ĐẶC TRƯNG CỦA LOÀI STREPTOMYCES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ LỚP MỎNG BỀ MẶT BIỂN (SML) Ở VỊNH TRONDHEIM,NA UY
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.39 MB, 50 trang )
ĐẶC TRƯNG CỦA LOÀI STREPTOMYCES ĐƯỢC PHÂN
LẬP TỪ LỚP MỎNG BỀ MẶT BIỂN (SML) Ở VỊNH
TRONDHEIM,
NA UY
GVHD: Phan Thị Huyền
Thực hiện: Nhóm 10
DANH SÁCH THÀNH VIÊN
1. Đỗ Thị Xuân Uyên
2.Nguyễn Thị Thu Trinh
3.Châu Mỹ Nga
1513982
1513639
1512109
4.Nguyễn Thị Bích Duyên 1510531
5. Nguyễn Đoàn Nam Sơn
1512837
NỘI DUNG
1. Đặt vấn đề
2. Phương pháp tiến hành
3. Kết quả thu được
4. Kết luận
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tìm kiếm các sản phẩm bậc hai mới từ vi khuẩn có hoạt tính sinh học rất
quan trọng => đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về thuốc kháng sinh mới.
Xạ khuẩn (Actinomycetes), đặc biệt từ chi Streptomyces sản xuất lượng lớn
hợp chất có hoạt tính sinh học..
Các vi khuẩn Streptomyces có khả năng ra khoảng 70% các sản phẩm tự
nhiên đặc trưng cho loài Actinomycete.
Tuy nhiên, phần lớn các vi khuẩn Streptomyces đặc trưng đến nay
vẫn được phân lập từ môi trường trên cạn.
Gần đây, đã phát hiện các vi sinh vật biển, có rất nhiều trong môi
trường nước dinh dưỡng trung bình, giàu dinh dưỡng hoặc trong
quá trình nở hoa của sinh vật phù du.
Hạt thường tích tụ ở bề mặt biển.
Neuston là một tên của nhóm các dạng sống trong lớp bề mặt của đại dương
và hồ, và có thể được chia thành Epineuston và Hyponeuston.
Các sinh vật Epineuston sống trên đỉnh mặt nước, và tự nhiên phụ thuộc vào
sức căng bề mặt của nước.
Sinh vật Hyponeuston sống trong vài cm đầu của cột nước.
Mật
độ vi khuẩn có hoạt tính chuyển hóa cao, thường được gọi là
bacterioneuston, được tìm thấy trong SML.
Các vi sinh vật này đã được chọn lọc tự nhiên và phát triển được trên môi trường
biển ở Na Uy với điều kiện thời tiết lạnh và khắc nghiệt.
Trong
nghiên cứu này, đã phân lập vi khuẩn Streptomyces từ SML ở vịnh
Trondheim (Na Uy)
2. Phương pháp tiến hành
2.1 Lấy mẫu và cô lập vi khuẩn Streptomyces từ màng mỏng trên bề
mặt biển
Thời gian: 22/3/2004
Địa điểm: vịnh Trondheim, Na Uy
-Steinvikholmen
(mẫu 1) là một hòn đảo nhỏ nằm cách lục địa khoảng 200 m,
trong khi đó điểm lấy mẫu khác ở gần bờ.
-Các màng mỏng trên bề mặt biển
được thu thập bằng cách sử dụng
các0 tấm Teflon như mô tả trước đó
Nhiệt độ nước 4,3
-Các tấm được ngâm trong nước,
nhẹ nhàng nhấc lên qua mặt nước,
và các vi khuẩn bám vào một cạnh
cao su.
Thu thập mẫu
Trữ và ủ
•
•
•
24h
o
-20 C
trên các đĩa agar (2% w/v)
Nuôi trên 3 môi trường
phân lập khác nhau
Chuyển mẫu sang môi trường
•
½ISP2
Trữ trong micro-well
•
ủ trong 16 ngày
- 80° C
Ba môi trường khác nhau đã được sử dụng:
•
½ ISP2: Chiết xuất mạch nha (5 g), chiết xuất nấm men (2 g), glucose (2 g), nước
biển tự nhiên (0.5 L) và nước cất (0.5 L)
•
Môi trường phân lập Kusters treptomycete (đã chỉnh sửa): Glycerol (10 g), Casein
(0.3 g), KNO3 (2 g), FeSO4.7H2O (0.25 mg), H2SO4 (0.5mg), nước biển tự nhiên (0.5
L) và nước cất (0.5 L).
•
Môi trường phân lập Actinomycete không có MgSO4. (Sách)
pH của môi trường phân lập được điều chỉnh đến pH = 8,2.
Chủng được lựa chọn
•
Nuôi cấy
hạt thủy tinh 3 mm
3 môi trường khác nhau có 1%
agarose (PM)
Ủ
Sấy khô
•
Trong tối để qua đêm
Chiết
•
DMSO
Ly tâm
•
•
1000 vòng/phút
2 giờ
Lọc chân không
Dịch chiết
Trữ
Thử nghiệm
•
-20
•
Trên 3 loại: Micrococcus luteus (M), Candida
°C
albicans (C) và Escherichia coli K12 (E).
Điều chế chỉ thị
Agarose
•
3 môi trường
•
2 μL dịch chiết
dày 1,3 cm
Chỉ thị Agarose
Ủ sơ bộ
Ủ
•
•
3 đến 4 giờ
4 °C
• -30 °C
qua đêm.
