều này làm
cho ADN tinh trùng dễ phân mảnh hơn ADN của các tế bào khác.
Phân mảnh ADN tinh trùng là sự phân mảnh ở tế bào có cơ chế tự sửa
chữa kém do đó nó ảnh hưởng lớn tới chất lượng tinh trùng. Trứng có thể sửa
chữa được những tổn thương của ADN tinh trùng nhưng ở một mức độ giới


10

hạn, khi tổn thương quá lớn, trứng không có khả năng sửa chữa và ảnh hưởng
đến sự phát triển của phôi, bào thai.
Có một tỉ lệ không nhỏ nam giới mắc vô sinh nam có tinh dịch đồ bình

thường nhưng mức độ phân mảnh ADN tinh trùng cao. Theo Dr. Evenson từ
đại học Florida, 25-30% trường hợp vô sinh nam có mức độ phân mảnh ADN
tinh trùng cao.
1.2.2. Nguyên nhân
Phân mảnh ADN tinh trùng cũng giống như với các tế bào khác, đó là sự
tích tụ dần dần ảnh hưởng của các tác nhân bên trong cũng như bên ngoài cơ
thể lên ADN tinh trùng. Hiện nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ,
rất nhiều tác nhân đã được phát hiện và chứng minh là có liên quan đến phân
mảnh ADN tinh trùng
1.2.2.1. Nguyên nhân bên trong cơ thể
 Quá trình tái tổ hợp không hoàn chỉnh trong quá trình sinh tinh trùng

Cơ chế: Các enzym nuclease thuộc nhóm SPO11 có khả năng bẻ gãy
mạch kép ADN, tạo điều kiện cho hiện tượng trao đổi chéo trong kỳ đầu giảm
phân I diễn ra. Những phân mảnh này sẽ được nối lại trước khi giảm phân I
kết thúc. Chỉ khi ADN tế bào được sửa chữa hoàn toàn và những tế bào có bất
thường ADN bị loại bỏ, sự phân chia tế bào giai đoạn giảm phân I mới được
tiếp tục. Do đó, nếu các yếu tố kiểm tra không hoạt động, các tế bào có bất
thường ADN vẫn tiếp tục được phân chia và trưởng thành [6].
 Bất thường trong quá trình trưởng thành tiền tinh trùng:
Cơ chế: Chất nhiễm sắc của tinh trùng được cô đặc và nén chặt ở mức độ
cao nhờ đó tinh trùng trở nên nhỏ gọn hơn và bộ gen của tinh trùng được bảo
vệ trong suốt quá trình di chuyển trong đường sinh dục nữ để thụ tinh với
noãn. Chất nhiễm sắc của tinh trùng được coi là đóng gói hoàn chỉnh khi 85%
lượng protein histone được thay thế bằng protamine. Protamine có kích thước
bằng một nửa histon nên giúp cho đầu tinh trùng nhỏ gọn hơn [7]. Đây là một


11

quá trình phức tạp gồm 3 giai đoạn. Đầu tiên là quá trình thay thế các histon
thường bằng các histon đặc hiệu của tinh hoàn [8]. Sau đó các histon này sẽ
dược thay thế bằng các protein chuyển tiếp [9] và cuối cùng các protein
chuyển tiếp sẽ được thay thế bằng protamine [10].
Để các quá trình thay thế protein diễn ra, ADN phải được tháo xoắn
bằng enzyme ADN topoisomerase 2. Khi có sai sót trong hoạt động của
enzyme này, sự đóng, tháo xoắn ADN tinh trùng sẽ gặp bất thường. Các cấu
trúc ADN bị phá vỡ này không được phục hồi có thể gây phân mảnh ADN
tinh trùng. Ngoài ra, các chất ức chế hoạt động của enzyme cũng làm cản trở
quá trình sửa sai và gây nên các phân mảnh ADN [11].
 Bất thường tỉ lệ protamine 1 và 2: Sự cân bằng giữa tỉ lệ protamine 1 và 2

giúp cho quá trình đóng xoắn hoàn chỉnh ADN và tạm ngưng biểu hiện của
gen trong tinh trùng. Sự mất cân bằng tỉ lệ protamine 1/ protamine 2 được
chứng minh là có liên quan đến phân mảnh ADN tinh trùng [12].
 Sự chết theo chương trình của tế bào (Apoptosis)
Trong quá trình sinh tinh, sự chết theo chương trình của tế bào có tác
dụng ngăn cản các tế bào mầm sản sinh quá mức và phá huỷ có chọn lọc
những tế bào mầm bị tổn thương. Tuy nhiên khi quá trình này diễn ra không
hoàn toàn, tinh trùng mang phân mảnh ADN vẫn có thể tiếp tục phát triển
[13].
 Tác động của các chất oxy hoá:

