ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC BỆNH NHÂN UNG THU TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN:
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC
BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội- 2019


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC
BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.Nguyễn Hải Hà
Hà Nội- 2019


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể
di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” là công trình nghiên cứu của
cá nhân tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc
công bố trong các công trình khác. Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tôi xin hoàn
toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.
Hà Nội,

tháng năm 2019
Học viên

Nguyễn Thị Thanh Hoa

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy - ngƣời chị không
chỉ hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà còn trong cuộc
sống hàng ngày. Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng
cho tôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này.
Tôi cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tôn –Trƣởng
Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền
Thƣơng và Ths. Trần Thị Bích Ngọc đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Qua đây tôi cũng xin cảm ơn tất cả các
cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt
thời gian tôi thực tập tại đây. Để có đƣợc những hiểu biết về kiến thức chuyên
ngành, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo ở khoa Công nghệ sinh học Học viện Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích
trong suốt 2 năm học qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian
thực tập để hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
UNBVM

U nguyên bào võng mạc

RB1

Retinoblastoma 1

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

cDNA

Complement deoxyribonucleic acid

mRNA

Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin

bp

Base pair

dNTPS

Deoxyribonucleotide Triphosphate

PCR

Polymerase chain reaction

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

UV

Ultra violet

TAE

Tris-axit axetic-EDTA

qPCR

Quantitative polymerase chain reaction

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO

Dimethyl sulfoxide


Danh mục các bảng biểu và hình ảnh
BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng

mạc ............................................................................................................................. 8
Bảng 1.2 Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn . …….10
Bảng 1.3 Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia đình
có trẻ bị UNBVM ..................................................................................................... 14
Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR……………………….……26
Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng của các đối tƣợng nghiên cứu. .................................. 36
Bảng 3.2 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu bệnh nhi UNBVM. ......................... 40
Bảng 3.3 Đột biến RB1 đƣợc xác định ở bệnh nhân UNBVM bằng phƣơng pháp
giải trình tự Sanger .......……………………………………………………………44
Bảng 3.4 Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao. .............................................. .47
Bảng 3.5 Các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1 đƣợc xác định bằng phƣơng
pháp MLPA…………………………………………………………………......49
HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của UNBVM .................................................................. 7
Hình 1.2 Hình ảnh cắt lớp vi tính của UNBVM ........................................................ 7
Hình 1.3 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào ....................................... 12
Hình 1.4 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào ....................................... 12
Hình 1.5 Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1 .................. 16
Hình 1.6 Tái tổ hợp trong nguyên phân ................................................................... 17
Hình 1.7 Hoạt động bất thƣờng của DNA polymerase trong sao ch p DNA .......... 18
Hình 1.8 Sự phân chia bất thƣờng của nhiễm sắc thể trong nguyên phân ............... 19


Hình 1.9 Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13.................................................... 19
Hình 1.10 Cấu trúc gen và protein RB1 ................................................................... 20
Hình 3.1 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu
bệnh nhân và gia đình .............................................................................................. 39
Hình 3.2 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM ...................... 42
Hình 3.3 Sơ đồ biểu diễn các đột biến trên gen RB1 đƣợc phát hiện ở 23 bệnh
nhân. ......................................................................................................................... 44

Hình 3.4 Kết quả dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau khi phân tích MLPA…49
Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự các đột biến mới đƣợc phát hiện ở bệnh
nhân UNBVM .......................................................................................................... 52
Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ của các gia đình mắc UNBVM. .......................................... 53


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC ............ 4
1.1.1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam......... 4
1.1.2. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM. ...................................................... 6
1.1.3. Chẩn đoán UNBVM. ........................................................................... 6
1.1.4. Phân loại UNBVM .............................................................................. 8
1.1.5. Điều trị UNBVM............................................................................... 10
1.1.6. Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc ................ 13
1.1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc......................................... 15
1.1.7.1.

