Luận văn thạc sĩ: Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn Lao phân lập từ bệnh nhân Lao điều trị bằng isoniazid và đánh giá ảnh hưởng của Gen Nat2 của bệnh nhân Lao đến tính kháng thuốc isoniazid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hà

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO
PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO
ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

Nguyễn Thị Thu Hà

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO
PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO
ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số:

8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Vũ Thị Thơm
TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội, 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan
tâm giúp đỡ của các Thầy Cô, nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Vũ Thị Thơm,
TS. Phạm Thế Hải là những người Thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều
kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Luyến - chủ nhiệm đề tài, ThS. Lê Anh Tuấn
- nghiên cứu sinh của đề tài Nghị định thư hợp tác nghiên cứu giữa Đại học Quốc gia
Hà Nội và Đại học Liverpool - Vương quốc Anh (Mã số HNQT/SPĐP/01.06), đã tạo
điều kiện để tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các nhà khoa học trong hội
đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý báu cho
luận văn.
Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, các
Thầy Cô Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học
tập, nghiên cứu tại trường.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại
học Quốc gia Hà Nội; các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Phổi Trung ương đã tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Sự biết ơn đối với gia
đình và bạn bè đã luôn sát cánh động viên và khích lệ tôi.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm
nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này.
Hà Nội, ngày

tháng

Nguyễn Thị Thu Hà

năm


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao..............................................................................3
1.1.1. Hình thể, cấu trúc ......................................................................................3

1.1.2. Khả năng gây bệnh ....................................................................................4
1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao................................................................................5
1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc ..........................................................6
1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc .......................................6
1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ...........................................................7
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của
vi khuẩn lao..............................................................................................................9
1.3. Isoniazid trong điều trị lao ..........................................................................10
1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid .....................................................10
1.3.2. Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao ......................12
1.4. Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2 .........................................13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................16
2.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................16
2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị .............................................................................16
2.1.2. Hóa chất, môi trường...............................................................................16
2.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................17
2.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu .............................................17
2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ ..................................................................................17


2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................17
2.3.1. Cỡ mẫu ....................................................................................................17
2.3.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm ........................................................................18
2.3.3. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT ............18
2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một................20
2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid....26
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................27
2.3.7. Đạo đức nghiên cứu y học .......................................................................28
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................29
3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một ...29

3.1.1. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu .............................29
3.1.2. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi .......32
3.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao và mối ảnh hưởng
đến tính kháng thuốc Isoniazid ..............................................................................40
3.2.1. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2 ...............................................40
3.2.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao ..........................42
3.2.3. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH ....47
KẾT LUẬN ..............................................................................................................50
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT ...........................................................19
Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1
trên môi trường đặc ...................................................................................................22
Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1) .........................................................23
Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc ..................................25
Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ............................................25
Bảng 2.6: Thành phần tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2 ...........................27
Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu................................................29
Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trưởng của vi khuẩn lao .....................32
Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm lao mới và lao tái trị ......................................34
Bảng 3.4: Kết quả kháng sinh đồ với từng thuốc chống lao hàng một .....................36
Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị ........................43
Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị ..................44
Bảng 3.7: Mối liên quan giữa kiểu hình chuyển hóa với thể lao ..............................45
Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở các vùng trên thế giới .....................46
Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH ........................48

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x .......................3
Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trường đặc [23], [59] .............5
Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao .........................................................9
Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [39]. .............................................................11
Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8..................................................................14
Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện .................................18
Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 .................................................................19
Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA ...................................................................................21
Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc ............................................24
Hình 3.1: Biểu đồ dinh dưỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân ..........................31
Hình 3.2: Một số hình ảnh kết quả kháng sinh đồ trên môi trường đặc ...................33
Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại.......................................................34
Hình 3.4: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% ...............41
Hình 3.5: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ưu ......41
Hình 3.6: Kết quả đọc kiểu gen NAT2 ......................................................................42


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFB

Vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid Fast Bacilli)

BMI

Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index)

EMB

Ethambutol

INH

Isoniazid

LJ

Lowenstein-Jensen

MTB

Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)

MDR-TB

Lao đa kháng thuốc (Multi Drug Resistant Tuberculosis)

