Luận án tiến sĩ y học: Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn Hổ Mèo (Naja siamensis) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ KHẮC QUYẾN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH
KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis)
TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ KHẮC QUYẾN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH
KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis)
TRÊN THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Dược lý và Độc chất
Mã số: 9720118

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS.BS. TRỊNH XUÂN KIẾM
2. TS.BS. HOÀNG ANH TUẤN

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng
dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn.
Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một phần
trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được công bố. Nếu có điều gì
sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Tác giả

Lê Khắc Quyến


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................
Chương 1..........................................................................................................
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................

1.1. RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN.........................................
1.1.1. Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn trên thế giới.....................................
1.1.2. Rắn độc và tai nạn rắn độc cắn tại Việt Nam....................................
Tỉ lệ tử vong do rắn độc cắn tại Trung tâm cấp cứu Sài Gòn trong
năm 1979-1980 là 20%. Tử vong do rắn độc cắn tại Bệnh viện
Chợ Rẫy giai đoạn 1985-1990 khi chưa có HTKNR đặc hiệu là
19.5%. Tỉ lệ này giảm rất đáng kể từ 19,5% xuống 3.1% khi có
HTKNR điều trị đặc hiệu giai đoạn 1990 -1996 [13]. Những
trường hợp tử vong hiện nay là do rắn hổ mèo, rắn cạp nia.
Nhiều trường hợp bị RHM cắn để lại hậu quả nặng nề: cắt cụt
tay, chân; di chứng co rút sau ghép da ảnh hưởng đến cuộc sống
của người lao động. Hiện nay, Việt Nam chưa có huyết thanh
kháng nọc rắn hổ mèo (HTKNRHM). Trên thực tế tại Bệnh
viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi đồng 1 và Nhi Đồng 2, điều trị
bệnh nhân bị nhiễm độc nọc RHM bằng HTKNR hổ đất không
cải thiện được triệu chứng nhiễm độc tại chỗ cũng như toàn
thân. HTKNR hổ đất (Naja kaouthia) không có khả năng trung
hoà chéo được nọc RHM (Naja siamensis) trên lâm sàng [14].
Do đó, cần nhanh chóng xúc tiến nghiên cứu sản xuất
HTKNRHM đặc hiệu để kịp thời cứu người bị nạn......................


1.2. NỌC RẮN VÀ NHIỄM ĐỘC NỌC RẮN.........................................
1.2.1. Nọc rắn...........................................................................................
1.2.2. Nhiễm độc nọc rắn trên người........................................................
1.3. CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN......................................
1.3.1. Cấp cứu đầu tiên.............................................................................
1.3.2. Điều trị không đặc hiệu..................................................................
1.3.3. Điều trị đặc hiệu.............................................................................
1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN.............................................

1.4.1. Khái niệm và phân loại huyết thanh kháng nọc rắn.......................
1.4.2. Qui trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn................................
1.4.3. Các thử nghiệm đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn.....................
1.4.4. Tình hình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn ở Việt Nam...........
1.5. RẮN HỔ MÈO....................................................................................
1.5.1. Đặc điểm nhận dạng và phân bố.....................................................
1.5.2. Nọc rắn hổ mèo..............................................................................
1.5.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ
mèo................................................................................................
*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến và cs. (2003)[14]......................................
1.5.4. Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo................................................
Chương 2........................................................................................................
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.................................
2.1.1. Động vật nghiên cứu.......................................................................
2.1.2. Hóa chất sinh phẩm........................................................................
2.1.3. Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu.............................................
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu........................................................................
2.2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................
2.2.3. Các phương pháp kỹ thuật tiến hành..............................................


- Thử nghiệm đánh giá tính an toàn (Safety test):......................................
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU...................................
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU.................................................................................
2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU.................................................................
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................
3.1. CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO........
3.1.1. Kết quả chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo............