t

p tron n u n p n ........................................................... 17

1.1.7.2. Hoạt độn
1.1.7.3.

p n

tt

n
tt

N po m r s tron t n
n

n

ms

t

p N .. 17

..................................... 18

1.2. GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1........................................................................... 19
1.3. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT
SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM ........................................................................................................... 21
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU ..... 23
2.1. VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU ........................................................................... 23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................ 23
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị ....................................................................... 23


2.1.3. Hóa chất............................................................................................. 24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU ................................................................. 24
2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ........................................................................ 25
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA genomic............................................. 25

2.2.3. Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR) ................................................. 26
2.2.4. Phƣơng pháp giải trình tự gen ........................................................... 30
2.2.5. Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA) .......................................................................................................... 31
2.2.6. Phƣơng pháp phân t ch kết quả ......................................................... 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 36
3.1. KẾT QUẢ ...................................................................................................... 36
3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu .................................................................. 36
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................... 39
3.1.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1 ................................................... 41
3.1.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1 ................................. 43
3.1.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA .................................... 46
3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................ 50
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 55
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 56


MỞ ĐẦU
U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính
mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1
(retinoblastoma 1). UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ
tƣơng ứng với khoảng 9000 trƣờng hợp mới mỗi năm, bệnh xảy ra ở cả hai giới
tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8]. Trên thế giới,
ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Tỷ lệ tử
vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%) do
khoảng cách về tiếp cận y tế [9]. Hầu hết các trƣờng hợp UNBVM đều liên quan
đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp chế khối u RB1 nằm trên nhiễm
sắc thể số 13 [7]. Khoảng 40% trẻ UNBVM là thể di truyền trong khi 60%
trƣờng hợp còn lại là thể không di truyền [10]. RB1 là gen áp chế khối u đầu tiên

đƣợc tìm thấy, nằm tại vị tr 13q14.2, có k ch thƣớc DNA là 183 kb. Cho đến
nay, hơn 1750 đột biến gen RB1 khác nhau phát hiện đƣợc ở bệnh nhân UNBVM
và đã đƣợc công bố trên ngân hàng dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene
Mutation Database) [11], và các đột biến gen RB1 gây bệnh UNBVM không
đồng nhất và xuất hiện rải rác trên vùng promoter và 27 exon. Việc xác định đột
biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM và gia đình là cơ sở để thực
hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tƣ vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.
Việc chẩn đoán sớm và phƣơng pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan
trọng trong việc tiên lƣợng và khả năng sống sót của bệnh nhân UNBVM [12]. Ở
các nƣớc phát triển, mục tiêu của điều trị là bảo tồn thị lực và việc kiểm tra gen
RB1 đã đƣợc áp dụng nhƣ là một kiểm tra định kì ở nhóm bệnh nhân UNBVM
[13-16]. Ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ
cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Mặc dù rất nhiều kinh ph đã đƣợc đầu tƣ cho việc
1


phát triển các kỹ thuật điều trị lâm sàng nhƣng phát triển các kĩ thuật sinh học
phân tử phục vụ chẩn đoán sớm của bệnh UNBVM gần đây mới thực sự phát
triển. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã
cho thấy vai trò của yếu tố di truyền với khả năng sinh bệnh, do đó việc phát
hiện sớm đột biến trên gen RB1 đóng vai trò quan trọng trong quản lý lâm sàng
cũng nhƣ dự đoán nguy cơ mắc bệnh của các thành viên trong gia đình ngƣời
bệnh. Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã
đƣợc thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử
và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tƣ vấn
di truyền hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho
gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có ngƣời mắc bệnh nhƣ
cha/mẹ hay anh/chị em ruột.
Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột
biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” đƣợc tiến

hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em
mắc u nguyên bào võng mạc. Nội dung nghiên cứu nhƣ sau:
 Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung
ƣơng, và ngƣời thân trong gia đình nhƣ mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có).
 Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại
vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của gen
RB1.
 Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1.
 Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại Việt
Nam.