MDR/RR-TB

Lao đa kháng hoặc Lao kháng Rifampicin
(Multi Drug Resistant - Rifampicin Resistant - Tuberculosis)

MGIT

Mycobacteria Growth Indicator Tube

NAT2

N-Acetyltransferase 2

RMP

Rifampicin

PZA

Pyrazinamid

SM

Streptomycin

SNP

Đa hình đơn nucleotit (Single Nucleotide polymorphisms)

XDR-TB

Lao siêu kháng thuốc
(Extensively Drug Resistant-Tuberculosis)

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng
phức tạp và thời gian điều trị kéo dài. Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ
lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53
triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống
còn 37%. Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên
nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên
cả HIV). Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong
số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018). Năm 2017, tổng số trường hợp
mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80%
là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm. Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao
đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách
thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc. Bệnh nhân mang lao kháng
thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém. Ở Việt Nam theo ước tính trung
bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn
nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường. Theo thống kê
mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao
tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB).
Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17%. Tuy nhiên đây chỉ là
con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng
thuốc với Rifampicin (WHO, 2018). Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài
Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao
còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid. Trong những năm gần đây, tình
hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo. Việc chỉ tập trung
vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến
động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này.
Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong
hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh

nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao. Isoniazid được chuyển hóa bởi

Khoa Sinh học

1

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

enzyme NAT2 tại gan. Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt
chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao. Nghiên cứu tại Nam Phi cho
thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy
ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không
tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể.
Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có
thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao.
Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức
khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương. Chỉ một số
lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất
khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong
quá trình nuôi cấy. Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán
nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF. Tuy nhiên, các xét nghiệm
này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi. Hơn nữa các kit thương mại
này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được
với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một. Từ thực tiễn chẩn đoán và điều
trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng

một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến
yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát
tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng
Isoniazid và đánh giá ảnh hƣởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính
kháng thuốc Isoniazid”.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao
hàng một trên bệnh nhân lao phổi;
Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng
thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi.

Khoa Sinh học

2

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao
1.1.1. Hình thể, cấu trúc
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales,
phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn
169 loài, đa phần không gây bệnh cho người. Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho
người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các
loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium

bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti. Trong
đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64].
Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert
Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch). M. tuberculosis là trực
khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm. Chúng không có vỏ, không
có lông và không có nha bào. Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám
nối đầu vào nhau. Thành tế bào của M. tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ
peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm
cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải
nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1.1) [15].

Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x

Khoa Sinh học

3

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

1.1.2. Khả năng gây bệnh
1.1.2.1. Độc lực và con đường lây truyền
Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố. Độc lực của vi khuẩn
lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào. Các chủng lao độc lực
có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose. Yếu tố sợi
này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực. Vi

khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào. Vi khuẩn lao phát
triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15].
Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp. Người bị nhiễm lao do hít phải
những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho,
hắt hơi vào không khí. Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở
lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có
triệu chứng không rõ ràng. Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng
đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển
dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Đôi khi, đường lây khác có thể là
đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M. bovis. Từ cơ quan bị lao ban đầu,
trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh
(lao hạch, lao mang não lao xương). Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng
nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15].
1.1.2.2. Cơ chế gây bệnh
Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn
tính. Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một
phần. Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại
thực bào và dần thành nang lao. Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm
rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện.
Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở
phổi xuất hiện. Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế
bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết

Khoa Sinh học

4

Khoá 2016-2018

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

chết vi khuẩn lao. Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả
là hình thành u hạt. Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình
thành sẹo. Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn
toàn. Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những
người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng
lây nhiễm. Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở
thành người mắc lao. Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi
trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa yếu tố gen [11].
1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao
Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm
Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy…. trong đó xét nghiệm nuôi cấy
vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng.
Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới
áp suất của oxy là 100 mmHg. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao
phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất. Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông
thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1.2).

a. Khuẩn lạc đƣợc phóng đại

b. Khuẩn lạc trên LJ

Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trƣờng đặc [24], [60]