Chất gây phản ứng oxy hóa là sản phẩm bình thường của quá trình trao
đổi chất tế bào, đặc biệt là quá trình sản sinh năng lượng cho cơ thể. Việc sản
xuất ra quá nhiều chất oxy hoá hoặc mất cân bằng giữa chất oxy hoá/chất
chống oxy hoá dẫn đến hậu quả là các chất oxy hoá phá huỷ cấu trúc tế bào
bao gồm cả ADN. ROS có thể làm biến đổi hoặc mất các base, gây trao đổi
chéo đoạn ADN, bất thường NST, đứt gãy mạch đơn hoặc mạch đôi ADN và

12

đột biến gen [14]. Do đó, tác động bất lợi của các chất oxy hoá có liên quan
chặt chẽ với phân mảnh ADN tinh trùng [15].
1.2.2.2. Nguyên nhân từ bên ngoài cơ thể
 Khoảng thời gian kể từ lúc xuất tinh: Mức độ phân mảnh ADN tinh trùng

không phải là con số hằng định mà nó thay đổi theo thời gian kể từ lúc xuất
tinh. Nguyên nhân của sự biến đổi như vậy chưa rõ ràng nhưng nhiều nghiên
cứu đã chỉ ra nó có thể liên quan đến protamine [16].
 Tác động của các chất oxy hoá sau khi xuất tinh: Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
các tinh trùng chưa trưởng thành sản xuất ra các chất oxy hoá ở mức cao. Các
chất này lại tác động lên chính các tinh trùng đã trưởng thành từ trong ống
dẫn tinh và kể cả sau khi đã xuất tinh [17].
 Giãn tĩnh mạch tinh: Khoảng 15-20% nam giới mắc giãn tĩnh mạch tinh và nó
là nguyên nhân phổ biến nhất gây giảm số lượng cũng như chất lượng của
tinh trùng. Giãn tĩnh mạch tinh cũng đã được chứng minh là gây ra phân
mảnh ADN tinh trùng ở mức độ cao hơn đáng kể so với nam giới ở nhóm
chứng [18] [19]. Trong một nghiên cứu khác, Hedin và cộng sự đã chỉ ra mức
độ cao stress oxy hóa như bằng chứng cho thấy sự tăng cao của các gốc tự do
có khả năng oxy hóa, hậu quả làm giảm khả năng chống oxy hóa ở cả nam
giới có khả năng sinh sản cũng như vô sinh mà có giãn tĩnh mạch tinh đã
được chẩn trên lâm sàng.
 Nhiễm khuẩn: nhiễm trùng bộ phận sinh dục do Chlamydia hoặc Mycoplasma
làm gia tăng mức độ phân mảnh ADN tinh trùng. Liệu pháp kháng sinh đóng
vai trò quan trọng trong khắc phục phân mảnh ADN tinh trùng ở những bệnh
nhân này [20].
 Nhiệt độ tinh hoàn: Vị trí của tinh hoàn đảm bảo cho nhiệt độ tinh hoàn thấp
hơn cơ thể từ 2-8 độ C, phù hợp cho quá trình sản xuất tinh trùng. Nhiệt độ

cao gây phá vỡ cấu trúc sợi ADN tinh trùng dẫn đến phân mảnh ADN tinh
trùng.


13

 Do thuốc, vaccine và các hóa chất, kim loại nặng: Hoá trị, xạ trị trong điều trị

ung thư ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Một số thuốc (VD: paroxetine) và
vaccine cũng đã được chứng minh gây ra phân mảnh ADN tinh trùng ở người
[21].
1.2.3. Ảnh hưởng của phân mảnh ADN tinh trùng
Theo Sheena (2013), 80% số cặp cợ chồng vô sinh không rõ nguyên
nhân là do chất lượng tinh trùng quá yếu hay phân mảnh ADN tinh trùng [22].
Khi ADN phân mảnh tại những vị trí chứa gen liên quan đến khả năng sinh
sản hay sự phát triển, làm tổ của phôi thì khả năng có con rất thấp. Khoảng
25% bệnh nhân nam vô sinh có mức độ phân mảnh ADN cao [23].
•

DFI < 15% là độ phân mảnh ADN tinh trùng thấp.

