Tóm tắt Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ ÁI LUYẾN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, KHẢO SÁT CẤU TRÚC VÀ
TÍNH CHẤT CỦA EXOPOLYSACCHARIDE SINH
TỔNG HỢP TỪ Lactobacillus fermentum

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9440114
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NĂM 2019


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học khoa học, Đại
học Huế

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đỗ Thị Bích Thủy

Phản biện 1: PGS. TS. Vũ Đình Hoàng – Trường Đại học Bách
khoa Hà Nội
Phản biện 2: PGS. TS Lý Nguyễn Bình – Trường Đại học Cần
Thơ
Phản biện 3: PGS. TS. Phạm Xuân Núi – Trường Đại học Mỏ Địa chất Hà Nội

Luận

án

sẽ

được

bảo

vệ

tại

………………………………………………….
Vào hồi………giờ………..ngày………tháng…….năm………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường Đại học khoa học,
Đại học Huế

0


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng
polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát
triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn.
Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại
bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115]. Các PS tách
chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng.
Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi
trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm. Chúng là những
tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, ... Hơn nữa,
gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS

như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm
cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến
[88], [125], [139] … Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng
trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn
tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp. Đây là lý do chính
khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung
và từ vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn
khá hạn chế. Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn”
(GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình
thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích
để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm
[59]. Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS –
với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các
sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,... Bên cạnh đó, nhờ
những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối
với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic
1


(LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác.
Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide,
vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng
dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác
nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần
môi trường [74], [102], [104], [126],….
Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn
khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành
phần các chất dinh dưỡng trong quá trình lên men cũng như điều
kiện nuôi cấy và thu nhận. Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh
hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính

chất chức năng trong công nghệ thực phẩm. Chính vì vậy, để
nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số
thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS sinh
tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng
Lactobacillus fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của
exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”.
Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được
điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả
nhất; khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm, đồng thời xác được một số thông tin về phân tử
lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được
tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Với những đặc tính
mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu
ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp
chất được tổng hợp hóa học.
2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về polysaccharide
1.1.1. Giới thiệu chung về polysaccharide
1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide trong công nghiệp
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus fermentum
1.3. Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic
1.3.1. Khái niệm
1.3.2. Phân loại và tính chất lý hóa của exopolysaccharide
1.3.3. Tính chất chức năng và ứng dụng của EPS
1.4. Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB
1.4.1. Về điều kiện nuôi cấy

1.4.2. Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS
1.4.3. Về đặc tính hóa lý của EPS
1.4.4. Tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng
phương pháp đo mật độ quang (OD)
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối
2.3.3. Phương pháp thu nhận và tách EPS
2.3.4. Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện
hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum
2.3.5. Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol –
sulfuric
3


2.3.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp
Kjeldahl
2.3.7. Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng
ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
2.3.8. Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm
cấu trúc của EPS
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ
một số chủng Lb. fermentum
3.1.1. Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb. fermentum sinh

tổng hợp EPS cao.
140

119,142a

EPS (µg/ml)

120

116,744a
100,768b

88,776c

100
68,980d
62,516e

80

68,370d
50,728g
43,248h

60
40

35,484i

56,581f

69,508d
58,939ef

20
0

Chủng vi khuẩn lactic

Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic
(Trong đó: - TC12: Lb. fermentum TC12
- TC20: Lb. fermentum TC20
- TC13: Lb. fermentum TC13
- TC21: Lb. fermentum TC21
- TC14: Lb. fermentum TC14
- MC2: Lb. fermentum MC2
- TC15: Lb. fermentum TC15
- MC3: Lb. fermentum MC3
- TC16: Lb. fermentum TC16
- N9: Lb. fermentum N9
- TC18: Lb. fermentum TC18
- N10: Lb. fermentum N10
- TC19: Lb. fermentum TC19
Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g thể hiện sự sai khác về hàm lượng EPS đạt được giữa
các chủng

4


Kết quả Hình 3.1 cho thấy, các chủng Lb. fermentum TC13,

TC16, TC21 và Lb. fermentum MC2, MC3) và Lb. fermentum
MC3 có khả năng sinh tổng hợp tốt hơn so với các chủng còn lại.
Từ kết quả này, bốn chủng được chúng tôi lựa chọn để tiến
hành các nghiên cứu tiếp theo trong luận án sẽ là Lb. fermentum
(TC13, TC16, TC21, MC3).
Lb. fermentum TC16