Khoa Sinh học

5

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần
trên môi trường thử nghiệm. Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu
khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao
mới hình thành khuẩn lạc điển hình. Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ.
Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao
mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn. Hiện nay trên môi trường thương mại
Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) dạng lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao có
thể cho kết quả dương tính sau 3-13 ngày[15].
1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc
1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc
Hiện nay, trong thực tế điều trị, người ta phân loại 2 nhóm thuốc trị bệnh lao,
thường gọi là “thuốc kháng lao hàng 1” và “thuốc kháng lao hàng 2” [18]:
Kháng lao hàng 1 gồm: Bao gồm Streptomycin (viết tắt là SM hay S),
Rifampicin (viết tắt RIF hay RMP hay R ), Isoniazid (INH hay H), Pyrazinamid
(PZA hay Z) và Ethambutol (EMB hay E). Đây là các thuốc được lựa chọn đầu tiên
để điều trị cho bệnh nhân bị lao.
Kháng lao hàng 2 gồm nhiều thuốc, chia làm 4 nhóm A, B, C, D: Nhóm A
gồm các thuốc thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolones như Levofloxacin,
Moxifloxacin, Gatifloxacin. Nhóm B là các thuốc tiêm hàng hai như Amikacin,
Capreomycin, Kanamycin. Nhóm C là các thuốc hàng hai chủ đạo khác như
Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide. Nhóm D là các
thuốc bổ sung, không thuộc nhóm chủ đạo như: Isoniazid liều cao, Pyrazinamide,

Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem [18]. Đây là các thuốc được dùng khi bệnh
nhân bị kháng với thuốc lao hàng một, hay dùng trong một số trường hợp đặc biệt.
Các thuốc này thường có nhiều tác dụng phụ hơn và việc sử dụng thuốc cũng phức
tạp hơn thuốc kháng lao hàng một. Ngoài ra, giá thành của các thuốc kháng lao
hàng hai cũng đắt hơn rất nhiều. Nhận diện nhanh các chủng kháng thuốc, đặc biệt
là các chủng kháng RMP và INH, sẽ tạo điều kiện để áp dụng kịp thời các biện
pháp điều trị thích hợp; và điều này là vô cùng quan trọng trong giảm sự lan
truyền của các chủng kháng thuốc.

Khoa Sinh học

6

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Có thể phân loại lao kháng thuốc dựa vào tính kháng các loại thuốc chống
lao hàng một như sau[18]: Nếu vi khuẩn kháng một loại trong các loại thuốc kháng
lao hàng một mà không phải là Rifampicin thì được gọi là kháng một loại thuốc.
Nếu vi khuẩn lao kháng với trên một loại thuốc chống lao hàng một nhưng không
kháng Rifampicin thì được gọi là kháng nhiều loại thuốc. Nếu vi khuẩn kháng
Rifampicin, có hoặc không kháng thêm các thuốc khác trừ Isoniazid thì được gọi là
kháng Rifampicin. Vi khuẩn kháng đồng thời với ít nhất hai thuốc chống lao là
Isoniazid và Rifampicin thì được gọi là lao đa kháng thuốc (MDR-TB).
Dựa trên tính kháng thuốc với các thuốc chống lao hàng hai để phân loại lao
siêu kháng thuốc. Lao tiền siêu kháng: Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ

thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone hoặc với ít nhất một trong ba thuốc tiêm
hàng hai Capreomycin, Kanamycin, Amikacin. Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB):
Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone và
bất cứ thuốc nào trong ba thuốc tiêm hàng hai (Capreomycin, Kanamycin,
Amikacin).
Ngoài ra còn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị:
- Lao mới là người bệnh lao chưa bao giờ dùng thuốc chống lao hoặc dùng
thuốc dưới một tháng. Lao phổi mới là bệnh nhân lao mới mắc thể lao phổi.
- Lao tái trị là người bệnh lao đã dùng thuốc chống lao từ một tháng trở lên
có thể là người bệnh đã điều trị khỏi lao từ lần trước hoặc điều trị thất bại trước đây
do nhiều nguyên nhân. Lao phổi tái trị là bệnh nhân lao tái trị mắc thể lao phổi
Trong lao tái trị người bệnh có thể tái nhiễm ngoại sinh (chủng vi khuẩn
khác với chủng vi khuẩn ban đầu) hoặc do tái phát (chủng vi khuẩn giống với chủng
vi khuẩn ban đầu) [64], [21].
1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao
Kháng thuốc là hiện tượng giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn lao với thuốc
điều trị lao in vitro với nồng độ vừa đủ hợp lý của một vài chủng kiểm tra so với
chủng hoang dại chưa từng tiếp xúc với thuốc điều trị lao [53].

