kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp và cách xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, nấm bào ngư đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính
trong bữa ăn của người dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dưỡng, rất dễ chế
biến, nấm còn được xem như là một loại “rau sạch” và có giá trị dược liệu. Sản lượng
nấm bào ngư tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv
(1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lượng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ
350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngư Pleurotus spp. tăng từ
169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997.
Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nước. Vì
thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nước ta còn nhập khẩu nhiều
loại nấm bào ngư khác từ nước ngoài như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số
đó, có một số loài đã được biết rất rõ về thành phần dinh dưỡng, một số loài còn lại
thành phần này vẫn chưa được công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid.
Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngư đối với Việt Nam là
điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng như so sánh sự khác nhau giữa
chúng. Từ xưa đến nay, việc xác định amino acid đã được thực hiện trên rất nhiều công
cụ khác nhau như: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các công cụ
phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp.
Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần
amino acid trong mẫu sinh hóa đã được đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công
cụ đã được tự động hóa và được nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị
trường đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid như: sắc ký lỏng cao áp,
HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis).
Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng
sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trường Việt Nam. Từ đó, với
kết quả thu được chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tượng khác cũng như sự
khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngư
sẽ được lưu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này.

2

1.2. Mục đích
So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngư đang có trên thị
trường Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần
amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau
1.3. Yêu cầu
Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao.
Tránh hiện tượng làm thay đổi tính chất mẫu như oxy hóa, halogen hóa, hay làm
mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân.
Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung
tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên
1.4. Nội dung thực hiện
Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trường.
Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trường mùn cưa có bổ sung một số vi
lượng. Tiến hành thu quả thể
Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngư bằng sắc ký lỏng
cao áp (HPLC).


3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm trồng
2.1.1. Khái niệm về nấm
Hiện nay, số loài nấm trồng được chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn
thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thước lớn (đa số
dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dưỡng [5].
Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn được và không ăn

được, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thường và những loài phải sử
dụng kính hiển vi mới quan sát được [5].
Ban đầu nấm được xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay
không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một
giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới
Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự
dưỡng như thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn
không chứa cellulose trong thành tế bào [1].

Thành tế bào

Nhân

Lysosome

Màng tế bào chất

Bộ máy golgi
Ti thể

Ribosome

Mạng lưới nội chất

Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001)


4

Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn. Các

ống này đều có vách ngăn. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn gọi là
khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào. Tế bào nấm có
những đặc trưng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật. Trước hết là thành tế
bào. Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi nhiều lớp. Nếu
như thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế bào của những
nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau. Hầu hết các loài
nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan. Thông qua các lỗ trên
vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1].

Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dưới kính hiển vi quang học phóng đại từ
1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy
Màng tế bào
Nhân tế bào
Bộ máy golgi
Ribosome
Lysosome
Ti thể
Mạng lưới nôi chất.
Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm. Bào tử nảy mầm
theo nhiều hướng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng
chịt và thường có màu trắng.
Riêng ở nấm đảm nói chung thường có tới 3 cấp sợi nấm. Sợi nấm cấp một (sơ
sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc
đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành
nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai được tạo thành do sự phối trộn
của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với
nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Người ta còn gọi sợi
nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm
cấp hai phát triển thành . Các sợi nấm nà y liên kết chặt chẽ với nhau và tạo thành quả
thể [1] .

5

2.1.2. Sinh sản và chu trình sống
Khả năng sinh sản là một đặc điểm quan trọng của nấm. Một tai nấm rơm trưởng
thành có thể phóng hàng tỉ bào tử. Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rộng.

