Nghiên cứu khả năng thuỷ phân bã sắn bằng các chủng vi khuẩn bacillus sp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo số liệu thống kê của FAO, Việt Nam là nước xuất khẩu tinh bột sắn
đứng thứ hai trên thế giới, chỉ sau Thái Lan. Tinh bột sắn được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau như thực phẩm, y dược, dệt…
Chính vì vậy, trong những năm gần đây, ở nước ta nhiều nhà máy sản xuất tinh
bột sắn ra đời. Hiện nay, ở Việt Nam có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng
công suất khoảng 38 triệu tấn củ tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chế biến
tinh bột sắn có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh
bột, kèm theo đó là 12 – 48 tấn bã (số liệu lấy từ nhà máy sản xuất tinh bột sắn
Fococev Thừa Thiên Huế). Chất thải rắn chính là vỏ và bã sắn. Bã sắn có độ ẩm
trên 80% nên khi phơi dễ bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh hưởng đến
môi trường xung quanh. Tại một số địa phương có nhà máy tinh bột sắn, người
dân sinh sống trong khu vực lân cận, hằng ngày, lúc ăn cũng như lúc ngủ, họ
phải chịu mùi hôi thối nồng nặc của bã sắn ngâm ủ, phơi và vận chuyển vung
vải trên đường. Như vậy, vấn đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay
là vấn đề cần được giải quyết một cách khẩn trương. Bởi lẽ tình trạng này càng
kéo dài thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng. Hơn nữa, xử lí bã sắn
vừa làm tăng giá trị cho bã sắn vừa tạo sản phẩm phụ có ích trong các nhà máy
sản xuất tinh bột sắn. Hiện nay, bã sắn chủ yếu được bán làm thức ăn gia súc ở
dạng khô hoặc dạng tươi. Việc sử dụng bã sắn theo dạng này mang lại hiệu quả
về giá trị dinh dưỡng và kinh tế không cao. Việc nghiên cứu giải pháp xử lý bã
sắn bằng chế phẩm vi sinh sẽ vừa có ý nghĩa kinh tế, vừa có ý nghĩa môi trường.
Bacillus là loài vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và nội bào
mạnh, các enzym của Bacillus có hoạt tính sinh học cao. Chúng ngày càng được
sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, thuộc da, y học, dệt
vải
Do đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu khả năng
thuỷ phân bã sắn bằng các chủng vi khuẩn Bacillus. sp” nhằm tìm ra giải
pháp xử lý bã sắn bằng chế phẩm vi sinh vừa mang lại giá trị kinh tế, vừa có ý
nghĩa môi trường.
Nội dung nghiên cứu gồm có:

- Khảo sát hoạt tính enzyme amylase và enzyme protease của bốn chủng
Bacillus.sp trong môi trường tối ưu cơ bản.
- Nghiên cứu khả năng thủy phân bã sắn của bốn chủng Bacillus.sp
1
1
- Nghiên cứu điều kiện thủy phân bã sắn (nhiệt độ, tỷ lệ canh trường và
thời gian thủy phân).
- Thăm dò khả năng lên men của chủng Lactobacillus fermentum MC9 và
Lactobacillus fermentum T10 trong dịch bã sắn sau khi đã thủy phân.
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là bước đầu tạo điều kiện cho các nghiên
cứu sâu hơn về khả năng thủy phân của hệ vi khuẩn và sàng lọc các dòng vi
khuẩn có khả năng thủy phân cao để áp dụng vào việc xử lý bã sắn ở các nhà
máy tinh bột sắn.
2
2
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bã sắn
1.1.1. Quy trình sản xuất tinh bột sắn
Nguyên liệu
Tiếp nhận
cân
Kiểm tra độ bột
Phễu nạp liệu
Bóc vỏ
Rửa
Chặt
Nước thải của máy phân ly
Tạp chất
Mài

Trích ly thô
Trích ly tinh
2-4
0
Be
Sữa loãng
Bã sắn
3
3
Đóng bao
Làm nguội
Sấy
210-220
0
C
Ly tâm
32-35%
Nước sạch
Dịch bào
Phân ly thô
10-12
0
Be
Phân ly tinh
19-21
0
Be
4
4
Sơ đồ 1 Sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột sắn tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn

Fococev Thừa Thiên Huế.
Trong quá trình sản xuất tinh bột sắn sẽ thải ra một lượng lớn bã sắn bao
gồm hai loại:
- Loại thứ nhất là bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ, chiếm tỉ trọng ít
và thành phần chủ yếu là cenlulose, hemicenlulose, cát và sạn. Loại này thường
được chôn lấp hợp vệ sinh hoặc dùng làm phân bón.
- Loại thứ hai là phần bã còn lại sau khi tách tinh bột sắn được gọi là bã sắn.
Trong loại bã này có chứa phần lớn là cenlulose và một phần tinh bột còn
sót lại. Mục đích của chúng tôi là sử dụng chế phẩm enzyme sinh học để chuyển
các thành phần này thành các hợp chất đơn giản và dễ hấp thụ cho gia súc, và
cũng có thể sử dụng các hợp chất này làm cơ chất cho các quá trình chuyển hóa
tiếp theo.
1.1.2 Bã sắn
Sắn thuộc chi Manihot loài Manihot Esculenta, còn có tên khác: khoai
mì, cassava, tapioca, singkong là cây lương thực ăn củ, thuộc họ thầu dầu
Euphrbijaceae. Sắn là một loại cây trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như
Brazil, Thái Lan, Việt Nam Nó được dùng để sản xuất bột sắn, làm thức ăn
và sản xuất tinh bột sắn. Mỗi ngày ngành công nghiệp sản xuất tinh bột sắn thải
ra hàng tấn chất thải rắn như bã sắn. Nó có thể là nguyên nhân nghiêm trọng làm
ô nhiễm môi trường.
Theo A.Pandey/ Bioresource Technology 74 (2000)
Bảng thành phần hóa lý của bã sắn (g/100 g khối lượng khô)
Thành phần
Soccol
(1994)
Cereda
(1994)
Sterz
(1997)
Vandenberghe

