KẾT QUẢ xét NGHIỆM tìm KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN BẰNG kĩ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP TRÊN tế bào HEP 2 tại BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (895.6 KB, 64 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
****************************
PHẠM THỊ CHÚC
KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM TÌM KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN
BẰNG KĨ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP
TRÊN TẾ BÀO HEP-2 TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU
TRUNG ƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ Y KHOA
KHÓA 2009-2015
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Bác sĩ VŨ NGUYỆT MINH
Hà Nội - 2015
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn tới:
Cô Vũ Nguyệt Minh, người thầy đã trực tiếp dìu dắt, tận tình hướng dẫn
và cho tôi những kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn,
trở ngại để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn đảng ủy, ban giám hiệu, phòng đào tạo trường
Đại học Y Hà Nội, bộ môn Da liễu trường Đại học Y Hà Nội, các cán bộ
nhân viên Bệnh viện Da liễu Trung ương, đặc biệt Phòng khám chuyên đề đã
tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ, gia đình, bạn bè và những
người thân đã động viên giúp đỡ tôi tiếp thêm cho tôi sức mạnh để vượt qua
mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập cũng như viết bản khóa luận này!
***************************************
Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015
Sinh viên
PHẠM THỊ CHÚC
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
-----------------
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi:
Phòng đào tạo đại học – Trường Đại học Y Hà Nội.
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Bộ môn Da liễu – Trường Đại học Y Hà Nội.
Tôi xin cam đoan toàn bộ số liệu và kết quả thu thập được trong luận văn
này là trung thực, chưa từng công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác.Tôi xin
chịu mọi trách nhiệm về tính chính xác của những thông tin và số liệu đưa ra.
Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015
Sinh viên
Phạm Thị Chúc
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANA
Antinuclear antibody
Kháng thể kháng nhân
Anti ENA
Anti-extractable nuclear antigens
Anti IgG-FITC
Kháng thể kháng IgG của người đã gắn
huỳnh quang
Anti- phospholipid
Kháng thể kháng phospholipid
Anti- Sm
Kháng thể kháng Smith
Anti SSA
Kháng thể kháng Ro
Anti-Sjögren's-syndrome-related antigen A
Anti-DNP
Anti Dinitrophenyl
Anti-Jo-1
Antihistidyl transfer RNA synthetase
DNA
Axit Deoxyribo Nucleic
ELISA
Enzyme linked immunosorbent
(Miễn dịch gắn men)
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
assay-
(phức hợp huỳnh quang)
HEp-2
Human Epithelial type 2
Hội chứng CREST
Calcinosis Raynaud Esophalageal Sclerodactylic Telangiectasis
IF
Immunofluorescence
(kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang)
MDHQGT
Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
PBS
Phosphate buffer saline
RIA
Radioimmunoassay
(kỹ thuật miễn dịch phóng xạ)
SLE
Systemic lupus erythematosus
( bệnh lupus ban đỏ hệ thống)
SS
Hội chứng Sjögren
Tif 1γ
Transcriptional intermediary factor 1
VBC
Viêm bì cơ
XCBHT
Xơ cứng bì hệ thống
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1: TỔNG QUAN
3
1.1. Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể
3
1.1.1. Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang gián tiếp trên tế bào HEp-2
3
1.1.2 Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể khác
1.2 Tổng quan về bệnh tổ chức liên kết tự miễn
1.2.1 Khái niệm
9
10
10
1.2.2 Bệnh lupus ban đỏ hệ thống
10
1.2.3 Bệnh xơ cứng bì hệ thống (systemic sclerosis)
1.2.4 Bệnh viêm bì cơ (VBC)
13
15
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
17
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
17
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
17
2.2 Phương pháp nghiên cứu
17
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 17
2.2.2 Cỡ mẫu
18
2.2.3 Phương pháp tiến hành
18
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
18
2.4 Cách khống chế sai số trong nghiên cứu
18
17
2.5 Sơ đồ nghiên cứu
19
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
20
3.1. Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp 2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/2013 - 12/2014 20
3.1.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu được làm xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ
thuật MDHQGT trên tế bào HEp - 2 20
3.1.2 Tình hình tiến hành xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên
tế bào HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương. 21
3.1.3 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp2 của phòng khám chuyên đề và phòng khám khác 22
3.1.4 Sự phù hợp giữa chẩn đoán sơ bộ và kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ
thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 của phòng khám chuyên đề
23
3.2 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2
của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn tại Bệnh
viện Da liễu Trung ương. 24
3.2.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu đủ tiêu chuẩnchẩn đoán SLE, XCBHT,
VBC trong nghiên cứu (N2=448)
24
3.2.2 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp2 của các bệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn (n1=317) 25
3.2.3. Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp2 của các bệnh nhân XCBHT đủ tiêu chuẩn (n2=117)
29
3.2.4 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp2 của các bệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn (n3=14) 33
Chương 4: BÀN LUẬN 37
4.1. Khảo sát chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế
bào HEp - 2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/2013 - 12/2014
(N1=1267) 37
4.1.1. Một vài đặc điểm của nhóm nghiên cứu
37
4.1.2 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp
-2
38
4.2. Đánh giá kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế
bào HEp- 2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu
chuẩn tại Bệnh viện Da liễu Trung ương.
