Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy và phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột h9c2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
**********************

ĐOÀN THỊ DẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ
PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO
CƠ TIM CHUỘT H9C2

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*****

ĐOÀN THỊ DẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀPHÂN TÍCH
MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO
CƠ TIM CHUỘT H9C2
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. VŨ THỊ THU

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu, người đã luôn quan
tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
luận văn cao học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô giáo, các bạn học viên, sinh
viên đang làm việc và học tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào, Bộ môn Sinh lý
học và Sinh học người, Trung tâm Khoa học sự sống, Khoa sinh học, các bạn học
viên lớp K25 cao học Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội và đặc biệt Ths. Ngô Thị Hải Yến, người đã đồng hành giúp đỡ, hỗ trợ
tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn các anh, chị, bạn bè đồng nghiệp tại khoa Truyền máu Bệnh
viện Nhi Trung ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt qúa trình học tập và
thực hiện luận văn.
Luận văn đã được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Nafosted, mã số
106-YS.06-2016.23 và trang thết bị, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm thuộc
Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trân trọng!

Hà Nội, ngày 6 tháng 1 năm 2020
Học viên

Đoàn Thị Dậu


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Bệnh tim mạch .................................................................................................2
1.2. Các dòng tế bào cơ tim sử dụng trong nghiên cứu bệnh tim ...........................2
1.3. Tế bào cơ tim chuột H9C2 ...............................................................................5
1.3.1. Nguồn gốc, đặc điểm của tế bào H9C2 .....................................................5
1.3.2. Tình hình sử dụng tế bào H9C2 trong nghiên cứu bệnh tim.....................5
1.4. Ty thể trong bệnh tim .......................................................................................8
1.4.1. Cấu trúc và chức năng ty thể .....................................................................8
1.4.2. Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh tim mạch .......................................9
1.4.3. Nghiên cứu về ty thể trên dòng tế bào H9C2 ..........................................11
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..........................................................14
2.1. Vật liệu ...........................................................................................................14
2.1.1. Mẫu nghiên cứu.......................................................................................14
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................14
2.1.3. Phòng nuôi, thiết bị .................................................................................14
2.2. Phƣơng pháp...................................................................................................15
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................................15
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................16
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................22
3.1. Quy trình nuôi cấy tế bào H9C2 trong điều kiện thƣờng ...............................22
3.1.1. Hoạt hóa tế bào H9C2 .............................................................................22
3.1.2. Cấy chuyển tế bào H9C2 ........................................................................25
3.1.3. Bảo quản tế bào H9C2 ............................................................................28
3.2. Quy trình gây mô hình TMTTMCT (HR) trên tế bào H9C2 .........................31


3.2.1. Mô hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 ......................................................31
3.2.2. Mô hình TMTTMCT sử dụng buồng thiếu oxy (buồng hypoxia) ..........35
3.3. Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 .........................................................42
3.3.1. Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 ..................................................42

3.3.2. Kết quả thử nghiệm quy trình phân tích ty thể .......................................43
KẾT LUẬN ...............................................................................................................47
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................49


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào cơ tim ............................................................................................... 3
Hình 1.2. Hình thái tế bào H9C2 ................................................................................ 6
Hình 1.3. Cấu trúc ty thể ............................................................................................. 8
Hình 1.4. Ty thể và cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh tim mạch ................................. 9
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................... 15
Hình 2.2. Quy trình chung nuôi cấy tế bào H9C2 theo hướng dẫn của ATCC ........ 16
Hình 3.1. Các bước hoạt hóa tế bào H9C2 trong nghiên cứu .................................. 24
Hình 3.2. Ảnh tế bào H9C2 sau hoạt hóa 24h .......................................................... 25
Hình 3.3. Ảnh tế bào H9C2 phát triển tốt sau hoạt hóa một thời gian ..................... 26
Hình 3.4. Các bước cấy chuyển tế bào H9C2 trong nghiên cứu .............................. 27
Hình 3.5. Ảnh đại diện ghi nhận sự phát triển của tế bào sau khi cấy chuyển tại các
một số mốc thời gian ................................................................................................. 29
Hình 3.6. Các bước bảo quản tế bào H9C2 trong nghiên cứu ................................. 30
Hình 3.7. Các bước gây mô hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 trên tế bào H9C2 trong
nghiên cứu ................................................................................................................. 32
Hình 3.8. Ảnh hưởng của CoCl2 lên tế bào H9C2 .................................................... 34
Hình 3.9. Ảnh hưởng của CoCl2 lên khả năng sống của tế bào H9C2 ..................... 35
Hình 3.10. Nguyên vật liệu cần thiết để tạo buồng hypoxia ..................................... 37
Hình 3.11. Buồng hypoxia sau khi hoàn thành ......................................................... 37
Hình 3.12. Các bước sử dụng buồng hypoxia ........................................................... 39
Hình 3.13. Các bước gây mô hình HR sử dụng buồng hypoxia trên tế bào H9C2
Hình 3.14. Tỷ lệ tế bào sống khi thử nghiệm buồng hypoxia .................................... 41
Hình 3.15. Tế bào H9C2 ở các điều kiện thiếu oxy/tái cung cấp oxy ....................... 42

Hình 3.16. Các bước phân tích ty thể tế bào H9C2 .................................................. 44
Hình 3.17. Mật độ huỳnh quang NAO của ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều
kiện khác nhau........................................................................................................... 45
Hình 3.18. Mật độ ty thể trong tế bào H9C2 ở các điều kiện khác nhau ................. 46


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các môi trường, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ...................144
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu...................................155
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của CoCl2 ở các nồng độ tới khả năng sống tế bào H9C2…
.................................................................................................................................345
Bảng 3.2. Tỷ lệ tế bào H9C2 sống khi thử nghiệm buồng hypoxia………………...40
Bảng 3.3. Tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều
kiện khác nhau ………………………………………………………………........ 45


