Nghiên cứu khả năng tổng hợp gamma aminobutyric acid (GABA) của vi khuẩn lactic từ bộ giống VTCC ứng dụng trong lên men chè giàu GABA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thùy Dương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP
GAMMA -AMINOBUTYRIC ACID (GABA)
CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ BỘ GIỐNG VTCC
ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CHÈ GIÀU GABA

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thùy Dương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP
GAMMA -AMINOBUTYRIC ACID (GABA)
CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ BỘ GIỐNG VTCC
ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CHÈ GIÀU GABA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG
PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2020


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS.Đào Thị Lương và KS.
Hà Thị Hằng đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tơi trong suốt q trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Quang Huy đã luôn động
viên và hỗ trợ tơi rất nhiều trong q trình thực hiện làm luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo trong Bộ môn Hóa Sinh học
người đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cùng tồn bộ cán bộ Viện Vi Sinh Vật và Cơng nghệ Sinh học (IMBT) – Đại học
quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hồn thành đề tài
khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia
đình, bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, động viên, khuyến khích tơi rất nhiều trong suốt
quãng thời gian qua.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 03 năm 2020
Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dương


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về vi khuẩn axit lactic (LAB) ............................................... 3
1.1.1. Khái niệm về vi khuẩn axit lactic ............................................................ 3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của LAB ....................................................... 4
1.1.3. Chi Lactobacillus..................................................................................... 8
1.2. Tổng quan về γ -Aminobutyric axit (GABA) ....................................... 9
1.2.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA) ........................................................... 9
1.2.3. Vai trò và chức năng của GABA ........................................................... 19
1.2.4. Tình hình nghiên cứu GABA ................................................................. 21
1.2.5. Giá trị của chè GABA và công nghệ sản xuất chè GABA ..................... 24
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................... 26
2.1. Nguyên vật liệu ....................................................................................... 26
2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................ 26
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 26
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 26
2.3. Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu .................................. 26
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 27
2.4.1. Phương pháp phân tích GABA .............................................................. 27
2.4.2. Hoạt hóa chủng giống ........................................................................... 31
2.4.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme
glutamate decarboxylase cao .......................................................................... 31
2.4.4. Định danh và phân loại chủng vi khuẩn lacticError! Bookmark not defined.
2.4.5. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè của vi khuẩn lactic..... 37
2.4.6. Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng nghiên cứu ............. 38

2.4.7. Khếch đại gen GAD trong vi khuẩn lactic cho việc lên men tạo GABAError! Book


2.4.8. Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử

dụng chủng vi khuẩn lactic ............................................................................. 39
2.4.9. Nghiên cứu phương pháp thu hồi, ảnh hưởng, tỷ lệ phối trộn của chất
mang và bảo quản sinh khối chủng vi sinh vật Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 43
3.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme
glutamate decarboxylase cao........................................................................ 43
3.2. Định danh và phân loại chủng vi khuẩn lactic .................................... 44
3.2.1. Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn lactic ............................................. 44
3.2.2. Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rDNA .......................... 46
3.3. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè ....................... 48
3.3.1. Khếch đại gen GAD trong vi khuẩn lactic cho việc lên men tạo GABA 48
3.3.2. Xác định GABA trong mẫu chè lên men bằng phương pháp HPLC ..... 49
3.4. Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của
các chủng vi khuẩn lactic.............................................................................. 51
3.4.1. Lựa chọn môi trường và thời gian ni cấy thích hợp.......................... 51
3.4.2. Lựa chọn nhiệt độ ni cấy thích hợp ................................................... 52
3.4.3. Lựa chọn pH ni cấy thích hợp ........................................................... 53
3.4.4. Lựa chọn điều kiện cung cấp khí ........................................................... 54
3.4.5. Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp .............................................................. 54
3.4.6. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp ............................................................. 55
3.4.7. Lựa chọn nguồn Carbon thích hợp ....................................................... 56
3.4.8. Lựa chọn tỷ lệ Glutamate thích hợp ...................................................... 57
3.5. Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử
dụng chủng vi khuẩn lactic .......................................................................... 62
3.5.1. Lựa chọn thời gian lên men thích hợp .................................................. 62
3.5.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp ....................................................... 62
3.5.3. Lựa chọn độ ẩm lên men thích hợp ....................................................... 63


3.5.4. Lựa chọn chế độ lên men thích hợp ...................................................... 64

3.5.5. Lựa chọn tỷ lệ glutamate bổ sung thích hợp ......................................... 65
3.6. Nghiên cứu phương pháp thu hồi, làm khô và bảo quản sinh khối
chủng vi sinh vật ............................................ Error! Bookmark not defined.

3.6.1. Thu hồi sinh khối các chủng vi khuẩn bằng phương pháp ly tâmError! Bookmark
3.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang và tỷ lệ phối trộn của chất
mang đến khả năng sống của vi khuẩn ........... Error! Bookmark not defined.