(1998)
Độ ẩm 5,02 9,52 10,70 11,20
Protein 1,57 0,32 1,60 1,61
Lipid 1,06 0,83 0,53 0,54
Chất xơ 50,55 14,88 22,20 21,10
Tro 1,10 0,66 1,50 1,44
Carbonhydrates 40,50 63,85 63,40 63,00
5
5
Hiện nay, bã sắn tại các nhà máy sản xuất tinh bột sắn được bán cho các
doanh nghiệp hoặc người dân chăn nuôi nhỏ với giá rất rẻ khoảng 200 đồng/kg
bã tươi và 800 – 1000 đồng/kg bã khô (giá tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn
Fococev Thừa Thiên Huế). Với giá thành như vậy thì việc sử dụng bã sắn để sản
xuất các sản phẩm khác là hoàn toàn thuận lợi, vừa giải quyết được vấn đề môi
trường, vừa tăng thêm giá trị sử dụng và kinh tế cho bã sắn.
Ở Việt Nam bã sắn chủ yếu được sử dụng để sản xuất ra các sản phẩm sau:
- Thức ăn cho động vật nhai lại
- Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao từ bã sắn
- Sản xuất cồn sinh học
-Tạo chất dính cho sản xuất diêm
- Dùng làm phân bón
- Dùng làm thức ăn gia súc
- Sản xuất etanol sinh học
1.1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay
Ở Việt Nam, bã sắn chủ yếu được bán ra ở dạng chưa qua xử lý hoặc phơi
khô khi không thể tiêu thụ ở dạng tươi được. Việc nghiên cứu nâng cao chất
6
6
lượng sử dụng của bã sắn và sử dụng bã sắn vào mục đích công nghiệp còn rất
ít, chỉ có một số công trình tiểu biểu như:

- Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009)[15] đã tiến
hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với
các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Kết quả cho thấy ủ chua là biện
pháp phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều
kiện nông hộ. Hàm lượng HCN giảm đáng kể sau 21 ngày ủ nên có thể sử dụng
một lượng lớn bã sắn ủ trong khẩu phần cho gia súc nhai lại mà không gây ngộ
độc.
- Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và
Nguyễn Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội)
[7] đã sử dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi
trường Nông nghiệp cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi
khuẩn với hoạt tính phân giải cenlulose, tinh bột và phân giải phốt phát khó tan),
sau đó cho ủ cùng bã thải sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các
nguyên liệu phụ như rỉ mật, ure, kali, super lân, vôi bột.
Trên thế giới, ở một số nước nhờ sự tiến bộ, phát triển của khoa học công
nghệ sinh học đã ứng dụng các tiềm năng sinh học vào quá trình nâng cao giá trị
cho các phế liệu của ngành nông-công nghiệp như là bã sắn, bã cà phê, bã táo
ép Một số công trình nghiên cứu điển hình như sau:
- Ashok Pandey và cộng sự (2000)[20] đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng
các thành tựu công nghệ sinh học nhằm nâng cao giá trị sử dụng cho các phế
liệu của ngành công nghiệp – nông nghiệp như sử dụng bã sắn, bã cà phê, bã táo
ép làm cơ chất để thu nhận ethanol, enzyme, hỗn hợp acid, amino acid, nấm
- S.Gaewchingduang và P. Pengthemkeerati ( 2010)[36] đã chỉ ra các biện
pháp xử lý bã sắn nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành đường khi thủy
phân bã sắn bằng enzyme và bằng acid. Và kết quả thu được là nếu thủy phân
bằng enzyme thì quá trình xử lý nhiệt ở 130
0
C trong 30 phút sẽ làm tăng hiệu
suất thu hồi đường, trong khi đối với thủy phân bằng acid là 120
0

C trong 60
phút.
- Shaktimay Kara và cộng sự (2010)[39] đã công bố điều kiện thích hợp
để sản xuất α-amylase bằng Streptomyces erumpens MTCC 7317 trong môi
trường lên men bán rắn của bã sắn. Kết quả cho thấy rằng, khi nuôi cấy
Streptomyces erumpens MTCC 7317 với tỉ lệ 15% (v/w, 2.5 x 10
6
CFU/ml) vào
môi trường bã sắn ở điều kiện nhiệt độ 50
0
C, độ ẩm 60% trong thời gian 60 giờ
7
7
và có bổ sung nguồn nitơ từ cao thịt thì khả năng thu nhận enzyme α-amylase là
cao nhất.
- Adenise Lorenci Woiciechowski và cộng sự (2002)[18] đã chứng minh
rằng quá trình thủy phân bã sắn bằng việc sử dụng kết hợp acid và enzyme sẽ
cho hiệu quả kinh tế cao hơn là chỉ sử dụng acid hoặc enzyme để thủy phân.
- Rojan P.John và cộng sự (2006)[33] đã sử dụng Lactobacillus ( L.casei
và L.delbrueckii) để thực hiện đồng thời hai quá trình đường hóa và lên men bã
sắn để sản xuất acid lactic.
1.2 Tổng quan về Bacillus sp.
1.2.1 Giới thiệu chung
Vi khuẩn thuộc Bacillus sp. phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về
sinh thái. Các loài Bacillus sp. đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật
quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng
loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên
men bia hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ
phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì
lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về Bacillus sp. cũng như mở

rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống con người.
Bacillus sp. đã được nhiều công trình công bố có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulose, protease. Vì vậy, có rất
nhiều nghiên cứu tập trung vào việc thu nhận các chế phẩm enzyme ngoại bào từ
các chủng vi khuẩn này. Dưới đây là một số công trình nghiên cứu tiêu biểu.
- Sự bổ sung 0,02% canxi (10 mM) hoặc peptone (1%) và chiết xuất nấm
men (0.5%) cùng 2% nguồn tinh bột hòa tan như là nguồn cacbon duy nhất cũng
đã cải thiện sự tăng trưởng và tổng hợp amylase của chủng Bacillus chịu nhiệt
(Suman. S and Ramesh K. , 2010)[42].
- Krishnan và Chandra (1982)[28] đã sử dụng phế liệu từ quá trình chế biến
dầu (lạc, mù tạt, vừng, cùi dừa, hạt lanh hoặc bông) trong nghiên cứu của mình
và cho rằng các loại bánh dầu thực vật có tác dụng rõ rệt lên quá trình sinh tổng
hợp α-amylase ngoại bào chịu nhiệt của B. licheniformis CUMC305.
- Shaista Kokab và cộng sự (2003)[37] đã sử dụng vỏ chuối cắt nhỏ trong
môi trường rắn (SSF) để khảo sát quá trình lên men sinh tổng hợp α-amylase từ
B. subtilis.
8
8
- William và Withers (1983)[42] đã phân lập được các chủng Bacillus sp.
(B. licheformis, B.coagulans, B. lateroporus, B. pumilus) có khả năng sinh tổng
hợp các enzyme ngoại bào thủy phân các polysaccharide như hemicellulose
depolymerase, glycoside hydrolase.
- Nghiên cứu thu nhận và khảo sát các tính chất hỗn hợp các enzyme ngoại
bào có khả năng thủy phân xylan (β-xylanase, β-xylosidase, β-glucosidase, β-
manase, arabinosesidase, α-glucuronidase và galactosidase) từ Bacillus pumilus
CBMAI 008 đã được thực hiện bởi Duarte và cộng sự (2003)[24].
- Shikha và cộng sự (2007)[40] đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi
cấy, có sử dụng rỉ đường, để Bacillus pantotheneticus sinh tổng hợp protease
kiềm tính ngoại bào cao. Các tính chất của chế phẩm enzyme thu được cũng
được nhóm tác giả này công bố. Điều kiện cho enzyme này hoạt động tốt là

nhiệt độ 30
o
C và pH=10
- Shah và cộng sự (1999)[38] đã nghiên cứu thu nhận và khảo sát tính chất
của enzyme thủy phân cellulose, xylananase ngoại bào, bởi Bacillus sp. và ứng
dụng chế phẩm enzyme này trong việc thủy phân bã sắn. Chế phẩm enzyme này
hoạt động tốt ở 60
o
C và pH 8. Nó có khả năng thủy phân bã sắn ở khoảng pH
khá rộng, từ 7 đến 9.
1.2.2 Tổng quan về một số enzyme của Bacillus sp.
1.2.2.1. Amylase
• Giới thiệu chung về amylase
Amylase là enzyme có khả năng xúc tác thủy phân tinh bột thành các sản
phẩm khác nhau bao gồm dextrin và các polyme có kích thước nhỏ hơn được tạo
thành từ các đơn vị glucose. Các enzyme này được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp sản xuất bánh mì, sản xuất các loại kẹo, công nghệ sản xuất rượu bia,
công nghiệp sản xuất mật tinh bột, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy. Trên
thế giới, enzyme amylase được sản xuất từ nguồn vi sinh vật chiếm khoảng 25-
30% [20].
• Phân loại và tính chất [1], [13]
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chia
amylase làm 3 loại: α-amylase, β-amylase và γ-amylase.
α -amylase
9
9
α-amylase là một trong những enzyme thương mại quan trong nhất, α-
amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào
trong phân tử tinh bột.
α-amylase tương đối bền với các tác dụng của nhiệt. Đặc biệt α-amylase

của nhiều vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng có thể giữ được hoạt tính ở 70-
90
o
C. Tính bền nhiệt của α-amylase là do sự có mặt của canxi trong phân tử
enzyme, ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme.
α-amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng axit yếu, α-amylase của
nấm mốc hoạt động mạnh ở pH = 4,5-4,9; của vi khuẩn ở pH = 5,9-6,1. Nếu
pH<3, đa số α-amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α-amylase của Aspergillus
niger có thể chịu được pH = 2,5-3,8.
β -amylase
β-amylase là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch
amylose, amylopectin, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose.
Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6 glucoside ở amylopectin
nên kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50-60% maltose. Hầu hết β-
amylase có nguồn gốc từ thực vật.
β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase bị vô hoạt hoàn
toàn ở nhiệt độ 70
o
C. Tuy nhiên, trong dịch nấu với nhiệt độ là 60-65
o
C pH môi
trường là 4,5-5 thì β-amylase sẽ hoạt động mạnh hơn.
γ-amylase
γ-amylase là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu
không khử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose. γ-amylase cũng có khả năng
thuỷ phân cả maltose và dextrin.
Đa số γ-amylase đều thuộc loại enzyme axit thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH= 3,5-5,5. Nhiệt độ hoạt động tối thích là 50-60
o
C. Hầu hết γ-amylase bị

