tìm hiểu cơ chế đề kháng carbapenem do carbapenemase ở 100 chủng enterobacteriaceae kháng carbapenem bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến, khoanh giấy phối hợp và pcr

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TUN LINH

tìm hiểu cơ chế đề kháng carbapenem do
carbapenemase
ở 100 chủng enterobacteriaceae kháng carbapenem
bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến,
khoanh giấy phối hợp và pcr

LUN VN THC S Y HC

H NI, 2017


B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

NGUYN TUN LINH

tìm hiểu cơ chế đề kháng carbapenem do
carbapenemase
ở 100 chủng enterobacteriaceae kháng carbapenem
bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến,

khoanh giấy phối hợp và pcr

Chuyờn ngnh: Vi sinh y hc
Mó s

: 60720115

LUN VN THC S Y HC

Hng dn khoa hc:
1.TS. Phm Hng Nhung
2.TS. Trn Minh Chõu

H NI, 2018


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDC

: Centers for Disease Control and Prevention
: Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ
CLSI
: The Clinical and Laboratory Standards Institute
: Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ
CPE
: Carbapenemase producing Enterobacteriaceae
: Enterobacteriaceae sinh carbapenemase
CRE
: Carbapenem resistant Enterobacteriaceae

: Enterobacteriaceae kháng carbapenem
DDST
: Double Disc Synergy Test
: Phương pháp đặt hai khoanh giấy
DNA
: Deoxyribonucleic acid
DPH
: Dehydropeptidase enzyme
EDTA
: Ethylenediaminetetraacetic acid
ESBL
: Extended-spectrum beta-lactamase
: Beta-lactamase phổ rộng
EUCAST
: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
: Ủy ban về thử nghiệm độ nhạy cảm kháng sinh của châu Âu.
FDA
: Food and Drug Administration
: Cục quản lý thục phẩm và dược phẩm Hoa Kì
GIM
: German imipenemase
IMI
: Imipenem hydrolyzing lactamase
IMP
: Imipenemase
CE-IVD
: Conformité Européenne-In Vitro Diagnostics
: Chứng chỉ cho các xét nghiệm chẩn đoán y tế của liên minh
châu Âu.
KPC

: Klebsiella pneumoniae carbapenemase
MALDI-TOF MS : Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass
spectrometry
:Máy định danh dựa trên khối phổ
MBLs
: Metallo-β-lactamases
mCIM
: Modified carbapenem inactivation method


MHA
MHT
MIC
MRSA
NDM-1
NMC
OXA
PBP
PCR
SIM
SME
SMP
TSB
VIM

: Kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến
: Müller-Hinton agar
: Thạch Muller Hinton
: Modified Hodge test
: : Kỹ thuật Hodge cải tiến

: Minimum inhibitory concentration
: Nồng độ ức chế tối thiểu
: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
: Tụ cầu vàng kháng methicillin
: New Delhi metallo-β-lactamase-1
: Not metalloenzyme carbapenemase
: Oxacillin-hydrolyzing
: Penicillin-binding protein
: Polymerase Chain Reaction
: Phản ứng trùng hợp chuỗi
: Seoul imipenemase
: Serratia marcescens enzyme
: Sao Paulo metallo-β-lactamase
: Trypton soya broth
: Canh thang trypton soya
: Verona integron–encoded metallo-β-lactamase


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH


7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, kháng kháng sinh đang là một trong những vấn đề nổi cộm

và nan giải của y tế thế giới. Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới công bố
năm 2017, các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem
được xếp vào nhóm đầu trong các vi khuẩn kháng thuốc nguy hiểm nhất [1].
Kháng sinh nhóm carbapenem là những kháng sinh có phổ kháng
khuẩn rộng nhất trong họ beta-lactam. Các kháng sinh thuộc nhóm này là một
trong những lựa chọn cuối cùng cho những trường hợp nhiễm khuẩn nặng và
đa kháng, đặc biệt là nhiễm trực khuẩn Gram âm đã kháng với hầu hết các
thuốc khác. Nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem thường là nhiễm khuẩn bệnh
viện. Việc điều trị cho các bệnh nhân này rất khó khăn vì các vi khuẩn này
thường chỉ còn nhạy với rất ít loại kháng sinh. Ở các nước phát triển, tỷ lệ tử
vong của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn này vẫn lên đến 50% [2], [3].
Hơn nữa, sự nguy hiểm của các vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng
carbapenem còn do cơ chế đề kháng rất đa dạng và khả năng lan truyền ngang
gen kháng thuốc của chúng. Theo cơ chế kháng carbapenem có thể chia làm 2
nhóm chính là Enterobacteriaceae sinh carbapenemase và Enterobacteriaceae
kháng carbapenem

