Tạo giống lúa kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---  ---

LÊ THỊ NHƯ

TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG
BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2
LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BÔNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, tháng 11/2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---  ---

Lê Thị Như

TẠO GIỐNG LÚA KITAAKE TĂNG CƯỜNG
BIỂU HIỆN HOẶC BẤT HOẠT GEN ANK1, ANK2
LIÊN QUAN ĐẾN CẤU TRÚC BÔNG

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 8420101.21

Cán bộ hướng dẫn: TS. Khổng Ngân Giang
TS. Trần Đức Long

Hà Nội, tháng 11/2019


Lê Thị Như – K26CH
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, số liệu và kết quả
nghiên cứu là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho luận văn này đều được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2020

Lê Thị Như

i


Lê Thị Như – K26CH
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành của tôi tới
TS. Khổng Ngân Giang. Với sự kiên nhẫn và hiểu biết của mình, cô là người đã
trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện khóa
luận tại Phòng thí nghiệm « Nghiên cứu di truyền chức năng hệ gen cây lúa, cà phê
và tương tác với vi sinh vật » (LMI-RICE2), Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin
cảm ơn TS. Tạ Kim Nhung vì những kiến thức chuyên môn và sự động viên,
khuyến khích với tôi từ những ngày đầu tôi đến thực tập tại LMI. Tôi cảm thấy rất
may mắn và biết ơn khi được làm việc dưới sự hỗ trợ của hai cô.
Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của tất cả anh chị, bạn bè đang
làm việc tại phòng thí nghiệm LMI-RICE2. Xin cảm ơn thầy Stephane Jouannic, chị
Phạm Thị Mai, chị Nguyễn Thị Mỹ Lệ nhóm « Cấu trúc bông lúa », tôi đã học được
rất nhiều điều về kiến thức chuyên môn và các vấn đề trong cuộc sống.

Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS. Trần Đức Long, bộ môn Di truyền học, Khoa
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Thầy là người đã giúp đỡ
cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin cảm
ơn thầy cô tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã cho tôi
những kiến thức cơ bản đầu tiên để tôi có thể thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED), Trung tâm Nghiên cứu phát triển (IRD) Pháp, Quỹ học bổng
NAGAO đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Nghiên
cứu này nằm trong khuôn khổ đề tài « Nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen các tính
trạng ảnh hưởng đến năng suất của tập đoàn lúa Việt Nam, phục vụ chương trình
chọn tạo giống lúa bản địa » mã số 106-NN.02-2016.60 do Quỹ Phát triển khoa học
và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ.
Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lời cảm ơn tới sự động viên, thấu hiểu và ủng hộ
từ gia đình, bạn bè tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

Học viên cao học
(ký tên)

ii

năm


Lê Thị Như – K26CH
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU....................................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1. Cấu trúc bông lúa ........................................................................................... 3
1.1.1 Cấu trúc bông và sự hình thành bông từ các mô phân sinh .........................................3
1.1.2 Các nghiên cứu về cơ sở di truyền kiểm soát cấu trúc bông lúa .................................4
1.2

Phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS), công cụ hữu hiệu

để nghiên cứu cơ sở di truyền của các tính trạng nông học ...................................... 6
1.3

Tổng quan về motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 ở lúa ............ 7

1.3.1 Motif ankyrin ..................................................................................................................7
1.3.2 Phân tích tin sinh gen ANK1, ANK2..............................................................................9
1.4

Nghiên cứu chức năng gen ở thực vật bằng phương pháp chuyển gen .......... 10

1.5

Bất hoạt gen bằng công cụ CRISPR/Cas9 .................................................... 14

1.5.1. Hệ thống CRISPR/Cas9.............................................................................................. 14
1.5.2. Chỉnh sửa đa điểm bằng các cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA .......................... 17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 19
2.1. Vật liệu………………………………………………………………………19
2.1.1. Vật liệu thực vật ........................................................................................................... 19
2.1.2. Plasmid ........................................................................................................................ 19
2.1.3. Các chủng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy ............................................................. 20

2.2. Phương pháp ................................................................................................ 20
2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt......................................................................................... 20
2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................................................. 20
2.2.3. Tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA................................................................... 23
2.2.4. Phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 ..................................................... 24
2.2.5. Đưa đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T Easy ................ 25
2.2.6. Ghép nối đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE ............ 26
2.2.7. Thiết kế cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bất hoạt gen ANK1, ANK2... 27
2.2.8. Chuyển gen vào giống lúa Kitaake sử dụng Agrobacterium.................................... 31

iii


Lê Thị Như – K26CH
2.2.9. Phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc tăng cường biểu hiện ANK1, ANK2 ....... 33
2.2.10. Chọc lọc các dòng chuyển gen đột biến bằng công nghệ CRISPR/Cas9 .............. 34
2.2.11. Các kỹ thuật khác....................................................................................................... 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 39
3.1. Tạo vector chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 ................... 39
3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 .............................................................. 39
3.1.2.

Nhân dòng trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector nhân dòng pGEM-T

Easy.............................................................................................................................................40
3.1.3. Ghép nối trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE..................... 42
3.2. Thiết kế cấu trúc PTG nhằm gây đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ
CRISPR/Cas9………………………………………………………………………44
3.2.1. Tạo các mảnh thành phần mang cấu trúc gRNA gây bất hoạt ANK1, ANK2 ........ 44
3.2.2. Sàng lọc các cấu trúc PTG ......................................................................................... 45

3.3. Chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .......................... 46
3.4. Chọn lọc các dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 ....... 47
3.4.1.

Sàng lọc các dòng T0 chuyển gen, đánh giá hiệu quả chuyển gen ........................ 47

3.4.2.

Chọn lọc các dòng T1 đồng hợp tử mang một bản sao T-DNA ............................ 48

3.4.3.

Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các dòng chuyển gen ... 50

3.5. Chọn lọc các dòng chuyển gen đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ
CRISPR/Cas9………………………………………………………………………52
3.5.1.

Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 mang cấu trúc chuyển gen ............................... 52

3.5.2.

Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 đột biến gen ANK1, ANK2............................... 53

3.5.3.

Chọn lọc các dòng T1 đột biến đồng hợp ................................................................ 55

KẾT LUẬN...............................................................................................................59
KIẾN NGHỊ..............................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61
PHỤ LỤC. DANH SÁCH CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG ................................ 68

iv


Lê Thị Như – K26CH
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ANK

Ankyrin

cDNA

complementary DNA (DNA bổ sung)

CRISPR

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
(Các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên)

DNA

Deoxyribonucleic acid (AND)

GBS

Genotyping by sequencing (Giải trình tự)

gDNA

Genomic DNA (AND hệ gen)

gRNA

guide RNA (ARN dò)

GWAS

Genome wide association study (Nghiên cứu liên kết trên toàn
hệ gen)

NST

Nhiễm sắc thể

PAM

Protospacer adjacent motif (vùng AND nằm cạnh trình tự đích)

PCR

Polymerase chain reaction (Chuỗi phản ứng khuếch đại)

PTG

Polycistronic tRNA-gRNA (Đoạn xen kẽ tARN và ARN dò)

qRT-PCR

quantitative real-time PCR (Phản ứng PCR định lượng)

QTL

Quantitive trait loci (lô-cút tính trạng số lượng)

RNA

Ribonucleic acid (ARN)

SBN

Secondary branch number (Số nhánh thứ cấp)

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

SpN

Spikelet number (Số hoa)

v


Lê Thị Như – K26CH
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cấu trúc bông lúa (A) và sự thay đổi qua quá trình thuần hóa (B) [46]....... 3
Hình 2. Các giai đoạn hình thành bông lúa non [40] ............................................... 4
Hình 3. Tương tác di truyền kiểm soát sự phát triển bông lúa [17] ......................... 5

Hình 4. Biểu hiện của ANK1, ANK2 ở hai nhóm lúa có cấu trúc bông tương phản .. 7
Hình 5. Sơ đồ mô phỏng cấu trúc các kiểu protein ANK1 (A), ANK2 (B) tạo ra từ
các mRNA khác nhau ............................................................................................ 10
Hình 6. Chỉnh sửa gen với hệ thống CRISPR/Cas9 [43] ....................................... 16
Hình 7. Cấu trúc PTG cho phép sản xuất nhiều gRNA [42] .................................. 18
Hình 8. Cấu trúc các vector pGEM-T Easy (A), PC5300.OE (B), pGTR (C) và
vector pRGEB32 (C). ............................................................................................ 20
Hình 9. Sơ đồ vị trí gắn mồi dùng phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 (A),
ANK2 (B) .............................................................................................................. 25
Hình

10. Phản ứng tái tổ hợp giữa vector pGEM-T_CDS_ANK và vector

PC5300.OE ........................................................................................................... 26
Hình 11. Vị trí các cặp mồi sử dụng giải trình tự vector PC5300.OE .................... 26
Hình 12. Nguyên tắc tạo cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bằng Golden
Gate [42] ............................................................................................................... 29
Hình 13. Các bước cơ bản trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở lúa ... 32
Hình 14. Vị trí cặp mồi nhằm xác định đột biến xảy ra ở các dòng chuyển gen
Cas9-ANK1, Cas9-ANK2 ..................................................................................... 35
Hình 15. Sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 và ANK2 từ mẫu
bông non của giống Nipponbarre ........................................................................... 40
Hình 16. Kiểm tra vector pGEM-T tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn. . 41
Hình 17. Kết quả phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEMT Easy tái tổ hợp. .................................................................................................. 42


Lê Thị Như – K26CH
Hình 18. Kiểm tra vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng PCR (A, C) và cắt enzyme
giới hạn EcoRI (B,D). ............................................................................................ 43
Hình 19. Kết quả PCR khuếch đại các mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt

ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2. ............................................. 44
Hình 20. Kết quả sàng lọc các dòng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1,
ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2. ........................................................ 45
Hình 21. Hình ảnh chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa
Kitaake. ................................................................................................................. 47
Hình 22. Kết quả sàng lọc cây chuyển gen T0 mang cấu trúc tăng cường biểu hiện
gen ANK1, ANK2................................................................................................... 48
Hình 23. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1 trong các dòng chuyển
gen T1 ................................................................................................................... 51
Hình 24. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK2 trong các dòng chuyển
gen T1 ................................................................................................................... 52
Hình 25. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 bằng PCR.......................................... 53
Hình 26. Sàng lọc đột biến bằng PCR ................................................................... 54
Hình 27. Sự thay đổi trong trình tự DNA (A), trình tự protein (B) và cấu trúc
protein (C) của các dòng đột biến của gen ANK1 ................................................... 56
Hình 28. Sự thay đổi trong trình tự DNA(A), trình tự protein (B) và cấu trúc
protein của các dòng đột biến của gen ANK2 ......................................................... 57
Hình 29. Sự thay đổi trong trình tự DNA, trình tự protein và cấu trúc protein của
dòng đột biến Cas9-ANK(1+2) .............................................................................. 58


Lê Thị Như – K26CH
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Danh sách các mồi được sử dụng trong đề tài ........................................... 21
Bảng 2. Trình tự gRNA-spacer .............................................................................. 27
Bảng 3. Các mồi sử dụng để tạo cấu trúc PTG ....................................................... 28
Bảng 4. Các mảnh PCR thành phần cần tổng hợp với cặp mồi tương ứng .............. 30
Bảng 5. Kết quả giải trình tự các dòng plasmid mang cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2
và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2 .................................................................... 46
Bảng 6. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA ở các dòng lúa chuyển gen T1