3.1.2. Kết quả gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố nọc
rắn hổ mèo.....................................................................................
3.1.3. Kết quả phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết
tương ngựa sau mỗi lần gây miễn dịch.........................................
3.1.4. Kết quả lấy máu, tách huyết tương và truyền trả khối hồng cầu
.......................................................................................................
3.1.5. Kết quả tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2
từ ngựa...........................................................................................
3.1.6. Kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2
đơn đặc hiệu tại Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm
y tế.................................................................................................
3.2. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG
NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT......................................
3.2.1. Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo............
Ảnh 3.16. Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo.....
3.2.2. Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết thanh kháng nọc
rắn hổ mèo (median effective dose-ED50)...................................
- Tiến hành pha nọc rắn hổ mèo 100μg/ml. Nọc RHM dùng là 100
LD50. Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,5ml hỗn hợp (nọc RHM và
HKNRHM theo các mức 0,010 – 0,030 – 0,050ml ) đã ủ 60
phút cho bốn lô chuột, mỗi lô có 8 chuột: Lô 4 (lô chứng) ủ nọc
RHM với nước muối sinh lý NaCl 0.9%. Lô số 1, 2, 3: các mức


pha loãng HTKNRHM 0,010 – 0,030 – 0,050ml (Bảng 3.10)......
3.2.3. Thử nghiệm đánh giá chất gây sốt (Pyrogen test) huyết thanh
kháng nọc rắn hổ mèo...................................................................
3.2.4. Thử nghiệm đánh giá tính an toàn (Safety test) huyết thanh
kháng nọc rắn hổ mèo...................................................................
3.2.5. Thử nghiệm đánh giá tính vô khuẩn (Sterility test) huyết thanh

kháng nọc rắn hổ mèo...................................................................
3.2.6. Thử nghiệm xác định hàm lượng Thimerosal, pH và natri clorid
trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo...................................
STT

94

Các tiêu chí lý hóa HTKNRHM cần xác định............................................
Kết quả 94
Tiêu chuẩn Quốc gia......................................................................................
1

94

pH

94

6.5 ± 0.3 94
6,0 - 7,0 94
2

94

Hàm lượng Thimerosal.................................................................................
< 0,01% 94
< 0,02% 94
3

94

Hàm lượng natri clorid.................................................................................
0,88% ± 0.2%.................................................................................................


0,85 - 0,9%......................................................................................................
3.2.7. Đánh giá tính đặc hiệu của huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo.....
3.2.8. Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo
dạng F(ab’)2..................................................................................
Chương 4........................................................................................................
BÀN LUẬN....................................................................................................
4.1. DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN
HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO.......
4.1.1. Dịch tễ rắn hổ mèo và cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc........
4.1.2. Thu nhận nọc rắn hổ mèo.............................................................100
4.2. QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ QUI TRÌNH
GÂY MIỄN DỊCH...........................................................................101
4.2.1. Chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo.......................101
Trong sản xuất HTKNR, có thể sử dụng từng độc tố là thành phần của
nọc rắn hoặc dùng nọc độc thô làm nguyên liệu chế tạo kháng
nguyên [10], [12]. Theo WHO, việc khử độc sẽ phá huỷ các vị
trí gây độc của độc tố nhưng nó cũng phá huỷ luôn các điểm tạo
ra tính kháng nguyên của độc tố nọc rắn. Khi sử dụng khử độc
bằng glutaraldehyde, protein sẽ bị phản ứng trùng hợp mức độ
khó kiểm soát và không hồi phục được. Việc khử độc sẽ làm
giảm đáp ứng tạo kháng thể cũng như kháng thể sẽ trung hoà
kém độc tố tự nhiên có trong nọc rắn. Do đó, WHO (2010)
khuyến cáo không nên khử độc nọc rắn mà nên gây miễn dịch
với liều thấp nhủ tương hoá tốt với tá chất Freund hoàn chỉnh và
không hoàn chỉnh [12]. Điều này được thực hiện như nghiên

cứu của Sapsutthiapas S. và cs. (2015) trong sản xuất HTKNR
đa giá chống lại rắn lục xanh, rắn choàm quạp và rắn lục Russel
[98]. Tuy nhiên, nọc RHM có nhiều độc tố như cardiotoxin tác
động trên hệ tuần hoàn và cytotoxin tác động trên hệ thống cơ