2.2. Tách dòng, giải trình tự và phân tích phát sinh loài
DNA
PCR
Tinh sạch
PCR
Primer: BP_F27 và BP_R1492
QIAquick Spin Kits
E. Coli
PCR
Vector pDrive
Primer M13 reverse
Tinh sạch
BLAST
Cây phát sinh
loài
MEGA 4
2.3. Khuếch đại PCR của gen PKS và NRPS
Mồi thoái hóa:
Gene PKS I của vi
KSMA-F và KSMB-R
khuẩn
0
96 C, 5 phút
Lặp lại 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ:
PCR khuếch đại KS
(β-ketoacyl synthase)
Xác định trình tự 16S rDNA
•
•
•
0
95 C, 1 phút
0
60 C, 1 phút
0
72 C, 2 phút
Cty Eurofins MWG Operon
Một tỷ lệ lớn các sinh vật Neuston Actinomycetes sản xuất được chất
kháng sinh
Bảng 1. Kết quả phân lập vi khuẩn trong môi trường có 50% nước biển
Cycloheximide và acid nalidixic
Mẫu
được thêm vào để ức chế sự
Phỏng đoán: Actinomycetes
phát triển của nấm và vi khuẩn
(dựa vào hình thái)
Khuẩn lạc
Gram âm
Åsenfjord
3
2,5x10 (tế bào/ml)
2
9,8x10 (tế bào/ml)
134
Steinvikholmen
4
1,2x10 (tế bào/ml)
3
1,3x10 (tế bào/ml)
83
Số lượng vi khuẩn Gram dương:
•
•
3
Pháp 2,3x10 tế bào/ml
4
Tây Ban Nha 3,0x10 tế bào/ml
Dựa vào hình thái khuẩn lạc mà các chủng phân lập có thể được chia thành 10
nhóm, được thể hiện trong Bảng 2
Bảng 2.Đặc điểm của các nhóm phân lập khác nhau, khi nuôi trên môi trường ½ISP2 với 50%
nước biển trong 14 ngày
Đặc điểm
STT
Khuẩn ty cơ chất
Khuẩn ty khí sinh
Khác
1
Không màu
Trắng
2
Không màu
Trắng
3
Không màu
Xanh lục – Trắng
4
Không màu
Xanh lục – Trắng
5
Nâu nhạt
Xám nhạt
6
Màu nâu / xanh lục
Xám
7
Không màu / nâu nhạt
Tím nhạt
8
Đỏ
Không có
9
Đỏ
Trắng
Xốp, dễ bong
Vàng
Không có
10
Sản sinh chất chuyển hóa màu vàng
khuếch tán trong môi trường rắn
Sản sinh chất chuyển hóa màu vàng
khuếch tán trong môi trường rắn
So sánh trên hai môi trường có và không có 50% nước biển
o
Hình 1. Sự tăng trưởng của actinomycetes bị cô lập sau 7 ngày nuôi cấy ở 30 C trên môi trường ½ ISP2
(A) có 50% nước biển - (B) không có 50% nước biển.
Sau khi tế bào được làm khô và chiết xuất với DMSO, các thử nghiệm thực
hiện với các sinh vật kiểm định: Micrococcus luteus (M), Candida albicans (C)
và Escherichia coli K12 (E).
Bảng 3. Tổng số chủng giống như streptomycete từ bacterioneuston, mẫu 1 và 2, nhóm
và phân nhóm theo hoạt tính kháng khuẩn và hình thái khuẩn lạc. Chiết xuất DMSO từ
tất cả các chủng được kiểm tra hoạt tính chống lại C. albicans (C), M. luteus (M) và E. coli
(E). Các mẫu 1 và 2 chứa 134 và 83 chủng, mẫu 1 và mẫu 2 tương ứng là S1 và S2, và
G1-G10 cho biết nhóm hình thái 1- 10. Các tỷ lệ phần trăm về hoạt tính kháng nấm,
kháng khuẩn và không có hoạt tính trong mỗi nhóm .
Nhóm (G1-10) và mẫu S1, S2
Sự ức chế
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
Nr
C
M
E
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
S1
S2
Total
1
X
X
X
6
7
0
1
5
0
2
0
1
0
0
0
0
0
1
4
0
2
0
0
29
2
X
X
6
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8
3
X
X
9
4
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
14
4
X
28
14
4
0
0
2
0
0
4
3
3
3
0
0
0
1
0
0
0
0
62
5
X
X
4
7
1
3
2
2
7
2
1
0
0
1
0
0
2
8
3
1
1
0
45
6
X
5
2
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
11
7
X
2
0
0
0
0
0
4
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8
8
12
7
2
0
1
0
0
0
5
4
7
2
0
0
0
0
0
0
0
0
40
72
42
7
4
8
5
13
2
13
8
11
6
2
0
3
13
3
3
2
0
217
Tổng
Tổng
Tính kháng nấm
(%)
Tính kháng khuẩn
(%)
Không hoạt tính
(%)
114
11
13
15
21
17
2
16
6
2
66
45
54
13
43
41
0
38
33
0
46
45
77
100
24
12
100
94
100
100
17
18
8
0
43
53
0
0
0
0
Phân tích 16S rDNA từ vi khuẩn được phân lập cho thấy sự khác nhau nhóm
kiểu hình và phân loại phân tử.
Hình . Cây phát sinh loài được
xây dựng cho một phần các
trình tự 16S rDNA của 46 chủng
Streptomycetes được phân lập
từ lớp mỏng bề mặt ở vịnh
Trondheim, Na Uy
•
(x-y-z): x. nhóm hình thái,
y. kiểu ức chế, z. số mẫu
•
•
Mũi tên: nhánh
Chữ đậm: chuỗi đại diện
cho một số chủng phân lập