3.6.3. Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột)Error! Bookm
KẾT LUẬN .................................................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Vai trò và chức năng sinh lý của GABA ...................................................20
Bảng 2.1.Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA.............................29
Bảng 2.2. Công thức phối trộn chất mang ................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1. Sàng lọc chủng lactic có khả năng sinh enzyme glutamatedecarboxylase ...... 43
Bảng 3.2. Khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn ..................48
Bảng 3.3. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi vi khuẩn tạo GABA của 2 chủng
VTCC-B-439 và VTCC-B-411 .................................................................................51
Bảng 3.4. Mật độ tế bào và pH sau nuôi của các chủng nghiên cứu ở pH ban đầu
khác nhau...................................................................................................................53
Bảng 3.5. Lựa chọn tốc độ ly tâm ............................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.6. Số lượng vi khuẩn trong sản phẩm sau đông khô với các công thức chất
mang khác nhau ......................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7. Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản trong điều kiện khác nhau Error!
Bookmark not defined.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của GABA [87] ............................................................. 9
Hình 1.2: Phương trình phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate [88] .................... 10
Hình 1.3 Con đường chuyển hóa GABA shunt [13] ................................................. 12
Hình 1.4.Quy trình sản xuất chè đen và chè giàu GABA ........................................ 25
Hình 2.1. Đường chuẩn GABA bằng phương pháp quang phổ ................................ 30
Hình 2.2. Đường chuẩn GABA xây dựng bằng phương pháp HPLC ...................... 31
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng B-439 ................................. 44
Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc (A), và tế bào (B) chủng VTCC-B-411. ................... 45
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng 66 ....................................... 45
Hình 3.4. Hình ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng 67 ....................................... 46
Hình 3.5.Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và các loài có quan hệ
họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự rDNA 16S ............................ 47
Hình 3.6. Phát hiện GAD từ 2 chủng B-411 và B-439 ............................................. 49
Hình 3.7. Sắc kí đồ GABA bằng HPLC. a, GABA chuẩn; b, dịch lên men chủng
VTCC-B-411; c, dịch lên men chủng VTCC-B-439 ................................................ 50
Hình 3.8. Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu ở các nhiệt độ.............................. 53
Hình 3.9. Sinh trưởng của các chủng ở các điều kiện cung cấp khí ......................... 54
Hình 3.10. Sinh trưởng của chủng Lactobacillus khi nuôi ở các tỷ lệ giống khác
nhau ........................................................................................................................... 55
Hình 3.11. Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu trêncác nguồn nitơ khác
nhau ........................................................................................................................... 56
Hình 3.12. Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu trên các nguồn carbon............... 57
Hình 3.13. Mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu ni cấy trên mơi trường có tỷ
lệ glutamate khác nhau .............................................................................................. 58
Hình 3.14. Hàm lượng GABA trên chè lên men với các tỷ lệ giống khác nhau ...... 63
Hình 3.15. Hàm lượng GABA trên chè lên men với độ ẩm khác nhau .................... 64
Hình 3.16. Hàm lượng GABA trên chè lên men với chế độ lên men khác nhau...... 64

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

DNA

Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic)

RNA

Axit ribonucleic

GABA Gamma -aminobutyric acid
GAD
HPLC

Glutamate decarboxylase
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High-performance liquid chromatography)


MỞ ĐẦU
Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật cùng với nhu
cầu cuộc sống ngày càng nâng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con người ngày càng
được chú trọng hơn, việc nghiên cứu và tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học
quan trọng nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Trong đó, Axit
Gamma-Aminobutyric (GABA) là một hợp chất được nghiên cứu rất nhiều trong
thời gian gần đây. GABA là một amino axit phi protein có 4 carbon, được tìm thấy

trong các lồi vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú. GABA
được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước.GABA là một chất dẫn truyền
xung thần kinh quan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống
oxy hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch,tiểu đường và giảm
cholesterol trong máu. GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng αdecarboxylation khơng nghịch đảo của axit L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc
tác bởi enzyme decarboxylase glutamic. Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như
Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Aspergillus và Neurospora; ở trong thực
vật như chè, cà chua, đậu nành, gạo lứt nảy mầm. Tuy nhiên vi khuẩn lactic là loại
phổ biến nhất để sản xuất GABA. Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt tính sinh lý
đặc biệt và có thể xem như khá an tồn trong q trình sử dụng vào mục đích chăm
sóc sức khỏe cho con người.
Chè là nguồn ngun liệu rất dồi dào của việt nam, giá thành rẻ, nhưng cho
tới nay vẫn chưa có một cơng trình nghiên cứu nào sử dụng lá chè xanh như một
nguồn nguyên liệu chính trong q trình sản xuất chè GABA. Do vậy, đây là một
trong những lý do chính giúp cho q trình sản xuất chè GABA có ý nghĩa khoa học
và thực tiễn và có thể tạo ra nguồn cung cấp GABA rất tiện lợi với giá thành rẻ.
Từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tổng hợp
Gamma-aminobutyric acid (GABA) của vi khuẩn lactic từ bộ giống VTCC ứng
dụng trong lên men chè giàu GABA.”
Mục tiêu:
-

Sàng lọc được các chủng Lactobacillus có khả năng tổng hợp GABA cao

-

Xác định được các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho quá trình tạo sinh khối
của các chủng vi khuẩn lactic lựa chọn.

1

-

Nghiên cứu được phương pháp thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic
lựa chọn và xác định được ảnh hưởng của các chất mang cũng như tỷ lệ phối
trộn của chất mang đến khả năng sống của vi khuẩn được lựa chọn

-

Nghiên cứu điều kiện lên men trên chè thích hợp tạo GABA cao sử dụng các
chủng vi khuẩn lactic lựa chọn

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về vi khuẩn axit lactic (LAB)
1.1.1. Khái niệm về vi khuẩn axit lactic
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi sinh vật có chung sản phẩm trao đổi chất
cuối cùng là acid lactic, đây là sản phẩm từ quá trình lên men của các carbohydrate.
LAB là các vi khuẩn Gram dương (+), có dạng trực khuẩn hay cầu khuẩn, ít di
động, khơng sinh bào tử và đặc tính catalase âm tính (Herich, 2002). Chúng có thể
hơ hấp kị khí hoặc kị khí tùy tiện. Một số lồi có thể sinh trưởng được khi có oxi.
LAB thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và sinh acid lactic.
Khoảng nhiệt độ cho LAB hoạt động khá rộng. Nhiệt độ sinh trưởng cho LAB ưa
ấm là 25oC - 30oC, ưa nhiệt là 40oC – 45oC và ưa lạnh là thấp hơn 5oC (Khalid,
2011). Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi
trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng

hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực
khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 4-3,8 cịn cầu khuẩn khơng thể phát triển
được ở mơi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng
pH = 5,5-6.0. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy được protein
của sữa tới peptide và acid amin. Hoạt tính này có ở các loài khác nhau, thường trực
khuẩn là cao hơn. Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn
ethylic, nhiều lồi vẫn sống được trong mơi trường có 10-15% cồn hoặc cao hơn,
một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10% (Nguyễn Văn Thanh, 2001).
Nhóm LAB bao gồm nhiều chi khác nhau và bao gồm bốn chi tiêu biểu:
Lactobacillus, Streptococcus, Leucononstoc và Pediococcus. Chi Bifidobacterium
cũng được coi là thuộc về LAB. Hơn nữa, có một vài chi cũng thuộc dòng
Lactobacilli:

Aerococcus,

Carnobacterium,

Enterococcus,

Oenococcus,

Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella (Halasz, 2009).
Dựa vào sản phẩm lên men, người ta phân vi khuẩn lactic thành 2 nhóm:
+ Lên men đồng hình: Là con đường lên men tạo ra 70-90% axit lactic. Một số
chủng lên men đồng hình: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus.

3


+ Lên men dị hình: Là con đường lên men tạo ra ít hơn 50% axit lactic và tạo ra các

sản phẩm khác như axit lactic, CO2 và Etanol. Một số chủng lên men dị hình:
Lactobacillus casei, Bifidobacteria.
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của LAB
1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng
Nhu cầu dinh dưỡng được phân làm ba loại là nhu cầu thiết yếu, nhu cầu
kích thích, và nhu cầu khơng thiết yếu (Letort, 2001). Các chất dinh dưỡng thiết yếu
có tác động tuyệt đối đến sự phát triển của vi khuẩn và khơng thể phát triển khi
khơng có các chất dinh dưỡng này. Các chất dinh dưỡng kích thích sự trưởng của vi
khuẩn và sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng này có thể dẫn đến sự sinh trưởng kém.
Các chất dinh dưỡng khơng thiết yếu khơng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi
khuẩn, không tăng cường hay ức chế. Tuy nhiên, chất dinh dưỡng, dù là thiết yếu,
kích thích, hoặc khơng cần thiết, đóng một vai trị quan trọng trong việc tối ưu hóa
và kiểm sốt các hoạt động trao đổi chất. Do vai trò quan trọng của chất dinh dưỡng
trong hoạt động trao đổi chất của LAB, nhu cầu dinh dưỡng của LAB được chú ý
nhiều hơn (Saeed, 2013).
a. Nhu cầu về carbohydrates
Carbohydrates là nguồn cacbon và năng lượng chính, hình thành các thành
phần thiết yếu trong môi trường của LAB cho sự sinh trưởng và chức năng bình
thường (Donnell, 2011).Các nguồn carbon và năng lượng có thể sử dụng hầu hết
các loại đường, nhưng một số lượng lớn các chủng LAB thích glucose (Kim,
2009).Tuy nhiên, các chủng LAB đã cho thấy sự ưu tiên giữa các loại đường khác
nhau và trong khả năng lên men các loại đường khác nhau có thể ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng của chúng. Do đó, sự sinh trưởng và các hoạt động trao đổi chất của
LAB có thể bị ảnh hưởng bởi các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy
(Degeest, 2001).
Sự khác nhau về nhu cầu carbohydrates giữa các chủng LAB có thể được sử
dụng để điều tra, lựa chọn và xác định. Fructose được bổ sung trong môi trường
MRS để phù hợp với sự tăng trưởng của L. bulgaricus và MRS bổ sung maltose
thích hợp cho sự khác biệt giữa L. acidophilus và L. paracasei [Tabasco, 2007].

4


Lactulose là một chất dẫn xuất lactose, thích hợp cho sự tăng cường sinh trưởng của
các chủng L. ruminis (Donnell, 2011). Do đó, mặc dù glucose thường được sử dụng
trong mơi trường ni cấy LAB, nhưng các lồi LAB và thậm chí là các chủng cho
thấy sự ưu tiên trong số các loại đường cho sự sinh trưởng tối ưu và hoạt động trao
đổi chất. Nồng độ đường cũng có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và chức năng
của LAB.
b. Nhu cầu về amino acids và peptides
LAB có nhiều nhu cầu về axit amin và peptide để đáp ứng nhu cầu nitơ phức
tạp của chúng (Savijoki, 2006). Sự tiến hóa của mơi trường phức tạp phức tạp dẫn
đến việc lựa chọn dinh dưỡng thụ động có liên quan đến các điều kiện mơi trường
ưa thích và khác nhau giữa các lồi LAB (Von Wright, 2011). Amino axit và
peptide có thể thu được từ các protease hoặc quá trình phân giải protein. Các nhu
cầu về peptide khác nhau giữa các chủng LAB, do đó các peptide có thể là nhân tố
sinh trưởng thiết yếu hoặc nhân tố kích thích, một số chủng có thể phát triển mà
khơng có chúng (Barrangou, 2011). Sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào các axit
amin từ các nguồn nitơ hữu cơ và sự sinh trưởng của LAB bị hạn chế bởi các axit
amin từ nguồn nitơ vơ cơ (Savijoki, 2006).
Các axit amin và peptit có thể được cung cấp từ các nguồn nitơ hữu cơ khác
nhau như sữa gầy, cao men, tryptone, soy peptones, cao thịt bị, cao
malt,…(Aguirre, 2008).Bên cạnh đó, peptide cũng có thể được cung cấp bởi các
nguồn nitơ vô cơ như Ure, (NH4) 2SO4, NaNO3 ... Tuy nhiên, peptone, cao men, cao
thịt bị thường được sử dụng cho sự sinh trưởng bình thường của LAB (Vazquez,
2004). Khi thay thế cao nấm men, peptone, cao thịt bị trong mơi trường bằng cao
nấm men và peptone, L. acidophilus, L. plantarum, L. casei có thể sinh trưởng trong
khi các chủng lactobacilli khác như L. delbrueckii subsp. bulgaricus và L.
delbrueckii subsp. lactis không thể sinh trưởng. Do đó việc thay thế cao thịt bị, cao
nấm men, và peptone với các nguồn nitơ khác có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự

sinh trưởng.
c. Nhu cầu về axit béo
Các axit béo thường liên kết với các hợp chất khác như glycerol, đường hoặc
phosphate để tạo thành lipid. Lipid là thành phần của cấu trúc tế bào