39
4.2.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự
miễn đủ tiêu chuẩn
39
4.2.2. Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn 42
KẾT LUẬN
47
KIẾN NGHỊ
49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Tỷ lệ mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của các
bệnh nhân do phòng khám chuyên đề và phòng khám khác chỉ định
22
Bảng 3.2: So sánh chẩn đoán sơ bộ và kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ
thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 của phòng khám chuyên đề 23
Bảng 3.3 Đặc điểm nhóm nghiên cứu đủ tiêu chuẩn chẩn đoán SLE, XCBHT,
VBC trong nghiên cứu 24
Bảng 3.4 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của
bệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn trong nghiên cứu
25
Bảng 3.5 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với số
lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SLE
27
Bảng 3.6 Mối tương quan giữa mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào
HEp-2 với số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SLE
28
Bảng 3.7 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của
bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán XCBHT 29
Bảng 3.8 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với số
lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh XCBHT 31
Bảng 3.9 Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với số
lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh XCBHT 32
Bảng 3.10 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của
bệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn 33
Bảng 3.11 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với số
lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh VBC
35
Bảng 3.12 Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với
số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh VBC
36
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi của bệnh nhân được làm xét nghiệm tìm
ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 trong nghiên cứu
.. 20
Biểu đồ 3.2: Phân bố theo giới tính của nhóm bệnh nhân được làm xét nghiệm
tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2
21
Biểu đồ 3.3 Phân bố đơn vị chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật
MDHQGT trên tế bào HEp-2 21
Biểu đồ3.4: Phân bố các mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2
của bệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn trong nghiên cứu 26
Biểu đồ 3.5: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của
bệnh XCBHT đủ tiêu chuẩn
30
Biểu đồ 3.6: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của
bệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn 34
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Quy trình xét nghiệm MDHQGT trên tế bào HEp-2
5
Hình 1.2: Một số dạng lắng đọng MDHQGT trên tế bào HEp-2 thường gặp
8
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu bệnh nhân
19
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tổ chức liên kết tự miễn là các bệnh lý do có sự kết hợp của tự
kháng thể với tự kháng nguyên dẫn đến tổn thương thực thể và chức năng tại
tế bào, tổ chức hay cơ quan [1], [2]. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ
thuật, người ta đã phát hiện được hơn 100 loại tự kháng thể kháng lại nhiều
thành phần của tế bào: kháng thể kháng nhân, kháng thể kháng tương bào,
kháng ty lạp thể, kháng màng tế bào [3]....Trong đó kháng thể kháng nhân là
những globulin miễn dịch đặc hiệu đối với các cấu trúc khác nhau của nhân tế
bào: axit nhân, histon, ribonucleoprotein chiếm tỷ lệ cao. Kháng thể kháng
nhân có tỉ lệ dương tính cao ở một số bệnh tổ chức liên kết tự miễn như bệnh
lupus ban đỏ hệ thống, xơ cứng bì, viêm bì cơ, bệnh tổ chức liên kết hỗn hợp,
hội chứng Sjögren [4], [5]. Những tự kháng thể này là tiêu chuẩn quan trọng
trong chẩn đoán các bệnh tổ chức liên kết tự miễn.