không sinh carbapenemase. Nhóm sinh carbapenemase

chiếm số lượng lớn hơn và gây bệnh hậu nặng nề hơn, vì thế chúng cũng được
tập trung nghiên cứu nhiều [4]. Do tính chất đề kháng kháng sinh khác nhau giữa
các nhóm carbapenemase, việc phân loại Enterobacteriaceae theo nhóm
carbapenemase có ý nghĩa quan trọng trong dịch tễ cũng như trong lựa chọn
kháng sinh điều trị.
Ở nước ta hiện nay, các nghiên cứu về Enterobacteriaceae kháng
carbapenem chưa nhiều, đặc biệt là nghiên cứu về Enterobacteriaceae sinh
carbapenemase, cũng chưa có thống kê đầy đủ về tỷ lệ phân bố các gen sinh


8

carbapenemase. Ở bệnh viện Bạch Mai trước đây, Enterobacteriaceae kháng
carbapenem được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ, sau đó khả năng
sinh carbapenemase được phát hiện được bằng kỹ thuật Hodge cải tiến. Hiện
nay, theo khuyến cáo của CLSI 2018, kỹ thuật Hodge cải tiến bắt đầu được
thay thế bởi kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến [24]. Đây là phương pháp
dễ thực hiện, chi phí thấp, được CLSI khuyến cáo và có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, tuy nhiên phương pháp này còn chưa được áp dụng nhiều ở Việt
Nam nên cần được kiểm nghiệm thực tế.
Ở Việt Nam, việc xác định chính xác nhóm carbapenemase chỉ thực
hiện trong các nghiên cứu, không thực hiện thường quy trong các bệnh viện.
Để xác định nhóm carbapenemase, chúng tôi lựa chọn tìm hiểu phương pháp
sử dụng bộ khoanh giấy phối hợp D73C của Mast và phương pháp sử dụng
thẻ kháng sinh đồ NMIC-500 của BD có kết hợp phát hiện CPO
(Carbapenemase-Producing Organisms). Đây là 2 phương pháp đã có chứng
nhận IVD, dễ thực hiện với điều kiện trang thiết bị ở Bạch Mai, tuy nhiên
chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá trên thế giới. Chúng tôi lựa chọn 2 phương
pháp này nhằm đánh giá hiệu quả và tính khả thi của 2 phương pháp khi áp
dụng thực tế. Chúng tôi sử dụng PCR làm tiêu chuẩn đối chứng cho 2 phương
pháp, đồng thời lấy kết quả PCR để đánh giá tương đối tỷ lệ các nhóm gen
carbapenemase hiện nay.
Ngoài ra, dựa vào kết quả kháng sinh đồ của thẻ NMIC-500, chúng tôi
cũng đánh giá sơ bộ tình trạng đề kháng kháng sinh của các chủng
Enterobacteriaceae kháng carbapenem hiện nay.
Từ những mục tiêu trên chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Tìm hiểu cơ chế
đề kháng carbapenem do carbapenemase ở 100 chủng Enterobacteriaceae
kháng carbapenem bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến, khoanh
giấy phối hợp và PCR”

9

Với 2 mục tiêu sau:
1:

Phát hiện carbapenemase bằng kỹ thuật bất hoạt carbapenem cải tiến
và khoanh giấy phối hợp ở 100 chủng Enterobacteriaceae kháng
carbapenem phân lập tại bệnh viện Bạch Mai năm 2017-2018.

2:

Xác định gen mã hoá carbapenemase bằng kỹ thuật PCR.


