Luận văn sư phạm Ảnh hưởng của điều kiện hạn sâu tới hàm lượng Prolin và huỳnh quang diệp lục ở lá đậu tương

Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Lời cảm ơn
Để hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp của mình, em đã nhận đợc sự
chỉ bảo, giúp đỡ nhiệt tình của PGS.TS Nguyễn Văn Mã, các thầy cô giáo
trong tổ Sinh lý thực vật, cùng các thầy cô giáo khoa Hoá học, các bạn sinh
viên khoa Sinh KTNN trờng Đại học S phạm Hà Nội 2.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý
báu của PGS.TS Nguyễn Văn Mã, các thầy cô giáo và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2009
Sinh viên
Hà Thị Phơng Lan

1


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Lời cam kết
Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam kết nh sau:
1. Đề tài của tôi không hề sao chép từ bất kì đề tài có sẵn nào.
2. Đề tài của tôi không trùng với một đề tài nào khác.
3. Kết quả thu đợc trong đề tài là do nghiên cứu thực tiễn đảm bảo
tính chính xác, tính trung thực.
Sinh viên
Hà Thị Phơng Lan

2


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

mục lục
TRANG

DANH MụC hình V BảNG

5

mở đầu

6

1

Tính cấp thiết của đề tài

6

2

Nhiệm vụ nghiên cứu

9

3

ý nghĩa thực tiễn

9

Nội Dung

10

chơng 1: tổng quan ti liệu

10

1

ảnh hởng của nớc đến quá trình sinh trởng và phát
triển của đậu tơng

10

1.1

Các thời kì sinh trởng của đậu tơng

10

1.2

Vai trò của nớc đối với thực vật

11

1.3

ảnh hởng của nớc đối với cây đậu tơng

11

2

Huỳnh quang diệp lục và những nghiên cứu về huỳnh
quang diệp lục ở thực vật

12

2.1

Huỳnh quang diệp lục

12

2.2

Những nghiên cứu về huỳnh quang diệp lục ở thực vật

15

3

Prolin và vai trò của prolin đối với đời sống thực vật

1

3.1

Prolin

15

3.2

Những nghiên cứu về prolin đối với tính chống chịu ở
thực vật

chơng 2: đối tợng, phơng pháp nghiên cứu
1

đối tợng nghiên cứu

17
19
19

3


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

2

phơng pháp nghiên cứu

19

2.1

phơng pháp bố trí thí nghiệm

19

2.2

phơng pháp xác định huỳnh quang diệp lục

20

2.3

phơng pháp xác định prolin

21

2.4

Phơng pháp xử lý số liệu

23

chơng 3: kết quả nghiên cứu v thảo luận
1

Sự biến động huỳnh quang diệp lục trong điều kiện hạn
sâu

24
24

1.1

Huỳnh quang ổn định

24

1.2

Huỳnh quang cực đại

27

1.3

Hiệu suất huỳnh quang biến đổi

29

2

sự biến động của hàm lợng prolin trong điều kiện hạn
sâu

32

2.1

sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì cây non

34

2.2

sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì ra hoa

35

2.3

sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì quả non

36

2.4

sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì quả chắc

37

KÊT LUậN

40

KHUYếN NGHị

41

TI LIệU THAM KHảO

42

PHụ LụC

45

4


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

danh mục HìNH v bảng
STT
Bảng 1
Bảng 2
Bảng 3
Bảng 4

Tên bảng

Trang

S bi n i hu nh quang n nh (Fo) trong pha h n sâu

25

và pha ph c h i
S bi n i hu nh quang c c i (Fm) trong pha h n sâu
và pha ph c h i.
Hi u su t hu nh quang bi n i (Fv/m) trong pha h n sâu

Hình 2
Hình 3
Hình 4
Hình 5
Hình 6
Hình 7

31

và pha ph c h i.
S bi n ng hàm l

ng prolin trong pha h n sâu và

33

ph c h i (mg/g)

STT
Hình 1

28

Tên hình

Trang

Sự biến đổi cờng độ huỳnh quang ổn định ( Fo) trong

24

pha hạn sâu và pha phục hồi
Sự biến đổi cờng độ huỳnh quang cực đại (Fm) trong

27

pha hạn sâu và pha phục hồi
Hiệu suất huỳnh quang biến đổi ( Fv/m) trong pha hạn

30

sâu và pha phục hồi
Sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì cây non trong

34

pha hạn sâu và pha phục hồi
Sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì ra hoa trong

35

pha hạn sâu và pha phục hồi
Sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì quả non trong

37

pha hạn sâu và pha phục hồi
Sự biến động hàm lợng prolin ở thời kì quả chắc trong
pha hạn sâu và pha phục hồi