•

DFI 15 – 30%: độ phân mảnh ADN tinh trùng trung bình.

•

DFI > 30%: độ phân mảnh ADN tinh trùng cao [24], [25].
Độ phân mảnh ADN tinh trùng của bệnh nhân càng cao thì khả năng thụ
thai sau các chu trình hỗ trợ sinh sản như IUI, IVF, ICSI càng thấp. Khi DFI >

20%, khả năng sinh sản của nam giới giảm [26] [27]. Khi DFI > 30%, cơ hội
để thụ tinh tự nhiên, thụ tinh nhân tạo (IVF) hoặc bơm tinh trùng vào buồng
tử cung (IUI) gần như bằng không [28], thay vào đó nên lựa chọn phương
pháp tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) [29]. Nghiên cứu của Đặng
Huệ Anh chỉ ra rằng độ oxy hóa và độ phân mảnh ADN của tinh trùng tăng có
thể sẽ làm giảm tỷ lệ thành công trong ICSI [29]. Esterhuizen (2002) cũng
tiến hành khảo sát 170 noãn không được thụ tinh của các cặp đôi sử dụng IVF.
Họ nhận thấy đối với bệnh nhân có tỷ lệ đóng xoắn chromatin sai hỏng cao thì
khả năng tìm thấy tinh trùng trong noãn giảm và khả năng tinh trùng thất bại
tháo xoắn tăng cao. Như vậy, DFI có giá trị cao dự đoán vô sinh nam cũng
như tỷ lệ thành công của các phương pháp hỗ trợ sinh sản. Tuy nhiên, việc
xác định khả năng sinh sản của nam giới lại đang được đánh giá chủ yếu bởi


14

những chỉ số trong tinh dịch đồ như hình thái tinh trùng, mật độ, độ di động…
ở hầu hết các bệnh viện và trung tâm hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam. Điều này
giải thích vì sao bệnh nhân với kết quả tinh dịch đồ bình thường vẫn có khả
năng vô sinh cũng như tỷ lệ có thai sau điều trị còn thấp.
1.2.4. Các phương pháp đánh giá mức độ phân mảnh ADN tinh trùng
Có rất nhiều phương pháp đánh giá mức độ phân mảnh ADN tinh trùng
đã được nghiên cứu và áp dụng trên thế giới. Trong đó, các phương pháp
thông dụng là:
1.2.4.1. Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA):
Phương pháp được giới thiệu lần đầu vào năm 1981, tinh trùng trong
huyền dịch được thêm vào dung dịch acid biến tính. Những tinh trùng không
có sự phá vỡ ADN có thể kháng lại acid biến tính này. Tuy nhiên, tinh trùng
với ADN phân mảnh, dung dịch acid biến tính sẽ làm hỏng ADN của chúng,
chuyển thành ADN đơn. Sau đó chúng được nhuộm với Acridine

Orange. Thuốc nhuộm này phát ra huỳnh quang màu xanh lá cây khi nó liên
kết với ADN kép. Tuy nhiên, có sự biến đổi từ màu xanh lá sang màu đỏ khi
liên kết với ADN mạch đơn đã biến tính hoặc ADN phân mảnh mạch đơn .
Phương pháp có sử dụng máy đếm dòng chảy tế bào và phần mềm đọc kết
quả chuyên dụng, do đó có thể định lượng một cách chính xác tinh trùng phân
mảnh ADN hoặc có nhiễm sắc chất đóng gói chưa hoàn chỉnh. Mức độ phân
đoạn ADN trung bình đến cao được tìm thấy trong các tinh thể huỳnh quang
đỏ này có thể vượt quá khả năng sửa chữa ADN của trứng.
•
-

Ưu điểm
Tinh trùng thực hiện ở trạng thái bảo quản trong nito lỏng, thuận tiện cho thực

-

hiện IVF về sau.
Kiểm tra nhanh chóng được số lượng nhiều tinh trùng.
Có thể định lượng tinh trùng bị phân mảnh ADN hoặc có chất nhiễm sắc đóng
gói chưa hoàn chỉnh.


15

•

Quy trình đã được chuẩn hoá rộng rãi.
Nhược điểm:
Tốn kém, khó thực hiện ở phòng thí nghiệm thông thường do cần thiết bị
chuyên dụng, giá thành đắt.