PC5300.OE-ANK1 ................................................................................................ 49
Bảng 7. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA ở các dòng lúa chuyển gen T1
PC5300.OE-ANK2 ................................................................................................ 50
Bảng 8. Kết quả phân tích đột biến các gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen thế
hệ T0 ..................................................................................................................... 55


Lê Thị Như – K26CH
MỞ ĐẦU
Lúa (Oryza sativa. L) là một trong những cây trồng quan trọng hàng đầu cung
cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới. Là quốc gia xuất khẩu gạo lớn thứ ba
thế giới, sản lượng lúa gạo của Việt Nam đóng vai trò quan trọng đối với an ninh
lương thực ở khu vực Châu Á (FAO, 2018). Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ do bùng
nổ dân số, đô thị hoá và những ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, dự đoán đến năm
2040 sản lượng gạo cần tăng thêm 20% (IRRI, 2018). Do đó, việc nâng cao năng
suất lúa gạo trở thành mục tiêu quan trọng đối với các quốc gia trồng lúa.
Cấu trúc bông lúa là một tính trạng nông học quan trọng trực tiếp ảnh hưởng
đến năng suất. Việc nghiên cứu xác định các yếu tố di truyền liên quan đến cấu trúc
bông luôn được quan tâm hàng đầu trong các chương trình chọn lọc và lai tạo giống
lúa năng suất cao [7] .
Nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen (Genome wide association study-GWAS)
thực hiện trên một quần thể lúa bản địa Việt Nam đã xác định được QTL9
(quantitative trait loci) nằm trên NST số 2, có liên quan đến số gié thứ cấp/bông và
số hoa/bông, là những tính trạng ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất lúa gạo [41].
Hai gen mã hóa protein chứa miền ankyrin (gọi là ANK1, ANK2) có biểu hiện trái
ngược nhau trong hai nhóm có cấu trúc bông tương phản (bông to và bông nhỏ).
Trong khi gen ANK1 biểu hiện mạnh ở nhóm lúa bông to thì gen ANK2 lại biểu hiện
tăng cao ở nhóm lúa bông nhỏ. Thêm vào đó, một số đa hình đơn nucleotide (single
nucleotide polymorphisms-SNPs) cũng được tìm thấy trong trình tự hai gen. Các
kết quả nghiên cứu cho thấy ANK1, ANK2 có thể có liên quan đến cấu trúc bông

lúa. Để nghiên cứu chức năng của 2 gen này, chúng tôi đã thực hiện đề tài : ”Tạo
giống lúa Kitaake tăng cường biểu hiện hoặc bất hoạt gen ANK1, ANK2 liên
quan đến cấu trúc bông lúa”.
Mục tiêu của đề tài :
- Thiết kế được cấu trúc vector làm tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 và
chuyển thành công vào giống lúa Kitaake

1


Lê Thị Như – K26CH
- Thiết kế được cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt gen
ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9 và chuyển thành công vào giống lúa
Kitaake
- Chọn lọc được các dòng lúa chuyển gen đơn bản, đồng hợp tử và đánh giá
mức độ biểu hiện gen và đột biến gen trong cây chuyển gen.

2


Lê Thị Như – K26CH
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Cấu trúc bông lúa

1.1.1 Cấu trúc bông và sự hình thành bông từ các mô phân sinh
Cấu trúc bông lúa là một trong những tính trạng hình thái quan trọng quyết
định tiềm năng năng suất, được chọn lọc qua quá trình thuần hóa. Bông lúa là một
cấu trúc dạng nhánh, bao gồm một trục chính, các gié sơ cấp mọc ra từ trục chính,

sau đó là các gié bậc cao hơn (gié thứ cấp, tam cấp, tứ cấp) và cuối cùng là hoa,
mọc trực tiếp trên các gié (Hình 1A). Số lượng hoa quyết định số lượng hạt trên
bông, trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Quá trình phân nhánh bông phụ
thuộc vào hoạt động của các tế bào gốc chồi nách trong suốt giai đoạn hình thành và
phát triển sớm của bông. Cấu trúc bông lúa rất đa dạng, không chỉ trong cùng loài
(giữa giống thuần và giống hoang dại) mà còn giữa các loài khác nhau (lúa châu á
và lúa châu phi). Cấu trúc bông lúa ở các loài thuần chủng thay đổi từ dạng bông
nhỏ, chỉ có một vài gié sơ cấp và gié thứ cấp, mang ít hạt đến dạng bông to, phân
nhánh nhiều và mang nhiều hạt hơn so với các loài tổ tiên (Hình 1B) [46].

Hình 1. Cấu trúc bông lúa (A) và sự thay đổi qua quá trình thuần hóa (B) [46]
n: Số hạt trên bông
Bông lúa là kết quả quá trình hoạt động của các mô phân sinh, chúng được
hình thành và biệt hóa liên tục trong quá trình phát triển của cây [24]. Sự hình thành
bông lúa non được chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn sớm là sự hình thành và kéo

3


Lê Thị Như – K26CH
dài của mô phân sinh trục (Hình 2A), hình thành các mô phân sinh gié sơ cấp
(Hình 2B), kéo dài các mô phân sinh gié sơ cấp, hình thành các mô phân sinh gié
cấp cao hơn (Hình 2C). Giai đoạn muộn là sự hình thành mô phân sinh hoa (Hình
2D), sự biệt hóa tạo thành các bộ phận của hoa và sự phát triển của chúng cũng
được quan sát ở giai đoạn này (Hình 2E).

Hình 2. Các giai đoạn hình thành bông lúa non [40]
A : Giai đoạn phát sinh mô phân sinh trục bông, B : Hình thành và kéo dài mô phân sinh
gié sơ cấp, C : Kéo dài gié sơ cấp và hình thành gié thứ cấp, D : Hình thành hoa, E : Sự
biệt hóa các cơ quan sinh sản của hoa. RM : mô phân sinh trục ; PBm : mô phân sinh gié

sơ cấp ; AM : mô phân sinh gié thứ cấp ; PB : Gié sơ cấp ; Sp : spikelet (cụm hoa) ; Fl :
hoa.