5

38


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

mở đầu

1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đậu tơng hay đậu nành (Glycine max), thuộc bộ đậu (Fabales), họ
Fabaceae có nguồn gốc từ cây đậu tơng hoang dại dạng thân leo, sống hàng
năm đợc phát hiện ở Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản. Chúng có nhiều
chủng loại khác nhau, thích nghi với các điều kiện khí hậu từ ôn đới tới nhiệt
đới [4].
Trong số các cây họ Đậu, đậu tơng có sản lợng và diện tích đứng đầu

thế giới. Diện tích trồng đậu tơng hàng năm trên thế giới đạt 53,6 triệu ha với
sản lợng 96 triệu tấn. Nếu năm 1940 tổng diện tích trồng đậu tơng trên thế
giới là 12,4 triệu ha thì năm 1995 đạt 57,73 triệu ha, năng suất bình quân 1690
kg/ha, sản lợng 97,5 triệu tấn [1].
Quê hơng của đậu tơng là Đông nam Châu á, nhng 48% diện tích
trồng đậu tơng và 56% sản lợng đậu tơng của thế giới nằm ở Mỹ. Nớc
Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu tơng năm 2000, trong đó hơn một phần ba đợc
xuất khẩu. Các nớc sản xuất đậu tơng lớn khác là Braxin, Achentina, Trung
Quốc và ấn Độ [6]. Phần lớn sản lợng đậu tơng của Mỹ hoặc để nuôi gia
súc hoặc để xuất khẩu mặc dù tiêu thụ đậu tơng ở ngời trên đất nớc này
đang tăng lên. Dầu đậu tơng chiếm tới 80% lợng dầu ăn đợc tiêu thụ ở Mỹ.
Đến năm 2005, tổng sản lợng đậu tơng trên thế giới đạt 221,55 triệu
tấn, tăng 3,85% so với năm 2004 (đạt 213,34 triệu tấn). Trong đó, sản lợng
một số nớc (đơn vị: triệu tấn) đạt nh sau: Mỹ 82,82; Braxin 59,50;
Achentina 40,5; Paragoay 4,8; Trung Quốc 17,0; ấn Độ 6,0.
Sản phẩm đậu tơng có nguồn protein, lipit, gluxit, vitaminphong
phú, làm thức ăn tốt cho ngời và gia súc, làm nguồn nguyên liệu cho công
nghiệp thực phẩm, chăn nuôi và chế biến. Sản phẩm của đậu tơng là mặt

6


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

hàng có kim ngạch xuất khẩu cao [10]. Hàm lợng protein trong đậu tơng
chiếm tỉ lệ cao (40% - 46%), là thức ăn bổ sung cho khẩu phần hạt cốc. Đây là
nguồn protein thực vật quan trọng. Dầu đậu tơng chứa chủ yếu các axit
không no, có khả năng đồng hoá cao, có tác dụng giảm lợng colesterol trong

máu. Đậu tơng có chứa nhiều vitamin (A, B, E, F) nhất là vitamin nhóm B.
Ngoài ra đậu tơng còn chứa các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S. Cũng
nh các cây họ Đậu khác đậu tơng cũng có tác dụng tốt trong việc cải tạo đất
trồng chủ yếu là nhờ hoạt động cố định nitơ tự do của các loài vi khuẩn
Rhizobium cộng sinh trong nốt sần của cây họ Đậu, chúng có khả năng cố
định nitơ tự do, cung cấp lợng lớn đạm cho đất, cho cây.
Đậu tơng là cây trồng có thời gian sinh trởng ngắn, thích nghi với
nhiều phơng thức canh tác nh: luân canh, xen canh...nên có thể nâng cao
hiệu quả sử dụng đất từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế.
Chính vì vậy mà diện tích trồng đậu tơng trên thế giới tăng nhanh trong
những năm gần đây.
Hiện nay trên thế giới diện tích đất hoang hoá ngày càng nhiều, riêng ở
nớc ta 3/4 diện tích là đồi núi, phần lớn đất bạc màu và thờng bị khô hạn do
khả năng giữ nớc kém. Những năm gần đây, hạn hán là một trong những
nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất của cây trồng trong đó có đậu
tơng. Viện sĩ Mắc - Ximốp đã nói: Hạn hán dẫu chỉ đi qua có tính chất tạm
thời cũng không phải đi qua mà không để lại dấu vết gì tác hại cho cây. Vì
vậy, việc tìm ra những giống đậu tơng có khả năng chịu hạn và các biện pháp
nhằm nâng cao tính chịu hạn là vấn đề có ý nghĩa thực tiễn sâu sắc.
Phơng pháp nghiên cứu hàm lợng diệp lục và huỳnh quang diệp lục
đang đợc nhiều nhà khoa học quan tâm, nhất là trong điều kiện bất lợi của
môi trờng. Huỳnh quang diệp lục là thông số phản ánh trạng thái sinh lý của
bộ máy quang hợp trong điều kiện bất lợi của môi trờng. Phơng pháp đo
huỳnh quang diệp lục cho phép xác định khả năng chống chịu của thực vật đối