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CAD

Coronary artery disease (Bệnh xơ vữa động mạch)

CS

Cộng sự

CVD

Cardiovascular diseases (Bệnh tim mạch)

CCK-8

Cell-counting kit-8

ESCs

Tế bào gốc phôi chuột

HR

Hypoxia/reoxygenation (Thiếu oxy/tái cung cấp oxy)

iPSCs

Tế bào gốc đa năng cảm ứng

LDH

Lactate dehydrogenase

MTG

MitoTracker Green

NAO

10-N-nonyl-acridine orange

ROS

Reactive oxygen spicies (Gốc tự do oxy hóa)

TMTTMCT

Thiếu máu tái tƣới máu cơ tim


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tim mạch là một trong những bệnh lý có khả năng gây tử vong cao trên
thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Dữ liệu khoa học cho thấy, những tổn
thƣơng trong bệnh lý tim mạch có liên quan nhiều đến sự thay đổi cấu trúc và chức
năng ty thể của tế bào cơ tim [2, 75]. Vì vậy, nghiên cứu phƣơng pháp phòng và
chống bệnh tim mạch hƣớng đích ty thể thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà
khoa học. Thực tế, nhiều nghiên cứu đã tập trung phân tích sự thay đổi cấu trúc và
chức năng của bào quan này nhƣ khả năng tổng hợp năng lƣợng ATP, thành phần
lipid màng, giá trị điện thế lớp màng ty thể hay hoạt động của chuỗi hô hấp ty thể
[40, 53]. Việc phân tích các chỉ số chức năng ty thể là cơ sở để đánh giá ảnh hƣởng
của thuốc hoặc các chất lên ty thể cũng nhƣ tế bào cơ tim.
Tế bào H9C2 là một dòng tế bào có nguồn gốc từ mô cơ tim phôi thai chuột
BDX1 [41] và thƣờng đƣợc sử dụng trong các mô hình nghiên cứu bệnh về tim nhƣ
thiếu máu cục bộ cơ tim, phì đại cơ tim, nghiên cứu ảnh hƣởng của các độc tố,
nghiên cứu sàng lọc và tạo thuốc mới. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam các nghiên
cứu sử dụng tế bào này để thiết kế mô hình bệnh tim mạch còn khá mới. Do vậy,
việc xây dựng và hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ổn định, phù hợp với điều
kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu là cần
thiết.
Với định hƣớng phát triển nghiên cứu thực nghiệm bệnh tim, đặc biệt là bệnh
thiếu máu cục bộ cơ tim trên cơ sở sử dụng dòng tế bào H9C2 tại Việt Nam, đề tài
“Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy và phân tích một số chỉ số chức năng
ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính sau:
-

Xây dựng quy trình nuôi cấy dòng tế bào cơ tim chuột H9C2.

-

Phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2.
Đề tài này nằm trong khuôn khổ nội dung nghiên cứu của đề tài Nafosted

“Nghiên cứu, sàng lọc chất c tác dụng bảo vệ cơ tim hƣớng đích ty thể sử dụng mô
hình thiếu máu cục bộ cơ tim trên tim chuột cô lập và tế bào tim chuột nuôi cấy”,
mã số 106-YS.06-2016.23. Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại các phòng Thí nghiệm
thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học ngƣời, Khoa
Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh tim mạch
Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases - CVD) gồm một nhóm các bệnh
liên quan đến hệ thống tim mạch nhƣ: bệnh động mạch vành, đau thắt ngực, đột
qụy, bệnh tim bẩm sinh, bệnh van tim, phình động mạch chủ….[10]. Bệnh lý này có
nguy cơ gây tử vong cao và có tính chất đột ngột. Trên thế giới, năm 2016 đã c
khoảng 17,6 triệu ngƣời chết vì các bệnh tim mạch [10]. Tỷ lệ tử vong sớm do bệnh
tim mạch dao động từ 4% (ở các nƣớc thu nhập cao) đến 42% (ở các nƣớc thu nhập
thấp) [63]. Mặc dù CVD thƣờng ảnh hƣởng đến ngƣời trƣởng thành trong giai đoạn
sau của cuộc đời, các triệu chứng nhƣ xơ vữa động mạch thƣờng bắt đầu sớm hơn,
do vậy việc phòng ngừa sớm là rất quan trọng [48] .
Những tiến bộ khoa học gần đây đã giúp làm sáng tỏ hơn về các nguyên
nhân cơ bản của bệnh tim. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu thƣờng sử dụng các mô
hình khác nhau và hƣớng tập trung vào sinh lý bệnh hoặc các ứng dụng điều trị

bệnh. Bên cạnh vấn đề đạo đức nghiên cứu, việc thực nghiệm phân tích bệnh lý cơ
tim ở cấp độ tế bào, mô cơ tim của ngƣời bệnh gần nhƣ là không thể thực hiện. Để
giải quyết vấn đề này, nhiều loài động vật nhƣ lợn, thỏ, chuột đã trở thành các đối
tƣợng nghiên cứu do mức độ khá tƣơng đồng của chúng so với ngƣời và thƣờng
đƣợc lựa chọn để thay thế. Từ các nguồn động vật này, nhiều dòng tế bào cơ tim
đƣợc cô lập, nuôi cấy và duy trì với các yêu cầu kỹ thuật không quá phức tạp, giúp
chúng trở thành đối tƣợng lý tƣởng cho nghiên cứu cơ chế sinh bệnh lý tim và phân
tích dƣợc lý liên quan [51].
1.2. Các dòng tế bào cơ tim sử dụng trong nghiên cứu bệnh tim
Nghiên cứu các bệnh về tim có thể dùng các loại tế bào đƣợc phân lập trực
tiếp từ cơ tim và nuôi cấy (primary cultural cells), các dòng tế bào cơ tim bất tử
(cardiomyocyte cell lines) và các dòng tế bào mang một số đặc điểm của tế bào cơ
tim (cardiomyogenic cell lines). Tuy nhiên, việc phân lập tế bào từ mô cơ tim và
nuôi cấy tƣơng đối phức tạp, phải chịu áp lực về mặt thời gian vì các tế bào có thời
gian sống ngắn, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng sau giai đoạn thử nghiệm trên các
dòng tế bào nuôi cấy ổn định. Do vậy, trong giai đoạn thử nghiệm đầu tiên của các
nghiên cứu bệnh tim mạch ở cấp độ tế bào, các dòng tế bào cơ tim nuôi ổn định hay
2


