Luận văn sư phạm Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ ngọt = (STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) HEMSLEY )

Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

TR

NG

Khoá lu n t t nghi p

IH CS

PH M HÀ N I 2

KHOA HOÁ H C
***************

Nguy n duy công

NGHIÊN C U THÀNH PH N HịA H C
C A CÂY C

NG T

(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)
KHOÁ LU N T T NGHI P

IH C

Chuyên ngành: Hoá H u C

Hà N i 2009

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
1


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

L ic m n
Tr

c h t, em xin đ

c bày t l i c m n chân thành và sâu s c t i th y

giáo - TS. Nguy n V n B ng- Khoa hoá h c- Tr

ng

i h c S ph m

Hà N i 2 đã t n tình ch b o, giúp đ em trong su t quá trình th c hi n và
hoàn thi n khoá lu n t t nghi p.
Em xin trân tr ng c m n TS. Phan V n Ki m – Vi n hoá h c các
H p ch t thiên nhiên - Vi n khoa h c và công ngh Vi t Nam đã t o đi u
ki n giúp đ em trong quá trình th c hi n và hoàn thi n khoá lu n.
Em xin đ
Tr

ng

c g i l i c m n t i các th y giáo trong Khoa Hoá h c-

i h c S ph m Hà N i 2 và các cán b Vi n hoá h c các H p ch t

thiên nhiên - Vi n khoa h c và công ngh Vi t Nam đã ng h và t n tình ch
b o, t o đi u ki n thu n l i cho em hoàn thành khoá lu n t t nghi p này.
Trong quá trình th c hi n khoá lu n t t nghi p này dù r t c g ng nh ng em
v n không tránh kh i m t s sai sót. Vì v y, em kính mong nh n đ

c s góp

ý ch b o c a các th y, cô và các b n sinh viên quan tâm.

Hà N i, ngày 10 tháng 5 n m 2009
Sinh viên

Nguy n Duy Công

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
2


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

L I CAM OAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tôi. Các s li u,
k t qu trong khoá lu n này là trung th c. Các k t qu không trùng v i các
k t qu đã đ

c công b .
Sinh viên

Nguy n Duy Công

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
3


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

M cl c
L ic m n
L i cam đoan
M cl c
Danh m c các ch vi t t t
Danh m c các hình v và b ng bi u
Trang
M đ u.................................................................................................

1

Ch

3

ng 1: T ng quan..................................................................
c đi m, tính v và công d ng c a cây c ng t..............................

3

1.1.1. Th c v t h c...........................................................................

3

1.1.2. Phân b , sinh thái...................................................................

4

1.1.3. B ph n dùng..........................................................................

4

1.1.4. Tác d ng d

c lý....................................................................

4

1.1.5. Tính v , công n ng..................................................................

6

1.1.6. Công d ng..............................................................................

6

1.2. Thành ph n hoá h c và ho t tính sinh h c c a cây c ng t..............

7

1.2.1. Gi i thi u chung.....................................................................

7

1.2.2. Thành ph n hoá h c và ho t tính sinh h c.............................

8

1.1.

1.3. Các ph

ng pháp chi t m u th c v t................................................

11

1.3.1. Ch n dung môi chi t..............................................................

12

1.3.2. Quá trình chi t........................................................................

14

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
4


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

1.4. Các ph
1.4.1.

Khoá lu n t t nghi p

ng pháp s c ký trong phân l p các h p ch t h u c ..........

15

c đi m chung c a ph

ng pháp s c kí...............................

15

ng pháp s c kí................................................

15

1.4.2. C s c a ph

1.4.3. Phân lo i các ph

ng pháp s c kí..........................................

16

1.5. M t s ph ng pháp hoá lý xác đ nh c u trúc c a các h p ch t
h u c ....................................................................................................

18

1.5.1. Ph h ng ngo i (Infrared spectroscopy, IR)..........................

18

1.5.2. Ph kh i l

ng (Mass spectroscopy, MS)..............................

19

1.5.3. Ph c ng h

ng t h t nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR).................................................................................
Ch

ng 2: đ i t

2.1. Ph

ng và ph

ng pháp nghiên c u...

19
23

ng pháp phân l p các h p ch t..................................................

23

2.1.1. S c ký l p m ng (TLC)..........................................................

23

2.1.2. S c ký l p m ng đi u ch ......................................................

23

2.1.3. S c ký c t (CC)......................................................................

23

2.2. Ph

ng pháp xác đ nh c u trúc hoá h c các h p ch t......................

23

2.2.1. i m nóng ch y (MP)............................................................

23

2.2.2. Ph kh i l

ng (ESI-MS)......................................................

24

2.2.3. Ph c ng h

ng t h t nhân (NMR)......................................

24

quay c c []D ...................................................................