gây tổn thương hoại tử tại chỗ nặng nề và tử vong. Điều này đã
được ghi nhận khi quan sát trên thực tế lâm sàng và trên thực
nghiệm. Do đó, khi sử dụng nọc thô RHM làm nguyên liệu sản
xuất kháng nguyên để gây miễn dịch thì nguy cơ động vật chủ
chết. Nếu sử dụng liều thấp nọc RHM thô khi gây miễn dịch thì
khả năng đáp ứng kháng thể kém trên động vật chủ nên nguy cơ
nghiên cứu thất bại. Vì vậy, nghiên cứu đã mạnh dạn áp dụng
việc khử độc nọc RHM bằng glutaraldehyte và nhiệt, tạo giải
độc tố kháng nguyên nọc RHM. Kháng nguyên giải độc tố nọc
RHM sẽ làm giảm độc lực nọc rắn nhưng có thể sử dụng liều
cao để gây miễn dịch. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã
thành công. Ngựa đã tạo kháng thể tốt sau gây miễn dịch tháng
thứ 3 bằng kháng nguyên giải độc tố nọc RHM. Tổn thương tại
chỗ và toàn thân trên ngựa đã được hạn chế ở mức thấp nhất.
Kháng thể tạo ra từ kháng nguyên giải độc tố nọc RHM có hiệu
lực tốt trên thực nghiệm in vitro và in vivo khi sử dụng nọc
RHM thô. Qui trình khử độc để tạo giải độc tố trong nghiên cứu
của chúng tôi là kinh điển trong chế tạo vắc xin. Nghiên cứu của
chúng tôi đã thực hiện tương tự như các nghiên cứu của Trịnh
Xuân Kiếm và cs. (2012) và (1997) [10], [13]............................101
4.2.2. Lựa chọn động vật gây miễn dịch................................................102
4.2.3. Lựa chọn tá chất phù hợp và kích thích tạo kháng thể.................103
Hiện nay, các nhà sản xuất HTKNR thường chọn cách gây miễn dịch là
kháng nguyên nọc rắn được chế tạo từ nọc rắn độc toàn phần có

làm giảm độc lực hoặc không làm giảm độc lực trộn với tá chất
Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh [61], [64], [98].
Một số tác giả khác sử dụng aluminium hydroxide làm tá chất
nhưng kết quả chưa cao [12]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi


chọn phương pháp làm giảm độc lực của nọc RHM tạo ra kháng
nguyên giải độc tố nọc RHM phối hợp với tá chất Freund hoàn
chỉnh trong 3 tháng đầu và tá chất Freund không hoàn chỉnh
trong 6 tháng tiếp theo. Bằng việc chế tạo thành công kháng
nguyên giải độc tố nọc RHM giảm độc lực đảm bảo tiêu chuẩn
vô khuẩn theo hướng dẫn của WHO, sản phẩm này gây miễn
dịch trên ngựa đã sinh kháng thể tốt làm cơ sở cho việc tinh chế
thành công HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơn đặc hiệu với hiệu lực
và an toàn theo các tiêu chuẩn Quốc gia yêu cầu [12],[72]........103
4.2.4. Lịch trình gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên giải độc tố
.....................................................................................................105
Cùng với việc chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc RHM, việc gây
miễn dịch cho ngựa tạo huyết thanh ngựa có hiệu giá kháng thể
đặc hiệu cao làm nguyên liệu cho việc sản xuất HTKNR là khâu
rất quan trọng. Quy trình gây miễn dịch cho động vật phụ thuộc
vào độc tính của loại nọc rắn, tính sinh miễn dịch của kháng
nguyên nọc rắn và khả năng đáp ứng sinh miễn dịch của loài
động vật được lựa chọn. Liều kháng nguyên được sử dụng tăng
dần kích thích tạo kháng thể trên động vật mà không gây chết
động vật thí nghiệm [10], [12], [61]. Thời gian gây miễn dịch có
thể kéo dài từ 3 đến 15 tháng cho đến khi đạt được nồng độ
kháng thể cao nhất trong máu của động vật miễn dịch và đó
cũng là thời điểm để lấy toàn bộ máu của động vật miễn dịch.
Nghiên cứu chúng tôi sử dụng lịch trình gây miễn dịch cách mỗi

tháng như khuyến cáo của WHO. Thời gian gây miễn dịch là 9
tháng đã cho hiệu giá kháng thể cao 1/64.000 và ổn định sau
tháng thứ 9. Như vậy, việc tinh chế HTKNRHM đã được tiến
hành sau khi thu hoạch đủ lượng huyết tương ngựa cần thiết.....105