dòng tế bào bất tử (dòng tế bào thƣơng mại) thƣờng đƣợc sử dụng. Sự phát triển của
các dòng tế bào cơ tim bất tử, sinh sôi nảy nở dễ dàng trong nuôi cấy nhƣng vẫn
duy trì một kiểu hình nhất định đã cung cấp cho các nhà nghiên cứu một công cụ
hiệu quả để thăm dò, phân tích các cơ chế sinh-bệnh lý của tế bào tim, và tim.
Có nhiều dòng tế bào cơ tim bất tử (cardiomyocytecell lines) đƣợc thiết lập
và dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu các bệnh lý tim nhƣ dòng tế bào AC16
[20], HL-1 [19], H9C2 [33]… Dòng tế bào AC16 đƣợc tạo ra từ mô thất trái của
ngƣời trƣởng thành có thể là lựa chọn trong các công việc nghiên cứu phân tích các
quá trình sau phân bào [20].

Hình 1.1. Tế bào cơ tim
A) Tế bào HL-1; B) Tế bào AC 16
( )

Dòng tế bào cơ tim HL-1 là dòng tế bào cơ tim của chuột có nguồn gốc từ
các tế bào của khối u tâm nhĩ. Tế bào HL-1 có thể liên tục phân chia qua nhiều thế
hệ mà vẫn giữ đƣợc các đặc tính hình thái, sinh h a và điện sinh lý. Các tế bào HL1 đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu chức năng tế bào cơ tim bình thƣờng liên quan
đến tín hiệu, điện, chuyển h a và điều hòa phiên mã cũng nhƣ để giải quyết các tình
trạng bệnh lý nhƣ thiếu oxy, tăng glucose máu - tăng insulin máu, sự chết theo
chƣơng trình và thiếu máu cục bộ,…[19].
Dòng tế bào cơ tim phôi chuột H9C2 thƣờng đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên
cứu in vitro, bao gồm phân tích vai trò, chức năng độc tính của chất/thuốc mới đối
với tim [17, 47]. Nghiên cứu gần đây đã phân tích ảnh hƣởng của số thế hệ tế bào cấy
chuyển (tối đa là 25 thế hệ) đến kết quả phân tích độc tính của tế bào gây ra bởi
3


doxorubicin cho thấy, khi số thế hệ cấy chuyển càng tăng thì kết quả thu đƣợc ở các
lần phân tích khác nhau sẽ c sự biến thiên cao [55]. H9C2 cũng đƣợc sử dụng nhiều
trong nghiên cứu về bệnh phì đại cơ tim [16, 77], nghiên cứu các enzym chuyển hóa
thuốc trong cơ tim [82]. Đặc biệt, dòng tế bào này đƣợc sử dụng nhiều trong các
nghiên cứu bệnh lý thiếu máu cục bộ-tái tƣới máu cơ tim (TMTTMCT)/ hypoxiareoxygenation (HR). Trong các điều kiện thiếu oxy-tái cung cấp oxy, tế bào H9C2 thể
hiện những đặc điểm khác biệt về trao đổi chất năng lƣợng, chức năng ty thể và tính
nhạy cảm với môi trƣờng so với dòng tế bào HL-1 [43].
Bên cạnh các dòng tế bào cơ tim ổn định nhƣ trên, một số dòng tế bào khác có
nguồn gốc không phải từ tim (cardiomyogenic cell lines) cũng đƣợc sử dụng trong
một số nghiên cứu về tim nhƣ P19 [74], ESCs [60], iPSCs [69]... Dòng tế bào P19
đƣợc phân lập từ tế bào ung thƣ biểu mô phôi chuột thực nghiệm. Các tế bào này là
đa bội và có thể phân hóa thành các loại tế bào của cả ba lớp phôi, bao gồm cả tế bào
cơ tim. Do khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim, chúng đƣợc sử dụng để phân tích

vai trò của các yếu tố phiên mã đặc hiệu của tim cũng nhƣ đƣờng dẫn tín hiệu ngƣợc
trong sự biệt hóa tế bào tim và gần đây nhất là để thử nghiệm đánh giá khả năng
tƣơng thích sinh học [74]. Ngoài ra, các tế bào gốc nhƣ ESCs - tế bào gốc phôi chuột
- đƣợc phân lập từ các nguồn phôi nang khác nhau và iPSCs - tế bào gốc đa năng cảm
ứng - đƣợc trực tiếp tạo ra từ các tế bào sinh dƣỡng đã cung cấp một mô hình hữu ích
cho nghiên cứu sự phát triển cũng nhƣ sự biệt hóa tế bào cơ tim [60, 69].
Các dòng tế bào cơ tim bất tử cũng nhƣ các dòng tế bào khác mang đặc tính
của tế bào cơ tim đã đƣợc ứng dụng nhiều trong các mô hình nghiên cứu in vitro về
cơ chế bệnh sinh cũng nhƣ các phƣơng pháp trị liệu bệnh tim. Trong đ , tế bào cơ
tim chuột H9C2 thể hiện một số đặc điểm ƣu việt hơn nhƣ dễ nuôi cấy, có tính ổn
định cao qua các lần cấy chuyển và có khả năng mô phỏng tốt nhiều điều kiện bệnh
lý tim. Do vậy, trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào
H9C2 cũng nhƣ thiết lập mô hình tổn thƣơng TMTTMCT/HR sử dụng dòng tế bào
này, để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và ứng dụng của H9C2 trong mô
hình thiết lập đƣợc. Đây là bƣớc tiền đề, là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm
phòng và chống lại bệnh lý tim nguy hiểm này.