24

2.3. D ng c và thi t b ............................................................................

24

2.3.1. D ng c và thi t b tách chi t.................................................

24

2.3.2. D ng c và thi t b xác đ nh c u trúc.....................................

25

2.4. Hoá ch t............................................................................................

25

2.2.4.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
5


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

2.5. Chi t phân đo n và phân l p các h p ch t........................................

25

Ch

27

ng 3: K t qu và th o lu n........................................

3.1. H ng s v t lý và các d ki n ph c a các h p ch t.........................

27

3.1.1. H p ch t 1: Stevioside............................................................

27

3.1.2. H p ch t 2: -Sitostorol.........................................................

28

3.2. Xác đ nh c u trúc hoá h c c a các h p ch t.....................................

28

3.2.1. H p ch t 1: Stevioside............................................................

28

3.2.2. H p ch t 2: -Sitostorol.........................................................

38

K t lu n.............................................................................................

43

Tài li u tham kh o.....................................................................

45

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
6


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

Danh m c các ch vi t t t
quay c c Specific Optical Rotation

[]D
13

1

1

C NMR

H NMR
H-1H COSY

2D-NMR

Ph c ng h

ng t h t nhân cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Ph c ng h

ng t h t nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Ph c ng h

ng t h t nhân hai chi u

Two-Dimensional NMR

CC

S c ký c t Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

FAB-MS

Ph kh i l

ng va ch m electron

Electron Impact Mass Spectrometry
Ph kh i l

ng b n phá nguyên t nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Ph kh i l

HR-FAB-MS

ng b n phá nguyên t nhanh phân gi i cao

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry

IR

Ph h ng ngo i Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Ph kh i l

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

ng Mass Spectroscopy

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
7


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

S c ký l p m ng Thin Layer Chromatography

TLC

Danh m c các hình v và b ng bi u
Trang
Hình 1.1: Cây c ng t và hoa c a cây c ng t

3

Hình 1.2.2.1: M t s h p ch t khung kauran ditecpen đã đ
l p t cây c ng t.

c phân

Hình 1.2.2.2: M t s h p ch t khung labdane ditecpen đã đ
l p t cây c ng t.

c phân

8

9

Hình 2.5: S đ chi t phân đo n và tinh ch các h p ch t t cây c
ng t

26

Hình 3.2.1.1: Ph

1

H-NMR c a h p ch t 1

28

Hình 3.2.1.2: Ph

1

H-NMR dãn r ng c a h p ch t 1

29

Hình 3.2.1.3: C u trúc hóa h c c a h p ch t 1

29

Hình 3.2.1.4: Ph

13

C-NMR c a h p ch t 1

30

Hình 3.2.1.5: Ph

13

C-NMR và các ph DEPT c a h p ch t 1

31

Hình 3.2.1.6: Ph HSQC c a h p ch t 1

35

Hình 3.2.1.7: Ph HMBC c a h p ch t 1

36

Hình 3.2.1.8: Các t

37

ng tác HMBC chính c a h p ch t 1

Hình 3.2.1.9: Ph kh i l

ng ESI-MS c a h p ch t 1

38

Hình 3.2.2.1: C u trúc hoá h c c a 2

39

Hình 3.2.2.2: Ph

39

H-NMR c a 2

1

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
8


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Hình 3.2.2.3: Ph

13

Khoá lu n t t nghi p

C-NMR c a 2

40

B ng 1: K t qu ph NMR c a h p ch t 1

32

B ng 2: K t qu

40

ph

NMR c a h p ch t 2

B ng 3: Hai h p ch t phân l p đ

c t lá cây c ng t.

Nguy n Duy Công

43

K31C- Khoa Hoá h c
9


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

M đ u
Vi t Nam n m trong khu v c nhi t đ i có khí h u nóng m, đ
trên 80%, l

m cao

ng m a l n, nhi t đ trung bình kho ng 15 đ n 270C. ó là đi u

ki n r t thích h p cho th c v t phát tri n. Do v y h th c v t Vi t Nam vô
cùng phong phú, đa d ng v i kho ng 12000 loài, trong đó có t i 4000 loài
đ

c nhân dân ta dùng làm th o d

c [7] . i u này th c s có ý ngh a to l n

cho s phát tri n c a ngành y t , ngành hoá h c và m t s ngành khác. H
th c v t phong phú trên đ
h c các h p ch t thiên nhiên

c coi nh là ti n đ cho s phát tri n ngành hóa
n

c ta.