1.1.2 Các nghiên cứu về cơ sở di truyền kiểm soát cấu trúc bông lúa
Sự phát triển của bông lúa phụ thuộc vào hoạt động của cả mô phân sinh trục
(rachis meristem) và mô phân sinh gié (branch meristem), chúng được kiểm soát
bởi mạng lưới nhiều gen khác nhau. Ngày nay, một số gen đã được mô tả tham gia
vào việc kiểm soát quá trình phát triển của bông lúa (Hình 3).

4


Lê Thị Như – K26CH

Hình 3. Tương tác di truyền kiểm soát sự phát triển bông lúa [17]
Theo đó, các gen kiểm soát hoạt động của các mô phân sinh trong thời gian
biệt hóa hình thành cơ quan sinh sản ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bông. Một số
yếu tố tham gia vào quá trình chuyển đổi và hình thành các mô phân sinh của cụm
hoa đã được nghiên cứu ở Arabidopsis, chức năng của một số gen tương đồng cũng
được phát hiện khi tiến hành nghiên cứu so sánh trình tự ở lúa. Các nhà khoa học đã
mô tả hai trong số bốn gen RICE CENTRORADIALIS ở lúa (RCN1, RCN2) liên
quan đến sự biệt hóa từ mô phân sinh ghé sơ cấp thành mô phân sinh gié thứ cấp
(Hình 3). Trong đó, khi tăng cường biểu hiện RCN1, RCN2 sẽ thúc đẩy sự hình
thành các mô phân sinh gié thứ cấp, kéo theo sự tăng cường số lượng gié thứ cấp ở
bông [33]. Thông qua phân tích các đột biến, gen LAX PANICLE 1( LAX1) đã được
chứng minh là cần thiết cho sự hình thành và duy trì các mô phân sinh gié, việc
giảm biểu hiện LAX1 sẽ làm giảm số lượng gié sơ cấp của bông. Đồng thời, gen
LAX1 cũng hoạt động như một gen nhận dạng mô phân sinh hoa [21]. TAWAWA1
(TAW1) được mô tả tham gia vào quá trình điều chỉnh cấu trúc bông bằng cách ức
chế sự chuyển đổi từ mô phân sinh gié sang mô phân sinh hoa. TAW1 được đánh giá

có thể hoạt động như một yếu tố phiên mã trong việc thúc đẩy các hoạt động của
mô phân sinh gié và hạn chế sự chuyển đổi sang mô phân sinh hoa từ đó làm tăng
số lượng hoa trên bông [45]. APO1 và APO2 (ABERRANT PANICLE
ORGANIZATION) là các yếu tố điều hòa chính ở bông lúa, các cây đột biến mất
chức năng các gen này có cụm hoa nhỏ, ít nhánh do mô phân sinh gié sớm chuyển
thành mô phân sinh hoa [18]. LONELY GUY (LOG) mã hóa một loại enzyme liên

5


Lê Thị Như – K26CH
quan đến cân bằng cytokinin nội sinh, đóng vai trò quan trọng quyết định số lượng
gié trên bông, tăng cường biểu hiện LOG có thể làm tăng số lượng gié sơ cấp [23].
Gen LEAFY HULL STERILE1 (LHS1) mã hóa một yếu tố phiên mã họ MADS liên
quan đến sự phát triển của các bộ phận của hoa cũng như kiểm soát thời kỳ ra hoa,
ức chế biểu hiện của gen này có thể làm tăng số lượng hoa trên bông [20]. Các nhà
khoa học cũng chứng minh được rằng số lượng gié sơ cấp và thứ cấp của bông được
kiểm soát tích cực bởi một alen của DEP1 (DENSE AND ERECT PANICLE 1) [16].
1.2 Phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS), công cụ hữu
hiệu để nghiên cứu cơ sở di truyền của các tính trạng nông học
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, sự ra đời của các thế hệ giải
trình tự mới đã tạo điều kiện cho hàng loạt dự án giải trình tự các giống lúa khác
nhau trên thế giới (như dự án giải trình tự 3000 giống lúa (3K RGP, 2014), dự án
đánh giá di truyền của tập đoàn 1568 giống lúa bản địa với 700000 SNPs (HDRA
SNP) [29], cung cấp cơ hội tuyệt vời cho các phân tích liên kết trên toàn hệ gen
(GWAS). GWAS trở thành công cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu đa dạng di
truyền, đặc biệt là ở những tính trạng nông học phức tạp như cấu trúc bông, do nó
so sánh đồng thời ảnh hưởng của nhiều alen lên tính trạng quan tâm trên một số
lượng lớn các giống trong tập đoàn. Nguyên tắc cơ bản của GWAS liên quan đến
việc xác định alen liên kết với nhiều SNP khác nhau trong mỗi một nghiên cứu, và

thống kê so sánh để xác định SNP hoặc gen liên kết với một đặc điểm cụ thể. Các
phân tích GWAS trên tính trạng cấu trúc bông được tiến hành hàng loạt trong một
vài năm gần đây. Nhiều QTL liên quan đến các tính trạng năng suất như số gié sơ
cấp trên bông, số gié thứ cấp trên bông, chiều dài trục bông, số hạt/bông đã được
tìm thấy, trong đó một số locus chứa các gen đã được biết ảnh hưởng tới cấu trúc
bông [1, 7, 27, 39, 44].
Năm 2018, Tạ Kim Nhung và cộng sự xác định được một QTL (quantitative
trait locus) hoàn toàn mới (QTL9) thông qua phân tích GWAS các tính trạng năng
suất của một tập đoàn 159 giống lúa bản địa Việt Nam [41]. QTL9 liên kết với 2
tính trạng quan trọng quyết định trực tiếp đến năng suất: số gié thứ cấp/bông và số
hoa/bông. Vùng QTL9 có kích thước 780 kb, 137 gen được tìm thấy nhưng chưa có