4


1.3. Tế bào cơ tim chuột H9C2
1.3.1. Nguồn gốc, đặc điểm của tế bào H9C2
Dòng tế bào cơ tim H9C2 là một nhánh của dòng tế bào có nguồn gốc từ mô
phôi chuột BD1X, Rattus norvegicus, đƣợc nghiên cứu lần đầu bởi Kimes và Brandt
năm 1976. Về hình thái, đây là tế bào mô cơ tim với đầy đủ các đặc tính của nguyên
bào cơ và đƣợc phân vào nhóm tế bào bám dính (Hình 1.2) [33, 65]. Trên bề mặt, tế
bào H9C2 có các thụ thể Acetylcholine, do đ c thể đáp ứng lại các kích thích với
Acetylcholine. Dòng tế bào này sinh trƣởng tốt trong điều kiện in vitro, cho phép
công việc nuôi cấy trở nên tƣơng đối dễ dàng. Theo khuyến cáo của hãng ATCC,
môi trƣờng cơ bản để nuôi cấy dòng tế bào này là môi trƣờng Dulbecco's Modified

Eagle's Medium (DMEM) có bổ sung 10% huyết thanh bò (Fetal bovine serum FBS) [6]. Ngoài nuôi cấy bằng môi trƣờng cơ bản DMEM, nghiên cứu của Syam và
cs (2016) đã tiến hành nuôi tế bào H9C2 trong môi trƣờng RPMI1640 có bổ sung
10% FBS ở 370C, 5% CO2 [68].
Các tế bào H9C2 giống các tế bào tim trƣởng thành ở một số đặc điểm liên
quan đến sự trao đổi năng lƣợng mức ATP trong tế bào, sự trao đổi chất, cấu trúc và
hoạt động của các G protein, các kênh ion [33], chức năng và hình thái của ty thể
của tế bào cơ tim [43]. Tế bào H9C2 có beta-tubulin II là yếu tố đ ng vai trò quan
trọng trong chức năng và điều hòa ty thể. H9C2 cũng nhạy cảm với các tổn thƣơng
oxy hóa, chúng có thể làm giảm khả năng sống của tế bào và chức năng ty thể [43].
1.3.2. Tình hình sử dụng tế bào H9C2 trong nghiên cứu bệnh tim
Nhƣ đã đề cập ở trên, dòng tế bào H9C2 đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu
sinh lý bệnh cũng nhƣ các nghiên cứu đánh giá và thử nghiệm thuốc điều trị nhiều
loại bệnh tim mạch nhƣ: bệnh phì đại cơ tim [77], bệnh TMTTMCT [46]…. Bên
cạnh đ , nhiều nghiên cứu về độc tính, sự chết theo chu trình và sự biệt hóa của tế
bào cơ tim cũng đƣợc thực hiện trên dòng tế bào này [42, 52].

5


Hình 1.2. Hình thái tế bào H9C2 [22, 25]
A) Tế bào được chụp bởi kính hiển vi quang học; B) Hình ảnh beta-tubulin II (màu
xanh) trong tế bào H9C2; C) Hình ảnh beta-tubulin II (màu xanh) và ty thể (màu
đỏ) trong tế bào H9C2.
Nghiên cứu của Beshay và cs (2007) đã tiến hành đánh giá tính khả thi của
dòng tế bào này trong nghiên cứu chuyển hóa thuốc mà cụ thể là thông qua biểu
hiện của Cytochrome P450. Nh m đã thực hiện nuôi cấy tế bào H9C2 trong môi
trƣờng DMEM không có phenol red, có bổ sung 0,45% Glucose, 0,15% Natri
bicarbonate, 0,11% Natri pyruvate, 10% FBS, 20 µM l-Glutamine, 50 µg/ml
Gentamicin sulfate, 100 IU/ml Penicillin, 10 µg/ml Streptomycin và 25 ng/ml
Amphotericin B ở 370C, 5% CO2. Kết quả cho thấy các enzym thuộc họ

Cytochrome P450, CYP1A1 và 1B1, đều biểu hiện trên cả dòng tế bào H9C2 và tế
bào cơ tim. Trong đ , CYP1A1 đƣợc kích thích bởi β-naphthoflavone trên cả hai
loại tế bào, còn khi CYP1B1 chỉ đƣợc kích thích ở tế bào cơ tim. Bên cạnh đ , các
gen CYP2C11, 2C13và 2C23 biểu hiện mạnh hơn ở dòng tế bào H9C2. Kết quả này
cung cấp bằng chứng đầu tiên về biểu hiện các gen mã hóa cho Cytochrome c ở tế
bào H9C2 và so sánh với các tế bào cơ tim chuột, từ đ đƣa ra kết luận về việc có
thể sử dụng dòng tế bào H9C2 trong nghiên cứu chuyển hóa thuốc và enzym đối với
các bệnh tim mạch [82].