4.2.5. Lấy máu thu hoạch huyết tương và truyền trả khối hồng cầu......107
4.3. QUI TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN
HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2................................................................109
4.3.1. Lựa chọn huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn giá trên thực
nghiệm.........................................................................................109
4.3.2. Lựa chọn qui trình tinh chế huyết thanh kháng nọc đặc hiệu đơn
giá dạng F(ab’)2..........................................................................110
4.3.3. Qui trình sản xuất công nghiệp.....................................................112
4.4. CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM HUYẾT THANH KHÁNG NỌC
RẮN..................................................................................................113
4.4.1. Lựa chọn huyết thanh kháng nọc rắn dạng F(ab’)2......................113
Huyết thanh kháng nọc rắn phải đạt tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia
trước khi cho phép sử dụng trên lâm sàng [12], [72]. Các tiêu
chí bao gồm an toàn chung, vô khuẩn, chất gây sốt, hiệu lực,
xác định nồng độ protein, độ pH, bảo quản, đóng gói và tính
chất vật lý của HTKNR. Kết quả kiểm định Quốc gia cả hai
dạng dung dịch và đông khô của HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơn
đặc hiệu đều đạt các tiêu chuẩn Quốc gia về sinh phẩm và phù
hợp với các khuyến cáo của WHO [12], [72]. HTKNRHM dạng
F(ab’)2 đơn đặc hiệu của nghiên cứu đạt tiêu chuẩn: an toàn
cao, hiệu lực mạnh, không có chất gây sốt và vô khuẩn. Các tiêu
chí về lý hoá đều đảm bảo theo qui định quốc gia. Như vậy, qui
trình sản xuất HTKNRHM dạng F(ab’)2 đã hoàn chỉnh, phù
hợp điều kiện kinh tế và thực tế Việt Nam..................................113

4.4.2. Lựa chọn dạng thành phẩm của huyết thanh kháng nọc rắn dạng
F(ab’)2.........................................................................................113
4.5. ĐÁNH GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN TRÊN
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM.......................................................114
4.5.1. Đánh giá hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn..............................114
4.5.2. Đánh giá tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn........................115


4.5.3. Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn................................115
4.5.4. Đánh giá tính đặc hiệu của huyết thanh kháng nọc rắn................116
4.6. NHỮNG ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN..................................116
KẾT LUẬN...................................................................................................118
KIẾN NGHỊ.................................................................................................118
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN...................................................120
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................121
PHỤ LỤC.....................................................................................................132
1. CÁC KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH HUYẾT THANH KHÁNG NỌC
RẮN HỔ MÈO TẠI VIỆN KIỂM ĐỊNH QUỐC GIA VỀ
VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ, BỘ Y TẾ............................133
134
135
2. CÁC KẾT QUẢ CẤY TÌM VI KHUẨN VÀ VI NẤM CỦA KHÁNG
NGUYÊN GIẢI ĐỘC TỐ NỌC RẮN HỔ MÈO.....................136
136
137
138
3. CÁC KẾT QUẢ CẤY TÌM VI KHUẨN VÀ VI NẤM CỦA HUYẾT
THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG DUNG DỊCH
VÀ ĐÔNG KHÔ..........................................................................139

140
141


142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
4. KẾT QUẢ ĐIỆN DI MIỄN DỊCH CỦA HUYẾT THANH KHÁNG
NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2........................................155
155
156
5. CÁC PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ
VẮC XIN VÀ SINH PHẨM THEO TIÊU CHUẨN VIỆT
NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM 2009)....................................157


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
TT

Phần viết tắt

1.

ACD

Acid citric, citrat natri, dextrose -chất chống đông

2.
3.

Ag
Al

ACD
Bạc
Nhôm

4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.

17.
18.