1.2.4.2. Phương pháp đánh dấu phân mảnh ADN bằng các dUTP được xúc
tác bởi enzyme terminal deoxynucleotidyl tranferase (TUNEL)
Phương pháp định lượng sự gắn kết của dUTP với đoạn ADN 3-OH tự
do. Phản ứng được xúc tác bởi enzyme TdT (terminal deoxynucleotidyl
tranferase) kết hợp dUTP có gắn nhãn chỉ xảy ra ở các vùng có vị trí 3
'giúp phát hiện sự phá vỡ sợi ADN), sau đó dùng một máy đếm dòng chảy
phát hiện tế bào có gắn nhãn.

•
-

Ưu điểm
Có thể sử dụng tinh dịch tươi, đông lạnh, tan băng, và lưu trữ chất lỏng (ở 5 C

-

trong một tuần).
Phương pháp này có thể phân loại hàng nghìn tinh trùng trong mỗi mẫu bằng

-

máy đếm dòng chảy tế bào.
Cho kết quả có độ nhạy cao (đặc biệt có hiệu quả với các trường hợp có số

lượng tinh trùng rất thấp).
• Nhược điểm
- Phương pháp này được thực hiện qua nhiều bước phức tạp trong nhiều giờ
-

đồng hồ, có sử dụng máy đếm dòng chảy tế bào nên giá thành còn rất đắt.

Độ đặc hiệu của phương pháp chưa cao.
1.2.4.3. Phương pháp điện di đơn tế bào (COMET):
Phương pháp điện di đơn tế bào xác định tỉ lệ và mức độ phân mảnh ADN
tinh trùng. Trong giai đoạn phân giải của phương pháp, các nhóm sulfhydryl
trong protamine được giảm đi làm giảm sự chuyển động của ADN phân đoạn
trên điện di. Sau khi điện di, các bức xạ nhỏ cho thấy sự xuất hiện của ADN
phân mảnh giống như một cái đuôi sao chổi trong khi ADN không bị tổn thương
và cô đặc xuất hiện như một khối cầu hình thành đầu của sao chổi.


16

•
-

Ưu điểm
Nhờ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang nên nhạy trong việc xác định phân

-

mảnh ADN ở từng tinh trùng
Đòi hỏi ít tinh trùng hơn (100 tế bào) để phân tích vì vậy nó đặc biệt hữu ích

đối với những người đàn ông có số tinh trùng thấp.
• Nhược điểm
- Đòi hỏi nguồn điện và bể điện di
- Tốn thời gian cho việc phân tích
- Có tính chủ quan quan sát viên và đòi hỏi kinh nghiệm để đánh giá kết quả nên
gặp nhiều khó khăn trong phân tích hình ảnh cũng như chuẩn hoá quá trình.
1.2.4.4. Phương pháp khảo sát phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng (SCD)

Dựa trên một quá trình biến tính ADN để tạo thuận lợi cho việc loại bỏ tiếp
theo protein trong tinh trùng, sau đó nhuộm màu. Bằng cách này, tinh trùng bình
thường tạo ra quầng sáng (halo) hình thành bởi các vòng lặp ADN ở phần đầu
của tinh trùng, hiện tượng này không có với tinh trùng bị đứt gãy ADN.
• Ưu điểm: Dễ thực hiện, dụng cụ đơn giản (kính hiển vi huỳnh quang).
• Nhược điểm: Kết quả còn phụ thuộc nhiều vào chủ quan người đọc. [30]
1.2.4.5. Phương pháp phát hiện phân mảnh ADN tinh trùng bằng lai huỳnh
quang tại chỗ (DBD-FISH):
Tinh trùng được cố định trên lam bởi agarose và được xử lý trong môi
trường kiềm để tạo ra các ADN mạch đơn. Sau khi trung hoà mẫu và loại bỏ
protein nhân, ADN mạch đơn tạo thành được lai với các mẫu dò đặc hiệu. Kết
quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, cho phép khảo sát, định
lượng phân mảnh ADN và cho xác định cấu trúc nhiễm sắc chất của tinh
trùng. Tuy nhiên phương pháp mất nhiều thời gian để thực hiện cũng như giá
thành còn đắt.
1.2.4.6. Phương pháp Aniline blue
Nhiễm sắc chất của ADN tinh trùng chưa trưởng thành chứa nhiều
histone giàu lysine và vùng này sẽ cho phản ứng dương tính khi nhuộm với
aniline blue. Ngược lại, nhiễm sắc chất của tinh trùng trưởng thành chứa
protamine giàu cysteine sẽ không bắt màu với aniline blue.