2




nghĩa của đề tài: Nghiên cứu này bƣớc đầu tao ra cơ sở dữ liệu đột biến
gen của bênh nhân UNBVM ở Việt Nam. Kết quả thu đƣợc có thể làm sáng
tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn
đoán, chữa trị và tƣ vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình ngƣời bệnh
UNBVM.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC

1.1.1.

Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam

U nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát
sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi,
gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Có khoảng 9000 trƣờng hợp
UNBVM mới đƣợc phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến
1/20000 trẻ tƣơng ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ
thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001
đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Mỗi năm có 175.000 ca UNBVM
mắc mới đƣợc phát hiện ở các nƣớc đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dƣới
15%. Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai
thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y
tế [9]. Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý
UNBVM theo nguyên tắc ƣu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe &
Vision) [9, 17].
Ở Việt Nam, chƣa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc UNBVM hàng năm. Tại
Bệnh viện Mắt trung ƣơng, số bệnh nhân mắc u nguyên bào võng mạc hàng năm
tăng t 29 ngƣời (2004) lên 68 ngƣời (2016), chủ yếu tập trung ở trẻ em lứa tuổi
t 2-3 tuổi (theo hội thảo quốc tế chuyên đề về UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung
ƣơng năm 2017). Tuy số lƣợng không nhiều so với các bệnh lý khác nhƣng đây
là căn bệnh hiểm nghèo, nếu không đƣợc điều trị đúng, xử lý sớm sẽ ảnh hƣởng
tới thị lực thậm tr t nh mạng ngƣời bệnh. Phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai
đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra
trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền
4


với khả năng sinh bệnh. Hiện nay, ở Việt Nam, chẩn đoán phân tử bệnh

UNBVM đã bắt đầu phát triển và đã đạt đƣợc một số thành tựu. Năm 2005,
Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn Tr Dũng đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào
nghiên cứu 30 ca võng mạc ở Việt Nam và xác định đƣợc một bệnh nhân bị đột
biến mất đoạn ở vị tr nhiễm sắc thể 13q14 [1]. T năm 2013 nhóm nghiên cứu
của chúng tôi, đứng đầu là tiến sỹ Nguyễn Hải Hà, đã bắt đầu xây dựng quy trình
sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM Việt Nam sử dụng kỹ thuật
giải trình tự trực tiếp. Năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di phát
hiện đƣợc t mẫu máu của bệnh nhân UNBVM [2]. Năm 2016, nhóm đã xây dựng

thành công phƣơng pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân t ch bản
phiên mã của gen này [3]. Kết hợp hai phƣơng pháp x t nghiệm trên DNA và
cDNA trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở một gia đình có hai con mắc bệnh ung
thƣ võng mạc đã phát hiện đƣợc ngƣời cha và hai con đều mang đột biến gây ảnh
hƣởng tới sự tổ hợp lại mRNA của RB1. Năm 2017, chúng tôi đã sử dụng
phƣơng pháp MLPA nhằm phát hiện những đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn trên
gen RB1 ở những bệnh nhân UNBVM [4]. Kết quả nghiên cứu cho thấy phƣơng
pháp này hoàn toàn đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán
di truyền của bệnh UNBVM. Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số
kết quả bƣớc đầu của nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh
nhân UNBVM trên tạp ch Molecular Vision (Mỹ), [18]. Cũng trên tạp ch này
gần đây nhất, nhóm nghiên cứu ph a Nam của giáo sƣ Nguyễn Công Kiệt đã
công bố kết quả kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân
UNBVM điều trị tại Bệnh viện mắt thành phố Hồ Ch Minh. Với nghiên cứu
này, các tác giả đã xác định dƣợc phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh
dƣỡng và đột biến dòng mầm trên nhóm bệnh nhân này [19]

5


1.1.2.

Biểu hiện lâm sàng của UNBVM.

Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt,
giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các
triệu chứng khác nhƣ: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi
mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc,
trẻ chậm phát triển...[20]. Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị
UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào
ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2
đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash. Dấu hiệu
nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20%. Đặc biệt, nếu bé bị lác trong
vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21].
1.1.3.