Bào tử của nấm phổ biến có hai dạng: vô tính và hữu tính. Ở vi nấm, nấm mốc
lan truyền chủ yếu nhờ bào tử vô tính, chúng gây nhiễm khắp nơi dưới dạng hạt bụi
nhỏ li ti, màu sắc khác nhau tùy loài. Riêng đối với nấm ăn, bào tử sinh ra bên dưới
cấu trúc đặc bịêt gọi là mũ nấm hay tai nấm. Mũ nấm thường có cuống nâng lên cao để
có thể nhờ gió đưa bào tử đi xa. Bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm mới [3].
Người ta quen gọi hệ sợi nấm ở giai đoạn tăng trưởng (hay dinh dưỡng) là tản
dinh dưỡng, phân biệt với quả thể nấm (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm) là
tản sinh sản.
Hầu hết nấm trồng là nấm đảm, cơ quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt là tai
nấm. Tai nấm chủ yếu gồm mũ và cuống nấm. Mũ thường có dạng nón hay phễu, với
cuống đính ở giữa hay bên. Mặt dưới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng
xếp sát vao nhau như hình nan quạt. Ở một số trường hợp, phiến nấm còn kéo dài từ
mũ xuống cuống (chân nấm), như nấm bào ngư (Pleurotus) [3].
Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là
đảm (basidium). Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trưởng thành mũ nấm sẽ chảy
thành dịch nước đen mang theo các bào tử đảm; còn các bào tử khác sẽ rụng và bay
theo gió. Đảm được tạo thành từ các đầu ngọn sợi nấm. Tế bào này phồng to và bên
trong hai nhân đứng riêng lẻ, sẽ nhập lại thành một nhân. Quá trình này gọi là quá
trình thụ tinh [3].
Nhân thụ tinh sẽ phân chia và cuối cùng tạo ra 4 nhân con. Bình thường mỗi
nhân sẽ được khối sinh chất đẩy vào một cái gai nhỏ (xuất hiện trên đảm) để tạo ra một
đảm bào tử, nhưng đôi khi một đảm bào tử có thể cùng lúc hai nhân như nấm rơm (tỉ lệ

chiếm đến 1/4) hoặc đặc biệt ở nấm mỡ (Agaricus bisporus) chỉ sinh ra hai đảm tử,
mỗi bào tử chứa hai nhân.
Các tế bào đảm hợp lại thành lớp trên bề mặt của phiến, được gọi là lớp thụ
tầng (hymennium) và vì vậy đảm bào tử cũng thành lớp phủ trên trên bề mặt phiến.
Điều này thấy rõ nấm rơm, khi trưởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ là do màu
của bào tử.


6

Người ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) và nấm dị đảm
(hemibasidiomycetidae) là dựa vào cấu trúc của đảm. Nấm đồng đảm có đảm là một tế
bào đồng nhất, còn nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm 4 phần, mỗi phần tạo ra một
đảm bào tử. Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi. Khi gặp điều
Quả thể

Phiến nấm

Hình thành
quả thể
Sợi nấm
song nhân

Quá trình
dung hợp

Sợi nấm thứ cấp
(song nhân)

Sợi âm

Giảm phân hình
thành bào tử đảm

Hợp tử

Bào tử đảm
Sợi dương

Sợi nấm sơ cấp
(đơn nhân)

Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H. Raven
và ctv, 1992)
kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm thường chỉ có một nhân nên
được gọi là sợi nấm sơ cấp (primary mycelium). Đối với nấm dị tản (heterothallic),
phải có sự phối hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di
truyền khác nhau mới hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium).
Trong khi đó nấm đồng tản (homothallic) chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy
mầm cũng có thể tự phối cho ra hệ sợi nấm thứ cấp. Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai
nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi trên cơ chất để hút chất dinh dưỡng.
Trong trường hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thương và tái lập lại hệ sợi,
tương tự như cây trồng trong giâm hay chiết cành. Ở những điều kiện nhất định, như
ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm. Hạch nấm sẽ
tiếp tục phát triển cho quả thể trưởng thành.[3].