T ngàn x a, ông cha ta đã s d ng nhi u ph
c đ ch a b nh, b i b c th hay làm h
đ gi i c m, Nhân sâm đ t ng c

Nâu đ nhu m màu. Các ph

ng thu c dân gian t cây

ng li u, ph m màu ... nh lá Tía tô

ng s c đ kháng, S đ t o mùi th m, c

ng thu c y h c c truy n đã th hi n nh ng m t

m nh trong đi u tr b nh là ít đ c tính và ít tác d ng ph . Do có nh ng u
đi m nh trên nên ngày nay con ng

i ngày càng quan tâm đ n các h p ch t

có ho t tính sinh h c cao trong th c v t và đ ng v t. V lâu dài đ i v i s
phát tri n các d

c ph m m i thì các h p ch t có ho t tính sinh h c đóng vai

trò quan tr ng, nó là kh i đ u cho vi c t ng h p nên các lo i thu c m i có tác
d ng t t h n.
Theo tài li u [28] công b hi n nay có kho ng 60% - 70% các lo i thu c
ch a b nh đang đ

c l u hành ho c đang trong giai đo n th nghi m lâm

sàng có ngu n g c t các h p ch t thiên nhiên.
Cây c ng t đ

c bi t đ n là m t lo i cây có ho t tính sinh h c cao, ch a

nhi u thành ph n hoá h c và có nhi u tác d ng d
nh t c a cây c ng t là ch a b nh đái tháo đ

c lý. Tác d ng quan tr ng

ng, b nh béo phì, cao huy t

áp...Vi c nghiên c u, kh o sát thành ph n hoá h c và tác d ng d

Nguy n Duy Công

c lý c a

K31C- Khoa Hoá h c
10


Tr

ng

cây c ng t

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

Vi t Nam nh m đ t c s khoa h c cho vi c s d ng chúng m t

cách thích h p, hi u qu có ý ngh a th c ti n đ i v i s phát tri n c a n n y
h c Vi t Nam hi n đ i d a trên các ph

ng thu c c truy n.

Do đó tôi đã ch n đ tài cho khoá lu n t t nghi p là:
“Nghiên c u thành ph n hoá h c c a cây c ng t (Stevia rebaudiana
(Bertoni) Hemsley)”.
Lu n v n này t p trung nghiên c u thành ph n hoá h c t lá cây c
ng t bao g m nh ng n i dung chính là:
1. S d ng các ph

ng pháp chi t và s c ký đ phân l p đ

c các

stevioside s ch t cây c ng t (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley).
2. S d ng các ph

ng pháp hoá lý k t h p đ xác đ nh c u trúc hoá h c

c a các h p ch t đã phân l p đ

c.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
11

Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Ch
1.1.

Khoá lu n t t nghi p

ng 1: T ng quan

c đi m, tính v và công d ng c a cây c ng t.
1.1.1. Th c v t h c.[7]
Tên khoa h c: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.
Hä: Cóc (Asteraceae).

Hình 1.1: Cây c ng t và hoa c a cây c ng t.
Cây th o nh , s ng nhi u n m, cao 0,5 – 0,6 m và có khi cao t i 1 m.
Thân c ng m c th ng, có rãnh d c và nhi u lông m n, ít phân nhánh.
Lá m c đ i, hình mác ho c b u d c, g c thuôn, đ u tù ho c h i nh n dài
5 -7 cm, r ng 1 - 1,5 cm, có 3 gân, 4 – 6 đôi r ng nh n

ph n n a v phía

đ u lá, hai m t có lông tr ng m n, nh m lá th y có v ng t r t đ m, cu ng lá
r t ng n.

Hoa l

ng tính, t h p thành đ u màu tr ng

ng n.

Qu b , không có mào lông, h t không có n i nh .
Mùa hoa: tháng 5 - 9

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
12


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

1.1.2. Phân b , sinh thái. [7]
Chi Stevia Cav. Không có m t đ i di n nào
đ

c tr ng ph bi n

M (ngu n g c

Vi t Nam hi n nay, đ

vùng Châu á. C ng t đang
c nh p n i t m t n

c Nam

Paraguay) n m 1988.

C ng t là cây a m và a sáng, có th ch u bóng ho c a bóng vào th i
vùng nhi t đ i, c ng t tr ng

k cây con. V n là cây
tr

Vi t Nam sinh

ng và phát tri n t t vào v xuân - hè. V mùa đông, cây có hi n t

r ng lá và h i tàn l i. Cây ra hoa, qu nhi u hàng n m. Tuy nhiên, ng
th

ng
i ta

ng áp d ng cách nhân gi ng b ng c m cành.
1.1.3. B ph n dùng. [7]
Ph n trên m t đ t c a cây c ng t. Thu hái lúc cây xum xuê.
1.1.4. Tác d ng d

c lý. [7]

1.1.4.1. Tác d ng h đ
c ng t có tác d ng làm đ

ng huy t: thành ph n steviosid trong lá cây

ng huy t gi m rõ r t

b nh nhân m c b nh đái tháo đ

th , chu t c ng tr ng và

ng.