Chẩn đoán UNBVM.

Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phƣơng pháp sau:
* Chẩn đoán lâm sàng: Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn
đoán bệnh. Tổn thƣơng ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hƣớng phát
triển của u. Các phƣơng pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán.
Khám siêu âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ k ch thƣớc và vị tr khối u hoặc
thấy hình ảnh canxi hóa trong khối u-dấu hiệu đặc trƣng của UNBVM. Ngoài ra
còn có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội sọ.
Chụp MRI cho ph p khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và não [22]. Quét
xƣơng toàn thân bằng Technetium-99m và chụp cắt lớp phát xạ positron
Fluorine-18 pos ourodeoxyglucose (PET CT) cũng rất hữu ch để phát hiện sớm
di căn [23]. Hầu hết trẻ em bị UNBVM không cần phải tiến hành chụp xƣơng.
Phƣơng pháp này thƣờng chỉ sử dụng khi UNBVM bị nghi ngờ rằng có thể đã
lan rộng ra khỏi mắt [11].

6


Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm của

Hình 1.2Hình ảnh chụp cắt lớp vi

UNBVM

t nh của UNBVM

N uồn:

/>
vong-mac-1236.html
* Kiểm tra mô bệnh học và phân t ch nhiễm sắc thể. Chẩn đoán UNBVM
có thể đƣợc xác định bằng kiểm tra mô bệnh học. Kiểm tra cẩn thận các dây thần
kinh thị giác là cần thiết để xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u.
Phân t ch di truyền học tế bào lympho máu ngoại vi đƣợc sử dụng để phát hiện
mất đoạn hay sự sắp xếp lại liên quan đến 13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng
5% các trƣờng hợp bị UNBVM một bên mắt và khoảng 7.5% các trƣờng hợp bị
cả hai bên mắt [20].
* Kiểm tra di truyền phân tử:
Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UNBVM là rất quan trọng để
bảo tồn cuộc sống và thị lực. X t nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan
trọng trong việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UNBVM. Gen RB1 là gen ức
chế khối u đầu tiên đƣợc xác định, phần lớn các đột biến RB1 là riêng cho t ng
gia đình, và đƣợc phân bố trên khắp gen RB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã
hóa exon, và khu vực nối của intron [24]. Việc chẩn đoán UNBVM thể di truyền
đƣợc tiến hành ở các bệnh nhân mang bệnh hoặc có tiền sử gia đình, trong đó

phần lớn các bệnh nhân bị bệnh không có tiền sử gia đình. Do đó việc xác định
7


một biến thể gây bệnh dòng mầm dạng dị hợp tử trên gen RB1 trong x t nghiệm
di truyền phân tử là cần thiết để xác định xem UNBVM có phải là dạng di truyền
hay không và cho ph p chẩn đoán, sàng lọc sớm nguy cơ cho các thành viên
trong gia đình [20].
1.1.4.

Phân loại UNBVM

Chẩn đoán UNBVM đƣợc tiến hành trên cơ sở các phát hiện lâm sàng và
x t nghiệm hình ảnh. Xác định giai đoạn khối u tại thời điểm chẩn đoán là rất
quan trọng để quản lý th ch hợp, do đó kiến thức về hệ thống phân loại u nguyên
bào võng mạc là rất quan trọng. Phân loại Reese Ellsworth (Bảng 1.1) đƣợc phát
triển vào những năm 1960 bởi Tiến sĩ Algernon Reese và Tiến sĩ Robert
Ellsworth là hệ thống phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi nhất đối với các khối u nội
nhãn và dựa trên vị tr , số khối u và k ch thƣớc của khối u [25].
Bảng 1.1: Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng
mạc [25]
Nhóm

Đặc điểm

Khả năng bảo tồn thị lực

Khả năng bảo tồn thị lực
rất cao

a, Khối u đặc, k ch thƣớc <4 DD, tại hoặc sau
đƣờng x ch đạo
b, Nhiều khối u, k ch thƣớc > 4 DD, tất cả đều tại
hoặc sau đƣờng x ch đạo.