7


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

với tác động bất lợi của môi trờng mà không gây tổn thơng cho cây trồng
trong quá trình nghiên cứu. Vì vậy, phơng pháp nghiên cứu huỳnh quang
diệp lục đang đợc sử dụng nh một công cụ có hiệu quả để đánh giá tính
chống chịu ở một số loài cây trồng nh: cà chua, lạc, nhãn, lúa[8]
[9][15][16]. Kết quả những nghiên cứu này giúp chúng ta phân loại, chọn tạo
những giống chống chịu hạn tốt một cách nhanh chóng.
Prolin là một trong những chất có vai trò điều hoà áp suất thẩm thấu ở
tế bào thực vật, đợc xem nh thành phần của hệ thống giữ gìn pH của tế bào
và điều chỉnh thế khử ở tế bào. Hàm lợng prolin trong rễ và lá cây sống trong
điều kiện khô hạn tăng lên gấp nhiều lần so với cây sống trong điều kiện bình
thờng [21] [22], có thể xem axit amin này nh một chất chỉ thị về khả năng
chịu hạn của thực vật.
ở nớc ta đậu tơng là cây trồng quan trọng, có lịch sử phát triển lâu đời một trong những cây lơng thực chính sau lúa, ngô, đợc trồng nhiều ở vùng
núi, trung du, đồng bằng của cả nớc... Tuy nhiên do ảnh hởng của khí hậu
thời tiết và kĩ thuật canh tác nên năng suất đậu còn thấp (trung bình chỉ đạt 10
- 12 tạ /ha vụ đông; 12 -15 tạ/ha vụ hè thu ) [6], công tác nghiên cứu khoa học
vẫn cha phát triển tơng xứng với vị trí, khả năng, tiềm lực của cây đậu tơng
mệnh danh là cây trồng kì lạ, vàng mọc trên đất [7]. Đậu nành mới chỉ
đợc quan tâm và bắt đầu đợc nghiên cứu từ thập niên 60 - 70 của thế kỷ
XX. Có lẽ thí nghiệm tại trại Sông Lô (1953) của viện trồng trọt, do viện
trởng Bùi Huy Đáp chỉ đạo đợc xem là thí nghiệm chính quy đầu tiên về
cây đậu nành ở Việt Nam. Trong những năm tiếp theo đã có nhiều công trình
nghiên cứu về các lĩnh vực khác nhau đối với đối tợng này nh nghiên cứu về
sinh trởng, dinh dỡng, kĩ thuật gieo trồng, năng suất, chống chịu... Có thể
kể đến các nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng, Trần Đình Long, Ngô Đức
Dơng về việc đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tơng nhập
nội [6], Sự hình thành nốt sần ở một số giống chịu hạn [4], Trần Phơng Liên
8

Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn và thành phần điện
di protein hạt đậu tơng. Nguyễn Văn Mã đã nghiên cứu khả năng quang hợp,
khả năng giữ nớc và hút nớc, khả năng tạo nốt sần ở rễ qua các thời kỳ sinh
trởng của một số giống đậu tơng có năng suất cao trên đất bạc màu [9]...
Việc nghiên cứu sâu sự biến động huỳnh quang diệp lục và hàm lợng
prolin trong điều kiện hạn sâu ở các giai đoạn sinh trởng và phát triển của
đậu tơng để tìm hiểu rõ hơn tác hại của hạn hán và phản ứng ở mức độ cao
của cơ thể thực vật với môi trờng bất lợi, để từ đó đánh giá đúng khả năng
chịu hạn của các giống đậu tơng giới thiệu cho sản xuất lại là vấn đề rất cần
thiết đang cần đợc nghiên cứu. Vì vậy, chúng tôi đã triển khai nghiên cứu về
huỳnh quang diệp lục và hàm lợng prolin ở lá đậu tơng qua 4 thời kì: cây
non (3 lá), ra hoa, quả non, quả chắc.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu.
- Xác định sự biến động huỳnh quang diệp lục, hàm lợng prolin trong
pha hạn sâu và pha phục hồi ở 4 thời kì sinh trởng và phát triển.
- So sánh tác động của hạn tới huỳnh quang diệp lục và hàm lợng
prolin giữa các thời kì đó.
3. ý nghĩa thực tiễn.
- Tìm hiểu sâu về huỳnh quang, hàm lợng prolin góp phần bổ sung
nguồn tài liệu về nghiên cứu huỳnh quang, hàm lợng prolin của lá đậu tơng
trong quá trình gây hạn. Khẳng định thêm vai trò của prolin đối với khả năng
chịu hạn của thực vật nói chung và của đậu tơng nói riêng.
- Kết quả nghiên cứu có thể cung cấp t liệu cho việc xác định nhanh
khả năng chống chịu với môi trờng bất lợi của các giống đậu tơng đang gieo

trồng và các giống nhập nội để có lựa chọn và định hớng gieo trồng trong
những vùng và mùa vụ thích hợp, góp phần nâng cao năng suất cây trồng.
9


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

NộI DUNG
CHƯƠNG 1: TổNG QUAN TI LIệU
1. ảnh hởng của nớc đến quá trình sinh trởng và phát triển của
đậu tơng
1.1. Các thời kì sinh trởng của đậu tơng.
Quá trình sinh trởng và phát triển ở đậu tơng gồm 5 thời kì chính sau:
* Thời kì nảy mầm và mọc: Đợc tính từ khi gieo hạt giống xuống đất
cho đến khi thân vơn lên khỏi mặt đất, hai lá mầm xoè ra. Trong thời kì này
cây đậu tơng con sinh trởng chủ yếu dựa vào chất dinh dỡng do lá mầm
cung cấp để phát triển thân non và bộ rễ.
* Thời kì cây non: Đợc tính từ khi cây mọc cho đến khi cây nở nụ hoa
đầu tiên, đây là thời kì sinh trởng mạnh của rễ, thân, lá.
* Thời kì nở hoa: Đợc tính từ khi cây ra hoa đầu tiên cho đến khi ra
hoa cuối cùng. Cây ra hoa sớm hay muộn tuỳ giống, thời vụ gieo trồng, vĩ độ
trái đất...Hoa thờng bắt đầu từ đốt thứ t đến đốt thứ tám trở lên. Đây là thời
kì rất quan trọng vì nó ảnh hởng đến năng suất của giống.
* Thời kì hình thành quả và hạt: Đợc tính từ giai đoạn ra hoa. Quả đầu
tiên đợc hình thành trong vòng 7 - 8 ngày kể từ lúc hoa nở. Các yếu tố nhiệt
độ, độ ẩm..có tác động rất lớn đến tốc độ phát triển của quả và hạt.
* Thời kì chín: Đợc tính từ khi hạt đã phát triển đạt đến kích thớc tối
đa và đạt đến độ chín sinh lý, vỏ hạt có màu sắc đặc trng của giống, vỏ quả