6


Năm 2011, Watkins và cs tiến hành nghiên cứu so sánh khả khăng mô phỏng
bệnh lý phì đại cơ tim giữa dòng tế bào H9C2 và tế bào cơ tim chuột sơ sinh sơ cấp
bằng cách sử dụng các chất kích thích sự phì đại. Trong nghiên cứu này, tế bào cơ
tim chuột sơ sinh sơ cấp và tế bào H9C2 đƣợc nuôi cấy in vitro và điều trị bằng
angiotensin II và endothelin-1 để thúc đẩy phản ứng phì đại. Sự gia tăng kích thƣớc
kết hợp với sự sắp xếp lại khung xƣơng của tế bào và cảm ứng gen tim thai đƣợc so
sánh trực tiếp ở cả hai loại tế bào sử dụng kính hiển vi và real-time PCR. Kết quả
cho thấy, tế bào H9C2 có phản ứng phì đại gần nhƣ giống hệt với các phản ứng
đƣợc quan sát thấy trong tế bào cơ tim chuột sơ sinh sơ cấp. Phát hiện này đã xác
nhận tầm quan trọng của tế bào H9C2 trong mô hình nghiên cứu in vitro về chứng
phì đại tim. Tế bào H9C2 cùng với các dòng tế bào cơ tim của ngƣời là phƣơng tiện
quan trọng cho các nghiên cứu phân tử về bệnh tim [77].
Kế đ , năm 2017, Jinanhua và cs đã tiến hành kiểm chứng khả năng bảo vệ
tế bào cơ tim của Osmotin khỏi các thƣơng tổn do thiếu máu TMTTMCT sử dụng
tế bào H9C2. Tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Beshay và cs trƣớc đ , tế bào H9C2
đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin,
100 µg/ml streptomycin và 2 mM glutamine, 5% CO2, 370C. Tế bào đƣợc gây mô
hình tổn thƣơng TMTTMCT bằng phƣơng pháp của Wu và cs (2013). Tế bào đƣợc

cấy trên đĩa 35 mm với mật độ 3x105 tế bào/giếng và nuôi ổn định trong 24 giờ.
Tiếp đ , các tế bào này sẽ đƣợc kích thích thƣơng tổn TMTTMCT bằng cách nuôi
trong môi trƣờng không có oxy (95% Nitơ, 5% CO2) ở 370C trong 4 giờ. Cuối cùng,
lƣợng đƣờng trong môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về nồng độ 4,5 mg/ml và tế bào tiếp
tục đƣợc nuôi với điều kiện nuôi cấy giống ban đầu (95% không khí, 5% CO2,
370C) trong 24 giờ. Để đánh giá tế bào sau khi gây TMTTMCT, nhóm nghiên cứu
đã sử dụng các tiêu chí về tỷ lệ tế bào sống, lƣợng lactate dehydrogenase (LDH)
giải ph ng, lƣợng tế bào chết theo chu trình, lƣợng ROS sinh ra. Để đánh giá khả
năng bảo vệ của Osmotin, Jianhua và cs đã sử dụng các chỉ tiêu về siRNA với đích
AdipoR1 và AdipoR2, biểu hiện TNF-α, IL-1β, IL-8 và IL-6. Nghiên cứu này đã
thành công trong việc xây dựng mô hình thiếu máu cơ tim cục bộ và tái tƣới máu
bằng OGD/R và đánh giá đƣợc khả năng bảo vệ tế bào H9C2 khỏi các thƣơng tổn
do OGD/R thông qua con đƣờng tín hiệu AdipoR1/PI3K/AKT [37, 79].
7


Với đặc tính dễ nuôi cấy và ổn định, tế bào H9C2 đƣợc sử dụng nhiều trong
nghiên cứu mô phỏng điều kiện bệnh lý tim. Tuy nhiên, việc ứng dụng dòng tế bào
trong nghiên cứu bệnh tim ở Việt Nam còn khá mới. Do vậy, việc xây dựng một
quy trình nuôi cấy tế bào H9C2 phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt
Nam là hết sức quan trọng. Điều này sẽ cung cấp thêm một công cụ mới và hữu
hiệu trong nghiên cứu bệnh tim mạch nói chung và bệnh thiếu máu cục bộ-tái tƣới
máu cơ tim n i riêng ở nƣớc ta.
1.4. Ty thể trong bệnh tim
1.4.1. Cấu trúc và chức năng ty thể
Ty thể là bào quan có mặt ở hầu hết các loại tế bào của sinh vật nhân thực,
nhƣng số lƣợng của chúng phụ thuộc vào nhu cầu năng lƣợng của từng loại tế bào.
Các tế bào có chuyển hóa cao nhƣ tế bào gan, tế bào cơ tim, tế bào thần kinh… có
số lƣợng ty thể lớn (khoảng 1000 đến 2000 ty thể trong mỗi tế bào gan). Ở cơ tim
của ngƣời trƣởng thành, số lƣợng ty thể chiếm khoảng 30% thể tích tế bào [56].

Hình 1.3. Cấu trúc ty thể [66]
Ty thể c đặc điểm cấu trúc khá độc đáo, đƣợc bao bọc bởi 2 lớp màng gồm
màng ngoài và màng trong có cấu tạo từ phospholipid kép và protein. Màng trong ty
thể chứa một loại lipid hiếm gặp là cardiolipin - một chất đặc trƣng của màng ty thể
[24], và có cấu trúc gấp nếp lấn sâu vào bên trong tạo thành mào mở rộng diện tích
và nâng cao khả năng sản xuất ATP (Hình 1.3).
Ty thể đ ng vai trò quan trọng trong cả sự sống và chết của các tế bào cơ
tim. Trong các tế bào khỏe mạnh, chức năng chính của chúng là đáp ứng nhu cầu
năng lƣợng cao của tim bằng cách cung cấp ATP thông qua quá trình phosphoryl
8


hóa oxy hóa. Ty thể chiếm một phần lớn của mỗi tế bào cơ và nằm giữa các tơ cơ và
ngay dƣới màng tế bào cơ. Vị trí chiến lƣợc và sự phong phú của ty thể đảm bảo
một hệ thống phân phối ATP cục bộ hiệu quả cao để hỗ trợ co b p, trao đổi chất và
cân bằng nội môi trong tế bào [28]. Bên cạnh đ , ty thể cũng là yếu tố quan trọng
điều chỉnh sự chết của tế bào, đáp ứng với nhiều tín hiệu stress khác nhau, bao gồm
sự mất các yếu tố tăng trƣởng, thiếu oxy, stress oxy hóa, tổn thƣơng DNA và các
yếu tố khác để kích hoạt sự chết theo chu trình [28-30].
1.4.2. Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh tim mạch
Với vai trò là trung tâm sản sinh năng lƣợng cũng nhƣ trung tâm của sự chết
tế bào cơ tim. Sự rối loạn chức năng ty thể liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều
bệnh tim mạch nhƣ xơ vữa động mạch, tổn thƣơng thiếu máu cục bộ - tái tƣới máu
cơ tim (Ischemia/Reperfusion), cao huyết áp, tiểu đƣờng, phì đại cơ tim và suy tim
(Heart failure), do sự sản xuất không kiểm soát ROS (Hình 1.4) [12]. Vì vậy, việc
kiểm soát sớm rối loạn chức năng ty thể là một bƣớc quan trọng trong điều trị bệnh
tim mạch [64].