Khoa Sinh học

7

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xảy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa
sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào; kháng thuốc thứ phát là kháng thuốc
sau khi bệnh nhân lao đã có tiếp xúc với thuốc. Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng
thuốc của chủng kiểu dại. Ví dụ như M.tuberculosis kháng tự nhiên với penicilin
[43]. Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên khác nhau tùy từng loại loại thuốc đặc
hiệu: Rifampicin là 1/108, Isoniazid là 1/106, Streptomycin và Ethambutol là 1/105.
Trong quá trình nhân lên của vi khuẩn tính kháng thuốc sẽ được phát sinh do các
đột biến ngẫu nhiên. Khi không có mặt của thuốc, các chủng mẫn cảm sẽ phát triển
lấn áp các chủng có đột biến khác. Khi có mặt của thuốc sẽ tạo thành áp lực chọn
lọc và chủng đột biến kháng thuốc sẽ trở nên ưu thế và và lây lan sang người khác
làm cho người bị nhiễm vi khuẩn lao này sẽ kháng thuốc ngay từ đầu [43].
Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao cũng giống như cơ chế kháng kháng sinh
ở các loại vi khuẩn khác do sự hạn chế xâm nhập của kháng sinh vào bên trong
thành tế bào hoặc sản xuất ra các men (enzzyme) để phá hủy kháng sinh hoặc che
chắn hay làm biến đổi đích tác động của kháng sinh và làm kháng sinh mất hiệu lực.
Ở 70-80% vi khuẩn lao kháng INH người ta nhận thấy có sự biến đổi ở gen katG
làm giảm hoặc mất hoạt tính men catalase-peroxidase do đó sẽ làm giảm hoặc mất
tác dụng của INH đối với vi khuẩn lao [5]. INH sẽ mất khả năng ức chế sự tổng hợp
axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao vì vậy mà vi khuẩn lao sẽ kháng
thuốc. Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có chứa đột biến gen rpoB làm cho
RMP mất khả năng ức chế men RNA-polymeraza của vi khuẩn lao. Tùy từng loại
thuốc với cơ chế tác động khác nhau sẽ có cơ chế kháng thuốc khác nhau. Cơ chế
kháng một số thuốc của vi khuẩn lao được trình bày trong hình 1.3.

Khoa Sinh học

8

Khoá 2016-2018

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi
khuẩn lao
Theo WHO, năm 2014 số lượng ước tính của các ca nhiễm đa kháng thuốc
(MDR/RR-TB) và siêu kháng thuốc (XDR-TB) trong số bệnh nhân nhiễm mới là
480.000, nhưng chỉ khoảng 25% trong số này được chẩn đoán và báo cáo. Trong năm
2014, ước tính có 190.000 người chết vì MDR-TB. Đến năm 2015, đã có báo cáo
xuất hiện XDR-TB ở 105 quốc gia; khoảng 9,7% bệnh nhân nhiễm MDR-TB sẽ bị
XDR-TB. Và tính đến năm 2016 ước tính có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB
nhưng chỉ có 153.000 ca được báo cáo và 130.000 ca được điều trị [67].
Việt Nam nằm trong nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc
cao nhất thế giới, xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều
nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015). Bên cạnh đó, Việt Nam là 1 trong 20
quốc gia xảy ra 80% trường hợp nhiễm TB mới của thế giới. Hiện tượng kháng
thuốc đã được giám sát từ năm 1978, và tỉ lệ giảm dần đến năm 1998. Năm 19961997 Việt Nam đã tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao trên toàn
cầu của WHO cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát khá cao 32,5% trong đó có cả