II

Khả năng bảo tồn thị lực
cao

a, Khối u đặc, k ch thƣớc 4-10 DD, tại hoặc sau
đƣờng x ch đạo.
b, Nhiều khối u, k ch thƣớc 4-10 DD, sau đƣờng
x ch đạo.

III

Có thể bảo tồn thị lực

a, Bất kỳ tổn thƣơng nào ở trƣớc đƣờng x ch đạo.
b, Khối u đặc > 10 DD, ở sau đƣờng x ch đạo

I

8


IV

V

a, Nhiều khối u, một số > 10 DD
Không thuận lợi trong bảo b, Bất kỳ tổn thƣơng nào lan về ph a trƣớc tới bờ
tồn thị lực
răng cƣa.

Rất khó khăn trong bảo
tồn thị lực

a, Những khối u lớn xâm lấn quá một nửa võng
mạc.
b, Gieo mầm vào pha lê thể.

Hệ thống phân loại Reese Ellsworth về cơ bản đƣợc thiết kế để dự đoán
kết quả điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài (EBRT), đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ
là phƣơng pháp điều trị bảo tồn mắt ch nh cho đến khi điều trị bằng hóa trị liệu
đƣợc sử dụng vào những năm 1990. Một số nhƣợc điểm của hệ thống phân loại
này nhƣ sau: các khối u ngoại biên, nhiều khối u và khối u lớn đƣợc cho là nguy
hiểm hơn trong giai đoạn điều trị bằng xạ trị chùm tia ngoài và có tiên lƣợng xấu
hơn ở mắt. Hệ thống phân loại Reese Ellsworth không giải quyết đƣợc vấn đề
gieo hạt dƣới võng mạc và không phân biệt giữa gieo hạt vào thủy tinh khu trú
và khuếch tán [26]. Do đó, cần phải đề xuất một hệ thống phân loại mới có thể
dự đoán kết quả điều trị bằng hóa trị liệu ch nh xác hơn. Nhiều trung tâm đã
tham gia và thống nhất một hệ thống phân loại duy nhất đƣợc thiết kế bởi
Murphree và các cộng sự (Bảng 1.2) [27]

9


Bảng 1.2: Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn [27]

Đặc điểm lâm sàng

Nhóm
A
Nguy cơ rất
thấp

Tất cả các khối u có k ch thƣớc 3 mm hoặc nhỏ hơn, giới hạn ở
võng mạc và nằm cách dây thần kinh thị giác t nhất 1.5 mm. Không
gieo hạt vào thủy tinh thể

B
Nguy cơ thấp

Các khối u võng mạc có bất kỳ k ch thƣớc hoặc vị tr nào không
thuộc nhóm A. Không gieo hạt vào thủy tinh thể. Một lƣợng nhỏ
dịch k o dài không quá 5 mm t nh t khối u đƣợc cho ph p.

C
Nguy cơ trung
bình

Gieo rắc hạt tại chỗ. Hạt thủy tinh có thể k o dài không quá 3 mm t
khối u. Có thể có tới một phần tƣ dịch dƣới màng lƣới.

D
Nguy cơ cao

Gieo rắc hạt lan tràn, khối u có thể to hơn một phần tƣ của võng
mạc.

E
Nguy cơ rất cao

Ngoài ra còn mắc một số bệnh về mắt nhƣ: Bệnh tăng nhãn áp thứ
phát, xuất huyết nội nhãn, viêm tổ chức hốc mắt không nhiễm
khuẩn, khối u xâm lấn vào thủy tinh thể, UNBVM di căn.

1.1.5.