chuyển dần sang màu vàng, màu tro, đen xám...
Trong thời gian hoa nở thì thân, cành, lá, rễ của cây đậu tơng vẫn phát
triển mạnh. Giai đoạn này cây cần tiêu thụ nhiều chất dinh dỡng, vì vậy cần
đáp ứng đủ nớc và phân bón cho cây.

10


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

1.2. Vai trò của nớc đối với thực vật.
Mỗi loài thực vật có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh
thái của môi trờng nh: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng ở ngoài giới hạn của các
yếu tố đó thực vật sẽ gặp điều kiện bất lợi cho sự sinh trởng phát triển của
chúng. Khả năng ngăn ngừa tổn thơng khi bị tác động hay sự thích ứng đối
với các nhân tố bất lợi khi điều kiện sống thay đổi của thực vật gọi là tính
chống chịu của thực vật.
Nớc là nhân tố quan trọng bậc nhất đối với tất cả các sinh vật. Trong
cơ thể nớc là thành phần chính chiếm 60 - 90% khối lợng. Với thực vật,
nớc chiếm 90 - 95% khối lợng tơi của cơ thể. Nớc là dung môi hoà tan
các chất, là môi trờng cho các phản ứng sinh hoá. Nớc còn có vai trò hydrat
hoá, nớc hấp phụ trên bề mặt các hạt keo và màng tế bào tạo nên một lớp
mỏng bảo vệ cho các cấu trúc sống. Nó còn là một nguyên tố nối liền cây với
môi trờng bên ngoài, có vai trò quan trọng trong việc điều hoà nhiệt của cây.
1.3. ảnh hởng của nớc đối với cây đậu tơng
Đậu tơng có nhu cầu đặc biệt về độ ẩm do có đặc điểm riêng là rễ ăn
sâu vào đất, thuộc loại rễ trụ, có nhiều rễ con và phân nhánh mạnh. Nhu cầu
nớc của đậu tơng thay đổi tuỳ theo thời gian sinh trởng. Trong quá trình

sinh trởng nhu cầu nớc tăng dần. Hàng loạt các chỉ tiêu sinh trởng và năng
suất nh: chiều cao thân, số hoa, tỷ lệ đậu quả, số hạt và khối lợng hạt..đều
có tơng quan thuận với độ ẩm đất, do đó cung cấp nớc đầy đủ đảm bảo sức
căng cho tế bào và tốc độ sinh trởng của cây, tăng khả năng tích luỹ chất khô
của chúng. Thiếu nớc hạt không có khả năng nảy mầm, cây con bị héo, tạo
quả kém, giảm năng suất.
Hiện tợng mất nớc của cây có thể do nhiều nguyên nhân: nhiệt độ
thấp, nóng, hạn hán Trong đó hạn hán là nguyên nhân chủ yếu gây nên sự
mất nớc ở thực vật.
11


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Hạn là phức hệ các điều kiện khí tợng bất lợi gây ra sự thiếu nớc, mất
nớc ở thực vật, bao gồm: hạn trong đất và hạn trong không khí. Hạn trong đất
có thể do nhiệt độ thấp hoặc nồng độ dịch đất cao. Hạn trong không khí có thể
do độ ẩm quá thấp hoặc do nhiệt độ cao, gió mạnh. Từ đó gây tác động xấu
ảnh hởng đến sự sinh trởng và phát triển của cây trồng, cuối cùng là ảnh
hởng đến năng suất, phẩm chất của chúng.
Thiếu nớc trong cây làm cho lỗ khí đóng, làm giảm lợng CO2 thâm
nhập vào lá, khiến cho sự quang hợp giảm sút, suy giảm sự vận chuyển các
sản phẩm quang hợp từ lá đến cơ quan, bộ phận khác của cây, giảm việc gắn C
vào các hợp chất protit. Quá trình tổng hợp protit cũng bị giảm do sự tăng
cờng phân giải axit nucleic khi hạn hán.
2. Huỳnh quang diệp lục và những nghiên cứu về huỳnh quang diệp
lục ở thực vât.
2.1 Huỳnh quang diệp lục

Hiện tợng huỳnh quang là sự bức xạ ngắn hạn với bớc sóng dài hơn
bớc sóng ánh sáng hấp thụ và tắt đi đồng thời với sự tắt đi của nguồn sáng
kích thích.
Khi phân tử diệp lục nhận thêm năng lợng, nó chuyển tới một trạng
thái năng lợng mới: trạng thái kích thích, trạng thái này không bền vững và
sự quay lại trạng thái cơ bản diễn ra rất nhanh chóng bằng cách giải phóng
năng lợng hấp thụ theo những con đờng sau:
Một là có thể chuyển năng lợng tới một phân tử khác và cuối cùng
khởi động các phản ứng quang hoá, gây ra sự truyền điện tử quang hợp.
Hai là nó có thể bị hao phí dới dạng nhiệt.
Ba là nó có thể phát lại dới dạng phôtôn có năng lợng nhỏ hơn (tức là
có bớc sóng lớn hơn). Hiện tợng này gọi là huỳnh quang diệp lục.