Với nền y học tiến bộ hiện nay có rất nhiều kĩ thuật miễn dịch giúp phát
hiện các tự kháng thể như kĩ thuật miễn dịch gắn men, kĩ thuật kết tủa khuếch
tán kép trên thạch... Trong đó, xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ
thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 (Human Epithelial
type 2) là kĩ thuật mới được áp dụng tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, cho
phép phát hiện nhiều loại kháng thể như kháng thể kháng nhân và kháng thể
kháng lại nhiều thành phần cấu trúc tế bào. Tế bào HEp-2 là tế bào được ly
trích từ các tế bào ung thư thanh quản của người, có nhân tế bào lớn, hình thái
dễ quan sát. Việc sử dụng tế bào HEp-2 làm kháng nguyên trong miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp để phát hiện kháng thể kháng nhân đã được sử dụng từ
những năm 1980, cho kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Theo nghiên cứu
của Henrique A. Mariz (2011) trên 153 bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết
tự miễn bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 cho
thấy tỷ lệ kháng thể kháng nhân dương tính là 90,2 % [6]. Xét nghiệm tìm
kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế
bào HEp-2 đã được áp dụng trên thế giới từ những năm 1980, tuy nhiên tại
Bệnh viện Da liễu Trung ương kĩ thuật này mới được triển khai từ tháng
5/2013. Mặt khác, hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu cụ thể về
kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2.
2
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài "Kết quả xét nghiệm tìm kháng thể
kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào
HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương" với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát chỉ định xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật
miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 tại Bệnh viện Da liễu
Trung ương từ 5/2013- 12/2014.
2. Đánh giá kết quả xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật
miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 của các bệnh nhân mắc
bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể
1.1.1. Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2
1.1.1.1. Lịch sử
Kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (MDHQGT) được Coons đề
xướng năm 1942, đây là một bước ngoặt trong nghiên cứu miễn dịch học,
miễn dịch bệnh học cũng như nghiên cứu bệnh sinh một số bệnh. Năm 1954,
Coons và weller đã áp dụng kỹ thuật MDHQGT để nghiên cứu và chẩn đoán
tự kháng thể. Sau 3 năm, Weir và Johson đã dùng kĩ thuật này để phát hiện
kháng thể kháng nhân (antinuclear antibody- ANA) trong huyết thanh bệnh
nhân lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE). Trước
đây, kháng nguyên thường dùng trong xét nghiệm là cắt lát cơ quan của loài
gậm nhấm, tổ chức hay dùng là gan và thận chuột. Do vậy tỉ lệ dương tính của
ANA trong SLE thường thấp. Theo nghiên cứu của Rowell chỉ gặp 37% ANA
dương tính ở bệnh nhân SLE. Mai Trọng Khoa nghiên cứu trên 38 bệnh nhân
SLE cho thấy tỉ lệ dương tính của ANA là 60,5% [7]. Để khắc phục những
hạn chế của kháng nguyên cắt lát mỏng tổ chức của chuột, ngày nay tế bào
HEp-2 đã được sử dụng thay thế.
Tế bào HEp-2 là tế bào được ly trích từ các tế bào ung thư thanh quản
của người. Nhân tế bào rất lớn và hình thái dễ quan sát. Do được nuôi cấy
nên tế bào HEp-2 xuất hiện trên tiêu bản ở nhiều giai đoạn phát triển khác
nhau giúp xác định dễ dàng các kháng thể mà trên mảnh cắt tổ chức không
cho phép.
4
1.1.1.2 Định nghĩa
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IF: Immunofluorescence) là một kĩ
thuật hóa mô dùng phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể và vị trí khu trú
của các kháng nguyên, kháng thể đó. Kháng thể đặc hiệu được gắn với phức
hợp huỳnh quang (FITC: Fluorescein Isothiocyanate), giúp chúng ta quan sát
được phản ứng miễn dịch dưới kính hiển vi huỳnh quang [8]
Có 2 kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cơ bản được sử dụng trong ngành
da liễu [9]
- MDHQ trực tiếp (Direct Immunofluorescence: DIF): là kỹ thuật phát
hiện kháng thể ở da người bệnh.
- MDHQ gián tiếp (Indirect Immunofluorescence: IIF): là kỹ thuật phát
hiện kháng thể ở trong huyết thanh, huyết tương, dịch bọng nước hoặc trong
các dịch khác.
1.1.1.3. Nguyên lý
Kháng thể (nếu có) trong huyết thanh bệnh nhân sẽ kết hợp với kháng
nguyên nhân (nhân tế bào HEp-2), phức hợp kháng nguyên-kháng thể được
phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang nhờ kết hợp với kháng thể kháng
IgG của người đã gắn huỳnh quang (anti IgG-FITC).