Điều trị UNBVM

Mục tiêu đầu tiên của điều trị là đảm bảo t nh mạng của ngƣời bệnh và
sau đó là thị lực. Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa
chọn phƣơng pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lƣợng các ổ khối u
(bị một bên và chỉ có một khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai bên
mắt), vị tr và k ch thƣớc khối u trong mắt, có gieo mầm vào pha lê thể và dƣới
võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân. Các phƣơng
pháp đƣợc sử dụng trong điều trị UNBVM bao gồm:
* Phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu: Thƣờng chỉ định khi khối u lớn (hơn 60%
thể t ch nhãn cầu) không còn thị lực, mù, mắt đau hoặc khối u xâm lấn vào thần
10


kinh thị. Ngƣời ta hay kho t bỏ nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các
phƣơng pháp điều trị bảo tồn trƣớc đó. Ngoài ra, kho t bỏ nhãn cầu đƣợc chỉ
định cho trƣờng hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm
lấn ra tiền phòng.
* Lạn đôn : Chỉ định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ (< 6 mm đƣờng
k nh và < 3 mm độ dày) và ở ph a trƣớc. Trong quá trình lạnh đông, một chất rất

lạnh nhƣ nitơ lỏng, đƣợc đặt trong hoặc gần các tế bào ung thƣ.Một khi các tế
bào đóng băng, chất lạnh đƣợc loại bỏ và các tế bào tan băng. Quá trình đóng
băng và tan băng này, lặp đi lặp lại một vài lần trong mỗi đợt trị liệu, khiến các
tế bào ung thƣ bị chết. Biến chứng của phƣơng pháp này gồm bong võng mạc tơ
huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc và xơ hóa
tiền võng mạc.
* Liệu pháp laser: Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định
cho u nhỏ và ở ph a sau. Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của
laser Argon để phá hủy mạch máu nuôi dƣỡng tế bào khối u.
* Tia xạ: Tia xạ với nguồn tia t ngoài vào (External beam radiotherapy viết
tắt EBRT) là phƣơng pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong UNBVM. Tia
xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào thủy tinh, các
khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực hoặc nhiều khối u
mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phƣơng pháp lạnh hoặc quang
đông.
* Điều trị bằng các tấm có hoạt t nh phóng xạ: Liệu pháp tia phóng xạ để gần
(I – 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt t nh phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của
khối u, có thể áp dụng nhƣ là phƣơng pháp điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu

11


thuật. Tuy nhiên, không phải là tất cả các bệnh nhân đều đƣợc điều trị bằng phƣơng
pháp này [22] [28].
* Liệu pháp hóa học: UNBVM là một bệnh ác t nh nhạy cảm với hóa chất.
Hóa chất có hoạt t nh nhất nhƣ carboplatin, vincristin, có hoặc không có
etoposide.
Hó

t

ảm tế ào: Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điểm

chẩn đoán nên ngƣời ta sử dụng hóa chất giảm tế bào để giảm k ch thƣớc khối u,
giúp tăng hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị tại chỗ. Hóa chất giảm tế bào
trở thành một phần quan trọng trong điều trị ban đầu UNBVM và làm tăng khả
năng bảo tồn nhãn cầu. Hóa chất giảm tế bào còn nhằm chống lại sự phát triển
của UNBVM ba bên [29].

Hình 1.3: Soi đáy mắt trƣớc điều trị

Hình 1.4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa

hóa chất giảm tế bào

chất giảm tế bào

Nguồn: />
Trƣớc đây, việc loại bỏ nhãn cầu đã đƣợc sử dụng để điều trị cho những
bệnh nhân mắc UNBVM nặng. Hiện nay có bằng chứng cho thấy cách tiếp cận
phối hợp nhiều phƣơng pháp bao gồm hóa trị thu nhỏ khối u, phẫu thuật loại bỏ
nhân, EBRT và hóa trị ngăn ng a có hiệu quả trong các trƣờng hợp khối u lan ra
12