Lb. fermentum TC13

215.159
238.817 216.988

EPS (µg/ml)

0

2

3

4

5

6

224.183

0

2
3
4
5
6
Nồng độ bổ sung (%)
Glucose Lactose Sucrose

Nồng độ bổ sung (%)
Glucose
Lactose
Sucrose
250
200
150
100
50
0

EPS (µg/ml)

Lb. fermentum TC21

EPS (µg/ml)

250
200
150
100
50

0

231.988

EPS (µg/ml)

250
200
150
100
50
0

250
200
150
100
50
0

179.752 176.581

0
Glucose

2
3
4
5
6

Nồng độ bổ sung (%)
Lactose
Sucrose

Lb. fermentum MC3
178.207

0

2
3
4
5
6
Nồng độ bổ sung (%)
Glucose Lactose Sucrose

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào
môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum
* Kết quả số liệu nghiên cứu cụ thể được trình bày ở phụ lục 4.1

3.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh
EPS của các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)
3.1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và nồng độ của chúng
Kết quả từ Hình 3.2 cho thấy rằng, quá trình sinh tổng hợp
EPS của Lb. fermentum TC13, TC16, TC21 và MC3 xảy ra tốt
hơn khi bổ sung các loại đường với nồng độ tương ứng lần lượt
là 4% glucose, 3% sucrose, 4% lactose và 4% glucose.
5

3.1.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen và nồng độ của chúng
Lượng EPS sinh tổng hợp đạt cao nhất bởi các chủng Lb.
fermentum TC16, TC21 đều ở trong môi trường chứa 0,8% cao thịt
và ở nồng độ cao nấm bổ sung là 0,4% cho chủng Lb. fermentum
TC16 và 0,3% cho chủng Lb. fermentum MC3 (Hình 3.3).

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào
MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb. fermentum
* Các mức 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ pepton, cao thịt là
0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0% và cao nấm là 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%;
0,5% bổ sung vào MTTH

3.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng
hợp EPS của các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3
3.1.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu
Quá trình sinh tổng hợp EPS đạt cao nhất đối với các chủng Lb.
fermentum TC16, TC21, MC3 khi mật độ tế bào nuôi cấy ban
đầu là 106 cfu/ml và của chủng Lb. fermentum TC13 là 107 cfu/ml

(Hình 3.4)
6


Hình 3.4. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu

3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Lượng EPS sinh ra của các chủng Lb. fermentum TC16,
TC21, MC3 đều đạt cực đại tại pH 6,0 và tại pH 5,5 đối với chủng
TC13 (Hình 3.5).

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

ĐC

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu

3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

7


Kết quả Hình 3.6 cho thấy, quá trình sinh tổng hợp EPS của
các chủng vi khuẩn khảo sát đều xảy ra tốt trong khoảng nhiệt độ
từ 35 – 40 oC.
3.1.4. Đường cong sinh trưởng và ảnh hưởng của thời gian lên
men

Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men

Lượng EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb. fermentum
TC13, TC16, MC3 đạt cực đại sau 48 giờ lên men và sau 36 giờ
lên men với chủng Lb. fermentum TC21. Thời điểm EPS tổng
hợp được đạt cực đại cũng chính là thời điểm mà giá trị OD của
môi trường đạt được là cao nhất.
Kết quả Hình 3.7 cũng chỉ ra những mối quan hệ nhất định
giữa hàm lượng EPS tổng hợp được, OD và pH của môi trường
trong suốt thời gian lên men.
Kết luận 1 :
8


Bảng 3.1. Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb.
fermentum nghiên cứu trong luận án

Các chủng
vi khuẩn
Lb.
fermentum

TC13

TC16
TC21
MC3

Điều kiện thu nhận
Mật

độ tế
Thành phần môi
bào
trường
nuôi
pH
cấy
ban
ban
đầu
đầu
Nguồn
Nguồn
(cfu/m
C
N
l)
4% glc
0,4%
cao
107
5,5
nấm
3% suc
0,8%
106
6,0
cao thịt
4% lac
0,8%

106
6,0
cao thịt
4% glc
0,3%
cao
106
6,0
nấm

Hiệu
suất thu
nhận
EPS ở
các điều
kiện đã
khảo sát
so với
MRS
(%)

Nhiệt
độ
nuôi
cấy
(oC)

Thời
gian
lên

men
(giờ)

40

48

353,56

35

48

356,95

35

36

414,51

35

48

479,14

3.1.5. Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men
3.1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid trichloroacetic (TCA) lên
khả năng loại bỏ protein