Tế bào HEp-2 được sử dụng như một cơ chất nền trong phương pháp
này để phát hiện các loại ANA, kháng hạt nhân, kháng các thành phần của
bào tương (DNA, histon, nucleosom, ribosom, enzyme…) [7]
1.1.1.4. Cách tiến hành xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật
MDHQGT trên tế bào HEp-2
- Các xét nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm Bệnh viện Da
Liễu Trung ương với kit FLUORO HEPANA của hãng MBL – Nhật bản
- Lấy bệnh phẩm: Lấy máu tĩnh mạch 3ml vào ống không chống đông,
để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, ly tâm với tốc độ 2000 vòng/15 phút. Chắt
phần huyết thanh vào ống 1,5ml, lưu ở tủ lạnh sâu -800C.
- Chuẩn bị bệnh phẩm: Huyết thanh
5
bệnh nhân được pha loãng với dung
dịch phosphate buffer saline (PBS) theo
Huyết thanh
tỷ lệ 1:40.
- Chuẩn bị lam kính có gắn tế bào
HEp-2: Lam kính được để ở nhiệt độ
phòng ít nhất 5 phút trước khi sử dụng.
Ủ ở buồng ẩm, 37 0C - 30 phút
- Hút 50 l huyết thanh đã pha loãng
nhỏ vào mỗi giếng trên lam, không
chạm đầu típ vào đáy mỗi giếng.
- Ủ lam ở buồng ẩm, nhiệt độ 37 0C,
thời gian 30 phút.
Làm khô
- Rửa lam 3 lần với dung dịch PBS, các
lần rửa cách nhau 5 phút
- Làm khô xung quanh lam, nhỏ một
giọt kháng kháng thể người cộng hợp
huỳnh quang (anti IgG-FITC) vào mỗi
Anti-IgG-HQ
Ủ ở buồng ẩm, 37 0C - 30 phút
giếng.
- Ủ lam ở buồng ẩm, nhiệt độ 37 0C,
thời gian 30 phút.
- Rửa lam 3 lần với dung dịch PBS, các
lần rửa cách nhau 5 phút
Làm khô
- Làm khô xung quanh lam, nhỏ một
giọt glycerin vào mỗi giếng, đậy lam
Glycerin
nhẹ nhàng tránh tạo bọt.
- Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh Đọc bằng kính hiển vi
Hình 1.1 Quy trình xét nghiệm
quang
MDHQGT trên tế bào HEp-2
1.1.1.5. Nhận định kết quả:
6
- Gián tiếp thông qua kháng thể IgG có gắn FITC, dưới kính hiển vi
huỳnh quang sẽ phát hiện được các kháng thể người bệnh gắn trên tế bào
HEp-2. Tuỳ vị trí gắn và mức độ huỳnh quang, kết quả sẽ đưa ra kiểu lắng
đọng và đậm độ huỳnh quang.
- Âm tính: nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn bộ tế bào màu đỏ
nhân sẫm hơn.
- Dương tính: trên nền tế bào đỏ, nhân tế bào to tròn nhuộm màu sáng
xanh. Test được nhận định dương tính khi hiệu giá huyết thanh pha loãng là
1/40 trở lên.
Âm tính
Nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn
bộ tế bào màu đỏ, nhân màu đỏ sẫm hơn.
Dạng lắng đọng Homogenerous (đồng
nhất)
- Toàn bộ nhân bắt màu đồng nhất, mịn
- Tế bào phân chia: bắt màu sáng hơn tế
bào bình thường.
Kháng
thể:
anti-histone,
Dinitrophenyl (anti-DNP)
anti
- Bệnh: SLE, SLE do thuốc, Hội chứng
Sjögren(SS).
7
Dạng lắng đọng Specked (đốm nhân)
- Nhân tế bào bắt màu không mịn và đều.
- Hạt nhân không bắt màu.
- Tế bào phân chia: không bắt màu.
- Kháng thể: Anti-extractable nuclear
antigens (anti-ENA) (Sm, SSA, SSB,
ribonucleoprotein- RNP).
- Bệnh: SLE (anti-Sm), bệnh tổ chức liên
kết hỗn hợp (anti-RNP), SS (anti-SSB)
Dạng lắng đọng Peripheral (viền nhân)
- Màng nhân bắt màu sáng hơn so với trung
tâm nhân.