10

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kháng sinh nhóm carbapenem:
1.1.1.Cấu trúc

Carbapenem thuộc nhóm beta-lactam, có đặc điểm khác với các betalactam khác ở vòng beta-lactam: vị trí 1 là C thay vì S, và có nối đôi ở C2 và
C3. Ngoài ra về cấu hình không gian, carbapenem có cấu hình trans, còn
penicillin hay cephalosporin có cấu hình cis. Chính các sự khác biệt này đã
làm cho carbapenem có đặc tính ưu việt là kháng được hầu hết các betalactamase [5], [6], [7].
Với các nhóm thế R1 khác nhau, sẽ cho các carbapenem khác nhau.

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học các kháng sinh nh`````````óm beta-lactam [6].

11

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học kháng sinh nhóm carbapenem [5].
1.1.2. Phân loại:
Hiện tại có 4 carbapenem đã được phê duyệt bởi FDA của Mỹ theo thứ tự
thời gian là: imipenem kết hợp cilastatin (1987), meropenem (1996), ertapenem
(2001) và doripenem (2007) [5], [6], [8], [9]. 4 thuốc này đều có mặt tại Việt
Nam [10]. Còn các thuốc khác chỉ được dùng ở một số nước hoặc đang trong
giai đoạn thử nghiệm [6].


12

Imipenem là kháng sinh đầu tiên của nhóm carbapenem. Imipenem bị
bất hoạt ở ống lượn gần của thận do bị phân cắt bởi men DPH-1
(dehydropeptidase enzyme), kết quả dẫn đến nồng độ thuốc ở dạng hoạt
động trong nước tiểu thấp và gây hoại tử ống lượn gần trên mô hình thử
nghiệm với thỏ. Vì vậy cần kết hợp với cilastatin, một chất ức chế
dehydropeptidase [6].
Imipenem - cilastatin có liên quan đến độc tính trên hệ thần kinh trung
ương, bao gồm sự thay đổi trạng thái tinh thần, rung giật cơ, và đặc biệt là co
giật. Những tác động này đặc biệt rõ rệt ở những bệnh nhân có bệnh lý thần
kinh trung ương hoặc suy thận [6].
Meropenem có phổ kháng khuẩn tương tự như imipenem. Tuy nhiên, khác
với imipenem, meropenem ổn định hơn với men dehydropeptidase ở thận, vì
vậy có thể có tác dụng mà không cần kết hợp với cilastatin. Meropenem ít có
nguy cơ gây động kinh hơn imipenem-cilastatin [6].
Ertapenem là một carbapenem thế hệ mới với phổ kháng khuẩn hẹp hơn so
với imipenem hoặc meropenem. Ertapenem có tác động trên Enterobacteriaceae
và các vi khuẩn yếm khí, nhưng kém hơn so với các carbapenem khác trên P.

aeruginosa, Acinetobacter, và các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là vi khuẩn
đường ruột và phế cầu kháng penicillin. Ưu điểm chính của ertapenem so với
các carbapenem khác là thời gian bán hủy kéo dài và có thể được dùng một
lần mỗi ngày [6].
Doripenem được FDA chấp thuận năm 2007 để điều trị nhiễm trùng đường
tiểu dạng phức tạp và nhiễm trùng ổ bụng . Phổ kháng khuẩn tương tự như
imipenem, tác dụng trên vi khuẩn Gram dương tốt hơn meropenem [6].
1.1.3. Cơ chế tác động
Kháng sinh nhóm carbapenem có cùng cơ chế tác động của nhóm betalactam là gắn và làm bất hoạt PBP (penicillin-binding protein : enzym xúc tác