1.1.4.2. Tác d ng giãn m ch: Steviosid có tác d ng làm giãn t nh
m ch toàn thân rõ r t.
1.1.4.3. Tác d ng trên th n và huy t áp: thành ph n steviosid trong lá
cây c ng t có tác d ng làm t ng l u l

ng huy t t

ng qua th n (RPF), t ng

t c đ l c c u th n (GFR), h huy t áp, t ng bài ni u và t ng th i tr natri.
1.1.4.4. Tác d ng tránh thai: Nghiên c u c a PLANAS (n m 1968)
đã thông báo , cho chu t c ng tr ng cái và đ c u ng n

c có 5% cao c ng t

th y có tác d ng ng a thai. Nh ng trong nh ng n m 70, b n nhóm th c
nghi m đ c l p, không xác nh n tác d ng này.
Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
13


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

1.1.4.5. Tác d ng kháng khu n: Cao lá c ng t có tác d ng đ i v i
Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris. Ch a th y tài li u công b v
tác d ng trên các vi khu n Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và
Lactobacillus casei là nh ng vi khu n có liên quan đ n quá trình sún r ng
tr em, vì hi n nay có dùng steviosid thay th đ
1.1.4.6. Li u dùng an toàn

ng

i: N ng đ steviosid trong m t s

Nh t B n là 0,005 – 0,007%. N u m t ngày u ng 1 lit thì

n

c gi i khát

l

ng steviosid đ a vào c th là 0,05 – 0,07g t

ng t.

ng trong ch bi n bánh k o.

i u đó có th đ

ng ng v i kho ng 1g lá c

c ch p nh n vì là li u an toàn, đã đ

c Nhà n

c

Nh t cho phép.
1.1.4.7.

c tính c p: Cho chu t u ng steviosid v i li u 2g/kg không

th y có chu t ch t và c ng không th y có bi u hi n đ c sau 2 tu n theo dõi.
1.1.4.8.

c tính bán c p: Cho chu t c ng tr ng n v i li u dùng

hàng ngày 0,5g/kg trong 56 ngày. các thông s theo dõi g m cân n ng, các ch
tiêu huy t h c, các ch tiêu hoá sinh và xét nghi m t ch c h c gan đ u bình
th

ng.
1.1.4.9.

c tính trên th n:

a. Thí nghi m trên chu t c ng tr ng, li u cao steviosid có th gây đ c
v i th n, làm t ng urê và creatinin huy t thanh.
b. Tiêm t nh m ch cho chu t c ng tr ng, li u 0,4; 0,8; 1,2; 1,6g/kg r i
theo dõi đ thanh th i c a m t s ch t có so sánh v i lô đ i ch ng, th y t
li u 0,8g/kg tr lên:
-

thanh th i inulin không thay đ i, ch ng t ch c n ng l c c u

th n không b nh h

ng.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
14

Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

ng l

Khoá lu n t t nghi p

thanh th i c a glucose t ng, ch ng t ch c n ng tái h p thu c a

n g n b suy gi m, m t ph n glucose không đ

th i tr qua n
-

c tái h p thu và đã b

c ti u.

thanh th i steviosid cao h n đ thanh th i inulin, ch ng t

steviosid còn b th i tr qua niêm m c c a ng th n.
- Ngoài ra, steviosid cong gây bài ni u t ng th i natri ni u và làm t ng
đ thanh th i c a paraaminohippuric.
c. Tiêm d

i da cho chu t c ng tr ng v i li u 1,5g/kg, k t qu th y:

- Nh ng thay đ i gi ng thí nghi m trên là t ng n ng đ urê và
creatinin trong huy t thanh, th y glucose trong n

c ti u.

- Ngoài ra v t ch c b nh h c, th y có bi n đ i hình thái
niêm m c ng l

n g n. Nh ng t n th

t bào

ng này là do ho t đ ng c a 2 enzym

phosphatase ki m và gama-glutamyl-transpeptidase t ng lên. Nh ng enzym
này khu trú ch y u

đi m bàn ch i c a t bào ng l

n g n.

1.1.4.10. Kh n ng gây đ t bi n:
a. Nhi u thí nghi m nghiên c u kh n ng gây đ t bi n trên các ch ng
Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,
ho c trên ch ng Escherichia coli WP2 đ u xác đ nh cao c ng t, steviosid và
steviol là aglycon c a steviosid không gây đ t bi n.
b. Có nghiên c u cho bi t m t s ch t chuy n hoá c a steviosid l i có
th gây đ t bi n. M c dù steviosid không b chuy n hoá trong c th và th i
tr nguyên v n qua n

c ti u. Song ng

màng tràng có th phân gi i đ

i ta lo ng i m t s t p khu n vùng

c steviosid.