- Tế bào phân chia: bắt màu sáng hơn tế
bàothường.
- Kháng thể: anti-DNA
- Bệnh SLE
Dạng lắng đọng Nucleolar (hạt nhân)
- Nhân bắt màu, hạt rời hoặc liên kết
- Số lượng hạt < 6.
- Kháng thể: anti-nucleolar
- Bệnh: SLE, SS.
8
Dạng lắng đọng Discrete (hạt rải rác)
- Nhân tế bào bắt màu đồng nhất và có
vùng không bắt.
- Số lượng đốm bắt màu: 40 – 60 hạt.
- Tế bào phân chia: các đốm xếp theo
đường ngang.
- Kháng thể: anti-centromere
- Bệnh: hội chứng CREST
Hình 1.2: Một số dạng lắng đọng MDHQGT trên tế bào HEp-2 thường gặp
1.1.1.6. Ý nghĩa kết quả:
Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật MDHQGT trên tế
bào HEp-2 cung cấp hai thông tin: nồng độ và kiểu lắng đọng huỳnh quang.
Trong đó:
Nồng độ quyết định ngưỡng dương tính, gợi ý loại kháng thể (vì có
những kháng thể dương tính ở những nồng độ pha loãng rất lớn và ngược lại,
có những kháng thể dương tính ở nồng độ nhỏ hơn).
Kiểu lắng đọng huỳnh quang và vị trí xuất hiện huỳnh quang trong tế
bào giúp định hướng một cách trực tiếp tình trạng bệnh học, có thể gợi ý loại
tự kháng thể có khả năng nhất trong huyết thanh của bệnh nhân.
Có nhiều yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả của xét nghiệm tìm ANA
bằng kỹ thuật MDHQGT như: bản chất của chất nền, bản chất huyết
thanh, sự chọn lựa dung dịch đệm pha loãng và sự kết hợp huỳnh quang,
điều kiện ủ và rửa, kính hiển vi huỳnh quang, huyết thanh chứng và phụ
thuộc chủ quan người đọc.
9
1.1.2. Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể khác
1.1.2.1. Miễn dịch kết tủa khuếch tán kép trên thạch (ouchterlony)
Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạch
agarose. Phức hợp này sẽ khuếch tán và tạo nên những đường kết tủa trên bề
mặt thạch, sau đó dùng huyết thanh chuẩn hoặc kháng nguyên mẫu để so
sánh. Kĩ thuật này cho phép phát hiện nồng độ tối thiểu là 3mg/ml [10], [11].
Kỹ thuật này được đánh giá có độ nhạy, độ đặc hiệu thấp hơn các kỹ thuật
miễn dịch gắn men, MDHQGT, miễn dịch đánh dấu...[12].
1.1.2.2. Miễn dịch gắn men (Enzyme linked immunosorbent assay-ELISA)
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản
ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện
màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng
nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên
hay kháng thể cần phát hiện.
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên
hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). Theo tác giả
Sinico, độ nhạy của phương pháp ELISA dao động từ 70 đến hơn 90% [13] và
từ 90 – 96% theo nghiên cứu của Copple [14]. ELISA có tính tự động hóa cao
nhưng kém đặc hiệu so với MDHQGT và chất lượng phụ thuộc nhiều vào
hãng sản xuất.
1.1.2.3. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay-RIA)
Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3, Cacbon 14, I125...
đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng
nguyên kháng thể. Kỹ thuật định lượng miễn dịch phóng xạ có thể phát hiện
10
nồng độ tối thiểu là 0,0001 mg/ml [10], [11]. Tuy nhiên, RIA đòi hỏi sinh vật
phẩm đắt tiền, máy đo tia gamma hoặc beta và trang bị xử lý chất thải.
1.2. Tổng quan về bệnh tổ chức liên kết tự miễn
1.2.1. Khái niệm
Bệnh tổ chức liên kết tự miễn (Autoimmune connective tissue diseases ACTDs) là các bệnh lý do có sự kết hợp của tự kháng thể với tự kháng
nguyên dẫn đến tổn thương thực thể và chức năng tại tế bào, tổ chức hay cơ
quan[1],[2]
Các bệnh thuộc nhóm này gồm: [10]
- Lupus ban đỏ hệ thống.