5


(phospholipids) và dự trữ năng lượng (triglycerides). Axit béo có nhiều chức năng
sinh học được xác định một cách đầy đủ; tuy nhiên, dữ liệu về vai trò của axit béo
và chất béo như là yếu tố tăng trưởng cho LAB vẫn còn hạn chế (Desbois, 2010).
Sự tương tác giữa sự phát triển vi sinh vật và các axit béo bao gồm LAB đã chỉ ra
tác dụng kháng khuẩn của axit béo (Desboi, 2010). Do đó, axit béo có thể ức chế sự
phát triển của vi sinh vật, nhưng một lượng nhỏ chất béo như 0,1% có xu hướng
kích thích sự phát triển của vi khuẩn (Jenkins, 2003).
Bên cạnh đó, hiệu quả ức chế của axit béo phụ thuộc nhiều hơn vào pH
(Kankaanpa, 2001). Ngoài ra, mặc dù hiệu quả kháng khuẩn của axit béo đã được
nghiên cứu kỹ lưỡng, cơ chế chính xác mà các axit béo ức chế sự phát triển của vi
khuẩn chưa được xác định rõ (Desbois, 2010; Jenkins, 2003).
d. Nhu cầu vitamin
Vitamin cần thiết cho LAB có thể được chia thành ba nhóm: vitamin thiết
yếu, kích thích và khơng thiết yếu. Nếu mơi trường ni cấy bỏ qua các vitamin
thiết yếu, sinh trưởng LAB có thể giảm 67%. Vitamin kích thích dẫn đến giảm từ 34
đến 66% sự sinh trưởng khi bỏ qua, các vitamin không thiết yếu dẫn đến giảm nhiều
nhất 65% sự sinh trưởng nếu bỏ qua. Pantothenic, axit nicotinic và riboflavin là các
chất thiết yếu cho hầu hết các chủng LAB (Letort, 2001; Wegkamp, 2010). Sự sinh
trưởng của lactobacilli cần thiamine trong arabinose, ribose và gluconate đóng vai
trị như một cofactor phosphoketolase, một enzym tham gia vào quá trình phosphate
pentose. Axit ascorbic không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của một số chủng LAB
nhưng nó là yếu tố tăng trưởng cần thiết cho các chủng khác (Wegkamp, 2010). Do

đó, nhu cầu vitamin của LAB thể hiện nhiều sự khác biệt giữa các chủng, và một số
vitamin có thể thay thế lẫn nhau. Tuy nhiên, từng chủng có nhu cầu từ một đến bốn
vitamin cho sự sinh trưởng bình thường.
e. Nhu cầu chất khống
Khống chất đóng một vai trị thiết yếu trong hoạt động tăng trưởng và
enzyme của vi khuẩn (Foucaud, 1997). Một số lồi LAB như Leuconostoc
mesenteroides khơng thể sinh trưởng khi thiếu ion kim loại, cho thấy nhu cầu thiết
yếu của các ion kim loại (Foucaud, 1997). Các ion kim loại thiết yếu có một số chức

6


năng: 1) như các chất kích hoạt hoặc đồng kết hợp của một loạt các enzyme, 2)
trong vận chuyển màng, 3) như các thành phần của các phân tử hoặc cấu trúc phức
tạp (Hébert, 2004). Mangan (Mn2+) là ion cần thiết cho sự phát triển và hoạt động
trao đổi chất của hầu hết các sinh vật bao gồm LAB. Mn2+ có tác động sinh học đối
với cấu trúc và hoạt hóa enzyme như glutamin synthetase, RNA polymerase, và
phosphatase kiềm (Fitzpatrick, 2001). Magnesium (Mg2+) là một thành phần thiết
yếu khác cho sự phát triển của LAB và các hoạt động trao đổi chất. Mg2+ kích thích
sự phát triển của LAB và cải thiện sự tồn tại của LAB. Mg2+ là oligoelement thiết
yếu cho sự phát triển của L. delbrueckii subsp. lactis (Hébert, 2004). Mg2+ cũng là
một ion kim loại thiết yếu cho sự sinh trưởng của S. thermophilus (Leite, 2015).
Mg2+ và Mn2+ được bổ sung vào môi trường tối thiểu của L. plantarum đảm bảo sự
sinh trưởng (Wegkamp, 2010).
1.1.2.2. Hoạt động trao đổi chất
Hoạt động trao đổi chất của LAB bao gồm sự phân hủy các carbohydrate
khác nhau và các hợp chất liên quan để thu được năng lượng và các phân tử cacbon
(Sanchez, 2008). Các hoạt động trao đổi chất khác như phá vỡ protein, lipid, và các
hợp chất khác cũng rất quan trọng đối với sự sinh trưởng bình thường. Do đó, các
hoạt động trao đổi chất của LAB có thể bao gồm trao đổi carbohydrate, protein,

lipid và các hoạt động trao đổi chất khác.
a. Trao đổi carbohydrate
Carbohydrate là nguồn năng lượng chính cho sự sinh trưởng của vi khuẩn.
LAB chuyển đổi carbohydrate thành các hợp chất hữu ích khác nhau (chủ yếu là
axit lactic) thơng qua q trình phổ biến được biết đến như lên men. Quá trình lên
men là q trình chuyển hóa đường, trong đó năng lượng có nguồn gốc từ q trình
oxy hóa từng phần của một hợp chất hữu cơ sử dụng các chất trung gian hữu cơ như
các nhà cung cấp và nhận electron (Von Wright, 2011).
b. Trao đổi protein
Các hoạt động phân giải protein của LAB rất quan trọng trong quá trình chín
nhanh và điều chỉnh enzym của các sản phẩm thực phẩm khác nhau như pho mát.
Phân giải protein là quá trình phá vỡ protein thành các polypeptide, amino axit, và