7

Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất

sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm. Quả thể là do các sợi nấm
song nhân liên kết lại tạo thành. Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là
(n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1].
Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng
dày (Chlamydospore), thí dụ như nấm rơm. Hậu bào tử giống như một bào tử thu nhỏ
với đầy đủ nguyên sinh chất và hai nhân nhưng cô đặc hơn và có vách tương đối dày
bao bọc. Có thể xem đây là một dạng sống tiềm sinh của nấm vì sau đó bào tử này có
thể nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3].
2.1.3. Đặc điểm biến dưỡng và sinh lý
Nấm chủ yếu sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ các nguồn hữu cơ (động vật hoặc
thực vật). Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tương
tự động vật), còn lại hầu hết các loài nấm đều nấm lấy dinh dưỡng qua màng tế bào hệ
sợi (giống rễ cây thực vật). Nhiều loài nấm có hệ enzym phân giải tương đối mạnh,
giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử như
(cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide),
lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm, rạ, mạt cưa và nhiều
cơ chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm (tản dinh dưỡng hay tản
sinh sản) [3].
Dựa theo cách thức dinh dưỡng của nấm có thể chia thành 3 nhóm:
Hoại sinh: Đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm
trồng. Thức ăn của chúng là xác bã động thực vật. Nhóm nấm này có hệ enzym tiêu
hoá tương đối mạnh, phân giải được nhiều loại cơ chất. Chúng có khả năng biến các
chất này thành những chất có thành phần đơn giản để có thể hấp thụ được. Tuy nhiên,
cũng có những trường hợp nấm không thể phân giải cơ chất mà phải nhờ vào các vi
sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trước một bước[3].
Ký sinh: Bao gồm chủ yếu các loại nấm gây bệnh. Chúng sống bám vào
các loài sinh vật khác (động vật, thực vật, các loài nấm khác). Thức ăn của chúng
chính là các chất lấy từ cơ thể ký chủ, làm suy yếu hoặc làm tổn thương ký chủ. Một
số nấm ăn có thể sống trên cây còn tươi nhưng đời sống thực sự vẫn là hoại sinh, nên
được xếp vào nhóm trung gian, gọi là nhóm bán ký sinh (trường hợp nấm mèo).

8

Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhưng không
làm chết hoặc gây tổn thương ký chủ, ngược lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn. Vì
vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Do đó, việc nuôi
trồng trở nên phức tạp hơn, thường giống nấm được cấy cùng lúc với việc trồng cây
(thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus).
2.2. Nấm bào ngư
2.2.1. Giới thiệu
Nấm bào ngư (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều
loài thuộc:
Chi Pleurotus
Họ Pleurotaceae
Bộ Agaricales
Lớp phụ Hymenomycetidae
Lớp Hymenomycetes
Ngành phụ Basidiomycotina
Ngành nấm thật-Eumycota
Giới nấm Mycota hay Fungi
Nấm bào ngư có tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên, số loài được nuôi trồng được

không nhiều, khoảng 10 loài [2].
Nấm bào ngư được nuôi trồng rộng rãi trên thế giới. Ở châu Âu nấm bào ngư
được trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan. Ở Châu Á nấm bào ngư được trồng ở
Trung Quốc với sản lượng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu
đồng Việt Nam. Ngoài Trung Quốc, nấm này còn được trồng ở Nhật Bản, Việt Nam,
Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2].
Nấm bào ngư không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dưỡng cao. Trong nấm

chứa đầy đủ các amino acid.
Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm bào ngư còn có giá trị dược liệu. Nhiều nghiên
cứu cho thấy nấm bào ngư cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thư. Bằng
phương pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên đã cho thấy nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju ở dạng bán cầu lệch có tác
dụng ức chế 2 chủng Vi khuẩn Gran dương S. aureus và B. subtilis và 2 chủng Gram


9

âm E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài ra, theo nghiên của nhà khoa học
Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngư còn có khả năng làm giảm lượng
cholesterol trong máu [3].
Một trong những đặc điểm quan trọng của nấm là hệ enzym. Nhờ enzym
cellulase và một số enzym khác, nấm bào ngư khả năng chuyển hoá cellulose thành
nhưng chất cơ bản góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trường do chất thải nông
nghiệp tạo ra như bã mía, rơm rạ. Ngoài ra, nấm còn có khả năng phân hủy thuốc trừ
cỏ Antrazin nhờ vào sự gia tăng các enzym P – 450 của hệ Cytochromeoxxygenase và
peroxydase (Sannia và ctv, 1990) [3] .
Nấm bào ngư có đặc điểm chung là tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang
bào tử kéo dài xuống chân. Cuống nấm gần gốc có lông mịn. Tai nấm còn non có màu
sắc tối, nhưng khi trưởng thành trở nên sáng hơn. Quả thể nấm bào ngư phát triển qua
nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho từng giai đoạn khác nhau.
Dạng san hô: quả thể mới tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm.
Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dưới dạng khối tròn.
Dạng phễu: mũ mở rộng trong khi cuống còn ở giữa
Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên so với vị trí trung bình.
Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trưởng, nhưng mũ vẫn phát triển.
Nấm bào ngư có chu trình phát triển cũng như các loài nấm đảm khác, bắt đầu
đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng (sơ cấp và thứ cấp) và “kết