Hình 1.4. Ty thể và cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh tim mạch [12]

9


* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch là một quá trình viêm mãn tính và yếu tố nguy cơ phổ biến
nhất của bệnh động mạch vành (Coronary artery disease - CAD). CAD có khả năng
gây tử vong cao và đƣợc đặc trƣng bởi thiếu máu cục bộ cấp tính hoặc mãn tính do
lƣợng oxy cung cấp cho cơ tim bị giảm hoặc dừng đột ngột [39]. Nhiều nghiên cứu
cho thấy, ty thể đ ng vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh xơ vữa động mạch. Sự rối
loạn chức năng ty thể dẫn đến sản sinh quá mức ROS, gây nên tình trạng oxy hóa
protein, lipit và DNA ty thể cũng nhƣ tế bào [11]. DNA ty thể đặc biệt dễ bị tổn
thƣơng oxy h a vì n thiếu protein histones và ít khả năng sửa chữa. Hơn nữa, đột
biến DNA ty thể, ngƣợc lại cũng kích hoạt chu kỳ sản xuất ROS [9]. Nghiên cứu cho
thấy, trên chuột thiếu apo-E biểu hiện sự thiếu enzym chống oxy hóa SOD-2 có mức
ROS cao làm tổn thƣơng DNA ty thể, tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu và đẩy
nhanh tiến trình của xơ vữa động mạch [8].
* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh phì đại cơ tim và suy tim
Trong bệnh phì đại cơ tim, sự tăng trƣởng tế bào cơ tim đòi hỏi nhiều năng
lƣợng hơn và do vậy có sự gia tăng số lƣợng của ty thể. Nghiên cứu trên tim chuột
phì đại sau co thắt động mạch chủ cho thấy sự khuếch đại mật độ ty thể. Tuy nhiên,
sự gia tăng ban đầu về số lƣợng ty thể chỉ đƣợc phát hiện ở giai đoạn bệnh sớm của
bệnh và suy giảm dần cùng với tiến triển của bệnh thƣờng đi kèm với bất thƣờng
trong co cơ [27]. Điều này dẫn đến giảm khả năng điều chỉnh sản xuất ATP của ty
thể, từ đ làm rối loạn chức năng tâm trƣơng và suy tim.
Trong bệnh suy tim, ty thể thƣờng bị tổn thƣơng do vỡ màng. Các ty thể này
thể hiện khả năng tổng hợp ATP suy giảm [13], tăng stress oxy hóa [35].
* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh thiếu máu cục bộ - tái tưới máu cơ tim
Nhiều kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ty thể đ ng vai trò quan trọng
trong quá trình sinh lý bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim, do vậy, sự bảo toàn chức năng

ty thể là cần thiết để hạn chế những tổn thƣơng tế bào cơ tim, hạn chế tiến triển
bệnh [75].
Trong giai đoạn thiếu máu cục bộ, hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử bị
ức chế do sự biến đổi của cardiolipin-một lipid đặc trƣng của màng trong ty thể và
10


tăng cƣờng sự rò rỉ của ion H+, dẫn đến sự giảm điện thế màng ty thể (ΔΨm) và tổng
hợp ATP [32]. Trong giai đoạn tái cung cấp máu, sự tái cung cấp oxy và thay đổi
pH máu làm rối loạn chức năng ty thể trở nên nghiêm trọng hơn nhƣ giảm điện thế
màng ty thể [72], tăng mạnh ROS [73], tăng Ca2+ ty thể [72], oxy hóa cardiolipin,
mở lỗ màng trong ty thể [61], và giải ph ng các protein kích hoạt sự chết theo
chƣơng trình của tế bào cơ tim. Ty thể bị biến đổi trong quá trình tái cung cấp oxy
đƣợc xác định nhƣ dấu hiệu của bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim [49]. Vì vậy, mục
tiêu bảo vệ ty thể trong quá trình tái tƣới máu có thể cải thiện sự phục hồi chức năng
của tế bào cơ tim [31, 72].
Các nghiên cứu về sự rối loạn hoạt động chức năng ty thể ở các tế bào cơ tim
do tổn thƣơng TMTTMCT đã gợi ý một số hƣớng điều trị mới với đích là cải thiện
hoạt động chức năng hoặc giảm thiểu các thƣơng tổn tế bào bắt nguồn từ ty thể nhƣ:
giảm ROS, kiểm soát hoạt động của các kênh ion trên màng ty thể, điều hòa chuỗi
hô hấp ty thể,… [3].
1.4.3. Nghiên cứu về ty thể trên dòng tế bào H9C2
Với các đặc điểm cấu trúc và chức năng độc đáo, ty thể là đích nhắm tới của
nhiều nhà khoa học trong chọn lọc các loại thuốc [38, 72].
Năm 2018, Xiangting và cs đã tiến hành thử nghiệm khả năng gây chết theo
chu trình của Aconitine trên đối tƣợng tế bào H9C2 thông qua con đƣờng ty thể.
Aconitine là một loại diterpenoid alkaloid thƣờng có trong các cây thuộc chi Mao
lƣơng Aconitum và đƣợc sử dụng trong việc điều trị nhiều loại bệnh. Theo nhóm
nghiên cứu, tế bào H9C2 sẽ chết theo chu trình của dƣới sự kích thích của Aconitine
thông qua sự ức chế kênh Na+, từ đ làm thay đổi điện thế màng và dẫn đến hiện