12


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Huỳnh quang diệp lục ở thực vật cũng có một chỉ số phản ánh quang
hợp, nó liên quan mật thiết với phản ứng quang hoá. Trong ba quá trình truyền
năng lợng cạnh tranh nhau: những thay đổi của hiệu suất quang hợp hoặc sự
hao phí dới dạng nhiệt sẽ gây ra thay đổi của bức xạ huỳnh quang (trong
cùng điều kiện thì sự hao phí dạng nhiệt hầu nh là không đổi, chủ yếu là sự
cạnh tranh giữa phản ứng quang hoá và huỳnh quang diệp lục).
Ta có thể mô tả mối tơng quan của ba quá trình trên thông qua sơ đồ:
Kf + Kd + KPh
P*

P

P và P* là trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích của phân tử diệp lục.
Kf, Kd, KPh là các hằng số tốc độ làm mất đi trạng thái kích thích bằng
bức xạ (huỳnh quang), không bức xạ (mất đi dới dạng nhiệt) và quang hoá
(sự phân chia đầu tiên các điện tích trong tâm phản ứng).
Hiệu suất lợng tử của phân chia đầu tiên điện tích và huỳnh quang sẽ
tơng ứng bằng:
KPh
Qz =

KF
;

QFo =

KF + Kd + KPh

KF + Kd + KPh

Trong các điều kiện tối u, khi các tâm phản ứng hoạt động (tâm phản
ứng mở) hằng số KPh lớn so với các hằng số còn lại. Do đó năng lợng kích
thích đợc sử dụng trong phản ứng quang hợp với hiệu suất lợng tử Qz gần
bằng một đơn vị (=1) và chỉ có một phần nhỏ năng lợng kích thích (gần
0,3%) bị mất đi dới dạng huỳnh quang. Khi tâm phản ứng mở, xảy ra quá
trình oxi hoá hoàn toàn chấp nhận điện tử đầu tiên quinon (QA) còn khi các
tâm phản ứng đóng xảy ra khử chất nhận điện tử đầu tiên quinon (QA) và khi
đó hiệu suất huỳnh quang đạt giá trị cực đại. Nh vậy khi tâm phản ứng đóng
thì hằng số tốc độ mất trạng thái kích thích bằng quang hoá sẽ bằng không,
còn hiệu suất huỳnh quang tăng lên và đạt giá trị cực đại (Fm).

13


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

KF
QZ = 0

QFm =
KF + Kd + KPh

Hiệu số giữa cờng độ huỳnh quang khi tâm phản ứng đóng và mở
(Fv = Fm - Fo) đợc gọi là huỳnh quang biến đổi diệp lục. Nó tơng ứng với
phần năng lợng ánh sáng đợc các tâm phản ứng sử dụng trong các phản ứng
quang hoá. Một cách dễ dàng có thể chỉ ra rằng tỷ lệ huỳnh quang biến đổi
trên huỳnh quang cực đại bằng hiệu suất lợng tử của phản ứng quang hoá đầu
tiên phân chia các điện tích ở các tâm phản ứng quang hợp.
KPh
(QFm QFo) / QFm =
KF + Kd + KPh
Nh vậy, đo cờng độ huỳnh quang ổn định Fo và cực đại Fm trong một
đơn vị thời gian tơng đối cho phép nhận đợc giá trị tuyệt đối về hiệu quả sử
dụng năng lợng ánh sáng trong các phản ứng quang hóa.
Fv

Fm - Fo

Qz =

=
Fm

Fm

Hiệu quả phân chia điện tích trong các tâm phản ứng bị giảm đi khi
điều kiện sinh trởng gặp bất lợi (ánh sáng d thừa, nhiệt độ thấp, hạn hán,
không đủ dinh dỡng). Hiệu suất huỳnh quang biến đổi đặc trng cho hiệu
quả khử quinon A trong hệ quang hoá II, và có thể đợc sử dụng để đánh giá
trạng thái sinh lý của thực vật.
2.2. Những nghiên cứu huỳnh quang diệp lục ở thực vật.
Huỳnh quang diệp lục là những thông số phản ánh trạng thái sinh lý bộ

14


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

máy quang hợp của cây trồng. Nhờ có các phơng tiện hiện đại ngời ta đã
thu đợc kết quả quan trọng để giải thích về nguồn gốc và hiểu đợc cách sâu
sắc về cơ chế của hiện tợng huỳnh quang.
Trong những năm gần đây đã có nhiều thông báo nh: huỳnh quang
diệp lục [19] ; mối liên quan của nó với các hiện tợng vật lý nói chung và
quang hợp nói riêng. Trong các công trình của Murata và Satoh (1986) và
Krause và Weis (1991) đã đa ra các dẫn liệu mới nhất về mối quan hệ của
bức xạ huỳnh quang và quang hợp sau khi đã phân tích các thông tin nhận