17

•

Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, kết quả được đọc dưới kính hiển vi quang

học nên có giá thành rẻ. Tuy nhiên, phương pháp có
• Nhược điểm:

- Sự bắt màu không đồng nhất của tinh trùng dẫn đến kết quả thu được đánh giá
-

không chính xác mức độ phân mảnh của ADN tinh trùng.
Hiện tại, chưa thể chuẩn hóa phương pháp này.
1.3. Bộ xét nghiệm Halosperm
Năm 2003, Fernandez và cộng sự đã xây dựng thành công phương pháp
khảo sát sự phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng (Sperm Chromatin
Dispersion - SCD) – đây là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện với chi
phí thấp và hiệu quả cao. Cơ chế SCD dựa trên nguyên tắc ADN tinh trùng
không bị phân mảnh sẽ tạo những quầng sáng (halo) đặc trưng quanh lõi nhân
tinh trùng, trong khi ADN tinh trùng bị phân mảnh không tạo được quầng
sáng hoặc tạo quầng sáng rất nhỏ khi xử lý biến tính trong môi trường acid và
loại bỏ các protein nhân. Sử dụng phương pháp này, các mẫu tinh dịch được
xử lý tuần tự trong microgel agarose bằng dung dịch làm biến tính axit, với
hai dung dịch ly giải và rửa sạch để chúng có thể được sấy khô và nhuộm màu
sau đó. Kỹ thuật này sử dụng thuốc thử và điều kiện quá mạnh. Phương pháp
được mô tả không cho kết quả nhất quán khiến việc đánh giá lặp đi lặp lại khó
khăn. Mặt khác, chất lượng và độ tương phản của hình ảnh thu được và độ tái
tạo của kết quả không đủ tốt để có thể được áp dụng thương mại. Ngoài ra,
cấu trúc của tinh trùng bị ảnh hưởng và đuôi tinh trùng không thể nhìn thấy
trong các mẫu.
Do đó, dựa trên nguyên tắc của phương pháp này, Fernandez và cộng sự vào
năm 2006 đã cho ra đời bộ xét nghiệm thương mại Halosperm (A method for
determination of ADN fragmentation on animal sperm cell - EP 1710320 A1).
Bảng 1.1: Các thay đổi trong kĩ thuật xét nghiệm Halosperm
Xét nghiệm Halosperm

Bộ xét nghiệm Halosperm

18

(Fernandez, 2003)
Dung dịch

(Fernandez, 2005)
Trộn 80 μL HCl từ ống

HCl 0,08N

eppendorf trong bộ dụng cụ

Dung dịch ly giải 1: 0,4 M

với 10 ml nước cất
Dung dịch chứa NaCl 2,5M,

Tris-HCl; 0,8 M DTT; 50

DTT 0,2M, Tris 0,2M, Triton

Thành phần

mM EDTA; 1% SDS, pH

X-100 1% và độ pH 7,5.

dung dịch ly

7,5.

biến tính

giải

Dung dịch ly giải 2: 0,4 M
Tris-HCl; 2 M NaCl; 1%
SDS. pH 7,5

Halosperm ® là một bộ chẩn đoán in vitro cho phép đo sự phân mảnh
ADN một cách nhanh chóng, dễ dàng và có thể tái tạo mà không cần thiết bị
thí nghiệm phức tạp. Halosperm ® dựa trên kỹ thuật SCD , được Halotech
cấp bằng sáng chế, dựa trên quy trình biến tính ADN có kiểm soát để tạo điều
kiện cho việc loại bỏ các protein có trong mỗi tinh trùng. Bộ dụng cụ này
chứa dung dịch làm biến tính DNA, dung dịch ly giải để tách protein màng
nhân, được đặc trưng ở chỗ dung dịch ly giải không chứa chất tẩy làm biến
tính protein và về cơ bản không phá hủy đuôi của tinh trùng [31], do đó có thể
phân biệt chúng với các loại tế bào khác có thể có trong khi xuất tinh, chẳng
hạn như bạch cầu. Hình ảnh của quầng halo được tạo ra bằng Halosperm ® có
độ tương phản cao và có thể được đánh giá chính xác bằng kính hiển vi thông
thường hoặc huỳnh quang. Ngoài ra, Halosperm ® cho phép hình dung các
tinh trùng có chứa ADN bị thoái hóa cao so với các loại tổn thương ít tích cực
khác. Thực tế này có tầm quan trọng lớn trong chẩn đoán và theo dõi giãn tĩnh
mạch thừng tinh.