mất hoạt tính khi đun nóng trên 70
o
C.
• Nguồn thu nhận amylase
Enzyme amylase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, rất phổ biến
trong thế giới sinh vật. Chúng được tìm thấy trong thực vật, động vật và vi sinh
vật như ở một số loại nấm và vi khuẩn.
10
10
Tuy nhiên amylase được thu nhận từ nguồn vi sinh vật là có giá trị kinh tế
hơn cả.
Amylase được sản xuất từ nguồn vi sinh vật chiếm khoảng 25-30% thị
trường enzyme thế giới (Nguyen và cộng sự., 2002) .
Enzyme amylase thu nhận từ vi sinh vật chủ yếu là từ nấm mốc và vi
khuẩn, có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzyme từ các nguồn khác.
• Ứng dụng của amylase [6], [12], [14]
 Công nghiệp sản xuất bia, rượu
Đối với công nghiệp rượu cồn, các enzyme đường hóa có một vai trò đặc
biệt quan trọng. Nguồn enzyme thường là A. awamori, A. oryzae, A. usamii.
Trong sản xuất bia, thường dùng hỗn hợp canh trường Asp. oryzae và
B. amyloliquefaciens để đường hóa thay malt. Hiện nay, ở nhiều nước trên thế
giới, người ta thay thế 25-50% malt bằng các nguyên liệu phi malt, nghĩa là
bằng các hạt chưa nảy mầm như đại mạch loại hai và loại ba, ngô đã lấy hết chất
béo Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật để thay thế malt bằng các
nguồn nguyên liệu tinh bột khác giúp giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản
xuất, mà chất lượng bia vẫn đảm bảo.
 Công nghiệp sản xuất bánh mỳ và bánh nướng
Amylase được sử dụng hàng trăm năm trong công nghiệp sản xuất bánh
nướng dưới dạng các chế phẩm enzyme từ malt để sản xuất nhiều sản phẩm có
chất lượng cao. Enzyme này có khả năng làm thay đổi hoàn toàn chất lượng của

bánh mỳ: bánh mềm, tăng thể tích, tăng độ xốp và làm cho hương vị, màu sắc
của bánh đẹp hơn.
Hiện nay, amylase sử dụng trong ngành công nghiệp này chủ yếu thu nhận
từ malt đại mạch, từ nấm mốc và vi khuẩn. Amylase từ nấm mốc cho phép sử
dụng làm phụ gia bánh mỳ ở Mỹ vào năm 1955 và ở Anh năm 1963. Bổ sung
amylase vào bột mỳ không những tăng cường khả năng lên men mà còn làm
giảm độ nhớt của khối bột nhào (do tăng thể tích và kết cấu, đồng thời tăng hàm
lượng đường, cải thiện mùi vị và màu sắc của vỏ bánh).
 Công nghiệp sản xuất glucose và các loại mật tinh bột
11
11
Hệ enzyme amylase của vi sinh vật đã và đang được ứng dụng có hiệu
quả trong sản xuất glucose thực phẩm, glucose tinh thể, mật maltose và mật
glucose.
Từ lâu các sản phẩm đường mật tinh bột thường được sản xuất bằng
phương pháp axit. Tuy nhiên không cho phép sản xuất các loại đường mật theo ý
muốn bởi vì khi đó phân tử tinh bột bị thuỷ phân vô trật tự, không thể điều chỉnh
được tỷ lượng giữa các cấu tử của dịch thuỷ phân.
Khi thuỷ phân tinh bột bằng enzyme vi sinh vật không xảy ra sự phân huỷ
đường bởi axit và bởi nhiệt làm cho chất lượng của dịch thuỷ phân tốt hơn, dễ
dàng tinh chế hơn.
 Công nghiệp dệt
Trong công nghiệp dệt luôn có một số lượng đáng kể công đoạn hồ vải,
sợi vải được nhúng hồ tinh bột trước khi dệt để hạn chế đứt gãy Sở dĩ tinh bột
được ngành dệt lựa chọn vì có giá thành rẻ, phổ biến ở mọi nơi và dễ dàng tẩy
bỏ sau này. Vì vậy trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất
khác. Người ta thường sử dụng amylase của vi khuẩn để loại bỏ hồ tinh bột để
làm cho vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt mà không
ảnh hưởng đến chất lượng sợi vải. Khi đó amylase sẽ thủy phân tinh bột thành
dextrin và dextrin dễ dàng bị nước rửa trôi. Sợi được xử lý bằng chế phẩm

enzyme hoàn toàn giữ được độ bền, độ dai.
 Công nghiệp giấy
Amylase được sử dụng trong ngành công nghiệp giấy để làm giảm độ nhớt
của hồ tinh bột khi phủ lên bề mặt giấy. Cũng tương tự như trong ngành dệt, việc
hồ giấy sẽ làm giảm các tác động cơ học đến chất lượng giấy trong quá trình sản
xuất. Tinh bột cũng là tác nhân hồ hóa thích hợp, góp phần cải thiện chất lượng
giấy thành phẩm, làm giấy bền và dai hơn.
 Trong chăn nuôi
Chế phẩm amylase được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với các chế phẩm
enzyme khác như: protease, cellulase, hemicellulase, peptinase để sản xuất các
loại thức ăn dễ tiêu hoá, dễ hấp thụ trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, đặc biệt
cho gia súc non. Do đó làm tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản và giảm
lượng thức ăn.
1.2.2.2 Protease
12
12
• Giới thiệu chung về protease
Protease là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide.
• Ứng dụng của protease
Protease là enzyme công nghiệp quan trọng, chiếm khoảng 60% trong
tổng enzyme chiết xuất từ vi sinh vật được bán trên thị trường [9], [21], chủ yếu
là các protease kiềm [22]. Nhiều loài sinh vật, đặc biệt là các loài vi sinh vật có
khả năng tiết ra một lượng lớn enzyme protease dùng để thủy phân các loại
protein đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như y dược,
nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng, sản xuất
giấy, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm …[22].
Tùy theo tính chất của các loại chế phẩm protease khác nhau (pH, nhiệt
độ, …) mà chúng được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống
[12]. Sau đây là một số ứng dụng chủ yếu của protease.