1.1.5. Tính v , công n ng. [7]

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
15


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

C ng t có v ng t r t đ m, có ích cho ng

i đái tháo đ

ng và ng

i

béo phì, thu c ít đ c.
1.1.6. Công d ng. [7]
1.1.6.1. Ch a đái tháo đ
gi m nhu c u ch t đ
đ

ng: C ng t và steviosid có v ng t s làm

ng và ch t b t c a ng

ng huy t. Li u dùng theo th nghi m

i b nh, vì th s làm gi m

Braxin là m i l n 0,25g steviosid

(ho c 2,5g lá c ng t), ngày 4 l n. U ng nhi u ngày.
1.1.6.2. Ch a béo phì: C ng t và steviosid có v ng t s làm gi m
nhu c u ch t đ

ng và ch t b t c a c th , nên c ng có tác d ng ch a béo

phì. Li u dùng 0,5 – 1g steviosid chia ra 3 – 4 l n trong ngày. U ng nhi u
ngày.
1.1.6.3. Lá c ng t ho c steviosid th

ng dùng làm ch t đi u v cho

các lo i trà thu c, trà túi l c: T l lá c ng t ho c steviosid trong đó th

ng

th p. T i Vi t Nam, c ng đã có m t s ch ph m trà thu c có c ng t nh :
- Trà actisô - stevia.
- Trà sâm quy – stevia có sâm khu 5, tam th t, đ

ng quy, th c đ a,

táo, long nhã, ng gia bì và c ng t.
- Trà nhân tr n, th o quy t minh, c ng t.
- Trà túi l c Sotevin có d a c n, hoa cúc, hoa hoè và c ng t.
1.1.6.4. Ch a cao huy t áp: Hàng ngày u ng trà sotevin.
1.1.6.5. Dùng thay th đ

ng s charose: Trong công nghi p th c

ph m đ làm ch t đi u v cho bánh m t k o, n

c gi i khát.

1.2. Thành ph n hoá h c và ho t tính sinh h c c a cây c ng t.
1.2.1. Gi i thi u chung

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
16

Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Cây c ng t t lâu đã đ

Khoá lu n t t nghi p

c s d ng nh là m t ch t t o ng t t nhiên

không ch a calo.Các nghiên c u v thành ph n hoá h c c a cây c ng t đã
đ

c ti n hành t lâu và đã xác đ nh thành ph n chính t o ra v ng t là các

đitecpen glycosit trong đó ch y u là stevioside và các d n xu t kauran
ditecpen t

ng t . Hàm l

ng stevioside trong c ng t là 3 – 20% tu theo

gi ng và các đi u ki n tr ng tr t, thu ho ch.
H p ch t stevioside có đ ng t g p 300 l n so v i đ
trung ch y u

ph n lá cây. Nghiên c u v hàm l

trong c ng t đ u tiên đ
l

ng sucrose và t p

ng các ch t stevioside

c công b n m 1955: stevioside (5-10% tr ng

ng khô), rebaudioside A (2-4%), rebaudioside C (1-2%) và dulcoside A

(0,4-0,7%) [26]. Sau đó m t nhóm nghiên c u Nh t B n đã phân l p và xác
đ nh c u trúc c a stevioside, rebaudioside A, rehbaudioside B và
steviobioside b ng các ph
đ

ng pháp ph [13]. V sau các h p ch t này c ng

c phân l p b i các nhóm nghiên c u khác trên th gi i [12, 16, 21].
1.2.2. Thành ph n hoá h c và ho t tính sinh h c.
1.2.2.1. M t s h p ch t khung kauran ditecpen

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
17


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

OR2

H

H
COOR1

Khoá lu n t t nghi p

Steviol: R1 = R2 = H
Stevioside: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -D-glucopyranosyl(1->2)--D-glucopyranoside
Rebaudioside A: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -DGlucopyranosyl-(1->3)-[-D-glucopyranosyl-(1->2)]--Dglucopyranoside
Rebaudioside B: R1 = , R2 = -D-Glucopyranosyl-(1->2)-[-Dglucopyranosyl-(1->3)]--D-glucopyranoside
Rebaudioside C: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -LRhamnopyranosyl-(1->2)--D-glucopyranosyl-(1->3)--Dglucopyranoside
Rebaudioside D: R1 = -D-glucopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside, R2 = -D-Glucopyranosyl-(1->3)-[-Dglucopyranosyl-(1->2)]--D-glucopyranoside
Rebaudioside E: R1 = R2 = -D-glucopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside
Rebaudioside F: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -DGlucopyranosyl-(1->3)-[-D-xylopyranosyl-(1->2)]--Dglucopyranoside
Dulcoside A: R1 = -D-glucopyranoside, R2 = -Lrhamnopyranosyl-(1->2)--D-glucopyranoside
Steviobioside: R1 = , R2 = -L-Rhamnopyranosyl-(1->2)--Dglucopyranoside

Hình 1.2.2.1: M t s h p ch t khung kauran ditecpen đã đ

c phân l p t

cây c ng t.