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ
protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC13

9


Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ
protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC16

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ
protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum TC21

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ
protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb. fermentum MC3

Kết quả trên các Hình 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy, khi nồng
độ TCA bổ sung vào tăng lên, lượng protein còn lại trong dịch
nuôi cấy đều có xu hướng giảm dần.
10


3.1.5.2. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả
năng tách EPS
Lượng EPS thu được từ các dịch nổi của các chủng Lb.
fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đạt tốt nhất khi tỉ lệ dịch
nổi và EtOH là 1:1 (Hình 3.12).
Các chủng Lb.
fermentum

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến
khả năng tách EPS

3.1.5.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng
tách EPS
Kết quả từ Hình 3.13 cho thấy thời gian áp dụng thích hợp
và hiệu quả để thu EPS tủa bằng EtOH trong quá trình tách chiết
EPS từ dịch nổi là 24 giờ.

Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả
năng tách EPS

11


Kết luận 2:
Bảng 3.2. Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy của các
chủng Lb. fermentum
Nồng độ Tỉ lệ dịch Thời gian
Các chủng
Hiệu suất
TCA bổ
nổi:
tủa bằng
Lb.
thu nhận
sung
ethanol
Ethanol
fermentum

tăng (%)
(%)
(v/v)
(giờ)
TC13
15
1:1
24
121,19
TC16
35
1:1
24
101,73
TC21
20
1:1
24
110,93
MC3
20
1:1
24
106,81
3.2. Kết quả khảo sát các tính chất của EPS thu được từ các
chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) có tiềm
năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
3.2.1. Khả năng hòa tan trong nước
Bảng 3.3. Độ hòa tan trong nước của EPS
EPS tách chiết từ các chủng

Độ hòa tan (%)
Lb. fermentum
EPS- TC13
73,33±3,81
EPS-TC16

75,33±5,17

EPS-TC21

64,00±4,97

EPS-MC3

87,00±2,49

Các EPS thu được từ các chủng Lb. fermentum (TC13,
TC16, TC21, MC3) đều có khả năng hòa tan trong nước rất tốt.
3.2.2. Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu
Kết quả Bảng 3.4 cho thấy rằng, EPS thu được từ các chủng
Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng giữ nước
tốt.

12


Khả năng giữ dầu tương ứng của các EPS từ các chủng Lb.
Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 thể hiện ở Bảng 3.5
Bảng 3.4. Khả năng giữ nước của EPS từ các chủng Lb.
fermentum

EPS tách chiết từ các chủng
Lb. fermentum
EPS- TC13
EPS-TC16
EPS-TC21
EPS-MC3

Khả năng giữ nước
(%)
140,55 ± 0,45
136,22 ± 0,6
120,63 ± 1,99
135,70 ± 3,11

Bảng 3.5. Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb. fermentum
EPS tách chiết từ các chủng
Khả năng giữ dầu
Lb. fermentum
(%)
EPS- TC13
EPS-TC16
EPS-TC21
EPS-MC3

590,78 ± 1,94
594,57 ± 1,42
608,30 ± 0,45
599,97 ± 1,14

3.2.3. Khả năng chống oxy hóa

Bảng 3.6. Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được
từ các chủng Lb. fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3)
Nồng độ
(mg/mL)

Hoạt lực chống oxy hóa (%)
EPSTC13

EPSTC16

1,0

-

-

1,5

-

-

29,14 ±
0,52
38,56 ±
0,37
55,01 ±
0,25
76,01 ±
0,35

2,85

27,34 ±
0,32
35,95 ±
0,52
51,08 ±
0,22
72,11 ±
0,45
2,96

2,0
2,5
3,0
3,5
IC50

EPSTC21
36,94 ±
0,35
57,14 ±
0,32
67,41 ±
0,30
78,99 ±
0,30
-

Ascorbic acid

EPSMC3
27,14 ±
0,30
47,66 ±
0,55
68,05 ±
0,47
80,93 ±
0,45

-

-

1,32

2,06

13

Nồng độ
(mg/mL)

0,00125
0,0025
0,0050
0,1250

Hoạt lực
chống

oxy hóa
(%)
27,05 ±
0,12
58,3 ±
0,17
89,57 ±
0,1
93,12 ±
0,12
0,00217


Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy, các EPS sinh tổng hợp từ 4
chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 đều có khả năng
chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa tăng dần theo chiều tăng
của nồng độ EPS và sự thay đổi này là không giống nhau khi so
sánh giữa các EPS từ các chủng khác nhau.
3.3. Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm
về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3
3.3.1. Khối lượng phân tử

a)