Khoa Sinh học

9

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

2,3% kháng đa thuốc. Nghiên cứu năm 2005-2006 tỷ lệ kháng thuốc tiên phát có
giảm nhưng không đáng kể 30,9%; kháng thuốc thứ phát ở bệnh nhân lao đã điều
trị là 58,9% và đặc biệt là tỷ lệ đa kháng ở lao mới (kháng tiên phát) cũng không
giảm 2,7% và ở bệnh nhân lao tái trị là 19.3%. Vào năm 2006, tỉ lệ kháng thuốc
lại tăng 12,52% so với năm 1978 (30,7% và 18,18%). Những nghiên cứu đơn lẻ
của một số cá nhân quanh thời điểm này cũng cho thấy những kết quả kháng thuốc
tương tự [3].
Lê Ngọc Hưng và cộng sự (2008) nghiên cứu 193 bệnh nhân lao phổi tái trị
tại Bệnh viện Phổi trung ương cho thấy tỷ lệ kháng đa thuốc là 62,9% [8]. Chu Thị
Mão và cộng sự (2007) cũng tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân lao phổi mới cho
thấy tỷ lệ lao đa kháng là 4% [9]. Lê Thị Kim Hoa (2008) nghiên cứu trên bệnh
nhân lao mới và lao tái trị cho thấy tỷ lệ đa kháng trên lao mới là 8,5% và trên lao
tái trị là 40,3% [7]. Trong các năm gần đây, tỉ lệ về tính kháng ít nhất 1 thuốc được
báo cáo: ví dụ kháng INH là 16% - 25%, và tỉ lệ MDR-TB là 2%-4% đối với bệnh
nhân điều trị lần đầu, 17%-18% với bệnh nhân điều trị tái trị. Năm 2017, theo
WHO, tại Việt Nam tỷ lệ ước tính lao kháng MDR/RR-TB ở thể lao mới là 4,1% và
17% ở thể lao tái trị. Có thể thấy, tình hình kháng thuốc lao tại Việt Nam vẫn đang
được theo dõi, tập trung nhiều vào nhóm vi khuẩn lao đa kháng thuốc.
1.3. Isoniazid trong điều trị lao
1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid
Isoniazid (viết tắt là INH), là một hydrazid của axit isonicotinic được tổng
hợp lần đầu tiên ở Praha năm 1912 nhưng đến năm 1952 mới biết được tác dụng
của INH với vi khuẩn lao. Isoniazid có cấu trúc đơn giản chứa vòng pyridine và
nhóm hydrazide có tác dụng kìm hãm sinh trưởng và diệt vi khuẩn lao trong và
ngoài tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là thông qua sự ức chế hình thành axit
mycolic có ở thành tế bào vi khuẩn lao [15]. Tuy nhiên, INH cũng được phát hiện
là có thể bị kháng bởi M.tuberculosis liên quan tới các đột biến ở nhiều gen, bao

gồm katG, ahpC, inhA, kasA, ndh. INH là một tiền thuốc cần được hoạt hóa bởi

Khoa Sinh học

10

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

catalase/ peroxidase mã hóa bởi katG. INH đã hoạt hóa sẽ can thiệp vào quá trình
tổng hợp một thành phần thiết yếu của vi khuẩn lao là mycolic acid bằng cách ức
chế NADH-dependent enoyl-ACP reductase được mã hóa bởi inhA. Hai cơ chế
phân tử này chính là các nguyên nhân chính dẫn đến tính kháng Isoniazid: đột biến
trên katG và inhA.
Sau khi uống, INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần
kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có
tác dụng với vi khuẩn lao. Phần còn lại sẽ được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp
chất không có tác dụng với vi khuẩn lao. Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa
bởi enzyme NAT2 như Hình 1.4 tạo thành acetyl Isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị
thủy phân tạo thành acetyl hydrazine. Một con đường khác là INH có thể bị thủy
phân trực tiếp tạo ra hydrazin. Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của
hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl hydrazin. INH, Acetyl hydrazine và
hydrazin có thể bị oxi hóa bởi cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) tạo thành các hợp
chất trung gian gây độc cho cơ thể. Enzyme glutathione S-transferase (GST) có thể
kết hợp với các chất trung gian này với glutathione và loại bỏ các chất chuyển hóa
độc hại này. Các chất chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua

hệ tiết niệu (chiếm 80%). Dưới 10% liều INH được đào thải qua phân [40].