13

cho sự nối peptidoglycan để tạo vách vi khuẩn), từ đó làm ức chế tổng hợp
vách tế bào vi khuẩn, dẫn đến ly giải vi khuẩn nên có tác dụng diệt khuẩn.
Mỗi carbapenem có ái lực đặc hiệu với các dưới nhóm penicillin-binding
protein khác nhau (PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3, PBP4…), vì vậy hiệu lực
kháng khuẩn của mỗi CP khác nhau và khác với β -lactam khác [5], [6], [7],
[8], [9].
Imipenem có ái tính cao với PBP2, tiếp sau là PBP1a và PBP1b, nhưng
gắn kém với PBP3[1].
Meropenem và ertapenem gắn mạnh nhất với PBP2, sau đó là PBP3,
PBP1a và PBP1b[1].
Ái lực của Doripenem với PBP khác nhau theo từng loài: gắn mạnh
với , PBP3 của P. aeruginosa, PBPs 1, 2 và 4 của S. aureus; PBP2 của
Escherichia coli [5].
Nhờ đặc tính không bị phân hủy bởi hầu như tất cả β -lactamase (bao
gồm AmpC β-lactamase và ESBL), carbapenem diệt được cả các vi khuẩn
Gram âm kháng với các beta-lactam khác (ví dụ cephalosporin III). Vì vậy,
carbapenem có tác dụng diệt khuẩn, phổ rộng nhất trong các beta-lactam: cả

vi khuẩn Gram âm và Gram dương, cả ưa khí và kỵ khí [5], [6], [7], [8], [9],
[10], [11].
1.1.4. Cơ chế đề kháng carbapenem của vi khuẩn:
Vi khuẩn đề kháng carbapenem thường được chia làm 2 nhóm theo cơ
chế: sinh carbapenemase và không sinh carbapenemase :
Các men carbapenemase ( chia làm 3 nhóm A, B, D) có khả năng phân
hủy tất cả penicilin, cephalosporin, carbapenem và monobactam, mức độ và
phổ phân hủy tùy thuộc vào từng loại enzym.
Nhóm không sinh carbapenemase thường có cơ chế :


14

Đề kháng tự nhiên: do carbapenem có ái tính thấp với PBP2a nên ít tác
động tới tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA), hay tương tự với PBP5 của
E. faecium [5], [8].
Khả năng đề kháng của các carbapenem khác nhau với các betalactamase không như nhau. Ertapenem là carbapenem dễ bị kháng nhất. Các
chủng E. coli và Klebsiella pneumoniae sinh beta-lactamases phổ rộng
(ESBL) hay Enterobacter spp. và Serratia marcescens sinh AmpC betalactamase có khả năng kháng với ertapenem [5], [8].
Đột biến gây mất porin OprD, thường phối hợp với tăng sinh men
AmpC β-lactamase dễ gây kháng imipenem và ertapenem [5], [8].
Đột biến tăng hệ thống bơm MexA-MexB-OprM, gây đẩy meropenem
và doripenem ra ngoài vi khuẩn [5], [8].
1.1.5. Chỉ định điều trị
Vì đây là nhóm kháng sinh phổ rất rộng, nên nó được dành để điều trị các
nhiễm khuẩn vừa và nặng, không đáp ứng với kháng sinh khác, đặc biệt là trong
các nhiễm khuẩn trực khuẩn Gram âm đa kháng (sinh ESBL, AmpC βlactamase) [5], [6], [8], [9], [10]:
Bảng 1.1. Bảng chỉ định điều trị của kháng sinh nhóm carbapenem [5].
Thuốc

FDA chấp thuận

Ghi chú

Doripenem

-Nhiễm trùng đường tiểu có biến chứng bao gồm Phổ

kháng

(Doribax)

cả viêm thận bể thận gây bởi E. coli, Klebsiella khuẩn tương
pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas đương
aeruginosa, Acinetobacter baumannii.

imipenem/

-Nhiễm trùng ổ bụng có biến chứng gây bởi E. coli, cilastatin và
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, meropenem
Bacteroides caccae, B. fragilis, B. thetaiotaomicron,


15

B. uniformis, B. vulgatus, Streptococcus intermedius,
S. constellatus, Peptostreptococcus micros
-FDA đang thông qua với viêm phổi bệnh viện
Ertapenem

-Nhiễm trùng ổ bụng có biến chứng do E.coli, Phổ rộng hơn

(Invanz)

Clostridium clostridioforme, Eubacterium lentum, đối với nhiễm
Peptostreptococcus species, Bacteroides fragilis, trùng
Bacteroides

distasonis,

Bacteroides

cộng

ovatus, đồng so với

Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis

nhiễm

trùng

-Nhiễm trùng da và mô dưới da có biến chứng do bệnh
S. aureus (không phải MRSA), Streptococcus Không

viên.