tƣợng loạn nhịp tim. Hơn thế, Aconitine cũng đồng thời làm thay đổi lƣợng Ca2+
trong tế bào, từ đ dẫn đến mất hoạt động chức năng cơ tim. Nh m đã giả định,
hoạt chất gây mất hoạt động chức năng cơ tim này c thể liên quan đến hoạt động
chức năng của ty thể, đặc biệt là các hoạt động sinh năng lƣợng và sinh ROS. Đúng
nhƣ giả định, sau 24 giờ kể từ khi xử lý với Aconitine, nhiễm sắc thể của tế bào
H9C2 tiến hành co xoắn bắt đầu đứt gãy liên tục, tế bào bắt đầu có những dấu hiệu
chuyển sang giai đoạn chết theo chu trình. Bên cạnh đ , ở thời điểm 4 giờ sau xử lý,
lƣợng ROS của tế bào sinh ra tặng mạnh, gấp 2 lần so với nh m đối chứng, trong
11


khi lƣợng ATP tạo thành lại giảm một nửa so với nh m đối chứng tại thời điểm 24
giờ sau xử lý với Aconitine. Để khẳng định về mặt phân tử rằng các tế bào đang đi
theo con đƣờng chết theo chƣơng trình, các thí nghiệm bằng Westen blot đã đƣợc
thực hiện và cho thấy, lƣợng Caspase-3 cũng nhƣ Cytochrome c tăng mạnh dƣới sự
kích thích của Aconitne trong khi đ , Bcl-2 lại bị ức chế biểu hiện [80].
Cũng trên dòng tế bào này, Ping Liu và Jing Dong (2017) đã tiến hành đánh
giả khả năng bảo vệ cơ tim khỏi giảm oxy huyết của Carnosic acid. Tƣơng tự nhƣ
nghiên cứu trên, nh m cũng sử dụng các chỉ tiêu về lƣợng Caspase-3, Bcl-2 và Bax
nhƣ một dấu chuẩn phân tử của hiện tƣợng chết theo chu trình và đánh giá hoạt
động chức năng ty thể bằng phƣơng pháp huỳnh quang. Bằng cách nhuộm với đầu
dò huỳnh quang Fluo-3 AM, lƣợng canxi trong tế bào đƣợc xác định, theo đ , đúng
nhƣ lý thuyết, ở nh m tăng canxi huyết, lƣợng canxi trong tế bào tăng vọt, sau đ ,
lƣợng canxi này sẽ giảm dần cùng với chiều tăng dần lƣợng Carnosic acid đƣợc xử
lý và đƣa gần về giá trị sinh lý bình thƣờng. Tƣơng tự nhƣ vậy, lƣợng ROS sinh ra
cũng c xu thế giảm dần cùng với sự tăng nồng độ Carnosic acid và có xu thế trở lại
mức bình thƣờng của tế bào.Trong khi đ , lƣợng Caspase-3 và Bax tăng lên ở nhóm
tế bào bị tăng oxy huyết, nhƣng sau đ đã giảm mạnh ở các nh m đƣợc xử lý với
hoạt chất. Ngƣợc lại, Bcl-2 lại có xu thế tăng mạnh trở lại tỷ lệ thuận với nồng độ
Carnosic acid sử dụng. Nhƣ vậy, theo nghiên cứu này, Carnosic acid có tác dụng

nâng cao khả năng sống của tế bào cơ tim H9C2 khỏi sự chết theo chu trình, bảo vệ
cơ tim khỏi các thƣơng tổn do thiếu oxy huyết gây ra, đồng thời ức chế enzym
lactate dehydrogenase. Ngoài ra, hoạt chất này cũng hỗ trợ hoạt động chức năng ty
thể thông qua việc giảm lƣợng ROS sinh ra [54].
Jin Han và cs (2013) đã thử nghiệm ảnh hƣởng của Fimasartan - một loại
thuốc ức chế thụ thể angiotensin II đối với tổn thƣơng TMTTMCT. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, tiền xử lý với Fimasartan làm giảm đáng kể tỷ lệ nhồi máu cơ tim.
Fimasartan cũng làm giảm tỷ lệ tế bào chết theo chƣơng trình ở cả mô hình in vivo
và mô hình thiếu oxy - tái cung cấp oxy in vitro sử dụng tế bào H9C2 thông qua
việc làm giảm tổn thƣơng ty thể. Fimasartan có khả năng làm giảm sản sinh O2- ,
bảo tồn điện thế màng ty thể, qua đ bảo vệ ty thể. Bên cạnh đ , Fimasartan cũng

12


làm giảm sự quá tải ion Ca2+ ty thể thông qua ức chế kênh vận chuyển Ca2+ loại L
và kênh vận chuyển Ca2+ đơn độc [31].