- Xơ cứng bì hệ thống.
- Viêm bì cơ/viêm đa cơ.
- Bệnh tổ chức liên kết hỗn hợp.
- Và các bệnh khác như viêm khớp dạng thấp, viêm mạch, hội chứng
Sjögren, hội chứng kháng phospholipid...
1.2.2. Bệnh lupus ban đỏ hệ thống
Lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE) là một bệnh
tự miễn có tổn thương đa cơ quan được đặc trưng bởi sự có mặt của ANA và
nhiều tự kháng thể khác. Cơ chế bệnh sinh của SLE rất phức tạp. Bệnh là hậu
quả của sự tương tác giữa yếu tố di truyền (gen bệnh), nội tiết và yếu tố môi
trường (thuốc, tia cực tím, virus...) dẫn đến đáp ứng miễn dịch bất thường, sản
xuất không ngừng các tự kháng thể bệnh lý. Các tự kháng thể này kết hợp với
kháng nguyên tạo phức hợp miễn dịch gắn vào các tổ chức đích gây tổn thương
[2], [15]. Ở Mỹ, theo thống kê hàng năm của Centers for disease control (CDC )
có khoảng 1,8-7,6 trường hợp mắc mới trên 100.000 dân, tỉ lệ mắc bệnh khoảng
52/100.000 dân. Bệnh gặp chủ yếu ở nữ giới, tỷ lệ nữ/nam là 9/1[1], [3]
11
1.2.2.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán SLE:
Tiêu chuẩn chẩn đoán của Hội Khớp học Mỹ năm 1997 gồm: [2], [10]
1. Ban cánh bướm ở hai bên má, phía dưới 2 mắt, có thể phẳng hoặc gồ lên mặt da.
2. Ban hình đĩa: những mảng màu đỏ, nổi gồ lên kèm theo vảy da
3. Nhạy cảm với ánh sáng
4. Loét miệng, mũi hầu: thường ít đau
5. Viêm khớp: thường không gây biến dạng khớp, có thể sưng khớp và ấn đau.
6. Viêm thanh mạc: tình trạng viêm của các túi hoặc màng phổi, tim và
khoang ổ bụng.
7. Tổn thương cầu thận: Protein niệu >500mg/24h hoặc tế bào niệu.
8. Rối loạn về thần kinh, biểu hiện bằng cơn động kinh hoặc rối loạn tâm
thần không do các nguyên nhân khác
9. Rối loạn về máu: giảm số lượng các thành phần bạch cầu, hồng cầu… trong máu.
10. Rối loạn miễn dịch: phát hiện kháng thể kháng Axit Deoxyribo
Nucleic (DNA), kháng Smith hoặc kháng thể antiphospholipid
11. ANA dương tính
Chẩn đoán SLE khi có ≥ 4/11 tiêu chuẩn. Trong 11 tiêu chuẩn đó ANA
coi là tiêu chuẩn quan trọng nhất, gặp ở 94% các trường hợp [1]
1.2.2.2. Các tự kháng thể có thể gặp trong SLE:
- ANA
ANA gặp ở 94% bệnh nhân SLE và được coi là một trong số 11 tiêu
chuẩn để chẩn đoán bệnh SLE. Theo Tan và cộng sự tỷ lệ ANA dương tính
bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với độ pha loãng 1/40 là
97,4% [5]. ANA gặp ở 78% bệnh nhân XCBHT, trong VBC là 19%. Tuy
nhiên, độ đặc hiệu của ANA không cao, có thể gặp trong các bệnh tự miễn
khác, bệnh lý nhiễm trùng mãn tính và gặp cả ở người bình thường đặc biệt là
người già [16]
12
- Kháng thể kháng DNA [1], [16]
Kháng thể kháng DNA bao gồm kháng thể kháng DNA chuỗi kép (antids DNA - antibodies to double-stranded DNA): tỉ lệ dương tính cao 70-90%
ở bệnh nhân SLE [2], [17], độ đặc hiệu cao 95% [3], rất có ý nghĩa trong chẩn
đoán SLE.
Kháng thể kháng DNA chuỗi đơn (anti-ss DNA - antibodies to singlestranded DNA) gặp ở 30% bệnh nhân SLE, tuy nhiên nó có thể gặp trong
bệnh SLE do thuốc, các bệnh nhiễm trùng và các bệnh tự miễn khác.