6


Lê Thị Như – K26CH
gen nào được nghiên cứu chức năng. Bằng phân tích tin sinh các cơ sử dữ liệu sẵn
có trên internet, 11 gen ứng cử viên đã được sàng lọc để đánh giá biểu hiện ở 2
nhóm lúa (haplotype) có cấu trúc bông tương phản (bông to: 47 gié thứ cấp, 240
hoa/ bông và bông nhỏ: 30 gié thứ cấp, 150 hoa/ bông). Trong đó, 2 gen mã hóa
protein chứa miền ankyrin (đặt tên là ANK1 và ANK2) có biểu hiện trái ngược nhau
ở 2 haplotype. Gen ANK1 biểu hiện mạnh hơn ở nhóm lúa bông to trong khi biểu
hiện của gen ANK2 cao hơn ở nhóm lúa bông nhỏ (dữ liệu chưa công bố) (Hình 4).
Bên cạnh đó, phân tích trình tự các gen này đã tìm thấy các SNPs, InDels ở 2
haplotype. Những kết quả thu được cho thấy tiềm năng của 2 gen ANK1 và ANK2
liên quan đến cấu trúc bông lúa, trong đó gen ANK1 đóng vai trò như một yếu tố
làm tăng cường khả năng phân nhánh của bông, còn gen ANK2 có tác động ngược
lại gây ức chế quá trình này. Phân tích chức năng của gen ANK1, ANK2 sẽ giúp làm
sáng tỏ vai trò của chúng liên quan đến cấu trúc bông lúa (Hình 4).

Hình 4. Biểu hiện của ANK1, ANK2 ở hai nhóm lúa có cấu trúc bông tương
phản
Màu xám: Biểu hiện gen giai đoạn sớm, Màu đỏ: Biểu hiện gen giai đoạn muộn. a, b, c, d
thể hiệ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.

1.3 Tổng quan về motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 ở lúa

1.3.1 Motif ankyrin
Motif ankyrin (ANK) là một trong những motif protein được bảo tồn và phân
bố đa dạng nhất trong các loài sinh vật, từ virus đến người [37]. Mỗi motif ANK
bao gồm từ 30-33 axit amin tạo thành hai vòng xoắn alpha song song và được nối

7


Lê Thị Như – K26CH
với nhau bởi các vòng cầu hoặc cấu trúc kẹp tóc. Hầu hết protein ANK chứa hai đến
sáu motif ANK lặp lại, số lần lặp lại lớn nhất được biết đến là 34 được dự đoán cho
một protein từ Giardia lamblia [10]. Các protein tín hiệu Swi6/Cdc10 và Notch là
các protein ANK đầu tiên được phát hiện từ nấm men và Drosophila [2].
ANK giữ vai trò trung gian trong tương tác protein-protein của tế bào nhưng
chúng thường không nhận ra bất kỳ chuỗi axit amin hoặc cấu trúc cụ thể nào, thay
vào đó, chúng tạo thành một bề mặt dài, kích thước khác nhau tùy thuộc vào số lần
lặp lại, do đó tính đặc hiệu phụ thuộc vào số lượng motif ankyrin trong protein [31].
Ở người và động vật, protein ANK có ý nghĩa quan trọng và vai trò sinh học
đa dạng. Chúng tham gia vào kiểm soát con đường sống sót của tế bào [30], điều
hòa phiên mã [5]. Quan trọng hơn cả là các khiếm khuyết trong protein ANK đã
được mô tả cho một số người bệnh. Một số protein ANK trực tiếp tham gia vào
ngăn ngừa sự phát triển của ung thư. Hơn nữa, protein ANK là các thành phần quan
trọng của kênh ion và vận chuyển phức hợp tín hiệu trong hệ thống tim mạch [12].

Ở thực vật, chỉ có một số lượng nhỏ protein ANK đã được nghiên cứu chức
năng, tuy nhiên cơ chế hoạt động của motif ANK vẫn chưa được làm rõ. Protein
ANK có nguồn gốc thực vật đầu tiên được báo cáo là AKR từ Arabidopsis, đóng
vai trò điều hòa trong quá trình biệt hóa tế bào và phát triển của cây [48]. Các
protein ANK cũng được báo cáo giữ vai trò quan trọng trong việc đáp ứng các
stress sinh học và phi sinh học ở thực vật. Motif ANK tham gia trong tương tác
protein-protein được nghiên cứu có liên quan đến một số phản ứng sinh lý trong tế
bào và chu kỳ tế bào, phân biệt tế bào [11], sự nảy mầm và tăng trưởng của hạt
phấn [14], phát triển và hình thành rễ bên [34], tham gia vào quy trình chết tự nhiên
của tế bào [8], điều chỉnh kênh ion Kali màng tế bào [25], duy trì việc cộng sinh với
vi khuẩn cố định nito trong nốt sần ở rễ [22].
Cho đến nay mới chỉ có 3 protein ANK được nghiên cứu chức năng ở lúa.
XB25 là một protein liên kết có khả năng tương tác với miền xuyên màng của
protein XA21, cần thiết để duy trì khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae,
tác nhân gây ra bệnh bạc lá ở lúa [19]. Protein thứ hai là CBT hoạt động như một

8


Lê Thị Như – K26CH
yếu tố điều hòa tăng cường phiên mã [6] và gen PIANK1 liên quan đến việc điều
chỉnh đáp ứng kháng bệnh đạo ôn [32].
Năm 2009, bằng cách phân tích các bộ dữ liệu ở lúa, Huang và cộng sự đã
xác định được 175 gen ANK dựa vào thành phần “miền protein” và được chia thành
10 phân lớp. Đánh giá biểu hiện của các gen này trong suốt vòng đời của lúa, cho
thấy biểu hiện của một số gen thay đổi đáng kể khi được đáp ứng với phytohormone
hay các yếu tố sáng/tối, trong khi đó một số gen ANK có thể giữ vai trò quan trọng
trong quá trình ra hoa và thụ phấn ở lúa [15]. Đáng chú ý, gen ANK1 và ANK2 cũng
có mặt trong nghiên cứu này và ANK1 có biểu hiện tăng cao trong giai đoạn phân
hóa gié của bông non.