đợc theo quan điểm lý sinh và hoá sinh một cách đầy đủ nhất [7].
ở nớc ta những năm gần đây các kỹ thuật hiện đại đo huỳnh quang đã
đa phơng pháp này trở thành một công cụ hết sức hữu hiệu để đánh giá tính
chống chịu của một số cây trồng nh: nhãn, cà chua, lúa, lạctrong điều kiện
bất lợi. Những tác động từ môi trờng đã ảnh hởng không tốt đến trạng thái
sinh lý của cây và đợc thể hiện thông qua huỳnh quang diệp lục (Fo, Fm, Fv/m).
Ưu điểm của phơng pháp này là cho phép xác định nhanh tính chống chịu
của thực vật dới tác động của điều kiện môi trờng ở trạng thái in vivo mà
không gây ra tổn thơng cây trồng trong quá trình nghiên cứu.
3. Prolin và vai trò của Prolin đối với đời sống thực vật.
Prolin

Cấu trúc không gian của prolin

Công thức cấu tạo của prolin

15


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Prolin là một imino axit a nớc, đợc tổng hợp từ glutamat bởi enzim
chìa khoá 1 - pyroline - 5 - carboxylat - synthetaza (P5CS) enzim đợc điều
hành bởi prolin thông qua cơ chế ức chế ngợc. Prolin thuộc lớp của các phân
tử nhỏ bao gồm nhóm các axit amin, nhóm hợp chất amon bậc bốn
(Glycinebetain, prolinbetain,
chất sul folium bậc :

- alanine betain và clolin - oxy - sulfat, và hợp

- dimethylsulfonyo propionat (DMSP). Các hợp chất

này đóng vai trò then chốt trong sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở tế bào thực
vật để trả lời các stress thẩm thấu. (22)
Còn đờng tổng hợp prolin trong thực vật bậc cao (20)
( Theo Delanney A J, Verma DPS 1993)

P5CS: -pyrrolin-5-cacboxilat synthetaza
P5CR: -pyrrolin-5-cacboxilat reductaza
Axit amin prolin đợc biết nh một tác nhân làm tăng áp suất thẩm thấu
của nội bào và thành tế bào
Trong điều kiện thiếu nớc dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu dịch bào,
kéo theo sự tăng cờng khả năng chống chịu của thực vật trên nền giảm thế
nớc của dịch đất.

16


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Phân tử prolin có cấu trúc vòng tạo nên cho prolin hình dáng vững chắc
hơn so với axit amin khác. Vai trò của prolin trong chống chịu stress nớc ở
thực vật là tổng hợp prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào,
tham gia các cấu trúc bảo vệ màng và protein.
3.2 Những nghiên cứu về prolin đối với tính chống chịu ở thực vật.
Sự tích luỹ prolin là một phản ứng chuyển hoá phổ biến của thực vật bậc

cao trong điều kiện thiếu nớc và stress muối. Đây là vấn đề đợc các nhà
khoa học nghiên cứu hơn 20 năm qua [ 22]
Chất ly gián sinh tổng hợp và phân huỷ của prolin trong cây lúa có thể
tăng cờng một số gen điều chỉnh thẩm thấu trong đó có DHN4 đợc sử dụng
để hình thành khả năng chống stress.
Đã có những công trình trong và ngoài nớc trên các đối tợng thực vật
và cây trồng khác tìm hiểu về chuyển hoá prolin Kishor B.B.K và cộng sự
(1995) [21] nghiên cứu gia tăng sản xuất prolin ở thực vật chuyển gen (cây
thuốc lá) trong điều kiện hạn do nớc, hạn do muối nhận đợc kết quả tốt.
Hàm lợng prolin gấp khoảng 10 - 18 lần so với đối chứng. Các nghiên cứu về
mô lá, mô phân sinh chồi của thực vật chịu áp lực nớc (Barnet và Maylor
1996, Bogess 1976) và trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng
nớc thấp (Voet Berg và Sharp 1991) [18]. Nghiên cứu về sự thay đổi hàm
lợng prolin và axit abcsisic của những đối tợng mẫn cảm và chống chịu điều
kiện áp suất thẩm thấu của Zheng Yi - Zhi và Litian cũng kết luận rằng: phản
ứng với áp lực nớc và nồng độ muối, cây đậu tơng tích luỹ hàm lợng prolin
cao, đó đợc xem nh phản ứng thích nghi với điều kiện khô hạn.
Bên cạnh đó còn nhiều công trình nghiên cứu khác: mối tơng quan
giữa hàm lợng prolin và tính chống chịu ở cây lúa của Nguyễn Hữu Cờng và
cộng sự [2]; sự biến đổi hàm lợng axit amin prolin trong mầm và trong lá đậu

17


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

xanh [5]; ảnh hởng của mannitol đến tích luỹ polin và glucozơ liên quan đến
khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy mô sẹo cà chua [13]

