Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng

Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây
trồng?
------------- o 0 o -------------
* Khái niệm về cây đơn bội:
Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n), lưỡng bội (2n),
tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, với
các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ
thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội
(n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong
điều kiện nhân tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được
người ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau. Những biểu
hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể cả các gen lặn. Đây
sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống.
* Các đường hướng tạo cây đơn bội:
Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội. Nếu
như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n). Tuy nhiên trong tự nhiên rất
hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành nghien cứu bằng các con đường
khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924,
Blakeslee và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp
bằng cách nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ) đã
lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược. Tiếp sau đó với các
đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định việc tạo cây đơn bội thông qua
nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra
bằng con đường đơn bội.
Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:
- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể coi là thủ
công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được dạng đồng hợp tử. Đây
cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém.
- Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và nhanh
chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in
vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và

gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây
đơn bội. Đặc biệt với cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác
giống cây trồng.
* Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng:
Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:
- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội:
Dòng thuần ổn định (F
1
, F
2
)

Chọn giống ưu thế lai
dòng đồng hợp tử tuyệt đối

Nhị bội hóa số lượng NST
(Tự phát, xử lý, colchicine)

Cá thể đơn bội
Lai với các thể đơn bội khác
bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần
(lai Soma) của các thể đơn bội

Gây đột biến, chọn lọc in vitro
Tái sinh cây
Nguyên liệu khởi đầu
cho chọn giống

* Kỹ thuật tạo cây đơn bội:
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:
+ Nguyên lý:
Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn
nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành
cây đơn bội.
Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis). Khi
nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau:
 Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu
bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n).
 Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo mô
sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n.
 Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián
tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua.
+ Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:
Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo
cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một. Bao phấn của
những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao
phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ
thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10
0
C trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7
0
C trong 1
tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày.
Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô cùng quan trọng.
Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa
thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10
-

5
mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây họ cà cần ít hơn, khoảng 10
-6
mol. Về hàm lượng đường cũng khác
nhau, ở ngô là 60-120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v.
Ngoài ra một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt trong
nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn.
Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn đều là
cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số phương pháp như đếm số lượng
NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình
thái, kích thước, khả năng sinh trưởng.
+ Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi cấy bao phấn,
tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt phấn này thước được nuôi cấy
trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng.
Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn:
Cây đơn bội
Phôi hóa

Tạo callus

Cây đơn bội
Nuôi cây bao phấn
môi trường dinh dưỡng đặc hiệu
- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh
(gynogensis).
Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn bội. Tuy nhiên,
khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã
bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải
đường, hướng dương, v.v. đã không cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm

70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ
tinh và đã thu được nhiều thành tựu.
Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối với hành, củ cải
đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, … Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây
thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như
kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …
Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và thu
được nhiều thành công hơn cả.