CYP2E1: cytochrome P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase 2
Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [40].

Khoa Sinh học

11

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH với vi khuẩn lao là
0,04 µg/mL, hệ số vượt là 20 ở người có kiểu hình acetyl hóa nhanh và 62 ở người
có kiểu hình acetyl hóa chậm. Nồng độ của INH trong huyết thanh của mỗi người
khác nhau phụ thuộc vào kiểu hình acetyl hóa của cá thể. Khi uống INH liều 5
mg/kg sau 1-2 giờ sẽ đạt nồng độ tối đa trong huyết tương là 3-5 µg/mL [15], [18].
Liều dùng hàng ngày của INH là 5 mg (4-6 mg)/kg thể trọng cho cả trẻ em
và người lớn, liều hàng ngày tối đa là 300 mg, nên uống một lần lúc đói. Liều cách
quãng 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng 2 lần/tuần là 15
mg/kg thể trọng (13-17 mg) [10].
INH có thể gây các tác dụng phụ trên hệ thần kinh và gan. Trên hệ thần kinh,
INH có thể gây ra viêm dây thần kinh, co giật, viêm dây thần kinh thị giác, rối
loạn tâm thần. Tại gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng chán ăn,
buồn nôn, nôn, mệt mỏi. 10 – 20% bệnh nhân sử dụng INH có thể có nồng độ
transaminase huyết thanh (AST, ALT), bilirubin máu, bilirubin nước tiểu tăng

bất kì trong đợt điều trị, nhưng thường tăng trong 1 đến 3 tháng đầu và sau đó trở
lại bình thường. Ngoài ra bệnh nhân có thể gặp một số tác dụng phụ khác như:
buồn nôn, nôn, đau thượng vị, viêm tụy; thiếu máu, giảm hoặc mất bạch cầu hạt,
giảm bạch cầu ưa axit giảm tiểu cầu, sốt, viêm da [55].
1.3.2. Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao
Tổn thương gan do thuốc chống lao là một tác dụng phụ phổ biến, đa phần
do INH gây ra. Quá trình chuyển hóa INH đóng vai trò quan trọng trong tổn thương
gan [59]. Sự khác biệt về độc tính của INH gây ra là do sự biến đồi về di truyền ở
một số gen như: N - acetyltransferase 2 (NAT2), Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1),
glutathione S - transferase M1 (GSTM1), glutathione S - transferase T1 (GSTT1)
[45].
CYP2E1 là gen mã hóa cho enzyme CYP2E1 có tác dụng chuyển hóa thuốc
ở gan. CYP2E1 xúc tác quá trình oxy hóa AcHz và Hz tạo ra các chất trung gian
gây độc cho cơ thể [42]. Sự đa hình của gen CYP2E1 quyết định khả năng hoạt
động của gen, hoạt tính cao hơn của enzyme này có thể làm tăng sự tổng hợp của
các độc tố gan [61].

Khoa Sinh học

12

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Các enzyme thuộc họ Glutathione S - transferase (GST) tham gia vào khả
năng giải độc cho cơ thể, chúng chuyển các chất trung gian gây độc hoặc các sản