18


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

CHƯƠNG 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

1. Đối tợng nghiên cứu.
Là giống đậu tơng ĐT - 22 do Trung tâm nghiên cứu đậu đỗ, viện
khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ dòng đột biến hạt lai của
tổ hợp DT - 95 và ĐT - 12 cung cấp. Đây là giống mới có năng suất cao 15 27 ta/ha, thời gian sinh trởng ngắn (85 - 90 ngày). ĐT - 22 có đặc điểm: hoa,
màu lông phủ trắng, hạt vàng, rốn nâu, quả chín có màu xám. Cây cao 45 70
cm, phân cành trung bình. Số quả chắc trung bình: 25 - 40 quả, tỷ lệ quả 3 hạt
cao (16% - 25%). Khối lợng 1000 hạt (140 - 150g) có thể trồng 3 vụ trong
năm. Đây là giống chịu đợc đất ớt và chịu bệnh khá.
2. Phơng pháp nghiên cứu.
2.1. Phơng pháp bố trí thí nghiệm.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tại khu thí nghiệm nhà lới khoa sinh KTNN, trờng Đại học S phạm Hà Nội II.
Đậu tơng đợc trồng vào vụ hè năm 2008. Gieo hạt đậu tơng vào các
chậu thí nghiệm. Kích thớc chậu cao 45cm, đờng kính 35cm.
Giai đoạn cây non chỉ để lại 5 cây trong mỗi chậu, đảm bảo lợng đất,
phân bón, chế độ tới tiêu nớc, chế độ chăm sóc đồng đều giữa các chậu thí
nghiệm theo kĩ thuật thông thờng. Nhổ cỏ và xới hai lần vào giai đoạn cây
non và giai đoạn quả non. Chia số chậu trồng cây thành hai phần: phần 1 tiến
hành đo huỳnh quang diệp lục, phần 2 tách chiết xác định hàm lợng prolin.
Chia số chậu trong mỗi phần thành 5 lô: cây non (3 lá), ra hoa, quả non, quả
chắc và lô đối chứng; đảm bảo chế độ chăm sóc thông thờng. Khi cây non (3

lá), ra hoa lần 1, quả non, quả chắc thì gây héo các lô tơng ứng bằng cách
ngừng tới nớc. Việc gây héo kéo dài cho đến khi hai lá dới cùng của lô thí
nghiệm bắt đầu héo. Lô đối chứng vẫn tới nớc bình thờng.
19


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu huỳnh quang diệp lục và hàm lợng
prolin ở các thời kì sinh trởng khác nhau của cây đậu tơng: cây non (3 lá),
ra hoa, quả non, quả chắc. Thời điểm đo huỳnh quang diệp lục vào buổi sáng
(8h - 9h30).
Các thời kì sinh trởng đợc xác định dựa theo cách xác định của Phạm
Văn Thiều [14].
- Thời kì (3 lá): Khi lá thứ 3 trên thân chính hình thành nhng cha
buông lá hoà toàn.
- Thời kì ra hoa: Thời điểm hoa nở rộ lần đầu.
- Thời kì quả non: Bắt đầu hình thành quả (thờng sau khi hoa nở rộ 7
ngày).
- Thời kì quả chắc: Khi đã có hạt đầy đủ (thuờng sau khi quả hình thành
21 - 25 ngày).
2.2. Phơng pháp xác định huỳnh quang diệp lục.
Đợc đo trên máy Chlorphill fluorometer OS do hãng ADC - Anh cung
cấp. Thời gian ủ tối là 7 phút để các tâm phản ứng trở về trạng thái mở hoàn
toàn hay toàn bộ chất nhận điện tử đầu tiên trong mạch vận chuyển điện tử
quang hợp quinon A (QA) ở trạng thái oxi hoá.
Cờng độ huỳnh quang ổn định (F0) phản ánh sự mất đi năng lợng
kích thích bằng bức xạ trong khoảng thời gian vận chuyển chúng về tâm phản

ứng PSII ở trạng thái mở.
Huỳnh quang cực đại (Fm) đợc đo khi các tâm phản ứng ở trạng thái
đóng.
Hiệu suất huỳnh quang biến đổi (Fv/m) phản ánh hiệu quả sử dụng năng
lợng ánh sáng trong phản ứng quang hoá đợc xác định nh sau:
Fv/m = Fm - F0/Fm.

20


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

Huỳnh quang diệp lục của lá đợc đo 8 lần trên lô thí nghiệm và 8 lần
đối với lô đối chứng. Lá đợc chọn để đo là lá thứ 3 tính từ trên ngọn xuống,
là lá đợc đánh giá độ hấp thụ ánh sáng hiệu quả nhất.
2.3. Phơng pháp xác định hàm lợng prolin.
* Cơ sở khoa học của phơng pháp.
Những hợp chất có màu là do trong phân tử chứa các nhóm mang mầu,
đó là các liên kết đôi, liên kết 3 nh: C = C, C = O, C = N, N = N, C

C, C

Nvà nhóm trợ màu là các hệ liên hợp
Theo thuyết MO Huckel (thuyết obitan phân tử Theory of
Molecular Orbitale): liên kết trong nhóm mang màu là kết quả của sự phân
các Electron và các MO. Phân tử sẽ hấp thụ photon có năng lợng Ep chuyển
lên trạng thái kích thích.
hc

Fp =
Trong đó:

=

E = E* - Ecb

E* - năng lợng kích thích,
Ecb - năng lợng ở trạng thái cơ bản của phân tử,
h - hằng số Plank,
C - tốc độ ánh sáng.