ALAT
aPTT
ASAT
BN
BSA
BT
BUN
°C
CK
CK-MB
CPK
CR
cs.
Cu
CVP

Alanine aminotransferase
Activated Partial Thromboplastine Time
Aspartate aminotransferase
Bệnh nhân
Bovine Serum Albumin – Albumin huyết thanh bò
Bình thường
Blood Urea Nitrogen
Nhiệt Độ Celsius
Creatine Kinase
Creatine Kinase –MB
Creatine Phosphokinase

Calloselasma rhodostoma – Rắn choàm quạp
Cộng sự
Đồng
Central venous pressure – Áp lực tĩnh mạch trung

ED50
ELISA

tâm
Median Effective Dose – Liều hiệu lực trung bình
Enzyme-linked immunosorbent assay – Xét

Fab

nghiệm miễn dịch gắn kết men
A monovalent immunoglobulin fragment – một

F(ab’)2

nhánh của kháng thể IgG
A bivalent immunoglobulin fragment – hai nhánh

FCA

của kháng thể IgG
Freund Complete adjuvant – Tá chất Freund hoàn

FIA

chỉnh

Freund Incomplete adjuvant – Tá chất Freund

g
HC

không hoàn chỉnh
Gam
Hội chứng

19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.

Phần viết đầy đủ


27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.

36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.

HRP
HT
HTKN
HTKNR
HTKNRHM
IgG
IgY
kDa
KN

KT
LD50
LDH
µg
mg
ml
NK
NS
OD
OPD
PBS-Tween

Horseradish Peroxidase – Enzym HRP
Huyết thanh
Huyết thanh kháng nọc
Huyết thanh kháng nọc rắn
Huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo
Immunoglobulin G – Kháng thể G
Immunoglobulin Yolk – Kháng thể lòng đỏ trứng
Kilô Dalton
Kháng nguyên
Kháng thể
Median Lethal Dose – Liều gây chết trung bình
Lactate Dehydrogenase
Microgram
Milligram
Mililittres
Naja kaouthia – Rắn hổ đất
Naja siamensis – Rắn hổ mèo
Optical Density – Mật độ quang

O-phenilenediamine - Dung dịch cơ chất
Phosphate Buffer Solution -Tween – Dung dịch

PT
PLA2
RHM
STT
SD
TC
V
WHO

đệm PBS-Tween
Prothrombin Time – Thời gian prothrombin
Phospholipase A2
Rắn hổ mèo
Số thứ tự
Standard Deviation - Độ lệch chuẩn
Clotting Time – Thời gian máu đông
Volume – Thể tích
World Health Organization – Tổ chức Y tế Thế

Zn

giới
Kẽm


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Đặc điểm lâm sàng phân biệt về 6 loại rắn độc cắn thường
gặp...................................................................................................
Bảng 2.1. Liều lượng kháng nguyên giải độc tố nọc RHM và các loại tá
chất Freund dùng cho gây miễn dịch..........................................
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn cần đạt
.........................................................................................................
Bảng 3.1. Kết quả tuyển chọn và lấy nọc rắn hổ mèo................................
Bảng 3.2. Kết quả chuẩn bị kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo
theo lịch trình gây miễn dịch cho ngựa.......................................
Bảng 3.3. Kết quả cấy vi trùng, vi khuẩn kỵ khí và vi nấm với kháng
nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo...............................................
Bảng 3.4. Liều lượng kháng nguyên và số mũi tiêm thực tế trong quá
trình gây miễn dịch.......................................................................
Bảng 3.5. Bảng theo dõi sức khoẻ ngựa trong quá trình gây miễn dịch
.........................................................................................................
Bảng 3.6. Kết quả hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo
sau gây miễn dịch bằng kỹ thuật ELISA....................................
Bảng 3.7. Bảng kết quả lấy máu ngựa tách huyết tương và truyền trả
hồng cầu.........................................................................................
Bảng 3.8. Kết quả kiểm định chất lượng huyết thanh kháng nọc rắn hổ
mèo..................................................................................................
Bảng 3.9. Xác định liều gây chết trung bình (LD50) nọc rắn hổ mèo......