1.3.2 Phân tích tin sinh gen ANK1, ANK2
Các nghiên cứu tin sinh đã được thực hiện trên cấu trúc protein được mã hóa
bởi các gen ANK1, ANK2 và một số phối tử tiềm năng của chúng, nhằm xác định
các dạng mRNA trưởng thành. ANK1 và ANK2 đều có thể tạo ra các dạng mRNA
khác nhau.
Gen ANK1 có hai dạng mRNA trưởng thành. Dạng đầu tiên có 9 exon, mã
hóa 6 motif ANK, và tạo ra hai vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác
(Molecular Binding Site). Protein ANK1 được dự đoán có thể tạo liên kết với một
số protein bám màng và cytoskeleton hay nó cũng có thể là một kênh vận chuyển
ion calcium. Dạng mRNA thứ hai chỉ có 5 motif ANK, tạo ra 1 vị trí tương tác
protein nhưng vẫn bảo tồn các chức năng sinh hóa như dạng mRNA1 (Hình 5A).
Gen ANK2 có bốn dạng mRNA. Dạng thứ nhất có 10 exon, mã hóa 5 motif
ANK và 3 motif TPR (Tetratricopeptide repeat), có hai vị trí tương tác với các
protein khác. Protein của dạng mRNA này có tiềm năng tham gia vào một cơ chế
truyền tín hiệu với thụ thể màng ty thể. Dạng thứ hai và dạng thứ tư tương tự nhau,
chỉ có 5 motif ANK và 1 vị trí tương tác protein. Trong khi đó dạng thứ ba không
mã hóa motif ANK nào (Hình 5B) (Dữ liệu chưa công bố).

9


Lê Thị Như – K26CH

Hình 5. Sơ đồ mô phỏng cấu trúc các kiểu protein ANK1 (A), ANK2 (B) tạo ra
từ các mRNA khác nhau
Đường màu đỏ: các motif ANK; đường màu cam: motif Tetratricopeptide repeats; đường
màu đen: liên kết màng- cytoskeleton; đường màu vàng: liên kết thụ thể màng của ty thể;
đường màu xanh: liên kết với các protein khác. a, b, c, d là các dạng mRNA phiên mã
khác nhau của gen.

1.4 Nghiên cứu chức năng gen ở thực vật bằng phương pháp chuyển gen
Một trong những phương pháp hiệu quả nhất để nghiên cứu chức năng gen là
phương pháp chuyển gen. Năm 1972, công nghệ ADN tái tổ hợp lần đầu tiên được
sử dụng để chuyển gen vào virus SV40, từ đó cho đến nay hàng loạt nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật này ra đời, một trong những ứng dụng quan trọng của công nghệ này
là tạo ra được những sinh vật biến đổi gen mang những đặc tính mong muốn. Nhiều
giống lúa biến đổi gen cũng được tạo ra nhờ việc áp dụng kết hợp công nghệ ADN
tái tổ hợp và các kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Có nhiều phương pháp chuyển gen
đã được áp dụng ở lúa như sử dụng súng bắn gen, chuyển gen qua tế bào trần hay
chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Phương pháp sử dụng súng bắ n gen: Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị
sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp
ADN ngoại lai vào tế bào thực vật, phát triển vào đầu thập niên 1980 bởi các nhà
thực vật học ở Ðại học Corrnell. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại

10


Lê Thị Như – K26CH
nặng có đường kính khoảng 1μm, được bao bọc ADN ngoại lai. Mục tiêu của súng
bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật, sau khi va chạm callus bị phá vỡ
nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi đã tiếp nhận các phân tử ADN
ngoại lai và tiếp hợp vào hệ gen thực vật. Phương pháp này có ưu điểm là thao tác
dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có
tỉ lệ sống sót cao, là phương pháp duy nhất có khả năng biến đổi hệ gen ty thể. Tuy
nhiên phương pháp này khá tốn kém. Hiê ̣n nay hơn 40 giố ng lúa đã đươc̣ biế n na ̣p
gen thành công bằng phương pháp này như chuyển thành công gen Xa21 vào giống
lúa Indica IR72, làm tăng sức đề kháng của giống lúa này với vi khuẩn gây bệnh
bạc lá, chuyển gen cryIA vào các giống KDML105, IR64, Taipei 309 làm tăng khả

năng kháng rầy nâu. Các nhà nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu lúa gạo Philippines,
đã bắn gen thành công để chuyển đổi hơn 20 giống khác nhau thích nghi với điều
kiện sinh thái địa lý khác nhau như psy, crt1, ferritin, FRO2, XA21, Bt, chitinase,
enod12, PEPC, glgC, rolC, sd1…( />Phương pháp chuyển gen qua tế bào trần: Ðể ADN dễ xâm nhập được vào tế
bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast. Protoplast có thể được duy trì
trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với
một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có
thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình chuyển gen như thế này được thực
hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản mà không cần vector
chuyển gen. Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với
PGE (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện. Phương pháp chuyển gen này rất
có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián
tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được. Tuy nhiên, việc tạo protoplast
cũng như tái sinh cây từ protoplast phức tạp, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của
nhiều yếu tố môi trường. Phương pháp được áp dụng thành công cho một số loài
phụ Japonica như Nipponbare và Taipei 309.
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium: được sử dụng phổ biến
nhất hiện nay để chuyển gen ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng. Năm 1993,
Hiei và cộng sự xây dựng hệ thống chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium cho