Năng lợng kích thích phụ thuộc vào cấu trúc electron của phân tử tức
là phân tử chỉ hấp thụ tia sáng có bớc sóng xác định đặc trng của phân tử.
Khi đa một dải photon trong vùng phổ tử ngoại khả biến UV
(Ultraviolet - visible Spectrophotometer, UV - VIS) qua dung dịch chiết, sẽ
cho ta một phổ UV - VIS đặc trng cho cấu trúc của phân tử. Do đó có thể sử
dụng UV - VIS để nghiên cứu cấu trúc phân tử hữu cơ nói chung và các hợp
chất màu nói riêng. Dựa vào UV của phân tử ta có thể biết bớc sóng hấp thụ
đặc trng của phân tử đó tơng ứng với các pick trên phổ UV. Theo những
21


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

nghiên cứu cho thấy phân tử prolin trong đề tài chúng tôi nghiên cứu hấp thụ
cực đại tia sáng có bớc sóng 520 nm.
+ Nguyên tắc hoạt động của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)

Nguồn sáng

Bộ tách sóng

Bộ phân tích

Cuvet mẫu

Bộ phận in

+ Lý thuyết của mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch:
Dựa vào định luật Lambert - Beer:
Io
D = log

I
= log

= Cd

I
Trong đó:

(*)

T

D - Mật độ quang đo ở bớc sóng ;
T - độ truyền qua, có giá trị 0 - 100%;
C - nồng độ dung dịch, mol/l;

I,I0 - cờng độ bức xạ trớc và sau khi ra khỏi dung dịch;
hệ số hấp thụ;
d - chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet.

Từ (*) ta thấy với d,

không đổi thì giá trị của D phụ thuộc vào nồng

độ C của dung dịch, bớc sóng khi đó (*) viết dới dạng: D = f( ), D = f(C).
* Phơng pháp xác định hàm lợng axit amin prolin: theo phơng pháp
của Bates và cộng sự [18]: cân 0,5g/mẫu nghiền kỹ, thêm 100ml dung dịch
axit axetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nớc nóng 100oC trong 1 giờ,
sau đó ủ nớc đá 5 phút. Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy
phần dịch mầu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD Optical density)
ở bớc sóng

= 520 nm trên máy UV- Visible - Spectrophotometer UV -

2450 do hãng Shimadzu sản xuất.
Hàm lợng axit amin prolin đợc tính theo công thức sau: ( công thức
suy ra từ việc lập đờng chuẩn Prolin):
Y = 1,4083 x X + 0,014
22


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

R2 = 0,9991

Y: Nồng độ prolin (mg/l)
X: Giá trị OD đo đợc ở bớc sóng 520 nm.
R2: Hệ số tơng quan.
YxV
A =
P x 1000
A: Hàm lợng prolin ( mg/g)
P: Khối lợng mẫu (g)
V: Thể tích dịch prolin chiết đợc
Tất cả các

axit amin của protein đều phản ứng màu Ninhydrin tạo

hợp chất màu xanh tím, riêng iminoaxit nh prolin tạo thành màu vàng với cơ
chế phức tạp ở bớc sóng = 520 nm.
2.4. Phơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm:
Số liệu đợc sử lý đánh giá theo phơng pháp toán thống kê trên máy
tính nhờ phần mềm Exel - 2003 với các thông số: trung bình số học, độ lệch
chuẩn, sai số trung bình số học, hệ số biến động, độ chính xác của thí nghiệm,
tiêu chuẩn độ tin của hiệu.
n

X=

m=


n

X

i =1

i

;

n

;

( X i X )2
=
n 1

m 00 =


X

;

;

td =

d = X DC X TN

23

Cv =

*100
X

md = m12 + m22

d
md


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

CHƯƠNG 3: KếT QUả NGHIÊN CứU V THảO LUậN
`
1. Sự biến động của huỳnh quang diệp lục trong điều kiện hạn sâu
1.1. Huỳnh quang ổn định
( F0)
500 Fo

Pha hạn sâu

Pha phục hồi

500Fo

Pha hạn sâu

400

Pha phục hồi

400

300
300

200

200

TN cây non
ĐC cây non

100

TN ra hoa
ĐC ra hoa

100

Lần đo

Lần đo
0

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

9 10 11

H. 1.1: thời kì cây non

500 Fo

Pha hạn sâu

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

H. 1.2: thời kì ra hoa

500 Fo

Pha phục hồi

400

400

300

300

200

200
TN quả non
ĐC quả non

100

1

Pha hạn sâu

Pha phục hồi

TN quả chắc
ĐC quả chắc

100

Lần đo
0

Lần đo

0
0

1

2

3

4

5

6

7

8

0

9 10 11

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

H. 1.4: thời kì quả chắc

H. 1.3: : thời kì quả non

Hình 1: Sự biến đổi cờng độ huỳnh quang ổn định ( Fo) trong pha
hạn sâu và pha phục hồi

24


Khoá luận tốt nghiệp

H Thị Phơng Lan - K 31A Sinh

chèn bảng 1

F0 phản ánh sự mất đi năng lợng bằng bức xạ trong khoảng thời gian
vận chuyển chúng về tâm phản ứng PSII ở trạng thái mở. Sự biến đổi F0
phần nào cũng phản ánh khả năng chịu hạn của các giống đậu tơng.
25