Bảng 3.10. Bảng kết quả thử nghiệm xác định hiệu lực huyết thanh
kháng nọc rắn hổ mèo...................................................................
Bảng 3.11: Kết quả thí nghiệm thăm dò......................................................
Bảng 3.12: Kết quả xác định chất gây sốt huyết thanh kháng nọc rắn
hổ mèo.............................................................................................
Bảng 3.13: Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc
rắn hổ mèo trên chuột lang (Lô thí nghiệm)...............................
Bảng 3.14: Kết quả thử nghiệm tính an toàn trên chuột lang (Lô
chứng).............................................................................................
+ Quan sát chuột lang sau khi tiêm HTKNRHM trong 01 tuần: Chuột
lang đều phát triển bình thường, tăng cân, không rụng lông
và không có xuất hiện bất cứ triệu chứng nào của phản ứng
muộn của HTKNRHM..................................................................
Bảng 3.15: Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc
rắn hổ mèo trên chuột nhắt trắng (Lô thí nghiệm)....................
Bảng 3.16: Kết quả thử nghiệm tính an toàn trên chuột nhắt trắng (Lô
chứng).............................................................................................
+ Quan sát chuột nhắt trắng sau khi tiêm HTKNRHM trong 01 tuần
như sau:..........................................................................................
Bảng. 3.17: Kết quả cấy vô khuẩn huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo
.........................................................................................................
Bảng 3.18: Kết quả pH, hàm lượng thimerosal và natri clorid trong
huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo.............................................
Bảng 3.19. Kết quả điện di miễn dịch huyết thanh kháng nọc rắn hổ
mèo..................................................................................................


Bảng 4.1: So sánh đặc tính HTKNR dạng IgG, F(ab’)2 và Fab..............111

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

Biểu đồ 1.1. Phân bố bệnh nhân bị các loại rắn độc cắn tại Bệnh viện
Chợ Rẫy từ năm 1990 -1998 (n=1997)...........................................
*Nguồn: theo Trịnh Xuân Kiếm và cs. (2000)[29]........................................
Biểu đồ 1.2. Số lượng bệnh nhân rắn cắn và tử vong tại Trung tâm cấp
cứu Sài Gòn và Bệnh viện Chợ Rẫy từ 1979-1996.......................
*Nguồn: theo Trịnh Xuân Kiếm và cs. (1997)[13]........................................
Biểu đồ 3.1. Hiệu giá kháng thể sau gây miễn dịch lần 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 của ngựa số1 sau tiêm kháng nguyên giải độc tố nọc rắn
hổ mèo.............................................................................................
Biểu đồ 3.2. Kết quả định lượng protein huyết thanh kháng nọc rắn hổ
mèo..................................................................................................
96


97
Bậc pha loãng.................................................................................................
Kết quả đ OD.................................................................................................
1

97

0,38

97

10

97

0,36

97

50

97

0,35

97

100

97

0,34

97

200

97

0,33

97

400

97

0,32

97

600

97

0,32

97

800

97

0,32

97

1000

97

0,33

97

2000

97


0,32

97

4000

97

0,.27

97

8000

97

0,21

97

16000

97

0,15

97

32000

97

0,12

97

64000

97

0,10

97

128000

97

0,08

97

256000

97

0,07

97

512000

97

0,06

97

1024000 97
0,06

97

2048000 97
0,06

97

Blank

97


0,06

97

Biểu đồ 3.3. Kết quả đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết
thanh kháng nọc rắn hổ mèo bằng phương pháp ELISA đạt
1/64.000...........................................................................................
- HTKNRHM pha loãng thấp nhất dương tính: 0.099 (với độ pha loãng
1/64.000) so với chứng âm+3SD là 0.082.....................................
Như vậy hiệu giá kháng thể HTKNRHM tương đương 0.10 của bậc
pha loảng 1/64.000.........................................................................


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Tên sơ đồ

Trang

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu..........................................................................
Sơ đồ 2.2. Các bước thu thập nọc rắn, xử lý chế tạo kháng nguyên.........
2.2.3.3. Gây miễn dịch cho ngựa...................................................................
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ vị trí gây miễn dịch trên ngựa..........................................
Sơ đồ 2.4. Lịch trình gây miễn dịch, lấy máu xét nghiệm kiểm tra hiệu
giá kháng thể và lấy máu thu hoạch huyết tương ngựa.............
Sơ đồ 2.5. Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định tính đặc hiệu của

kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa
trước và sau gây miễn dịch theo lịch trình qui định đối với
kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo (NS antigen) và nọc
rắn hổ mèo thô (NS venom)..........................................................
Sơ đồ 2.6. Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony tìm hiệu giá kháng thể kháng
nọc rắn hổ mèo trong huyết tương ngựa chưa gây miễn dịch
và đã gây miễn dịch tháng thứ 3..................................................
Sơ đồ 2.7. Sơ đồ kỹ thuật Ouchterlony xác định phản ứng chéo huyết
tương ngựa chưa gây miễn dịch và huyết tương ngựa đã gây
miễn dịch tháng thứ 3 bằng giải độc tố nọc rắn hổ mèo với
nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia-NK) và nọc rắn choàm quạp
(Calloselasma rhodostoma-CR)...................................................
Sơ đồ 2.8. Sơ đồ tinh chế và đánh giá huyết thanh kháng nọc rắn hổ
mèo..................................................................................................