Các ent – Kauren diterpen glycosid: steviosid(2,2 – 18,5%), rebaudiosid
A, B, C, D. E, dulcosid, steviobiosid. Các thành ph n này có v ng t

các

m c đ khác nhau.
1.2.2.2. M t s h p ch t khung labdane ditecpen.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
18


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p
HO

O

CH2OH

OH

OH

OH
R

OH
OH

Sterebin D: R = H
Sterebin C: R = OH
Sterebin B: R = acetoxy

Sterebin G

CH2OR1
R

OH
OH

OH
OH
OH
OH

Sterebin E: R1 = H
Sterebin K: R1 = Me
Sterebin I: R1 = aldehyde

Sterebin M: R = OH
Sterebin N: R = OH

Hình 1.2.2.2: M t s h p ch t khung labdane ditecpen đã đ

c phân l p t

cây c ng t.
Ngoài khung kauran ditecpen, trong cây c ng t còn ch a các đitecpen
thu c nhóm labdane. M t lo t h p ch t khung này đã đ

c phân l p và đ

c

đ t tên d ng sterebin [14, 17, 18].

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
19


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

Các labdan diterpen g m: jihanol, austroinulin, acetylaustroinulin.

1.2.2.3. Ho t tính sinh h c.
Các h p ch t đitecpen này đ
h p d n. V đ c tính khi đ

c bi t đ n có nhi u ho t tính sinh h c r t

c dùng làm ch t t o ng t, stevioside có đ đ c

r t th p khi nghiên c u trên chu t thí nghi m v i li u l

ng LD50 kho ng 10

g/kg th tr ng [25].
D ch chi t c ng nh các ch t tách đ

c t c ng t có tác d ng m nh

trong vi c đi u khi n quá trình chuy n hoá glucoz và insulin trong c th .
ng đ

ng

chu t b ti u đ

ng

Theo Chen và c ng s , stevioside v i li u 0,5 mg/kg làm gi m l
glucoz trong máu đ ng th i h n ch s kháng insulin
[4]. Tác gi Ferreira c ng ch ra r ng d ch chi t n

c c ng t (20 mg/kg/ngày)

c ng có tác d ng làm c ch quá trình chuy n hoá glucoz trong gan trên
chu t thí nghi m [8]. Tr
c a d ch chi t n

c đó vào n m 1986, Curi đã th nghi m tác d ng

c c ng t trên m t nhóm ng

i tình nguy n. K t qu cho

th y v i d ch chi t 5 g lá dùng liên t c trong 3 ngày, hàm l
glucoz trong huy t t

ng đ

ng

ng gi m rõ r t [5]. Các nghiên c u này m ra kh

n ng ng d ng c ng t trong vi c ch a tr b nh ti u đ

ng và các b nh liên

quan đ n s chuy n hoá glucoz . Ngoài ra, cùng v i tác d ng gi m đ

ng

huy t, stevioside còn có tác d ng h huy t áp trên lô chu t b ti u đ

ng [11].

Tác d ng ch ng ung th và ch ng viêm c a c ng t c ng đ

c nghiên

c u chi ti t trên mô hình chu t thí nghi m gây u b ng 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). Các h p ch t tách đ

c t cây này

g m stevioside, rebaudiosides A và C, và dulcoside A c ch m nh quá trình
gây viêm đ ng th i h n h p các h p ch t này ng n ng a t t s hình thành
ung th da trên chu t v i li u 1,0 và 0,1 mg/con [27].

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
20


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

M i đây, tác gi Boonkaewwan c ng cho th y tác d ng ch ng viêm

c a stevioside và steviol thông qua quá trình ng n ng a s t ng h p TNF- và
IL-1õ v i n ng đ khá th p (0,01-0,2 mM). C hai h p ch t này đ u có kh
n ng ng n ch n s phát tri n c a 3 d ng t bào T84, Caco-2 và HT29. Ho t
tính này đ

c bi t có liên quan đ n quá trình c ch y u t phiên mã NF-kB

[1].
H p ch t stevioside còn đ

c s d ng trong tr li u ch a a ch y hi u

qu . Kh i ngu n t k t qu nghiên c u tác d ng kháng khu n và kháng virut
c a d ch chi t nóng cây c ng t cho th y tác d ng di t m nh ch ng E. coli là
nguyên nhân gây ra b nh a ch y [24]. Các nghiên c u ti p sau đó kh ng đ nh
tác d ng và kh n ng ng d ng r t cao c a c ng t c ng nh nhóm ch t
stevioside trong vi c ch a tr a ch y [19, 20, 23].
Ngoài các h p ch t đitecpen, trong cây c ng t còn ch a l p ch t
phenol và flavonoit. Tác gi Ghanta đã đ nh l
ch t này trong d ch chi t etyl axetat là t

ng đ

ng đ

c hàm l

ng nhóm

ng 0,86 mg axit galic và

0,83 mg quercetin trên 1 mg. B ng phân tích LC-MS và ph NMR, nhóm tác
gi đó nh n d ng đ

c s có m t c a quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,

apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.
D ch chi t methanol và etyl axetat cho th y có kh n ng di t các g c t do
b ng ph

ng pháp th DPPH và lipid peroxidation. Nghiên c u này ch ng t

cây c ng t còn là m t d
1.3. Các ph

c li u thiên nhiên ch ng oxy hoá hi u qu [9].

ng pháp chi t m u th c v t.