 Trong công nghiệp thực phẩm
Protease được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác
nhau để tạo nên sự thay đổi về mùi vị, kết cấu và hình dạng của sản phẩm [2], ví
dụ như sản xuất phomat, sản xuất bia, làm bánh nướng, chế biến cá, sản xuất và
làm mềm thịt.
- Chế biến sữa:
Với mức độ tăng trưởng nhanh của ngành công nghiệp sản xuất phomat,
lượng renin thu nhận từ dạ dày bê và các protease từ các chủng vi sinh vật như
Mucor miehi, B. subtilis và Endothia parasitica được đưa vào sản xuất. Vai trò
chủ yếu của các enzyme này trong sản xuất phomat là thủy phân liên kết peptide
đặc hiệu tạo ra para-k-casein và các macropeptide, dẫn đến đông tụ sữa [10].
- Sản xuất bia:
Bia là sản phẩm lên men từ malt đại mạch với hàm lượng tinh bột và
protein cao. Trong quá trình đường hóa, ngoài tác dụng của amylase chuyển hóa
tinh bột thành đường, tham gia vào quá trình lên men còn có sự hiện diện của
protease thủy phân protein đại mạch thành dạng hòa tan ổn định vào dịch đường,
13
13
giúp sử dụng hoàn toàn protein đại mạch, cho phép nâng cao chất lượng nấu,
lọc, bảo quản bia. Đặc biệt, trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất
bia, người ta thường bổ sung protease nhằm thủy phân nửa vời protein phân tử
lớn tạo nên các protein trung gian. Sản phẩm thủy phân nửa vời này sẽ có tác
dụng làm bền bọt bia nhằm nâng cao giá trị của bia thành phẩm. Vì vậy, người ta
thường sử dụng phối hợp các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật như: α-amylase,
protease, enzyme chuyển hóa diacetyl thành acetoin, Các protease được sử
dụng rộng rãi nhất từ trước đến nay là chế phẩm của vi khuẩn B.
amyloliquefaciens [10].
- Chế biến thịt:
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng để làm mềm thịt nhờ
thủy phân một phần protein, làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.

Protease thường dùng trong sản xuất thịt thường là protease thực vật (papain,
bromelain, ficin) và protease vi sinh vật (nấm, xạ khuẩn) [1].
- Sản xuất các sản phẩm đậu:
Giá trị dinh dưỡng của bột đậu nành thường bị hạn chế do các yếu tố phản
dinh dưỡng như chất ức chế trypsin và lectin, các chất này có tác dụng ngăn cản
sự tiêu hóa protein [26]. Do đó, khi bổ sung protease subtilisin của B. subtilis làm
tăng hàm lượng chất hòa tan và giảm mức độ ức chế trysin trong bột đậu nành.
Marsman và cộng sự (1997) nhận thấy rằng enzyme neutrase có thể thủy phân
được β-conglycinin [10]. Caine và cộng sự (1998) đã chứng minh protease của
B. subtilis có khả năng ổn định giá trị của nguyên liệu thô và nguyên liệu chế
biến của đậu nành [17]. Các dịch thủy phân protein của đậu được dùng để sản
xuất nước giải khát và tạo thức ăn kiêng, bổ sung chất dinh dưỡng và làm thức
ăn trẻ em, bổ sung vào nước chấm (xì dầu) làm tăng hương thơm cho sản phẩm.
- Chế biến thủy sản:
Các chế phẩm protease sử dụng trong công nghiệp chế biến và sản xuất bột
cá với nhiều mục đích khác nhau, như loại bỏ da cá, sản xuất dịch thủy phân
protein của cá, tách thịt khỏi xương, da, bột mịn, rút ngắn thời gian sản xuất và
tăng hiệu quả kinh tế. Trong sản xuất nước mắm, protease giúp rút ngắn thời gian
chế biến từ 3-6 lần, tăng thể tích nước mắm nguyên chất thu được đồng thời làm
tăng hương vị cho sản phẩm .
 Trong công nghiệp sản xuất hóa mỹ phẩm và chất tẩy rửa
Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, mỹ phẩm, thuốc đánh răng, người
14
14
ta cho protease vào có tác dụng làm sạch vết bẩn, tẩy mồ hôi, làm da mịn, làm
sạch răng [4]. Vào những năm 60, một nửa số loại bột giặt ở châu Âu, châu Mỹ
đều có chứa protease. Đặc biệt là nhóm protease kiềm đóng vai trò rất quan
trọng được ứng dụng một cách phổ biến chiếm 50% tổng số enzyme hiện hành.
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với
tên Bio-40 với nhiều ưu điểm giá thành rẻ và có thể tái sử dụng. Đến năm 1963,