phẩm oxy hóa thành chất ít hoặc không gây độc và giúp cơ thể đào thải ra ngoài.
GST tham gia quá trình chuyển hóa của thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng
liên hợp các chất chuyển hóa trung gian gây độc ở dạng tiềm ẩn [40]. Sự thiếu hụt
hoạt tính GST do sự đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể ảnh hưởng
đến tính nhạy cảm với độc tính gan do INH gây ra. Nguy cơ nhiễm độc gan do
INH ở bệnh nhân Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến đã tăng so với nhóm
còn lại [34] . Tuy nhiên ở một số nghiên cứu khác lại chỉ ra không chỉ ra được tính
liên quan giữa sự đa hình của gen GST và nguy cơ tổn thương gan. Ngoài ra còn có
một số gen khác cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa INH như HLADQA1/DQB1 [54].
So với các enzyme trên, N-acetyltransferase 2 (NAT2) là enzyme được
chứng minh có vai trò quan trọng nhất liên quan tới chuyển hóa Isoniazid. Đa hình
gen NAT2 ảnh hưởng đến tốc độ acetyl hóa, tạo ra các kiểu hình acetyl hóa chậm
làm tăng nồng độ INH trong huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH và tăng
các sản phẩm chuyển hóa trung gian gây độc cho cơ thể [45], [36].
1.4. Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2
NAT là một loại enzyme xúc tác quá trình acetyl hóa arylamine từ acetylCoA. Nó được tìm thấy ở nhiều loài khác nhau. NAT1 và NAT2 là các gen chính
của NAT nằm gần nhau trên nhiễm sắc số 8, vị trí 8p22. Biểu hiện của 2 gen này
khác nhau ở các mô riêng biệt và các enzyme có các ưu tiên khác nhau. NAT1 biểu
hiện ở hầu hết các mô như mô thần kinh, gan, đường tiêu hóa, tế bào máu, trong khi
NAT2 chỉ giới hạn tại gan và đường tiêu hóa [32]. Gen NAT2 gồm hai exon, exon 2
là một khung đọc mở dài 870 bp (tức là các vùng mã hóa protein) không có intron.
Đa hình gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm làm tăng nồng độ INH trong
huyết thanh, giảm tốc độ thanh thải của INH, tăng các sản phẩm chuyển hóa trung
gian gây độc cho cơ thể [48], [44] .

Khoa Sinh học

13

Khoá 2016-2018

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8
Sự đa hình của gen NAT2 có vai trò quan trọng trong việc biểu hiện các vai
trò của gen ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng thuốc cũng như gia tăng tỷ lệ mắc một
số bệnh khi tiếp xúc với các yếu tố phơi nhiễm. Dựa vào kiểu gen của NAT2, các
nhà khoa học đã chia kiểu hình của enzyme NAT2 thành 3 dạng: kiểu hình acetyl
hóa nhanh (RA), acetyl hóa chậm (SA), acetyl hóa trung gian (IA). Các nghiên cứu
đều chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa nhanh khi mang 2 alen kiểu dại (NAT2*4*4),
acetyl hóa trung bình khi có 1 alen kiểu dại (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6 và
NAT2*4/*7) và acetyl hóa chậm khi có 2 đa hình alen (NAT2*5/*5, NAT2*5/*6,
NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7 và NAT2*7/*7) [44]. Hiện nay, các nhà di
truyền học đã xác định được alen kiểu dại (được qui ước là NAT2*4) và 88 biến thể
trên gen NAT2 [30]. Trong các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, 3 alen
NAT2*5, *6, *7 được nghiên cứu nhiều nhất. Alen NAT2*5 có axit amin thay thế là
I1e114Thr; alen NAT2*6 có axit amin thay thế là Arg197Gln, alen NAT2*7 có axit
amin thay thế là Gly286Glu. Thường gặp nhất là nhóm cá thể có kiểu hình acetyl
hóa nhanh, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại (NAT2*4) ở cả 3 vị trí SNP (T341C,