Khối lượng trung bình (kDa)

Hình 3.14. Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng
phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 có khối lượng

phân tử khoảng 98,5 kDa (Hình 3.14)
3.3.2. Đặc điểm về cấu trúc của các EPS
- Thành phần monosaccharide của các EPS
Bảng 3.7. Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh

STT
1
2

tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3
Thời gian
Hợp chất
lưu (phút)
1,5,6-tri-O-acetyl-2,3,4-tri-O5,134
methyl-D- glucitol
1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O6,025
methyl-D-mannitol
14

Diện tích
peak
6665390
6034772


Kết quả Bảng 3.7 cho thấy thành phần monosaccharide
tương ứng trong cấu trúc của EPS-MC3 gồm D-glucose, Dmannose.
Dữ liệu Bảng 3.8 thể hiện tỷ lệ và thành phần phần trăm của
các monosacharide có trong cấu trúc của EPS-MC3.
Bảng 3.8. Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu

trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3
STT

Thành phần

Tỷ lệ

Thành phần (%)

1

D-glucose

1,00

52,48

2

D-mannose

0,91

47,52

- Xác định vị trí liên kết glycoside trong các EPS bằng GC-MS
Bộ khung của EPS-MC3 sinh tổng hợp được có dạng mannoglucan với hai liên kết chủ yếu là (1→6) glucoside và (1→3)
mannoside (Bảng 3.9).
Bảng 3.9. Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide
thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp

bởi Lb. fermentum MC3
STT
1

Hợp chất

Liên kết glycoside

1,5,6-tri-O-acetyl-

→6)-D-

2,3,4-tri-O-methyl-

glucopyranoside-(1→

Tỷ lệ
1,00

D-glucitol
2

1,3,5-tri-O-acetyl-

→3)-D-

2,4,6-Tri-O-methyl-

mannopyranoside-(1→

0,91

D-mannitol
- Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định đặc điểm về
cấu trúc của EPS-MC3

15


Kết quả phân tích phổ NMR thể hiện ở hình 3.16, hình 3.17,
hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21

Hình 3.16. Phổ 1H-NMR của EPS-MC3

Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của EPS-MC3 cho thấy,
trong vùng từ  4,5 đến  4,9 có sự hiện diện của 2 thành phần
đường thông qua các tín hiệu đặc trưng của hai proton anomer ở
độ chuyển dịch 4,87 ppm và 4,55 ppm; các proton của nhóm Omethyl từ H 3,00 đến 3,62 ppm (Hình 3.16). Hai monosaccharide
này được chúng tôi kí hiệu là A và B theo chiều giảm dần của độ
chuyển dịch hóa học. Từ giá trị về độ chuyển dịch của proton
anomer trong 1H NMR, cấu trúc của EPS-MC3 chỉ chứa liên kết
glycoside dạng β-pyranose [9].

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của EPS-MC3

16


Kết quả ở Hình 3.17 của phổ 13C –NMR cho thấy EPS-MC3
có sự xuất hiện của hai tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học là

94,1 và 94,0 ppm và các vùng carbon trong mạch vòng của nó từ
61,5 đến 77,2 ppm. Kết hợp các kết quả công bố trước đây [9], [41],
[49], [108] và từ phổ 1H, 13C-NMR của EPS-MC3 có tín hiệu carbon
anomer ở  94,1 nên có thể được quy cho là của β-Dmannopyranose và tín hiệu ở C1 94,0 sẽ là β-D-glucopyranose.
b)

a)

c)

Hình 3.18. Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3

Các đỉnh của đường cắt ngang trong phổ HSQC giúp xác
định được vị trí của các phân tử carbon anomer và proton
anomer trong cấu trúc dạng vòng từ 1 đến 6 của chúng (Hình
17


3.18). Điều này cho phép xác định vị trí của proton nối với
nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3.
Những tương tác 1H → 1H trong phổ COSY đã chỉ ra các
tương tác giữa các proton của carbon cận kề nhau trong cấu trúc
EPS-MC3 sinh tổng hợp bởi Lb. fermentum MC3. Từ đó cho
phép thiết lập trật tự liên kết carbon trong các thành phần đường
tương ứng trong cấu trúc phân tử của EPS-MC3 là (Hình 3.19)