một chất tẩy rửa khác có tên là Biotex được tung ra thị trường chiết xuất từ B.
licheniformis. Và đến gần đây tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên
thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus và chủ yếu
là từ B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 75% enzyme này
cho ngành công nghiệp tẩy rửa [27].
 Trong công nghiệp thuộc da
Quá trình xử lý da qua các bước như sau: ngâm nước, tẩy lông, làm mềm
và tẩy các loại vôi, nhuộm da. Hợp phần chính của da và lông là protein. Các
phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như sodium sulfide,
làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy chảy ra
sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc
nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Protein là một thành
phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số
thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin trong quá trình thuộc da [10].
Trước đây, để làm mềm da người ta thường dùng protease có trong cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, trypsin được sử dụng kết hợp với các
protease của vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A.
flavus) và xạ khuẩn (Streptomyces griceus, S. rimosus) vào công nghiệp thuộc
da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [1].
 Ứng dụng trong y học
Protease cũng là enzyme được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược.
Chế phẩm protein thuần khiết cao đã được ứng dụng trong y học nhằm
loại bỏ các bộ phận hoại tử, loại trừ cholesterin bám trên thành mạch máu cũng
như hỗ trợ tiêu hóa. Ngoài ra, protease còn giúp hình thành sẹo ở vết thương
cũng như chữa bệnh viêm tắc động mạch [8].
Protease còn dùng làm thuốc trị tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp,
chống viêm, thuốc làm tăng tiêu hóa protein, thành phần các thuốc dùng trong da
liễu và mỹ phẩm [3], sản xuất các chế phẩm sinh học dùng trong y học [10].
15

15
Protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nhằm nuôi
cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc. Ngoài ra người ta còn
dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để
chữa bệnh [4].
 Trong xử lý ô nhiễm môi trường
Chất thải từ các khu công nghiệp và chất thải sinh hoạt là nguyên nhân
chính góp phần gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Trong thành phần của
các chất thải này chứa một lượng lớn protein là nguyên nhân gây ra các hiện
tượng phú dưỡng, ảnh hưởng đến các loài động thực vật sống ở các sông hồ mà
chất thải này đổ vào. Nhiều protease ngoại bào ngày càng được sử dụng rộng
rãi trong quá trình xử lý nước thải ở quy mô công nghiệp nhờ khả năng phân
giải protein thành các chuỗi peptide ngắn và amino acid [3].
Trong nông nghiệp các loại chế phẩm có chứa protease và các enzyme
khác được sử dụng như là phân bón hữu cơ. Ngoài ra chúng còn đóng góp vào
việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường [3].
Ngành chế biến thủy sản hàng năm thải ra một lượng lớn các phụ phế
phẩm như nội tạng, đầu, xương, da cần được xử lý hoặc chế biến tiếp. Protease
ngoại bào được tiết ra từ B. polymyxa, B. megaterium, vừa làm tăng sản lượng
các phản ứng thủy phân thịt cá, vừa góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường
nuôi trồng thủy sản [11].
Một số chủng thuộc chi Bacillus có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ
đơn giản và phức hợp thải ra từ thức ăn thừa và phế thải nhờ khả năng tổng hợp
enzyme phân hủy hữu cơ protease. Vì vậy chúng được sử dụng để làm chế
phẩm sinh học biochie dùng xử lý nước nuôi thủy sản bảo đảm an toàn sinh học
[11].
Protease kiềm từ các loài Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc
tính bền vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao, có khả năng thủy phân
protein vỏ của các loài giáp xác trong nước, nên chúng được ứng dụng trong xử
lý chất thải từ động vật giáp xác [29].

 Ứng dụng khác
- Nghiên cứu khoa học
Người ta sử dụng enzyme protease để nghiên cứu cấu trúc của protein.
Bên cạnh đó nó còn được sử dụng trong các phản ứng tổng hợp peptide [8].
- Sản xuất chitin, chitosan
16
16
Chitin và dẫn xuất của nó có giá trị kinh tế cao, được ứng dụng rộng rãi
trong các ngành sản xuất. Tuy nhiên giá thành sản xuất của chúng vẫn còn rất
đắt do nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản suất chúng là từ các loài giáp xác, rất
khó phân hủy vỏ của các loài này để thu chitin. Hơn nữa số lượng lại bị hạn chế.
Hiện nay người ta đã sử dụng phương pháp dùng enzyme protease từ B. subtilis
để thủy phân protein từ phế thải của các loài giáp xác đã tăng hiệu quả kinh tế,
đồng thời giảm thiểu được ô nhiễm môi trường [21], [10].
- Trong sản xuất tơ tằm, dịch enzyme protease có tác dụng làm bóng sợi tơ,
tách rời các sợi tơ do thủy phân lớp sericin [4].
1.2.2.3 Cellulase
Enzyme Cellulase là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân các chất
cellulose [6]. Enzyme này là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá
trình chuyển hóa cellulose: Enzyme exoglucanase, enzyme endogluconase,
enzyme β-1,4-glucosidase.
Cellulase đã được sản xuất với qui mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực:
- Các chế phẩm enzyme cellulase vi sinh vật được ứng dụng để làm tăng
hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật như protein, acid
amin, vitamin từ đậu trứng, thạch từ rong, tinh bột từ bã, chất thơm và chất hoà
tan khi sản xuất chè xanh và cà phê hoà tan.
- Tăng chất lượng các sản phẩm và thức ăn gia súc như làm mền các
nguyên liệu có nguồn gốc thực vật làm tăng hệ số đồng hoá, và nhất là để sản
xuất các thức ăn riêng, bột dinh dưỡng trẻ em.