11


Lê Thị Như – K26CH
hiệu quả cao ở các giống lúa japonica bằng cách sử dụng mô sẹo từ hạt trưởng
thành, sau đó trở thành phương pháp chuyển gen phổ biến nhất. Sau đó Salaud và
cộng sự đã cải tiến chu trình để rút ngắn thời gian chuyển gen và nâng cao hiệu quả
chuyển gen. Các nghiên cứu đánh giá cho thấy chuyển gen gián tiếp thông qua
agrobacterium cho sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và di truyền của các gen
chuyển ổn định qua nhiều thế hệ ( />Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn tự nhiên phổ biến trong đất và là

tác nhân gây bệnh cho một số loài thực vật. Agrobacterium có thể xâm nhập vào
thực vật thông qua vết thương ở thân hoặc rễ, chúng gây ra bệnh khối u hình chóp
(crown

gall)

và

bệnh

lông

rễ

(hairy

root)

ở

các

loài

thực

vật

( Agrobacterium được sử dụng làm trung gian để chuyển
gen nhờ khả năng đưa vật liệu di truyền mới vào tế bào thực vật. Vật liệu di truyền

được gọi là T-DNA (DNA chuyển) nằm trên một plasmid Ti, là một đoạn DNA tròn
được tìm thấy trong hầu hết các vi khuẩn. Trong quá trình chuyển gen, một số thành
phần của plasmid Ti cho phép chuyển các gen quan tâm vào tế bào thực vật một
cách hiệu quả, bao gồm : 1) vùng trình tự lặp lại ở 2 đầu của T-DNA (left border và
right border) phân định đoạn DNA được chuyển vào hệ gen thực vật. Các gen nằm
giữa vùng LB và RB không có vai trò trong việc tích hợp T-DNA vào hệ gen thực
vật, do đó có thể lợi dụng để thay thế các gen quan tâm và tích hợp vào thực vật; 2)
gen vir (gen độc lực), cần thiết để chuyển vùng T-DNA sang cây nhưng bản thân
chúng không được chuyển vào; 3) vùng T-DNA được sửa đổi trong đó các gen gây
bệnh khối u được loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm.
T-DNA của Ti-plasmid tự nhiên có thể mang theo một đến hàng chục
gen. Ví dụ, T-DNA của pTiC58 có thể mang khoảng 23 kbp. Hiện nay, A.
tumefaciens được báo cáo có thể lây nhiễm tới 643 loài thuộc 331 chi thực vật
( Gần đây các nhà khoa học tiến hành cải tiến Tiplasmid tăng hiệu quả cho quá trình chuyển gen. Có hai hệ thống vector được cải
tiến từ Ti-plasmid: vector đồng liên hợp (Cointegrated vector) và vector nhị thể
(Binary vector). Hệ thống vector đồng liên hợp là kết quả của sự kết hợp hai vector:
Ti-plasmid đã loại bỏ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine, nhưng

12


Lê Thị Như – K26CH
vẫn giữ lại vùng vir và LB, RB; thay vào các đoạn gen bị loại bỏ là đoạn tương
đồng với một đoạn DNA trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian). Plasmid trung
gian thường là các plasmid tách dòng từ E. coli và có thể tái sinh ở Agrobacterium.
Plasmid này có chứa gen cần chuyển, gen chỉ thị phục vụ việc sàng lọc và đoạn
tương đồng Ti-plasmid. Khi hai vector tương tác với nhau, chúng sẽ trao đổi chéo
tạo thành vector liên hợp. Do tần số chuyển plasmid từ E. coli sang Agrobacterium
rất thấp nên vector này ít được sử dụng. Hệ thống vector nhị thể có hai plasmid: một
plasmid tách dòng từ E. coli trong đó thiết kế vùng LB, RB, nằm giữa chúng là các

gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển; plasmid thứ hai là Ti-plasmid đã cải tiến
chỉ giữ lại vùng Vir (plasmid hỗ trợ). Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ
chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rất hiệu quả.
Quá trình chuyển gen bao gồm các bước sau : 1) phân lập gen quan tâm ; 2)
thiết kế cấu trúc chuyển gen mang gen quan tâm, promoter điều khiển biểu hiện gen
và gen chỉ thị để hỗ trợ việc sàng lọc cây chuyển gen ; 3) cài gen chuyển vào
plasmid Ti ; 4) biến nạp plasmid mang T-DNA vào vi khuẩn Agrobacterium ; 5)
đồng nuôi cấy khuẩn với tế bào thực vật để chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật ; 6)
tái sinh cây chuyển gen ; 7) phân tích cây chuyển gen.
Phân tích cây chuyển gen là một bước rất quan trọng để đánh giá các khía cạnh
liên quan đến chức năng của gen quan tâm. Các kỹ thuật sinh học tế bào, sinh học
phân tử và sinh lý thực vật được sử dụng như: PCR, Southern blot, giải trình tự
DNA, cho phép khẳng định sự có mặt của gen chuyển trong cây, cũng như vị trí của
gen cài trong nhiễm sắc thể, số lượng bản sao của gen chuyển trong genome. Mức
độ biểu hiện của gen (RNA, protein) được đánh giá bằng các kỹ thuật: Northern
blot, qRT-PCR, Western blot, immunofluorescence, ELISA, phân tích kiểu hình.
Các nghiên cứu chuyển gen sử dụng Agrobacterium để tăng cường biểu hiện
gen, chuyển các cấu trúc gây bất hoạt gen,... được áp dụng ở hầu hết các phòng
nghiên cứu di truyền ở cây lúa với hàng trăm công bố mỗi năm. Năm 2012, các nhà
khoa học tăng cường biểu hiện PIN2 ở Nipponbare thông qua việc chuyển gen
Agrobacterium dẫn đến chiều cao cây thấp hơn, nhiều nhánh hơn so với loài hoang
dại từ đó xác định chức năng của PIN2 trong quá trình phát triển của lúa [4]. Năm