7


peptide bởi enzyme proteinase và peptidase (Savijoki, 2006). Hệ thống phân giải
protein của LAB rất quan trọng để tạo ra protein, peptide, và axit amin có sẵn cho
sự phát triển của vi khuẩn (Liu, 2010). Phân giải protein liên quan đến sự sinh
trưởng của lactobacilli và lactococci trong sữa, nơi chúng chủ yếu chịu trách nhiệm
về sự phát triển hương vị trong sản xuất pho mát [Liu, 2010]. Proteinase cũng làm
tăng tính dị ứng của sữa và các sản phẩm sữa cho trẻ sơ sinh có thể dẫn đến một vài
vấn đề dinh dưỡng nghiêm trọng về thiếu hụt năng lượng protein (Yuan, 2003).
c. Trao đổi lipid
Sự trao đổi lipid liên quan đến sự phá vỡ lipid bởi lipase thành axit béo và
glycerol. Các chủng LAB có lipase nội bào hoặc ngoại bào (Meyers, 1996). Bên
cạnh đó, các chủng LAB thực hiện các phản ứng chuyển hóa axit béo bao gồm đồng
phân, hydrat hóa, trùng ngưng và bão hịa [Ogawa, 2005]. Những chức năng này có
thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và chế phẩm sinh học, nhưng khơng
phải tất cả các chủng LAB đều có thể chuyển hóa lipid. Meyers và cs (1996) đã

sàng lọc trên 100 chủng LAB khác nhau để sản xuất lipase và chỉ xác định được 29
chủng tạo ra lipase (Meyers, 1996).
Hoạt tính lipase của LAB cung cấp các lợi ích sức khoẻ khác nhau cho vật
chủ. Lipase rất hữu ích trong việc chế tạo các chế phẩm ăn kiêng cho trẻ sơ sinh,
người cao tuổi, và các bệnh nhân đang dưỡng bệnh (Ogawa, 2005; Taranto, 1998).
Tác dụng gây hạ lipit của Lactobacillus có thể là do sự hấp thu lipid ở ruột thấp hơn
hoặc do sự chuyển hóa lipid cao hơn (Taranto, 1998).
1.1.3. Chi Lactobacillus
Lactobacillus là chi gồm các vi khuẩn Gram dương, hình que khơng tạo bào
tử, catalase âm tính, sinh trưởng bằng hình thức lên men carbohydrate tạo axít lactic
( Hammes, 2009).
Trong số LAB, Lactobacillus cũng là chi bao gồm một số lượng lớn các lồi
GRAS (thường được cơng nhận là an toàn) và nhiều chủng vi khuẩn quan trọng
trong vi sinh vật thực phẩm và dinh dưỡng của con người do sự đóng góp của chúng
vào q trình lên men thực phẩm hoặc sử dụng chúng như là probiotic .

8


Lactobacillus được phân nhóm dựa trên nhiệt độ tăng trưởng của chúng và
quá trình lên đồng hình hay dị hình (Carr, 2002). Nhóm lên men đồng hình bao gồm
L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, và L. salivarius.Nhóm lên men dị hình
bao gồm L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L.
fermentum, và L. reuteri.
Nhiệt độ nhiệt độ sinh trưởng của Lactobacillus từ 20 đến 55oC, và chúng có
thể phát triển trong khoảng pH 3-9. Nhiệt độ và độ pH sinh trưởng thích hợp cho
Lactobacillus lần lượt là 30-40oC và 6,5-8,0.
1.2. Tổng quan về γ -Aminobutyric axit (GABA)
1.2.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA là một amino axit phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các

lồi vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú. GABA được phát
hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước. Tuy nhiên vai trị của nó ở trong thế giới
thực vật vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật
thì các nhà khoa học đã tìm ra được vai trị của GABA: là một chất dẫn truyền xung
thần kinh quan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy
hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh. Ở vi khuẩn và
thực vật GABA đóng vai trị trao đổi chất trong chu trình Krebs, cịn ở động vật có
xương sống nó đóng vai trị như một máy phát tín hiệu thần kinh mạnh (Diana và
cộng sự, 2014).
GABA có cơng thức phân tử là: C4H9NO2

Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của GABA [87]

9


1.2.1.1. Enzyme tổng hợp GABA
L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp
GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2. Hoạt động của enzym GAD cần
một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP).