- Thủy phân gỗ và phế liệu gỗ: Dùng cellulase để thuỷ phân các vật liệu
gỗ thành đường đơn giản chế biến làm thức ăn gia súc.
Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Myrothecium verrucaia,
Polyporus versicolor,Trichodema viride, Penicillium notatum, Aspergillus
awamori, Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis.
17
17
PHẦN 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
Bã sắn khô được mua tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn Fococev Thừa
Thiên Huế.
Các chủng Bacillus subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải; chủng Bacillus
subtilis C10 được phân lập từ phế liệu tôm; chủng Bacillus amyloliquefaciens
T9 phân lập từ tôm chua và chủng Bacillus amyloliquefaciens N1 được phân lập
từ nem chua; tất cả các chủng này được định danh bởi công ty Nam Khoa NK-
BIOTEK số 793/58 Trần Văn Soạn, P. Tân Hưng, Q7, TP.HCM và đang được
bảo quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật của Viện Tài nguyên Môi trường và
Công nghệ Sinh học số 27 Phan Đình Phùng – Thành phố Huế.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp cấy tăng sinh
Khuẩn lạc của 4 chủng được nuôi cấy ở trong 2 mL môi trường lỏng có
chứa 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5 % NaCl trong ống nghiệm, lắc 200
vòng/phút ở 35
0
C trong 24 giờ [10].
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
Phân phối 500 µl dịch cấy tăng sinh vào bình tam giác 100 mL có chứa
20 mL môi trường dinh dưỡng (môi trường tối ưu sinh enzyme amylase) (có

bảng đính kèm). Nuôi cấy 200 vòng/ phút trên máy lắc ở 40
0
C đối với ba
chủng Bacillus subtilis C10, Bacillus amyloliquefaciens N1, Bacillus
amyloliquefaciens T9 và ở 35
0
C đối với chủng Bacillus subtilis DC5 trong vòng
24 giờ.
Kết thúc thời gian nuôi cấy, dịch môi trường nuôi cấy có chứa enzyme
được thu nhận bằng cách ly tâm tách tế bào ở 14.000 vòng/phút, nhiệt độ 4
0
C
trong 10 phút [10].
18
18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus có khả năng
thuỷ phân bã sắn [18], [20], [36].
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Không thanh trùng canh trường
Cấy vào bã sắn đã thanh trùng
Ủ ở 40
0
C, 48h
Ly tâm thu dịch nổi
chủng Bacillus
Cấy tăng sinh
Cấy trong MTTƯCB
Ủ (điều kiện khác nhau)
Dịch canh trường
Thanh trùng canh trường

Cấy vào bã sắn đã thanh trùng
Ủ ở 40
0
C, 48h
Ly tâm, thu dịch nổi
Thực hiện phản ứng màu
Thực hiện phản ứng màu
19
19
Tiến hành thí nghiệm bằng cách cấy 10mL dịch canh trường vào bình
tam giác có chứa 2g bã sắn và 10mL nước cất đã qua thanh trùng. Làm tương
tự với mẫu đối chứng nhưng khác là dịch canh trường đã được thanh trùng để
tiêu diệt enzym và vi khuẩn. Sau đó đem ủ ở máy trong 48 giờ, ở 40
0
C. Sau
khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C, 14000vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi
và tiến hành làm phản ứng màu. Đo hấp thụ màu ở bước sóng 540 nm.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ
phân bã sắn [18], [33], [36]
2.2.3.1. Tỷ lệ canh trường
Tiến hành thí nghiệm bằng cách cấy lần lượt 5mL, 10mL, 15mL, 20mL
dịch canh trường vào bình tam giác có chứa 2g bã sắn và 10mL nước cất đã
qua thanh trùng. Riêng đối với bình tam giác có 5mL canh trường phải bổ
sung thêm 10 mL dịch canh trường đã qua xử lý nhiệt và đối với bình tam
giác có 10mL thì thêm 5 mL, bình tam giác 15mL thì phải bổ sung thêm 5mL.
Tương tự, ta tiến hành cho mẫu đối chứng nhưng khác là dịch canh trường đã
được thanh trùng để ngừng hoạt tính enzym và vi khuẩn. Sau đó đem ủ ở
máy trong 48 giờ, ở 40

0
C. Sau khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C, 14000vòng/phút
trong 10 phút để thu dịch nổi và tiến hành làm phản ứng màu. Đo hấp thụ
màu ở bước sóng 540 nm.
2.2.3.2. Nhiệt độ ủ
Tiến hành thí nghiệm bằng cách ủ bình tam giác chứa bã sắn, dịch canh
trường ở máy trong 24 giờ đầu ở 40
0
C và 24 giờ tiếp theo lần lượt ở các mức
nhiệt độ 40
0
C, 45
0
C, 50
0
C, 55
0
C, 60
0
C . Sau khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C,
14000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi và tiến hành làm phản ứng
màu. Đo hấp thụ màu ở bước sóng 540 nm.
2.2.3.3. Thời gian ủ
Tiến hành thí nghiệm bằng cách ủ bình tam giác chứa bã sắn, dịch canh
trường ở máy trong 24 giờ đầu ở 40
0