Sau khi ti n hành thu hái và làm khô m u, tu thu c vào đ i t

ng ch t

có trong m u khác nhau (ch t phân c c, ch t không phân c c, ch t có đ phân
c c trung bình...) mà ta ch n dung môi và h dung môi khác nhau.
1.3.1. Ch n dung môi chi t.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c

21


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Thông th

Khoá lu n t t nghi p

ng các ch t chuy n hoá th c p trong cây có đ phân c c

khác nhau. Tuy nhiên nh ng thành ph n tan trong n

c ít khi đ

Dung môi dùng trong quá trình chi t c n ph i đ

c quan tâm.

c l a ch n r t c n

th n.
i u ki n c a dung môi là ph i hoà tan đ
c p đang nghiên c u, d dàng đ

c nh ng ch t chuy n hoá th

c lo i b , có tính tr (không ph n ng v i

ch t nghiên c u), không đ c, không d b c cháy.
Nh ng dung môi này nên đ

c ch ng c t đ thu đ

khi s d ng. N u chúng có l n các ch t khác thì có th
qu và ch t l

ng c a quá trình chi t. Th

c d ng s ch tr
nh h

c

ng đ n hi u

ng có m t s ch t d o l n trong

dung môi nh các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.
Nh ng ch t này có th l n v i dung môi trong quá trình s n xu t ho c trong
khâu b o qu n nh trong các thùng ch a ho c các nút đ y b ng nh a.
Methanol

và

chlorofrom

th

ng

ch a

dioctylphtalat

[di-(2-

etylhexyl)phtalat ho c bis-2-etylhexyl-phtalat]. Ch t này s làm sai l ch k t
qu phân l p trong các quá trình nghiên c u hoá th c v t, th hi n ho t tính
trong th nghi m sinh h c và có th làm b n d ch chi t c a cây. Chlorofrom,
metylen clorit và methanol là nh ng dung môi th

ng đ

c l a ch n trong

quá trình chi t s b m t ph n c a cây nh : lá, thân, r , c , qu , hoa...
Nh ng t p ch t c a chlorofrom nh

CH2Cl2, CH2ClBr có th ph n ng

v i m t vài h p ch t nh các ancaloit t o mu i b c 4 và nh ng s n ph m
khác. T

ng t nh v y s có m t c a l

th gây ra s phân hu , s kh n

c hay s đ ng phân hoá v i các h p ch t

khác. Vì chlorofrom có th gây t n th
thao tác khéo léo, c n th n

ng nh axit clohiđric (HCl) c ng có
ng cho gan và th n nên nó c n đ

c

n i thoáng và ph i đeo m t n phòng đ c.

Metylen clorit ít đ c h n và d bay h i h n chlorofrom.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
22


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

Methanol và etanol 80% là nh ng dung môi phân c c h n các
hiđrocacbon th clo. Ng

i ta cho r ng các dung môi thu c nhóm r

us

th m t t h n lên màng t bào nên quá trình chi t v i các dung môi này s thu
đ

cl

ng l n các thành ph n trong t bào. Trái l i, kh n ng phân c c c a

chlorofrom th p h n, nó có th r a gi i các ch t n m ngoài t bào. Các ancol
hoà tan ph n l n các ch t chuy n hoá phân c c cùng v i các h p ch t phân
c c trung bình và th p. Vì v y khi chi t b ng ancol thì các ch t này c ng b
hoà tan đ ng th i. Thông th

ng dung môi c n trong n

c có nh ng đ c tính

t t nh t cho quá trình chi t s b .
Tuy nhiên c ng có m t vài s n ph m m i đ

c t o thành khi dùng

methanol trong su t quá trình chi t [10]. Thí d trechlonolide A thu đ
Trechonaetes aciniata đ

hu
đ

ct

c chuy n thành trechonolide B b ng quá trình phân

1-hydroxytropacocain c ng x y ra khi erythroxylum novogranatense
c chi t trong methanol nóng.
Ng

i ta th

ng ít s d ng n

thay vào đó là dùng dung d ch n
Dietyl ete hi m khi đ

c đ thu đ

c d ch chi t thô t cây mà

c c a methanol.

c dùng cho các quá trình chi t th c v t vì nó r t

d bay h i, b c cháy và r t đ c, đ ng th i nó có xu h

ng t o thành peroxit

d n , peroxit c a dietyl ete d gây ph n ng oxi hoá v i nh ng h p ch t
không có kh n ng t o cholesterol nh các carotenoid. Ti p đ n là axeton
c ng có th t o thành axetonit n u 1,2-cis-diol có m t trong môi tr
Quá trình chi t d

i đi u ki n axit ho c baz th

ng đ

ng axit.