13


Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Dòng tế bào cơ tim phôi chuột H9C2 (hãng ATCC® - USA) đƣợc tặng bởi
Trung tâm nghiên cứu bệnh chuyển hóa tim mạch, Trƣờng Đại học Inje, Hàn Quốc.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các môi trường, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

1

Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle Medium
Gibco (USA)
(DMEM)

2

Photphate buffer saline (PBS)

Gibco (USA)

3

Fetal bovine serum (FBS)

Gibco (USA)

4

Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

Sigma (USA)

5

Mitotracker Green (MTG)

Invitrogen (USA)

6

10-N-nonyl acridine orange (NAO)

Invitrogen (USA)

7

Cell-counting kit-8

Sdojindo (Nhật Bản)

8

Penicillin-Streptomycin

ThermoFisher (USA)

9

Trypsin 0,25%, EDTA

Gibco (USA)

2.1.3. Phòng nuôi, thiết bị

Phòng nuôi cấy tế bào là phòng sạch với đầy đủ các thiết bị nuôi cấy nhƣ: Tủ
ấm CO2 (Shellab, USA); Tủ an toàn sinh học cấp 2 (ESCO); Kính hiển vi soi ngƣợc
Axiovert S100 (Zeiss, Germany); Máy ly tâm EBA 270 (Hettich, Germany). Các
thiết bị cơ bản khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong Bảng 2.2

14


Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc

1

Máy đọc huỳnh quang đĩa 96 giếng

Hidex (USA)

2

Máy đo OD đĩa 96 giếng

SpectraMax Plus 384 (USA)

3

Đĩa nuôi 90x20, 60x15, 35x15

SPL (Korea)

4

Đĩa 96 giếng thành trong

SPL (Korea)

5

Đĩa 96 giếng đen, đáy kính

Corning (USA)

6

Bình khí, buồng hypoxia

Việt Nam

2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Tế bào H9C2

Nuôi cấy trong điều
kiện thƣờng

Đánh giá tỷ lệ

sống
(Blue Trypan)

Thử nghiệm mô hình
bệnh TM-TTMCT

Mô hình
sử dụng
CoCl2

Mô hình
sử dụng
buồng
thiếu oxy

Phân tích ty thể

Cardiolipin
(NAO)

Đánh giá tỷ
lệ sống
(CCK-8)

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
15

Mật độ ty
thể (Mito
tracker

green)


2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy cơ bản
Tế bào H9C2 đƣợc bảo quản lƣu giữ lâu dài trong Nitơ lỏng. Toàn bộ quy
trình hoạt hóa, nuôi cấy và bảo quản tế bào đƣợc tiến hành tuân thủ theo hƣớng dẫn
của hãng ATCC, gồm các công đoạn sau:

Tế bào bảo
quản lạnh
(N2 lỏng)

Hoạt h a

Nuôi, cấy
chuyển

Phân tích thí
nghiệm

Bảo quản

Hình 2.2. Quy trình chung nuôi cấy tế bào H9C2 theo hướng dẫn của ATCC
* Hoạt hóa tế bào
Trƣớc khi tiến hành hoạt h a, môi trƣờng nuôi cấy với DMEM 4,5 g/l
glucose có bổ sung 12% FBS và 1% Penicilin-Streptomycin, đệm PBS 1X, bình
nuôi T25 hoặc đĩa nuôi 60x15 mm cần đƣợc chuẩn bị trƣớc. Ống tế bào H9C2 đƣợc
lấy từ bình Nitơ lỏng, rã đông trong bể ổn nhiệt ở 370C. Sau rã đông, ống tế bào
đƣợc ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút.

Sau khi ly tâm, phần dịch nổi phía trên đƣợc loại bỏ, một thể tích môi trƣờng
DMEM mới (1ml) đƣợc bổ sung thêm vào ống đựng tế bào lắng ở đáy. Sau đ , mẫu
tế bào đƣợc trộn nhẹ nhàng bằng pipet và chuyển sang đĩa nuôi (đã chuẩn bị sẵn
16


trƣớc đ ). Sau cùng, đĩa tế bào đƣợc giữ duy trì trong tủ nuôi ở điều kiện 370C, 5%
CO2. Môi trƣờng nuôi đƣợc thay sau khoảng 48h [6].
* Cấy chuyển tế bào
Trƣớc khi cấy chuyển tế bào, mật độ của tế bào đƣợc kiểm tra thông qua việc
quan sát trên kính hiển vi soi ngƣợc, nếu mật độ tế bào đạt khoảng 70-80% thì mới
tiến hành cấy chuyển. Các bƣớc đƣợc thực hiện tuần tự nhƣ sau:
- Hút bỏ môi trƣờng cũ và rửa tế bào 2 lần bằng đệm PBS;
- Bổ sung Trypsin 0,25%, ủ trong 5-10 phút và quan sát dƣới kính hiển vi
xem tế bào tách hết chƣa. Khi bị tách khỏi bề mặt đĩa, các tế bào H9C2 sẽ có dạng
cầu và trôi nổi trong dung môi; bổ sung môi trƣờng mới DMEM vào đĩa nuôi với
thể tích gấp bốn lần thể tích Trypsin đã sử dụng để bất hoạt;
- Hút toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm (15 ml) rồi ly tâm với tốc độ 1500
vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng;
- Hút bỏ dịch nổi và bổ sung môi trƣờng mới ống ly tâm và chuyển môi
trƣờng có chứa tế bào sang các đĩa đã chuẩn bị sẵn (ghi trên nắp đĩa thời gian
chuyển, tên tế bào và số lần chuyển).
* Bảo quản tế bào
Tế bào H9C2 cần đƣợc lƣu trữ để thực hiện các thí nghiệm khác nhau, do
vậy, các tế bào này sẽ đƣợc cất trong Nitơ lỏng với thời gian lƣu trữ có thể đến
nhiều năm. Yêu cầu chất lƣợng tế bào và các bƣớc trong quy trình đƣợc mô tả nhƣ
sau:
- Kiểm tra chất lƣợng tế bào: tế bào đƣợc lấy ra khỏi tủ ấm và soi dƣới kính
hiển vi để đánh giá mật độ tế bào (chỉ khi tế bào lan 70-80% mới tiến hành bảo
quản);

- Hút bỏ môi trƣờng cũ và rửa tế bào từ 1- 2 lần bằng dung dịch đệm PBS;
- Tách tế bào bằng Trypsin 0,25%;
- Bổ sung môi trƣờng DMEM vào đĩa nuôi để ức chế Trypsin, trộn nhẹ
nhàng tạo dịch huyền phù tế bào; Hút dịch sang ống ly tâm và ly tâm ở tốc độ 1500
vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng;
17