Hình 3.19. Phổ đồ COSY của EPS-MC3
Bảng 3.10. Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR
của EPS-MC3 đo trong DMSO
→6)-βDglucopyranoside-(1→

→3)-β-Dmannopyranoside(1→
Phần đường
→6)-βDglucopyranoside-(1→
→3)-β-Dmannopyranoside(1→

4,87

3,53

3,62

3,49

3,28

Đơn vị: ppm
3,51
A

4,55

3,01

3,47

3,27

3,50

3,43

B

C-1
94,0

C-2
71,6

C-3
61,5

C-4
70,6

C-5
73,8

C-6
71,4

A

94,1

77,2

73,2

67,1

67,4

61,5

B

Đối chiếu với các tài liệu tham khảo [41], [54], [101], [137],
[142] cùng những phân tích trên các phổ 1H -NMR, 13C – NMR,
18


COSY và HSQC, chúng tôi đã xác định được độ chuyển dịch hóa
học của các thành phần đường trong EPS-MC3 (Bảng 3.10).

Hình 3.21. Phổ đồ NOESY của EPS-MC3

Hình 3.20. Phổ đồ HMBC của EPS-MC3

Các tương tác của proton anomer và các nguyên tử C trên
phổ HMBC (Hình 3.20) và NOESY (Hình 3.21) đã chỉ ra các mối
liên kết glycoside trong cấu trúc của EPS-MC3 tương ứng là
A(1→3)B và B(1→6)A. Thông tin này cho phép chúng tôi định
vị được các gốc đường (Bảng 3.11)
Bảng 3.11. Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3
qua phổ NOESY, HMBC
Đơn vị: ppm
Phần đường

Ký

H1

NOESY

HMBC

Mối liên kết

hiệu
(1→6)-β-D-glucopyranoside

A

4,87

A: H1 với B: H3
3,47

(1→3)-β-D-

B

73,2

4,55

mannopyranoside

A: H1 với B: C3

B: H1 với A: H6

3,51

71,4

B: H1 với A: C6

Từ kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phân
tích thành phần monosacharide của EPS-MC3 cho phép sắp xếp
19


đơn vị mắt xích lặp lại với dạng liên kết cụ thể như sau: [6)-βD-Glcp-(13)-β-D-Manp-(16)-β-D-Glc-(1]n (Hình 3.22)

Hình 3.22. Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3
đã được thủy phân một phần
EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 là một PS mới.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu thu được trong luận án cho phép
chúng tôi có những kết luận như sau:
1.1. Về hiệu suất thu nhận EPS:
1.1.1. Từ các chủng LAB sử dụng nghiên cứu, chúng tôi đã chọn
ra được 04 chủng có khả năng sinh tổng hợp EPS tốt. Đó là các
chủng Lb. fermentum TC13, Lb. fermentum TC16, Lb. fermentum
TC21 và Lb. fermentum MC3.
1.1.2. Đối với các chủng vi khuẩn lựa chọn nghiên cứu, chúng tôi
đã xác định được nguồn dinh dưỡng (nguồn C, N) và điều kiện
nuôi cấy (mật độ gieo cấy ban đầu, pH ban đầu, nhiệt độ, thời

20


gian) thích hợp và hiệu quả cao cho quá trình sinh tổng hợp EPS
của các chủng vi khuẩn sử dụng. Cụ thể như sau:
+ Chủng Lb. fermentum TC13 có khả năng sinh tổng hợp
EPS cao khi phát triển trong môi trường MRS có bổ sung thêm
4% glucose, 0,4% cao nấm với điều kiện lên men ở 40 oC, pH
ban đầu 5,5, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 107 CFU/mL trong
thời gian 48 giờ.
+ Chủng Lb. fermentum TC16 có khả năng sinh tổng hợp
EPS cao trong môi trường MRS có bổ sung thêm 3% sucrose,
0,8% cao thịt sau 48 giờ ở điều kiện lên men bao gồm mật độ tế
bào nuôi cấy ban đầu là 106 CFU/mL, pH ban đầu 6,0 và nhiệt độ
nuôi cấy là 35 oC.
+ Chủng Lb. fermentum TC21 có khả năng sinh tổng hợp
EPS cao sau 36 giờ lên men ở nhiệt độ 35 oC, pH ban đầu 6,0,
mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL trong môi trường
MRS có bổ sung thêm 4% lactose, 0,8% cao thịt.
+ Ở điều kiện nuôi cấy là 35 oC, pH ban đầu 6,0, mật độ tế
bào nuôi cấy ban đầu 106 CFU/mL trong thời gian 48 giờ với môi
trường MRS có bổ sung thêm 4% glucose, 0,3% cao nấm, chủng
Lb. fermentum MC3 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao nhất.
1.1.3. Từ dịch lên men thu nhận được bởi các chủng Lb.
fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) chúng tôi đã xác định
được điều kiện tách EPS hiệu quả tương ứng.
+ Nồng độ TCA bổ sung vào dịch lên men của các chủng
Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 phù hợp nhất nhằm loại
bỏ protein và thu EPS tốt được làm sáng tỏ trong nghiên cứu này
lần lượt tương ứng là 15%, 35%, 20% và 20%.