c dùng v i quá trình

phân tách đ c tr ng, c ng có khi x lý các d ch chi t b ng axit-baz có th
t o thành nh ng s n ph m mong mu n.
S hi u bi t v nh ng đ c tính c a nh ng ch t chuy n hoá th c p trong
cây đ

c chi t s r t quan tr ng đ t đó l a ch n dung môi thích h p cho

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
23


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

quá trình chi t tránh đ

Khoá lu n t t nghi p

c s phân hu ch t b i dung môi và quá trình t o

thành
ch t mong mu n.
Sau khi chi t dung môi đ

c c t ra b ng máy c t quay

quá 30-400C, v i m t hoá ch t ch u nhi t có th th c hi n

nhi t đ không

nhi t đ cao h n.

1.3.2. Quá trình chi t.
H u h t quá trình chi t đ n gi n đ

c phân lo i nh sau:

- Chi t ngâm.
- Chi t s d ng m t lo i thi t b là bình chi t Xoclet.
- Chi t s c v i dung môi n

c.

- Chi t lôi cu n theo h i n

c.

Chi t ngâm là m t trong nh ng ph

ng pháp đ

c s d ng r ng rãi nh t

trong quá trình chi t th c v t b i nó không đòi h i nhi u công s c và th i
gian. Thi t b s d ng là m t bình thu tinh v i m t cái khoá

d

i đáy đ

đi u ch nh t c đ ch y thích h p cho quá trình tách r a dung môi. Dung môi
có th nóng ho c l nh nh ng nóng s đ t hi u qu chi t cao h n. Tr

c đây,

máy chi t ngâm đòi h i ph i làm b ng kim lo i nh ng hi n nay có th dùng
bình thu tinh.
Thông th

ng quá trình chi t ngâm không đ

pháp chi t liên t c b i m u đ

24 gi r i ch t chi t đ

c s d ng nh ph

ng

c ngâm v i dung môi trong máy chi t kho ng

c l y ra. Thông th

ng quá trình chi t m t m u ch

th c hi n qua 3 l n dung môi vì khi đó c n chi t s không còn ch a nh ng
ch t giá tr n a. S k t thúc quá trình chi t đ

c xác đ nh b ng m t vài cách

khác nhau.

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
24


Tr

ng

i h c S ph m Hà N i 2

Khoá lu n t t nghi p

Nh v y tu thu c vào m c đích c n chi t l y ch t gì đ l a ch n dung
môi cho thích h p và th c hi n quy trình chi t h p lý nh m đ t hi u qu cao.
Ngoài ra, có th d a vào m i quan h c a dung môi và ch t tan c a các
l p ch t mà ta có th tách thô m t s l p ch t ngay trong quá trình chi t.
1.4. Các ph
Ph

ng pháp s c ký trong phân l p các h p ch t h u c .

ng pháp s c ký (chromatography) là m t ph

h u hi u nh t hi n nay, đ

ng pháp ph bi n và

c s d ng r ng rãi trong vi c phân l p các h p

ch t h u c nói chung và các h p ch t thiên nhiên nói riêng.
1.4.1.

c đi m chung c a ph

S c ký là ph

ng pháp s c ký.

ng pháp tách các ch t d a vào s khác nhau v b n ch t

h p ph và s phân b khác nhau c a chúng gi a hai pha đ ng và pha t nh.
S c ký g m có pha t nh và pha đ ng. Khi ti p xúc v i pha t nh, các c u
t c a h n h p s phân b gi a pha đ ng và pha t nh t

ng ng v i tính ch t

c a chúng (tính b h p ph , tính tan…). Các ch t khác nhau s có ái l c khác
nhau v i pha đ ng và pha t nh. Trong quá trình pha đ ng chuy n đ ng d c
theo h s c ký h t l p pha t nh này đ n l p pha t nh khác, s l p đi l p l i quá
trình h p ph và ph n h p ph . K t qu là các ch t có ái l c l n v i pha t nh
s chuy n đ ng ch m h n qua h th ng s c ký so v i các ch t t
h n v i pha này. Nh đ c đi m này mà ng

ng tác y u

i ta có th tách các ch t qua quá

trình s c ký.
1.4.2. C s c a ph
Ph

ng pháp s c ký.

ng pháp s c ký d a vào s phân b khác nhau c a các ch t gi a hai

pha đ ng và pha t nh.
thu c c a l

đi u ki n nhi t đ không đ i, đ nh lu t mô t s ph

ng ch t b h p ph lên pha t nh v i n ng đ c a dung d ch (ho c

Nguy n Duy Công

K31C- Khoa Hoá h c
25