DANH MỤC CÁC ẢNH
Tên ảnh

Trang

Ảnh 1.1. Rắn hổ đất (Naja kaouthia).............................................................
Ảnh 1.2. Rắn hổ mang (Naja atra).................................................................
Ảnh 1.3. Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah)..............................................
Ảnh 1.4. Rắn hổ mèo (Naja siamensis)..........................................................
Ảnh 1.5. Rắn cạp nia (Bungarus candidus)...................................................
Ảnh 1.6. Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus)................................................
Ảnh 1.7. Rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma)...............................
7
Ảnh 1.8. Rắn lục (Cryptelytrops albolabris).................................................

Ảnh 1.9. Rắn sải cổ đỏ (Rhabdophis subminiata)........................................
Ảnh 1.10. Hình ảnh lâm sàng bệnh nhân nhiễm độc nọc rắn hổ mèo......
(Naja siamensis) tại chỗ và toàn thân..........................................................
*Nguồn: Theo Lê Khắc Quyến và cs. (2003) [14].......................................
Ảnh 2.1. Ngựa sử dụng cho nghiên cứu chuẩn bị gây miễn dịch..............
Ảnh 3.1. Rắn hổ mèo (Naja siamensis)........................................................
Ảnh 3.3. Kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo thành phẩm.............
Ảnh 3.4. Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên
môi trường thioglycolat................................................................
Ảnh 3.5. Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên
môi trường thạch máu..................................................................


Ảnh 3.6. Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên
môi trường thạch Mac Conkey....................................................
Ảnh 3.7. Kết quả cấy kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo trên
môi trường Sabouraud..................................................................
Ảnh 3.8. Theo dõi tổn thương tại chỗ (a) và biểu hiện toàn thân (b) của
ngựa sau tiêm kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo..........
Ảnh 3.9. Kết quả xác định kháng thể đặc hiệu sau 3 tháng gây miễn
dịch với nọc rắn hổ mèo và kháng nguyên giải độc tố nọc rắn
hổ mèo bằng kỹ thuật Ouchterlony.............................................
Ảnh 3.10. Kết quả xác định kháng thể đặc hiệu sau 3 tháng gây miễn
dịch bằng kháng nguyên giải độc tố rắn hổ mèo bằng kỹ
thuật Ouchterlony.........................................................................
Ảnh 3.11. Thu tủa kháng thể........................................................................
Ảnh 3.12. Thẩm tích bằng màng cellulose acetat loại bỏ ammonium
sulfate..............................................................................................
Ảnh 3.13. Lọc vô trùng..................................................................................
Ảnh 3.14. Đóng lọ sản phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo dạng

F(ab’)2............................................................................................
Ảnh 3.15. Thành phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn
đặc hiệu...........................................................................................
Ảnh 3.18. Kết quả thử nghiệm xác định chất gây sốt trong huyết thanh
kháng nọc rắn hổ mèo...................................................................
Ảnh 3.19. Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn
hổ mèo trên chuột lang ngày 1: Lô thí nghiệm (1), Lô chứng
(2)....................................................................................................


Ảnh 3.20. Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn
hổ mèo trên chuột lang sau 1 tuần...............................................
Ảnh 3.21. Kết quả thử nghiệm tính an toàn huyết thanh kháng nọc rắn
hổ mèo trên chuột nhắt ngày thứ 1 và ngày thứ 7 trên Lô thí
nghiệm (màu vàng) và Lô chứng (màu xanh).............................
Ảnh 3.22. Kết quả định lượng protein huyết thanh kháng nọc rắn hổ
mèo..................................................................................................
Ảnh 3.23. Kỹ thuật thực hiện đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu
trong huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo bằng phương pháp
ELISA.............................................................................................