19

20

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
•

Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu
Mẫu tinh dịch của bệnh nhân nam được chẩn đoán vô sinh tại Bệnh viện
Đại học Y Hà Nội, làm xét nghiệm đánh giá độ đứt gãy ADN tinh trùng tại Bộ
môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội.

 Nam từ 18 tuổi.
 Xét nghiệm tinh dịch đồ kết quả mật độ tinh trùng ≥ 5 triệu/ml.
 Đồng ý tham gia nghiên cứu.
•

Tiêu chuẩn loại trừ: Không thoả mãn các điều kiện trên, không mắc các bệnh
lây qua đường tình dục.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường đại học Y Hà Nội.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu

•

Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 10 mẫu tinh dịch để hoàn thiện quy trình cải tiến.

•

Sau đó chúng tôi tiến hành chọn mẫu để tiến hành so sánh tương đương giữa
quy trình cải tiến và bộ kit thương mại.
Công thức tính cỡ mẫu cho một nghiên cứu quan sát tính theo công thức
của S.K.Luanga và Lemeshow [23]:

1- α/2 = 0,95


21

ε = 0,10
P = 95% (độ chính xác của qui trình tham chiếu)
n = số lần thực nghiệm cần thực hiện, tính ra là 21.
Chúng tôi lấy cỡ mẫu là 50.
Cách chọn mẫu: chọn mẫu ngẫu nhiên thuận tiện.
2.4.3. Các biến số nghiên cứu
•
•

Đánh giá nồng độ thạch tối ưu phủ lam tái chế và lam thường.
So sánh độ đông, độ mịn khi lên lam giữa lam thường (ở nồng độ thạch phủ
tối ưu), lam tái chế (ở nồng độ thạch phủ tối ưu) và lam trong bộ xét nghiệm

Halosperm.
• Đánh giá nồng độ thạch eppendorf tự pha tối ưu.
2.4.4. Quy trình nghiên cứu

2.4.4.1. Sơ đồ nghiên cứu
Thu
Thu thập
thập thông
thông tin
tin bệnh
bệnh nhân:
nhân: tên,
tên, tuổi,
tuổi,
kết
kết quả
quả tinh
tinh dịch
dịch đồ
đồ

10
10 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch
dịch để
để hoàn
hoàn thiện
thiện quy
quy

50
50 mẫu
mẫu tinh

tinh dịch
dịch để
để so
so sánh
sánh tương
tương

trình
trình

đương
đương

10
10 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch
dịch tối
tối ưu
ưu nồng
nồng độ
độ

50
50 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch
dịch sử
sử dụng
dụng lam

lam tái
tái

thạch
thạch phủ
phủ lam
lam tái
tái chế
chế

chế
chế

10
10 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch
dịch tối
tối ưu
ưu nồng
nồng độ
độ
thạch
thạch phủ
phủ lam
lam thường
thường

10
10 mẫu

mẫu tinh
tinh dịch
dịch tối
tối ưu
ưu nồng
nồng độ
độ
thạch eppendorf
eppendorf tự
tự pha
pha
thạch

2.4.4.2. Xét nghiệm tinh dịch đồ

50
50 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch
dịch sử
sử dụng
dụng lam
lam
thường
thường

50
50 mẫu
mẫu tinh
tinh dịch

dịch sử
sử dụng
dụng lam
lam
Halosperm
Halosperm


22

Kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ được xác định có mật độ tinh trùng ≥ 5
triệu/ml.
Tinh dịch được lấy khi bệnh nhân kiêng giao hợp trước khi làm xét
nghiệm 3 – 5 ngày. Mẫu tinh dịch được bảo quản ít nhất trong vòng 1h ở điều
kiện nhiệt độ phòng, ít nhất 24h ở nhiệt độ 4oC.
2.4.4.3. Quy trình tái chế lam
 Tẩy màu thuốc nhuộm: Ngâm cồn tuyệt đối ngập hai giếng lam kính