C và tiếp đến là ở nhiệt độ thích hợp
trong các khoảng thời gian: 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và
20
20
48 giờ. Sau khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C, 14000 vòng/phút trong 10 phút để
thu dịch nổi và tiến hành làm phản ứng màu. Đo hấp thụ màu ở bước sóng
540 nm.
2.2.4. Phương pháp thăm dò khả năng lên men của chủng Lactobacillus
fermentum T10 và Lactosbacillus fermentum MC9 trong môi trường dịch
bã sắn [20], [33], [34], [35]
Dịch bã sắn thu được sau khi qua quá trình thủy phân nhờ enzyme của
các chủng Bacillus.sp sẽ được làm môi trường nuôi cấy 2 chủng
Lactobacillus fermentum T10 và Lactobacillus fermentum MC9 để đánh giá
khả năng lên men của hai chủng này trong môi trường bã sắn. Thí nghiệm
được bố trí trong các khoảng thời gian là: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 42 giờ.
2.2.5. Các phương pháp hoá sinh
2.2.5.1. Xác định hoạt độ α- amylase bằng phương pháp Bernfield [21]
Nguyên tắc: dùng dung dịch tinh bột làm cơ chất để xác định hoạt độ thủy
phân của amylase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu
với thuốc thử tạo màu Dinitrosalisilic (hòa tan 1g acid 3,5-dinitrosalisilic trong
20ml NaOH 2N và 50ml nước cất, cho thêm 30g kalinatri tactrat và dẫn nước
đến 100ml). Độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máy quang phổ, bước sóng
540nm. Dựa vào đường chuẩn (Hình 1.2 phụ lục 1) để tính sản phẩm tạo thành
dưới tác dụng của enzyme.
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng 0,1ml dung dịch tinh bột 1% (hòa tan 1g
tinh bột và 0,035g NaCl trong 60ml dịch đệm phosphat, pH 7.0, đun sôi cho đến
tan, để nguội và dẫn đến 100 ml) và 0,1ml dung dịch enzym. Ủ hỗn hợp này ở
30

0
C, 10 phút. Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2ml dung dịch Dinitrosalicylic
1% và ủ ở 100
0
C trong 10 phút. Sau đó ủ hỗn hợp này trong nước đá 10 phút. Bổ
sung vào hỗn hợp 2ml nước cất trước khi đưa đi so màu ở bước sóng 540 nm.
Tiến hành làm mẫu trắng song song với mẫu chuẩn bằng cách vô hoạt
enzym bởi nhiệt (đun trong nước sôi 20 phút) và axit Dinitrosalicylic 1% trước
khi tiến hành các bước tiếp theo như trên.
Cách lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase
 Hóa chất
- Dung dịch glucose chuẩn nồng độ 0,01 M
- Thuốc thử tạo màu
21
21
- Nước cất
 Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm Mẫu chuẩn
Nước cất 0,16 ml 0,12 ml 0,08 ml 0,04 ml 0 ml
Dung dịch maltose chuẩn 0,04 ml 0,08 ml 0,12 ml 0,16 ml 0,2 ml
Thuốc thử tạo màu 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
Lắc nhẹ, đặt trong nước sôi 10 phút, làm nguội trong chậu nước đá,
Nước cất 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2ml
Trộn đều, đọc mật độ quang ở bước sóng 540nm
 Cách tính hoạt độ
Đọc lượng phân đoạn khử được hình thành từ đường chuẩn dưới dạng
μmol glucose. Một đơn vị hoạt độ α- amylase được xác định là lượng μ mol
glucose tạo thành bởi 1ml dịch enzyme trong thời gian một phút ở nhiệt độ
30
o

C.
μ mol glucose
10 x 0,1
Hoạt độ = (U/ml)
Trong đó:
10: thời gian phản ứng
0,1: thể tích dịch enzyme đem phản ứng
2.2.5.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
Hoạt độ protease của các chủng Bacillus được xác định theo phương
pháp Anson cải tiến. Cơ chất được sử dụng là casein 2% (w/v) trong đệm
Sorencen. Sự thủy phân của protease được bắt đầu bằng cách bổ sung 150 µL
dung dịch enzyme thích hợp vào trong 300 µL cơ chất, sau đó ủ ở 55
o
C trong 10
phút, dừng phản ứng bằng 750 µL TCA 5% (w/v), ủ dung dịch phản ứng 10 phút
ở 35
O
C, ly tâm ở 4
o
C, 14.000 vòng/phút để thu dịch nổi. Xác định hoạt độ thủy
phân protein trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với
thuốc thử Folin. Đo OD của dung dịch màu thu được sau phản ứng bằng máy
22
22
quang phổ SmartSpec
TM
Plus (Bio-Rad, USA) ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đồ
thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của
enzyme [1].
Dịch nuôi cấy

Thu dịch nổi (enzyme)
Lấy 150µl dịch nổi cho vào Enpendord
Ủ ở 55
0
C,10 phút
Sử dụng máy ủ Thermonitri
Ly tâm lạnh,10phút,14000
vòng/phút
Để ổn định 20 phút
Cho vào750µl TCA 5%
(mẩu thử)
Ủ và lắc nhẹ 500 vòng/phút,35
0
C,10 phút
Sử dụng máy ủ Thermonitri
Cho vào 300µl casein 2%
(mẩu kiểm tra)
Mẩu thử
Mẩu kiểm tra
Cho vào 300µl
casein 2%
Cho vào 750µl
TCA 5%
Ly tâm
23
23
Cách tiến hành:
Tiến hành phản ứng màu:
Lấy 200µl dịch nổi cho vào 800µl Na
2

CO
3
Cho vào 200µl Folin 0,2N
Đồng nhất
ở máy Vontex
Để ổn định 28 phút
So màu ở 750nm
24
24
2.2.6. Các phương pháp vật lý
Xác định, điều chỉnh pH ban đầu và theo dõi pH sau quá trình nuôi cấy
bằng máy đo pH điện tử
2.2.7. Phương pháp toán học
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để xác định sự sai
khác giữa các trung bình.
25
25