ổ mắt và thần kinh thị giác, do đó không cần phải kho t bỏ nhãn cầu và khả năng
sống sót tốt hơn [30]. Cách tiếp cận này bao gồm 3-6 chu kỳ hóa trị liệu hệ thống
liều cao, gây ra sự thu nhỏ khối u và làm cho mắt có thể điều chỉnh đƣợc. Kiểm
soát khối u hiệu quả hơn và an toàn hơn đã đƣợc quan sát với phƣơng pháp VEC
khi so sánh một phác đồ 5 thuốc bao gồm carboplatin và etoposide, xen kẽ với

cyclophosphamide, idarubicin và vincristine. Hóa trị liệu liều cao đƣợc tiếp tục
trong 12 chu kỳ và theo dõi chặt chẽ với mục đ ch loại bỏ hoàn toàn khối u bằng
cách soi đáy mắt và ngăn ng a di căn [31]. Chawla và cộng sự phân t ch một
nhóm nhỏ trẻ em mắc UNBVM đã phát hiện ra rằng 39,2% trẻ em còn sống
không bị tái phát/di căn, 9% trẻ bị di căn và 51,8% trẻ tử vong. Di căn đến hệ
thần kinh trung ƣơng đƣợc ghi nhận ở 15,7% trẻ và mang tiên lƣợng xấu. Các
khối u ác t nh thứ phát đáng quan tâm trong đó có u xƣơng là phổ biến nhất [32].
1.1.6.

Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc

Nguy cơ mắc UNBVM có thể đƣợc xác định t mối quan hệ của trẻ sơ
sinh với thành viên trong gia đình đã đƣợc chẩn đoán bị bệnh (Bảng 1.3) [33].
Trong trƣờng hợp chƣa thực hiện hoặc không thể thực hiện đƣợc xét nghiệm di
truyền, nguy cơ mắc bệnh ƣớc tính có thể xác định đƣợc bằng cƣờng độ kiểm tra.
Tuy nhiên, nguy cơ mắc bệnh của một đứa trẻ có thể đƣợc xác định chính xác
hơn bằng phân tích di truyền của gia đình, thƣờng bắt đầu với việc thực hiện xét
nghiệm di truyền toàn bộ gen RB1 của một thành viên trong gia đình bị UNBVM
để xác định khả năng di truyền; nếu di truyền, đột biến gây bệnh sẽ đƣợc kiểm
tra một cách kĩ lƣỡng ở những ngƣời có nguy cơ cao.

13


Bảng 1.3: Đánh giá nguy cơ mang đột biến RB1 của các thành viên trong gia
đình trẻ mắc UNBVM [33]
Nguy cơ mang đột biến gây bệnh (%)
Mối quan hệ với bệnh
nhân

Bệnh nhân mắc Rb Bệnh nhân mắc Rb
hai mắt (100)
một mắt (15)

Con cái (trẻ sơ sinh)

50

7.5

Bố mẹ

5

0.8

Anh/chị/em ruột

2.5

0.4

Cháu trai/gái

1.3

0.2

Chú/dì

0.1

0.007

Anh chị em họ gần nhất

0.05

0.007

Ngƣời bình thƣờng

0.007

Xét nghiệm phân tử xác định đột biến RB1 giúp làm rõ nguy cơ mắc
UNBVM của các thành viên trong gia đình, do đó có thể giảm cƣờng độ kiểm tra
mắt chuyên khoa ở một số trẻ em, cho phép trẻ trải qua tầm soát t hơn. X t
nghiệm và tƣ vấn di truyền cho UNBVM là một vấn đề phức tạp và cần sự phối
hợp chặt chẽ giữa bác sĩ với các chuyên gia di truyền (cố vấn di truyền hoặc các
nhà di truyền y học) có kinh nghiệm. Ví dụ, mặc dù bố mẹ của một đứa trẻ bị
UNBVM cả hai bên mắt có thể xét nghiệm âm tính với đột biến RB1, nhƣng vẫn
có 5% nguy cơ sinh ra những đứa trẻ tiếp theo bị bệnh vì khả năng có thể bố mẹ
bị đột biến RB1 dạng khảm dòng mầm. Việc sàng lọc trƣớc sinh là rất quan trọng
đối với những gia đình có tiền sử mắc UNBVM. Nếu có tiền sử gia đình mắc
UNBVM mang đột biến gen RB1 thì trẻ sinh ra cũng có nguy cơ cao mang khối
u võng mạc. Khi cha mẹ có mong muốn kiểm tra trong thai kỳ để phát hiện đột
14