21


+ Quá trình tách EPS đạt hiệu quả tốt khi thời gian tủa bằng
EtOH được thực hiện trong 24 giờ với tỉ lệ dịch nổi và EtOH là
1:1 cho tất cả các chủng sử dụng nghiên cứu.
1.2. Về một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ
thực phẩm: Các EPS sinh tổng hợp từ các chủng Lb. fermentum
(TC13, TC16, TC21, MC3) đều thể hiện tốt các tính chất có tiềm
năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Cụ thể là:
- Khả năng hòa tan trong nước của các EPS thu nhận được
từ các chủng Lb. fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 theo thứ
tự giảm dần như sau: EPS-MC3 > EPS-TC16 > EPS-TC13 >
EPS-TC21.
- Khả năng giữ nước của các EPS này tăng theo trình tự như
sau: EPS-TC21 < EPS-MC3 < EPS-TC16 < EPS-TC13.
- Khả năng giữ dầu của các EPS đạt được trong nghiên cứu
này là tương đối cao. EPS có khả năng giữ dầu cao nhất là EPSTC21, tiếp đến là EPS-MC3, tiếp theo là EPS-TC16 và thấp hơn
cả là EPS-TC13.
- Khả năng chống oxy hóa của các EPS sinh tổng hợp được từ
các chủng Lb. fermentum khác nhau theo trình tự giảm dần như
sau: EPS-TC21 > EPS-MC3 > EPS-TC13 > EPS-TC16. Cụ thể
là, tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH của các EPS đạt 50% tại các nồng độ
1,32 mg/mL đối với Lb. fermentum TC21, 2,06 mg/mL đối với
Lb. fermentum MC3, 2,85 mg/mL đối với Lb. fermentum TC13
và 2,96 mg/mL đối với Lb. fermentum TC16.
1.3. Về khối lượng phân tử và một số đặc điểm cấu trúc của
EPS tách chiết từ chủng Lb. fermentum MC3 (EPS-MC3)

22

- Đã xác định được khối lượng phân tử của EPS-MC3 là 98,5 kD
nhờ phương pháp sắc ký thẩm thấu gel.
- EPS sinh tổng hợp từ Lb. fermentum MC3 là một PS mới. Một
số thông tin mới về cấu trúc của EPS-MC3 bao gồm thành phần,
tỉ lệ các monosaccharide và các loại liên kết chủ yếu trong bộ
khung đã lần lượt được làm sáng tỏ. Cụ thể:
+ Thành phần monosaccharide có trong EPS-MC3 bao gồm
các đơn vị lặp đi lặp lại là D-glucose, D-mannose với tỉ lệ phân
tử tương ứng là 1,00:0,91.
+ Các loại liên kết glycoside chủ yếu tạo nên bộ khung chính
của EPS-MC3 là (1→6) glucoside và (1→3) mannoside.
2. Kiến nghị
Do thời gian tiến hành đề tài nghiên cứu có hạn, đồng
thời, trong quá trình thực hiện luận án, chúng tôi đã gặp một số
khó khăn về vấn đề trang thiết bị do đó chúng tôi vẫn chưa thể
thực hiện sâu hơn các thông tin liên quan đến kết quả cũng như
phạm vi ứng dụng thực tiễn. Vì vậy, để các kết quả từ luận án
này có thể được ứng dụng tốt hơn trong thực tiễn, chúng tôi xin
được phép kiến nghị tiếp tục:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng
khác nhau lên đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp
được từ các chủng Lb. fermentum này.
2. Tiến hành nghiên cứu ứng dụng của EPS thu được lên
một số sản phẩm lên men cụ thể về việc cải thiện tính chất lưu
biến của sản phẩm như khả năng giữ nước, khả năng tạo gel, khả
năng làm đặc,...

23