Hình 1.2: Phương trình phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate [88]
GAD tồn tại dưới hai dạng đồng phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân
tử của chúng (lần lượt là 65 và 67 kDa). Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập
nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số 10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10
và gen GAD67 nằm trên NST số 2. GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào
thần kinh GABAergic trong cơ thể. Ngược lại, GAD65 chủ yếu được tìm thấy ở tận
cùng các dây thần kinh và nó có thể được treo trên màng của các túi chất dẫn truyền
thần kinh. Cả GAD65 và GAD 67 đều được quy định thông qua sự phosphoryl hóa.
GAD65 được kích hoạt bởi sự photphoryl hóa trong khi GAD67 bị ức chế bởi sự

photphoryl hóa. GAD67 được photphoryl hóa bởi protein kinase C (PKC). Cả
GAD67 và GAD65 cũng được quy định sau khi dịch bởi Pyridoxal 5’-phosphate
(PLP); GAD được kích hoạt khi bị ràng buộc với PLP. Đa số GAD67 bị ràng buộc
với PLP vào bất kỳ thời điểm nào, trong khi GAD65 liên kết với PLP khi mà
GABA là chất cần thiết cho sự dẫn truyền thần kinh. Điều này phản ánh sự khác
nhau về tính chất và chức năng của 2 đồng vị.
1.2.1.2. Cơ chất tham gia tổng hợp GABA
Trong quá trình sản xuất Axit γ-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic
thì Monosodium glutamate (MSG) được xem như là một cơ chất quan trọng (Kook
và cộng sự, 2010). MSG là một dạng muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên
sinh ra từ amino axit mà được tìm thấy trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực

10


phẩm chứa hàm lượng protein cao chẳng hạn như phomai, sữa, thịt, cá và nhiều loại
rau khác nhau. Trong thực phẩm thường sử dụng MSG để tạo ra vị đã được biết tới
khoảng 1200 năm về trước. Nó đã có mặt trên thị trường cách đây hơn 300 năm.
Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hương vị bằng cho thêm MSG với hàm lượng
cao. MSG trong một số loại thuốc đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở
chuột cống mới sinh. Tuy nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã khơng xảy ra
trong thực phẩm có MSG. Ngồi ra, dựa vào vơ số những chứng minh khoa học
cũng đã công bố MSG là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con
người mà nó có vai trị như một phân tử truyền tín hiệu khơng chỉ ở trong thần kinh
mà cịn ở một số các mơ khác. Tuy nhiên, nếu q trình tích lũy MSG vượt q
ngưỡng trong các khe xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn
tới phá hỏng hoặc làm tổn thương tới tế bào. Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là
gây độc cho tế bào thần kinh ở trẻ em dưới 5 tuổi. Bởi vậy, sử dụng MSG như là một
cơ chất cho q trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng được quan tâm.
1.2.1.3. Cơ chế hình thành GABA

Trong cây và trong động vật, GABA được hình thành qua 3 enzyme: enzyme
glutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) và
enzyme succinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH).
Chu trình thủy phân nitrogen bởi enzyme glutamine–synthetase hay
glutamate–synthase (GS hay GOGAT) là một con đường chính để đồng hóa
nitrogen thành glutamate và amino axit trong thực vật. Glutamate decarboxylase
(GAD) là một enzyme trong dịch tế bào chịu ảnh hưởng bởi phức hợp Ca2+–
calmondulin (CaM), làm xúc tác cho quá trình decarboxyl glutamate biến đổi thành
GABA. Sau đó, GABA được chuyển vào trong ty thể và bị biến đổi thành succinic
seminaldehyde bởi enzyme GABA transaminases sử dụng cả α–ketoglutarate (thành
enzyme GABA–TK) và pyruvate (thành enzyme GABA–TP) như là những nơi tiếp
nhận các amino axit. Tiếp theo, succinic seminaldehyde được biến đổi thành
succinate bởi enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH), sau đó tham
gia vào chu trình TCA. Cả ATP và NADH có thể trở thành chất ức chế hoạt động
của enzyme SSADH. Các enzyme succinyl–CoA ligase và α–ketoglutarate

11


dehydrogenase (α–KGDH) là các enzyme của chu trình TCA nhưng có liên quan
đến chu trình biến đổi GABA và các enzyme này nhạy cảm với sự stress oxy hóa.
Succinic semialdehyde cịn có thể bị biến đổi thành γ–hydroxybutyric (GHB) ở bên
ngoài là dịch bào ở cả động vật và thực vật.Ở động vật có vú, GHB được biết đến
như là một chất dẫn truyền xung thần kinh, trong khi đó, ở thực vật thì vẫn chưa
biết rõ chức năng của GHB.
Vai trò của enzyme GABA–TK vẫn còn đang được nghiên cứu, trong khi đó,
vai trị của enzyme GABA–TP đã được nghiên cứu rõ ràng trong cây thuốc lá và cây
hoa Arabidopsis. GABA–TP là một enzyme chức năng cho quá trình biến đổi
GABA. GABA–TP có một vài chức năng đặc biệt ở các lồi hoa: đóng góp vào sự
cân bằng C:N, điều chỉnh lại độ pH, chống lại sự oxy hóa, bảo vệ cây khỏi cơn trùng,

GABA cịn là chất điều hòa thẩm thấu màng tế bào (Palanivelu và cộng sự, 2003).

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa GABA shunt [13]
Như vậy, cơ chất chính trong q trình tạo thành GABA chính là glutamate,
sau đó GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde và
cuối cùng tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) và succinate (ty lạp thể). Ngồi
ra ta cũng có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouche' và cộng
sự, 2004).
Có rất nhiều nghiên cứu mới để làm tăng hàm lượng GABA như tác động lên
bộ gen của enzyme glutamate dehydroxylase, biến tế bào thành một nhà máy sinh
tổng hợp thừa GABA. Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp lên
men bằng vi sinh vật Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei,...; Escherichia