pyogenes, E. coli, các loài Peptostreptococcus.
-Viêm

phổi

cộng

đồng

do

Streptococcus

pneumoniae (chủng nhạy với penicillin) kể cả có
nhiễm khuẩn huyết, H. influenzae (chủng không
có beta-lactamase), Moraxella catarrhalis.
-Nhiễm khuẩn đường tiểu có biến chứng (gồm cả
viêm thận bể thận) do E.coli, kể cả có nhiễm
khuẩn huyết, hay Klebsiella pneumoniae.
- Nhiễm trùng vùng tiểu khung cấp tính bao gồm
viêm nội mạc tử cung sau sinh, nhiễm trùng sau phá
thai, và các bệnh nhiễm khuẩn phụ khoa sau phẫu
thuật

do

Bacteroides

Streptococcus
fragilis,

agalactiae,

E.

coli,

Porphyromonas

asaccharolytica, Peptostreptococcus sp., Prevotella
bivia

bao

gồm
Pseudomonas
hay
Acinetobacter


16

Imipenem/

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới do S.auerus Nguy cơ cao

cilastatin

(chủng

(Primaxin)

Enterobacter

sinh

penicillinase),
sp.,

E.coli,

Acinetobacter
H.

influenzae,

sp., nhất gây động
H. kinh. Yếu tố

parainfluenzae, Klebsiella sp., Serratia marcescens.

nguy

cơ

là

-Nhiễm khuẩn tiết niệu ( có hoặc không có biến bệnh lí thần
trung
chứng) do Enterococcus faecalis, S. aureus (chủng kinh
trước
sinh penicillinase), Enterobacter sp., E. coli, ương
Klebsiella sp., Morganella morganii, Proteus đó, suy thận,

vulgaris,

Providencia

rettgeri,

Pseudomonas liều cao.

aeruginosa

Không dùng

-Nhiễm trùng ổ bụng do Enterococcus faecalis, S. cho MRSA
aureus (chủng sinh penicillinase), S. epidermidis,
Citrobacter

sp.,

Enterobacter

sp.,

E.

coli,

Klebsiella sp., Morganella morganii, Proteus sp.,
Pseudomonas aeruginosa, Bifidobacterium sp.,
Clostridium sp., Eubacterium sp., Peptococcus
sp., Peptostreptococcus sp., Propionibacterium

sp., B. fragilis, các chủng Bacteroids khác.
-Viêm nhiễm phụ khoa do Enterococcus faecalis,
S.

aureus

(chủng

sinh

penicillinase),

S.

epidermidis, Group B streptococci, Enterobacter
sp., E. coli, Gardnerella vaginalis, Klebsiella sp.,
Proteus sp., Bifidobacterium sp., Peptococcus sp.,
Peptostreptococcus sp., Propionibacterium sp., B.
fragilis, các chủng Bacteroids khác
-Nhiễm khuẩn huyết do Enterococcus faecalis, S.


17

aureus (chủng sinh penicillinase), S. epidermidis,
Enterobacter sp., or Pseudomonas aeruginosa
-Nhiễm trùng da, mô dưới da do Enterococcus
faecalis, S. aureus (chủng sinh penicillinase), S.
epidermidis, Acinetobacter sp., Citrobacter sp.,
Enterobacter

sp.,

E.

Morganella

morganii,

coli,

Klebsiella

Proteus

sp.,

vulgaris.,

Providencia rettgeri, Pseudomonas aeruginosa,
Serratia sp., Peptococcus sp., Peptostreptococcus
sp., Propionibacterium sp., B. fragilis, Bacteroids
sp., Fusobacterium sp.
-Viêm nội tâm mạc do S. aureus (chủng sinh
penicillinase).
-Thay cho penicillin G trong nhiễm trùng đa
khuẩn liên quan tới Streptococcus pneumoniae, S.
pyogenes, or S. aureus (chủng không sinh
penicillinase)
Meropenem

-Nhiễm trùng da, mô dưới da do Enterococcus Carbapenem

(Meronem)

faecalis (chủng nhạy vancomycin), S. aureus duy nhất dùng
(chủng nhạy methicillin), Streptococcus pyogenes, cho

viêm

streptococci nhóm B, viridans streptococci, E. màng não
coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis,
Peptostreptococcus sp., B. fragilis.
-Viêm ruột thừa và viêm phúc mạc do viridans
streptococci, E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Peptostreptococcus sp.,


18

B. fragilis, B. thetaiotaomicron.
-Viêm màng não ở trẻ trên 3 tháng tuổi do
Streptococcus pneumoniae (hiệu quả đơn trị liệu
chưa được kiểm chứng), Neisseria meningitides,
H. influenzae.