biến gen RB1 của bào thai, các kĩ thuật sinh thiết gai nhau (t tuần thai 11-14) và

chọc ối (t tuần thai 16 trở đi) sẽ đƣợc thực hiện. Sau khi sinh, việc kiểm tra khối
u mắt (thực hiện khi gây mê trẻ) càng sớm càng tốt sẽ đảm bảo kiểm soát sự xâm
lấn của khối u nếu có. Trong trƣờng hợp thai nhi đƣợc xác định là mang đột biến
gen RB1 thì sẽ đƣợc chỉ định sinh sớm hơn thời gian dự kiến (t tuần 36-38 của
thai kỳ), t đó có thể phát hiện và kiểm soát tốt hơn sự tiến triển của khối u kể t
khi khối u vẫn còn nhỏ, đồng thời giúp bảo tồn thị lực của trẻ [33, 34].
1.1.7.

Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc

Dựa vào những biểu hiện lâm sàng của UNBVM, ngƣời ta đƣa ra các giả
thuyết về cơ chế phân tử của bệnh: chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u là
gen RB1, protein RB (pRB) tác động vào chu kỳ tế bào. Khi gắn với yếu tố phiên
mã E2F, pRB ức chế sự sinh sản tế bào. Khi không có pRB, các phôi bào sinh
sản bất tận dẫn đến bệnh ung thƣ. Hoạt động tƣơng tác giữa pRB và E2F đƣợc
điều hòa bởi các yếu tố nhƣ cyclin D1, cdk4 và p16 [35]. Một alen hoạt động của
gen RB1 cũng có khả năng ngăn chặn sinh ung thƣ, do đó, sự chuyển dạng ác
tính của các tế bào võng mạc xảy ra khi cả 2 alen của gen RB1 bị đột biến mất
chức năng. Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hit” của Knudson, cho rằng
UNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tổn thƣơng di truyền: lần 1 (đột biến
dòng mầm tế bào sinh dục) đột biến xảy ra trên các exon của gen RB1, lần 2 (đột
biến thể soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối u [36]
[37]. Cơ chế bệnh sinh này đƣợc giải thích tốt nhất bằng việc khảo sát sự di
truyền của UNBVM.
Với bệnh nhân mà gia đình không có tiền sử bệnh: ngay tại hợp tử không
mang gen RB1 đột biến, tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào soma trên
2 alen của cùng một gen RB1 [38]. Đối với bệnh nhân mà gia đình có tiền sử gây
15

bệnh, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một gen RB1 đột biến, chỉ
cần trải qua một sự kiện đột biến trên tế bào soma là có khả năng gây nên kiểu
hình ung thƣ. Bất kể các đột biến ban đầu là do di truyền hay do phát sinh trên tế
bào soma, các tế bào võng mạc chỉ trở thành ác tính khi bị mất bản sao bình
thƣờng còn lại của RB1. Mất alen RB1 chức năng thứ hai có thể là do một đột
biến soma riêng biệt (~30% các khối u), sự methyl hóa quá mức (tỷ lệ nhỏ các
khối u), hoặc mất trạng thái dị hợp tử (~70% các khối u). Mất trạng thái dị hợp
xảy ra do tái tổ hợp trong nguyên phân bào, phân ly bất thƣờng của nhiễm sắc
thể, hoặc mất đoạn lớn [39].

Hình 1.5: Giải th ch về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen RB1[40]
T đó, ngƣời ta đƣa ra một số giả thuyết gây nên hiện tƣợng đột biến
trên gen Rb1 gồm: Tái tổ hợp trong nguyên phân, hoạt động bất thƣờng của
DNA polymerase trong tổng hợp DNA và sự phân chia bất thƣờng của nhiễm
sắc thể [40].

16