12


coli; Monascus,… trên nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau để sản xuất GABA và
còn nhiều phương pháp khác (Bouche' và cộng sự, 2004).
1.2.1.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến tổng hợp GABA
Các yếu tố lên men khác nhau ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất GABA từ vi sinh
vật. Giữa chúng các nhân tố chung và cần thiết là pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy,
các chất phụ gia của mơi trường. Các điều kiện lên men có thể được tối ưu hóa dựa
trên các đặc tính sinh hóa của GAD của các vi sinh vật lên men. Hiệu quả của
phảnứng này làm tăng tính kiềm của cytosol và mơi trường. Để duy trì pH tối ưu 5,0;
tại pH này sản xuất GABA cao nhất thu được bằng L. brevis, H2SO4 đã được bổ
sung vào dịch lên men để bù lại sự gia tăng pH, phát sinh từ decarboxylation. Tương
tự, hàm lượng glutamat 500 mM trong nuôi cấy vừa được chuyển thành 302 mM
GABA bằng cách tối ưu hóa điều kiện lên men của L. paracasei NFRI 7415 ở pH 5.0
với việc bổ sung pyridoxal-5’- phosphate (PLP) (Komatsuzaki, 2005). Các sản xuất
GABA bởi Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Y2 cũng được tăng cường

bằng cách tối ưu hóa điều kiện lên men ở pH 4,5 và bằng cách bổ sung PLP.
Các điều kiện tối ưu khác nhau giữa các vi sinh vật lên men do các tính chất
khác nhau của GAD, do đó, đặc tính hóa hóa sinh của GAD sẽ được yêu cầu trong
các vi sinh vật quan tâm để đạt được sản xuất GABA cao nhất. Điều kiện tối ưu cho
vi sinh vật sản xuất GABA được tóm tắt dưới đây, đặc biệt ảnh hưởng của pH, nhiệt
độ, thời gian ni cấy, các chất phụ gia.
• Ảnh hưởng của pH
Sự sinh tổng hợp GABA trong vi sinh vật chủ yếu được điều chỉnh bởi độ
pH, thường có tác động rõ rệt nhất đối với quá trình lên men (Komatsuzaki, 2005).
Các đặc tính sinh hóa của GAD khác nhau giữa các vi sinh vật khác nhau, do đó giá
trị pH hiệu quả cho sản xuất GABA tối là đa phụ thuộc vào lồi (Li, 2010).
pH trong mơi trường lên men thay đổi theo thời gian lên men, do đó độ pH
ban đầu ảnh hưởng đến sản lượng GABA cuối cùng và pH của môi trường nên được
điều chỉnh kịp thời để duy trì độ pH tối ưu (Li, 2010).
Sản xuất GABA cao bằng q trình lên men khơng chỉ phụ thuộc vào kích
hoạt hoạt động của GAD mà cịn liên quan đến ức chế hoạt động của các enzyme

13


phân hủy GABA. Một con đường để phân hủy GABA tồn tại trong rất nhiều loại
thực vật và vi sinh vật.
GABA transaminase làm xúc tác chuyển đổi thuận của GABA thành semialdehyde succinic sử dụng pyruvate hoặc α-ketoglutarate như là chất chấp nhận
amino và succinate semi-aldehyde dehydrogenase làm xúc tác sự chuyển đổi có thể
đảo ngược succinate semi-aldehyin . GABA transaminase phân lập từ Pseudomonas
aeruginosa chuyển GABA hoạt động mạnh nhất ở pH 8,5 . Các sinh vật khác, bao
gồm Pseudomonads cũng như các sinh vật cao hơn cũng cho thấy hoạt tính cao nhất
của transaminase GABA khoảng pH 8,5. Succinic semi-aldehydedehydrogenase
phân lập từ Saccharomyces có pH tối ưu 8,4 cho hoạt động enzyme cao nhất. Do
đó, hoạt động của hai enzyme nên bị cản trở bởi pH bằng cách điều chỉnh độ pH của

đệm để đạt được sản xuất tối đa GABA.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ cũng là nhân tố ảnh hưởng sản lượng GABA tối đa bằng lên men.
Ngoài tác động lên hoạt động sinh học và ổn định, nhiệt độ cịn có ảnh hưởng đến
sự cân bằng nhiệt động lựchọc của một phản ứng. Việc chuyển đổi glutamate thành
GABA đạt hiệu quả cao đòi hỏi mật độ tế bào cao và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp.
Sản xuất GABA ở L. brevis NCL912 có tương quan dương với mật độ tế bào, điều
này phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy. L. brevis NCL912 tăng trưởng với nhiệt độ
cao hơn và đạt ngưỡng tại 35ºC, sau đó giảm xuống khi nhiệt độ giảm. L.
plantarumDSM19463 tổng hợp lượng GABA (59 μM / h) cao nhất khi được nuôi
tại nhiệt độ giữa 30ºC và37ºC. Nhiệt độ tối ưu cho L. brevis GAD và L. brevis
CGMCC 1306 đã được tìm ra tại 30 ° C và 37 ° C; L. brevis GABA100 nước ép
mâm xôi đen lên men sản sinh tối đa GABA (27,6 mg / ml) ở pH 3,5 và 30 ° C vào
ngày thứ 12 của quá trình lên men. L. buchneri ni cấy trong mơi trường dịch thể
MRS cũng có nhiệt độ tối ưu cho sản xuất GABA tại 30 ° C. Tế bào của L. brevis
đã sản xuất 92% GABA sau 8 giờ lên men. Nói chung, nhiệt độ lên men dao động
từ 25 ° C đến 40 ° C, tạo ra sản lượng GABA cao.
• Ảnh hưởng của thời gian lên men
Yếu tố thời gian đóng một vai trị quan trọng trong q trình lên men và sản
xuất GABA khi nhiệt độ và pH làm L. plantarum DSM19463 và L. paracasei NFRI

14


7415 cần 72 giờ và 144 giờ lên men để đạt được sản lượng GABA cao nhất là 4,83
mM và 60 mM . Nước mâm xôi đen lên men với L. brevis GABA 100 đạt sản lượng
cao nhất GABA ở mức 25,4 mg / ml và 26,5 mg / ml vào ngày thứ 15 của quá trình
lên men ở (25 ° C; pH 4,0) và (37 ° C; pH 5,5), trong khi đó nó đạt đến mức cao
nhất của GABA vào ngày thứ 12 khi các mẫu được lên men ở pH 3,5 và 30 ° C
(Kim, 2009).