13


Lê Thị Như – K26CH
2013, các nhà khoa học tăng cường biểu hiện gen ARG trong lúa Kitaake bằng
chuyển gen thông qua Agrobacterium làm tăng số lượng hạt trên bông [28]. Zeng và
cộng sự năm 2016 cũng nhận thấy rằng tăng cường biểu hiện GlyI ở Oryza sativa có

thể làm tăng tỉ lệ vào chắc của hạt từ đó làm tăng năng suất lúa gạo [47]. Năm 2017,
Park và cộng sự chuyển gen ở Kitaake sử dụng Agrobacterium, chứng minh được
rằng tăng cường biểu hiện XA21 làm tăng khả năng chống chịu Xanthomonas
oryzae pv. oryzae (Xoo) ở Kitaake [35]. Sử dụng phương pháp này mới đây, He và
cộng sự (2018) làm tăng cường biểu hiện AFB6 ở lúa, làm tăng đáng kể số lượng
hạt/bông, số gié sơ cấp, từ đó làm tăng năng suất lên 50% [13].
1.5 Bất hoạt gen bằng công cụ CRISPR/Cas9

1.5.1. Hệ thống CRISPR/Cas9
Trong những năm gần đây, các kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen, ZFNs (zinc finger
nucleases),

TALENs

(transcription

activatorlike

effector

nucleases)

hay

CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) đã được
phát triển để tạo ra những đột biến tại một vị trí cụ thể trong hệ gen các loài vi sinh
vật, thực vật, động vật và cả tế bào người. Trong đó, CRISPR/Cas9 đã trở thành
một công cụ mạnh mẽ để chỉnh sửa hệ gen vì có độ đặc hiệu mục tiêu lớn hơn, dễ
thiết kế và hiệu quả hơn.
Kỹ thuật CRISPR/Cas9 được phát triển dựa trên hệ thống miễn dịch loại II,

CRISPR/Cas9 của vi sinh vật prokaryote trong việc phát hiện và phân hủy DNA của
các bacteriophage và plasmid ngoại lai. Để bảo vệ vi khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vi
khuẩn gắn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tự
lặp lại CRISPR. Vùng trình tự này được phiên mã và được xử lý thành các đoạn
RNA ngắn (được gọi là crRNA_CRISPR-derived RNA) có khả năng liên kết với
endonuclease Cas để nhận diện DNA mục tiêu (thông qua liên kết bổ sung của trình
tự crRNA và DNA mục tiêu) và cắt phân tử DNA mục tiêu thông qua hoạt động
endonuclease của Cas (Hình 6). Trong tế bào prokaryote, proteine Cas9 được dẫn
dắt đến DNA của gen đích bởi phức hợp 2 RNA không mã hóa CRISPR RNA
(crRNA) và trans-activating crRNA (tracrRNA). Sau đó, Jinek và cộng sự đã tổng

14


Lê Thị Như – K26CH
hợp thành công một RNA dò duy nhất (sgRNA) hoạt động tương tự như crRNA và
tracrRNA [51]. Từ đó hệ thống CRISPR/Cas9 đã được phát triển để trở thành công
cụ chỉnh sửa đặc hiệu DNA trong tế bào dựa vào đoạn trình tự RNA dò mà chúng ta
đã có thể thiết kế được ( />Chức năng cắt sợi đôi DNA của Cas9 được thực hiện nhờ hai motif cấu trúc:
một vùng RuvC nằm ở đầu amino và một vùng HNH nằm ở vùng giữa trình tự
protein. Trong quá trình phá hủy DNA, hai vùng RuvC và HNH cắt phân tử DNA
mạch kép tạo ra sự đứt gãy sợi đôi ở trong vùng liên kết bổ sung với gRNA, vùng
HNH cắt sợi bổ sung, vùng RuvC cắt sợi không bổ sung. Hoạt tính cắt sợi đôi DNA
của Cas9 cũng đòi hỏi một vùng trình tự bảo thủ ngắn (2-5 nucleotides)
(protospacer-associated motif (PAM). Cas9 từ Streptococcus pyogenes nhận biết
vùng trình tự PAM 5’-NGG-3’ (N là một nucleotide bất kỳ) (Hình 6). Trên thực tế,
mặc dù các chuỗi trình tự gRNA bổ sung hoàn toàn mà không có mặt trình tự PAM
thì hệ thống Cas9 cũng bỏ qua [51]. Tần suất có mặt của PAM trong genome khá
cao nên Cas9/gRNA có thể chỉnh sửa hầu như tất cả các gen. Điểm đứt gãy tạo ra
nhờ hoạt động của hệ thống này sẽ được nối lại bởi các cơ chế tự nhiên trong tế bào

như tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination HR) hoặc không tương đồng
(non-homologous end-joining NHEJ). Quá trình sửa chữa sẽ dẫn đến những thay
đổi ngẫu nhiên về trình tự DNA xung quanh điểm đứt gãy như làm mất hoặc thêm
một vài nucleotide đối với trường hợp nối không tương đồng (NHEJ), khiến gen bị
knock-out. Nếu có 1 đoạn DNA mà trình tự ở 2 đầu của nó tương đồng với điểm
đứt gãy thì nó có thể được chèn thêm vào nhờ cơ chế tái tổ hợp (HR) (knock-in gen)
[58]. Dựa trên cơ chế này, các nhà khoa học có thể thiết kế gRNA cho các điểm cắt
đặc hiệu gây ra đột biến điểm, đột biến mất đoạn hoặc chèn ngang một đoạn trình tự
vào đoạn gen có sẵn làm triệt tiêu hoặc thay đổi mức độ biểu hiện của gen đích
(Hình 6) [43]. Một ưu điểm nổi bật khi sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 là có thể
chọn lọc được các dòng đồng hợp đột biến ngay từ thế hệ T0 chỉ bằng các phản
ứng PCR và giải trình tự. Bên cạnh đó còn có thể xác định được các dòng đồng hợp
đột biến không mang vector chuyển gen ở thế hệ T1 nhờ vào sự phân ly.

15