- Kháng thể kháng Histon (Antibodies to individual histones)
70% bệnh nhân SLE có kháng thể kháng Histon dương tính, đó là kháng
thể kháng tiểu phần H1 và H2B. Kháng thể kháng Histon H2A-2B, H3, H4
thường thấy trong bệnh SLE do thuốc.
- Kháng thể kháng chất nhiễm sắc (Antibodies to chromatin)
Chất nhiễm sắc là phức hợp gồm DNA và protein loại Histon, trong đó
nucleosom là phức hợp của DNA và Histon loại 2A-2B. Kháng thể kháng
chất nhiễm sắc dương tính ở 69% bệnh nhân SLE.
- Kháng thể kháng nhân hòa tan
+ Kháng thể kháng Smith (Splicesome ribonucleoprotein- Sm): Kháng
nguyên Smith là phức hợp của protein loại B, B’, D, E, F, G với các Acid
ribonucleic (RNA) nhân loại U1, U2, U4-6 và U5. Phức hợp này đóng vai trò
quan trọng đối với sự gắn của tiền RNA thông tin, bước không thể thiếu trong
quá trình sao chép RNA từ DNA. Như vậy, anti Sm thực chất gồm nhiều
kháng thể kháng lại các protein nhân khác nhau. Anti Sm có độ đặc hiệu cao
đối với bệnh SLE. Theo tác giả Lock RJ tỷ lệ anti Sm dương tính trong bệnh
SLE bằng phương pháp ELISA là 34- 45%, độ đặc hiệu 88- 100% [18]. Trong
giai đoạn lui bệnh, anti- dsDNA có thể trở về giá trị bình thường nhưng anti
Sm vẫn dương tính. Do đó định lượng anti Sm có ý nghĩa trong chẩn đoán
13
SLE, đặc biệt khi giá trị anti- dsDNA ở ngưỡng bình thường.
+ Kháng thể kháng Ro (Anti-Sjögren's-syndrome-related antigen A - Anti
SSA)
Anti SSA kháng phức hợp gồm 5 tiểu phần RNA tương bào (Y1-Y5) và
khoảng 4 protein có trọng lượng phân tử 62, 60, 52, 50 kilo dalton. Theo tác
giả Lock RJ độ nhạy bằng phương pháp ELISA của anti SSA trong bệnh SLE
là 61%, độ đặc hiệu 80- 93% [18]. Kháng thể này gặp trong lupus ở trẻ sơ
sinh, lupus bán cấp ở da, bệnh nhân lupus có tổn thương thận và phổi, hội
chứng Sjögren...
- Kháng thể kháng phospholipid (Anti- phospholipid)
Anti-phospholipid gặp ở 24% bệnh nhân SLE. Hội chứng kháng
phospholipid đặc trưng bởi sẩy thai nhiều lần, tiền sản giật, huyết khối tĩnh
mạch, động mạch trung tâm và ngoại vi.
1.2.3. Bệnh xơ cứng bì hệ thống (systemic sclerosis)
Xơ cứng bì hệ thống (XCBHT) là một bệnh tự miễn mạn tính, không rõ
căn nguyên, đặc trưng về lâm sàng bởi tình trạng rối loạn vận mạch, xơ, teo
da, tổ chức dưới da, cơ khớp, tiêu hóa, phổi, tim, thận, hệ thần kinh. Bệnh
thường gặp ở nữ (tỷ lệ nữ/nam = 4/1). Tần số bệnh XCBHT khoảng 2,3- 10
bệnh nhân trên 1.000.000 người dân. Tuổi khởi phát trong khoảng từ 30 – 40
tuổi [1], [2]. Nguyên nhân tử vong thường do tổn thương nội tạng như tăng áp
động mạch phổi, xơ hóa phổi, bệnh tim...
XCBHT được chia làm 2 thể chính:
- XCBHT khu trú (Localized cutaneous systemic sclerosis - lcSSc): còn
gọi là hội chứng CREST (Calcinosis Raynaud Esophalageal Sclero-dactylic
Telangiectasis) gồm các biểu hiện calci hóa đầu chi, hội chứng Raynaud, tổn
thương thực quản, xơ cứng đầu chi và giãn mạch. Thương tổn da giới hạn ở
vùng đầu chi, mặt, ngực mà không có ở gốc chi, thân mình, tiến triển chậm [19]
14
- XCBHT lan tỏa (Diffuse cutaneous systemic sclerosis – dcSSc): xơ
cứng vùng gốc chi, thân và mặt. XCBHT lan tỏa tiến triển nhanh gây tổn
thương nội tạng, rối loạn chức năng nhiều, tỉ lệ tử vong cao.