1.2. Enterobacteriaceae kháng carbapenem
1.2.1.Định nghĩa
Định nghĩa Enterobacteriaceae kháng carbapenem theo CDC năm 2015
[2] là Enterobacteriaceae có:

+ Đề kháng bất kì kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (nghĩa là, MIC 4
µg/ml với doripenem, meropenem, hay imipenem hoặc 2 µg/ml với ertapenem).
+ Hoặc: Được chứng minh là sinh carbapenemase.
+ Ngoài ra: Với những vi khuẩn đề kháng tự nhiên với imipenem (như:
Morganella morganii, Proteus spp., Providencia spp.), cần kháng thêm với
kháng sinh thuộc nhóm carbapenem khác, không phải imipenem.
1.2.2. Cơ chế đề kháng và phân nhóm:
Thường chia làm 2 nhóm chính theo cơ chế đề kháng carbapenem: sinh
men carbapenemase và không sinh carbapenemase:
1.2.2.1.Nhóm sinh carbapenemase:
Chia làm 3 lớp [12], [13]:
+ Lớp A carbapenemase gồm chủ yếu là các enzyme NMC (not
metalloenzyme carbapenemase), IMI (imipenem-hydrolyzing-lactamase),
SME

(Serratia

marcescens

enzyme),

KPC

(Klebsiella

pneumoniae

carbapenemase). Các enzym này thường hay gặp ở các chủng Enterobacter

19

cloacae, Serratia marcescens, Klebsiella spp. Chúng đều có khả năng thủy
phân nhiều loại β-lactam như: carbapenems, cephalosporins, penicillins,
aztreonam, và đều bị ức chế bởi acid clavulanic, tazobactam. KPC là enzyme
thường gặp nhất trong lớp này [12].
+ Lớp B metallo-β-lactamases (MBLs) gồm :Verona integron–encoded
metallo-β-lactamase (VIM), imipenemase (IMP), New Delhi metallo-βlactamase-1 (NDM-1),German imipenemase (GIM), Seoul imipenemase
(SIM), Sao Paulo metallo-β-lactamase (SMP). Phần lớn các enzyme này thủy
phân được cephalosporins và penicillins nhưng không thủy phân aztreonam.
Do cơ chế thủy phân phụ thuộc vào trung tâm hoạt động chứa ion Kẽm nên bị
ức chế bởi EDTA và các cation tạo chelat với Zn2+[12].
+ Lớp D gồm các OXA (oxacillin-hydrolyzing) β-lactamases, thường
được mã hóa trên plasmid, hay gặp ở các chủng Enterobacteriaceae, P.
aeruginosa và A. baumannii. Enzym lớp D thủy phân carbapenem yếu, và khả
năng thủy phân cephalosporins phổ rộng rất yếu. Tuy nhiên, chúng không bị
ức chế bởi EDTA hay acid clavulanic. Vì tính thủy phân yếu carbapenem việc
xác định carbapenemase thuộc lớp này là khó nhất [12].
1.2.2.2.Nhóm không sinh carbapenemase:
Thường là cơ chế kếp: sinh enzym AmpC hoặc ESBL kết hợp với đột
biến mất porin hoặc tăng bơm đẩy carbapenem ra ngoài tế bào [12].
1.3. Các phương pháp xác định Enterobacteriaceae sinh
carbapenemase
1.3.1. Các phương pháp dựa trên kiểu hình
- Kỹ thuật Hodge cải tiến: Nguyên lí dựa trên sự thủy phân carbapenem
của enzym carbapenemase. Kết quả dương tính khi chủng chỉ thị (nhạy với
carbapenem) mọc trong vùng ức chế của khoanh giấy carbapenem, cạnh
đường ria của chủng Enterobacteriaceae sinh carbapenemase, tạo nên hình

20

cánh hoa thị. Kỹ thuật Hodge cải tiến có độ nhạy tốt với carbapenemase lớp A
và lớp D, nhưng kém nhạy với lớp B. Kỹ thuật này có thể có kết quả dương
tính giả (đặc biệt với các chủng tăng sản AmpC hoặc ESBL kết hợp với đột
biến mất porin), âm tính giả với các chủng sinh NDM [15].