Thời gian bổ sung cho cơ chất GABA cũng ảnh hưởng đến năng suất cuối
cùng của GABA cũng như nồng độ chất nền trong môi trường. Một sự khác biệt
đáng kể về sản lượng GABA giữa các lần bổ sung MSG khác nhau đã được hiển thị
trong quá trình lên men của Lc. lactis, sản lượng GABA cao nhất thu được khi
MSG được thêm vào lúc bắt đầu lên men (0 giờ), sản lượng GABA giảm xuống khi
MSG được bổ sung trong suốt 6 đến 96 giờ lên men trong khoảng thời gian 6 giờ.
Việc bổ sung PLP trong các khoảng thời gian khác nhau cũng ảnh hưởng đến việc
sản xuất GABA (Yang, 2008). Sản xuất GABA ở 72 giờ đạt 6272; 6570 và 7333
mg / l khi PLP được thêm vào lúc 0; 24 và 48 giờ. Lượng GABA cao hơn được tạo
ra bằng cách thêm PLP vào lúc 48 giờ so với lúc 0 và 24 giờ cho thấy rằng PLP có
thể dễ dàng mất đi vai trị là coenzyme do mất kiểm sốt đối với dịch ni cấy trong
q trình lên men. Tuy nhiên , bổ sung PLP tại 48h cũng phục hồi một phần hoạt
động GAD. Những kết quả này chỉ ra rằng sản xuất GABA cao nhất do vi sinh vật
có thể phụ thuộc vào việc bổ sung các chất phụ gia thích hợp và thời gian bổ sung
tối ưu cho các chất phụ gia.
• Ảnh hưởng của các chất phụ gia
Thành phần dinh dưỡng và điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến sản xuất
GABA bằng q trình lên men vi sinh. Ngoài ra, các chất phụ gia bao gồm
glutamate và PLP là coenzyme của GAD là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sản
xuất GABA trong quá trình lên men. Thành phần mơi trường, đặc biệt là nguồn
cacbon , nitơ và các thành phần khác có thể ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất
GABA. Ngoài ra, nồng độ cơ chất cũng quan trong cho năng suất GABA cao.
L. plantarum DSM19463 đã sản xuất 0,9 mM GABA bằng q trình lên men
nho phải pha lỗng tới 4% (w / v) trong tổng số carbohydrate (Di Cagno, 2010).

15


Trong số các loại carbohydrate khác nhau được thử nghiệm như L-arabinose;
Ribose; D-xylose; galactose; glucose; fructose; maltose; Melibiose; a-metyl Dglucoside; N-acetyl D-glucosamine và gluconate làm nguồn carbon, glucose 1,25%

là carbon tốt nhất cho sản xuất GABA cao. Bổ sung 0,5% ethanol làm nguồn carbon
trong quá trình lên men bằng cách sử dụng M. purpureus NTU 601 và M. pilosus
làm tăng sản xuất GABA và đạt đến 7453 và 385 mgGABA / kg. Việc bổ sung
2,5% cao men, peptone và cao thịt là một nguồn nitơ sản xuất khoảng 200 mM
GABA. So với việc lên men của M. pilosuss không bổ sung MSG như là nguồn
nitơ, việc bổ sung 1,0% MSG vào môi trường của gạo 60 g đã khử trùng với
peptone 1,0% (w / w) đã tạo ra GABA khoảng 2,8 lần (502,39 mg / kg). Ngay cả
0,5% urê như là một nguồn nitơ đã tăng cường sản xuất GABA trong quá trình lên
men với M. purpureus 601 (Wang, 2003).
Bổ sung glutamate làm tăng sản xuất GABA bằng L. paracasei và L. brevis .
Nồng độ GABA đạt 161 mM sau nuôi cấy 144 h trong môi trường chứa 500 mM
glutamate của L. paracasei NFRI 7415, L. brevis NCL912 và L. brevis cũng tăng
sản xuất GABA bằng cách bổ sung glutamate . Tuy nhiên, S. salivarius subsp.
thermophilus Y2 không làm tăng sản xuất GABA đáng kể khi glutamate được thêm
10-20g / l môi trường, cho thấy nồng độ glutamate này không thích hợp cho sự tổng
hợp GABA trong lồi này .Việc sản xuất GABA bằng cách sử dụng glutamatelàm
cơ chất vẫn cịn với một số vấn đề, như chi phí cao của môi trường nuôi cấy.
PLP được sử dụng như là một coenzyme của GAD để tăng cường hoạt tính
GAD. Bằng cách bổ sung PLP, sản xuất GABA tăng lên và đạt đến 7333 mg / l, 200
mM và 504 mg / kg trong quá trình lên men với S. salivarius subsp.thermophilus
Y2, L. paracasei NFRI 74150 và L. plantarum C48. Việc bổ sung 0,1 mM PLP vào
nho đã pha lỗng khơng làm tăng tổng hợp GABA , có thể là do sự có mặt của PLP
trong nho (Castor, 1953). Việc bổ sung PLP trong môi trường nuôi cấy cho sản xuất
GABA bằng L. brevis NCL912 không tăng số lượng GABA, cho thấy rằng L.brevis
NCL912 có thể tự tổng hợp PLP bằng chính nó (Li, 2010).
Việc bổ sung ion sunfat làm tăng hoạt tính GAD của L. brevis IFO 12005
cho thấy hoạt động GAD tăng lên là do sự tương tác hydrophytobic tăng lên giữa

16