Khoa Sinh học

14

Khoá 2016-2018

Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

G590A, G857A). Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình thường có kiểu gen
dị hợp tử về alen biến đổi ở một locus đơn, tức là một trong 3 vị trí NAT2*5, *6
hoặc *7 . Những người acetyl hóa chậm là những người có nhiều hơn một đa hình
alen. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh, những bệnh nhân có kiểu hình
acetyl hóa chậm có nguy cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại
điều trị cao hơn 2 kiểu hình còn lại. Đa hình gen cho thấy có sự khác biệt ở các
chủng tộc, gần 50% người da trắng Châu Âu cho kiểu hình acetyl hoá chậm, trong
khi đó ở người Nhật chỉ có 10% có kiểu hình acetyl hoá chậm. Trên quần thể bệnh
nhân Nhật và Đài Loan, bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa INH chậm có thể bị
nhiễm độc gan cao hơn 28 lần so với những bệnh nhân có kiểu hình chuyển hóa
nhanh [50]. Một nghiên cứu của Hàn Quốc cũng chỉ ra rằng kiểu hình acetyl hóa
chậm có nguy cơ nhiễm độc gan cao gấp 3 - 8 lần khi điều trị bằng INH so với kiểu
chuyển hóa nhanh. Wang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp 14 nghiên
cứu khác trên 474 trường hợp và 1446 nhóm chứng đã cho thấy mối liên quan đáng
kể giữa các chất acetyl hóa chậm và nguy cơ nhiễm độc gan do INH [57]. Tại Việt
Nam, nghiên cứu gần đây của Phạm Thị Hồng Nhung và cộng sự (2011) trên 100
người Việt Nam khỏe mạnh bằng phân tích đa hình gen của NAT2 cho thấy người
Việt Nam có loại hình acetyl hóa nhanh chiếm tỷ lệ lớn [46].
Enzyme NAT2 có vai trò quan trọng trong việc giúp cơ thể tránh khỏi các
phản ứng quá khích với thuốc và môi trường. NAT2 có khả năng hoạt hóa sinh học,
giải độc nhiều thuốc và các hóa chất độc hại, bao gồm cả các hợp chất gây ung thư.
Các nghiên cứu trong hơn 50 năm trở lại đây đã chứng minh được tầm quan trọng
của việc xác định kiểu hình acetyl hóa ở các cá thể mắc lao hoặc một số cá thể phơi
nhiễm với các tác nhân ung thư. Việt Nam hiện đang đứng thứ 14/30 nước có gánh
nặng bệnh lao cao nhất thế giới, chính vì vậy việc xác định kiểu hình acetyl hóa
không chỉ có thể giúp các nhà lâm sàng định hướng trong xác định liều Isoniazid

cho mỗi cá thể khi điều trị lao mà còn cung cấp nguồn dữ liệu về yếu tố di truyền để
có thể đánh giá những yếu tố nguy cơ đối với người mắc bệnh lao, đặc biệt là mắc
lao kháng Isoniazid.

Khoa Sinh học

15

Khoá 2016-2018


Luận văn Thạc sĩ khoa học

Nguyễn Thị Thu Hà

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị
Thiết bị chính:

Hệ thống cấy nhanh BACTEC MGIT 960 hoặc 320

(BD,Mỹ), Tủ an toàn sinh học cấp II (Telstar), Máy ly tâm lạnh đủ tiêu chuẩn an
toàn sinh học, đủ lực ly tâm > 3000g (Mỹ), Máy lắc (Scientifica, Châu Âu), tủ lạnh
âm, tủ lạnh mát (Panasonic, Nhật), cân (Shinko, Nhật), Tủ ấm hoặc buồng ấm
(Memmert, Đức), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Nồi hấp ướt (Tomy, Nhật), Máy
soi chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific, Anh), Máy
PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li
tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer,
Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý).

Dụng cụ, vật tư: Lam kính trứng, ống thủy tinh vô trùng, lọ nhựa chia vạch
vô trùng, pipet nhựa chia vạch, pipet tự động loại 2-100µL và 1000µl và đầu côn vô
trùng, ăng nhựa vô trùng, ống bi vô trùng, găng tay, khẩu trang N95.
2.1.2. Hóa chất, môi trường
Các hóa chất chính dùng cho phân lập, nuôi cấy và kháng sinh đồ lao:
Dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm photphat, Bộ nhuộm Ziehl-Neelsen, Bộ
sinh phẩm nuôi cấy lỏng MGIT bao gồm: tube BBL MGIT 7mL; BACTEC MGIT
Growth Supplement 15ml; BBL MGIT PANTA; BD MGITTM TBcID test nhanh
định danh MTB, Sinh phẩm làm kháng sinh đồ lỏng PZA: Tube MGIT960 PZA,
BACTEC MGIT 960 PZA Supplement, Giá code AST, Lọ kháng sinh PZA 8000
µg/ml, Độ đục chuẩn 0.5 McFarland, Độ đục chuẩn 1.0 McFarland, Nước cất vô
trùng, Môi trường LJ có và không có kháng sinh.
Các hóa chất chính cho phân tích đa hình di truyền gen NAT2: E.Z.N.A
blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek), Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid,
(EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA
loading dye (hãng ThermoScientific), Gene Ruler Ladder DNA marker (hãng

Khoa Sinh học

16

Khoá 2016-2018