21

Hình 1.3. Kỹ thuật Hodge cải tiến [16]:
1-chứng dương, 3-mẫu dương, 2-chứng âm.
- Phương pháp dựa trên sự phối hợp kháng sinh với các chất ức chế:
Nguyên lí chung là dựa trên tác dụng ức chế từng loại men carbapenemase
của các loại chất khác nhau, phối hợp cùng với kháng sinh carbapenem [15],
cụ thể:
+ Etest MBL: So sánh sự đề kháng của các chủng Enterobacteriaceae
kháng carbapenem với imipenem và imipenem kết hợp EDTA nhằm phát hiện
các chủng MBLs (dựa trên tác dụng ức chế của EDTA với MBLs) [15].


22

Hình 1.4. Etest MBL [17]
+ Kỹ thuật khoanh giấy phối hợp: so sánh vùng ức chế của khoanh
giấy carbapenem với khoanh giấy carbapenem có bổ sung chất ức chế
carbapenemase trên thạch Muller–Hinton [18].
+ Kỹ thuật 2 khoanh giấy: Đặt khoanh giấy carbapenem với khoanh
giấy chứa chất ức chế ở các khoảng cách khác nhau. Nhận định kết quả dựa
trên vùng giao thoa giữa 2 khoanh giấy [18].

Hình 1.5. Kỹ thuật khoanh giấy phối hợp (phải) và 2


23
khoanh giấy (trái) [19]
+ Phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc: Nguyên lí là nuôi
cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc (có sẵn kháng sinh carbapenem) để
sàng lọc và phân lập Enterobacteriaceae kháng carbapenem. Có thể tự đổ
thạch MacConkey với 10 ug carbapenem hoặc dùng các môi trường thương
mại như CHROMagar KPC, ChromID ESBL, ChromID CARBA,
Brilliance™ CRE Agar, SUPERCARBA [18].

Hình 1.6: Đĩa ChromID CARBA: chủng E. coli ATCC®* 1011230 (NDM1)
màu đỏ, chủng K. pneumoniae ATCC®* BAA17052 (KPC) màu xanh [20].
- Kỹ thuật bất hoạt carbapenem và kỹ thuật carbapenem cải tiến: Có
cùng nguyên lí dựa vào khả năng sinh carbapenemase của vi khuẩn. Ủ khoanh
giấy carbapenem trong canh thang chủng xét nghiệm, sau đó đặt khoanh giấy
vào đĩa cấy chủng chỉ thị. Nếu không có carbapenemase, vùng ức chế của
khoanh giấy sẽ không bị giảm [18].


24

Hình 1.7. Kỹ thuật bất hoạt carbapenem [21].
- Phương pháp dựa trên tính chất sinh vật hóa học:
+ Sử dụng MALDI-TOF MS: Phát hiện các sản phẩm từ sự phân hủy
carbapenem thông qua sự thay đổi của khối phổ [18].
+ Carba NP test: Dựa trên sự thay đổi pH của môi trường khi
Enterobacteriaceae phân hủy carbapenem [18].

25

Hình 1.8: Cơ chế Carba NP test [22].
1.3.2. Các phương pháp dựa trên kiểu gen:
- PCR: phát hiện các gen sinh carbapenemase dựa vào các cặp mồi
đặc hiệu [15].
- Sequence: Giải trình tự các đoạn gen sinh carbapenemase hoặc giải
trình tự toàn bộ chuỗi DNA vi khuẩn [18].
- Microarray: phương pháp cải tiến: dùng sản phẩm của PCR, lai phân
tử hàng loạt để tìm các gen sinh carbapenemase [18].