1.2.3.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán
Tiêu chuẩn chẩn đoán XCBHT theo Hội thấp khớp học Mỹ (ACR) 1980:
- Tiêu chuẩn chính: XCB hướng tâm, đối xứng, da dầy, căng cứng.
- Tiêu chuẩn phụ:
+ Xơ cứng da đầu chi.
+ Sẹo lõm hoặc loét ở ngón tay.
+ Xơ phổi vùng đáy 2 bên: Trên phim X quang thấy mờ hình dải hoặc
nốt mờ ở hai đáy phổi, mờ có thể lốm đốm tạo thành hình "tổ ong". Những
tổn thương này không do bệnh phổi nguyên phát gây nên.
Chẩn đoán xác định XCBHT khi có một tiêu chuẩn chính hoặc trên hai
tiêu chuẩn phụ ở trên.
1.2.3.2. Một số tự kháng thể thường gặp trong bệnh XCBHT
- Kháng thể Topoisomerase I (Scl - 70/Topol)
Trước đây, kháng thể này có tên gọi là Scl- 70 vì kháng đoạn trọng lượng
phân tử 70 kilodalton của enzym DNA topoisomerase I, enzyme có vai trò
tháo xoắn chuỗi DNA xoắn kép trong quá trình phiên mã. Ngày này được gọi
là kháng thể Topoisomerase I, kháng thể này gặp ở 25 - 40% bệnh nhân
XCBHT, thường ở thể tổn thương da lan toả. [20]
- Kháng thể kháng Centromere
Kháng thể kháng đoạn trung tâm của chromosome, gặp ở 60% bệnh
nhân XCBHT thể giới hạn, đặc hiệu cho thể này (98%). Chúng cũng có 6% ở
bệnh nhân SLE, 17% ở bệnh nhân xơ gan đường mật tiên phát.
- Kháng RNA polymerase I, II, III
Gặp ở 4 - 20% bệnh nhân, liên quan với XCBHT có tổn thương thận.
15
Ngoài ra, có thể gặp các tự kháng thể khác như kháng thể kháng
Fibrillarin (U3-RNP)
1.2.4. Bệnh viêm bì cơ (VBC)
VBC là một bệnh hệ thống biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau, trong
đó chủ yếu tác động đến da, cơ và mao mạch, đặc trưng bởi các dát đỏ phù nề
trên da, yếu cơ và các dấu hiệu viêm. Cơ chế bệnh sinh còn chưa rõ ràng. Tỷ
lệ bệnh khoảng 5,5 trường hợp trong 1.000.000 dân tại Mỹ, nữ mắc bệnh gấp
đôi nam giới. Bệnh có thể gặp ở bất kỳ lứa tuổi nào, song có 2 lứa tuổi thường
gặp: ở người lớn khoảng 50 tuổi, trẻ nhỏ 5-10 tuổi [2]
1.2.4.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán
Tiêu chuẩn chẩn đoán của Nhật Bản năm 1995 gồm:
- Triệu chứng da:
1. Ban tím sẫm quanh hốc mắt (helitrope rash)
2. Sẩn Gottron: ban xuất huyết sừng hóa, mảng đỏ hoặc tím ở mặt duỗi
của ngón tay
3. Ban đỏ ở mặt duỗi các khớp ngoại vi lớn (khuỷu, gối)
- Triệu chứng về cơ và ngoài cơ
1.Yếu cơ gốc chi: chi trên, chi dưới, thân mình.
2.Tăng creatinin kinase hoặc aldolase huyết thanh.
3. Đau cơ khi bóp hoặc đau tự nhiên.
4. Thay đổi trên điện cơ (đơn vị vận động đa pha ngắn có điện thế rung tự
nhiên).
5. Xét nghiệm kháng thể kháng Jo-1 dương tính.
6. Viêm khớp không có phá hủy khớp.
7. Dấu hiệu viêm hệ thống: sốt, C reaction protein (CRP) tăng, máu lắng
>20mm/h.
8. Sinh thiết cơ có tình trạng viêm cơ vân, thoái hóa sợi cơ.