trong 15 phút. Vớt lam kính ra, lau màu giemsa, rửa lại lam với một
làn nước sạch.
 Khử thạch: Lam kính sau khi được tẩy màu thuốc nhuộm, sẽ
được đun sôi trong nước 3-5ph. Vớt lam kính, lau sạch lam bằng
khăn sạch, rửa sạch lại lam với một lần nước, phơi khô trong
nhiệt độ phòng.
 Phủ thạch: đun thạch ở các nồng độ khác nhau, nhúng ngay lam
kính vào dung dịch thạch, giữ trong khoảng 1 phút, sau đó kéo lam
lên xuống 10 lần
Yêu cầu: Thao tác nhanh, tránh thạch bị đông
 Ủ khô: Vớt lam kính ra khỏi dung dịch thạch, đặt lam ở nhiệt độ
phòng đến khi bề mặt lam khô hoàn toàn. Cất và bảo quản lam

trong hộp để lam.
Yêu cầu: lam phủ đều thạch, không đọng giọt lớn, bề mặt mịn và trong suốt
2.4.4.4. Quy trình xác định nồng độ thạch phủ lam tối ưu
 Pha loãng mẫu tinh dịch bằng dung dịch PBS sao cho nồng độ

khoảng 10 triệu tinh trùng/ml tinh dịch.
 Chuẩn bị thạch: Đun cách thủy eppendorf chứa agarose pha sẵn
trong lò vi sóng 3-5 phút, cho đến khi hóa lỏng hoàn toàn
agarose.
 Trộn đều bằng pipet 25µl tinh dịch với 70µl thạch trong
eppendorf, chú ý tránh tạo bọt. Nhỏ một giọt 20µl hỗn hợp trên


23

lên hai giếng của lam kính, đậy lamen, ấn nhẹ, tránh bọt khí xuất
hiện. Lam kính đặt nằm ngang trong suốt quá trình thao tác. Đặt
tiêu bản vào tủ lạnh 4oC trong 15 phút để agarose đông lại
 Sau khi hỗn hợp tinh dịch – thạch đông lại, lấy tiêu bản ra khỏi
tủ lạnh, bỏ lamen bằng cách trượt nhẹ.
 Xác định độ đông, mịn của từng tiêu bản.

Hình 2.1. Độ đông-mịn kém

Hình 2.2. Độ đông – mịn vừa
Quy ước: Độ đông/mịn tốt: 3 điểm
Độ đông/mịn vừa: 2 điểm
Độ đông/mịn kém: 1 điểm
Không đông/không mịn: 0 điểm

24

2.4.4.5. Các nồng độ thạch phủ lam làm thí nghiệm:
Bộ xét nghiệm Halosperm
Nồng độ thạch
Lam đã phủ thạch của kit
phủ lam

Lam tái chế - Lam thường
0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

2.4.4.6. Quy trình pha chế thạch eppendorf:
 Pha thạch ở các nồng độ khác nhau: 0.5 ; 0.7; 0.9; 1.2; 1.5
 Đun sôi trong lò vi sóng 5 phút
 Lấy 70µl thạch cho vào eppendorf, bảo quản ở nhiệt độ

thường.
2.4.4.7. Nhập số liệu, phân tích xử lí số liệu, báo cáo.
2.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu sau khi thu thập sẽ được xử lí, phân tích theo phương pháp
thống kê y học.

Số liệu được nhập và quản lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Số liệu được xử lí bằng lập trình SPSS v.20.0 với các phép kiểm định, so
sánh có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 hoặc p < 0,01.
2.6. Đạo đức nghiên cứu
Tất cả những thông tin về bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ được phân
tích để phục vụ tư vấn sinh sản cho bệnh nhân và cho nghiên cứu này, không
sử dụng cho bất kỳ mục đích nào khác.
Không công bố các thông tin cá nhân của bệnh nhân.


25

CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá nồng độ tối ưu thạch phủ lam tái chế
Bảng 3.1: Kết quả độ đông với các nồng độ thạch phủ lam tái chế
Nồng độ thạch phủ lam tái chế
STT mẫu
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
Nhận xét:
Bảng 3.2: Kết quả độ mịn với các nồng độ thạch phủ lam tái chế
Nồng độ thạch phủ lam tái chế
STT mẫu
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nhận xét:
3.2. Đánh giá nồng độ tối ưu thạch phủ lam thường
Bảng 3.3: Kết quả độ đông với các nồng độ thạch phủ lam thường
STT mẫu
1

0.1

Nồng độ thạch phủ lam tái chế
0.3
0.5
0.7

0.9