thúc” bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm. Tai nấm sinh ra đảm bào tử và
chu trình lại tiếp tục [3] .
2.2.2. Một số loài nấm bào ngư được nuôi trồng ở VIệt Nam.
Hiện nay, nấm bào ngư được trồng rộng rãi ở Việt Nam cả miền Bắc lẫn miền
Nam vì khí hậu nước ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này. Hiện nay, nấm
bào ngư được trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và .
Hầu hết các dòng nấm được nuôi trồng ở nước ta là các giống được nhập từ nước
ngoài. Tuy nhiên vẫn có một số ít được khai thác ngay trên địa lý của Việt Nam sau đó
đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo.


10

Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngư (Lê Duy Thắng, 1999)

Loài nấm

Nhiệt độ thích

Nhiệt độ thích hợp

hợp cho tơ tăng

cho ra nấm ( C)

0

0

trưởng ( C)

Pleurotus floridanus

25-30

25

Pleurotus sajor - caju

25-30

25

Pleurotus pulmonarius

22-28

25

Pleurotus abalonus

27-32

25

Pleurotus flabellatus

20-28

20-25

2.2.2.1. Nấm bào ngư Pleurotus floridanus (Hình 2.6)
o

Đây là loài thích nghi với nhiệt độ khá rộng từ 8 - 30 C. Quả thể màu trắng sữa.
Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao. Sợi nấm có họat tính mạnh đối với việc phân
giải cellulose. Sản lượng trên đơn vị nguyên liệu tương đối cao. Nấm này có thể thích
nghi với nhiều loại cơ chất khác nhau: bã mía, mùn cưa, rơm, trấu. Khi trồng trên trấu,
năng suất có thể đạt được đợt ra quả thể đầu tiên là 114g nấm tươi trên 360 g nguyên
liệu khi có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4].
2.2.2.2. Nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju (nấm sò phượng vỹ hay nấm sò
dạng phễu)
Quả thể được hình thành ở nhiệt độ tương đối cao so với các loài nấm khác.
Gần đây, nấm này đang dần chiếm thị trường vì quả thể chắc, ăn ngon và rất thích hợp
đối với khí hậu Việt Nam. Ngoài ra, dịch chiết từ nấm này có thể ức chế một số loài vi
khuẩn: S. aureus và B. subtilis, E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài các cơ
chất thông thường, gần đây nấm này còn được trồng trên cơ chất là cây mai dương để
chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trường. Loài nấm này được
nhập từ Nhật Bản và được nuôi trồng thành công trên mùn cưa đầu tiên ở .


11

Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius

Hình 2.5 Pleurotus sp.

Hình 2.4. Pleurotus abalonus

Hình 2.6. Pleurotus floridanus

2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius
Phần lớn được nhập từ nước ngoài (Hình 2.3). Nhưng gần đây, GS. Lê Xuân
Thám và cộng sự (1999) phát hiện được một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó
đưa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cưa [7] .
2.2.2.4. Nấm bào ngư Pleurotus abalonus
Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ưa nóng nên rất thuận lợi
để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc
điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đường kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2].
Ngoài ra còn một loài khác cũng đang được trồng ở Việt Nam như Pleurotus
eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng
thành công 2 loài nấm bào ngư mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả
thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7].


12

2.3. Phương pháp sắc ký - Phân tích amino acid
2.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký được phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet
(1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter
Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân
tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng được phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24].

Sắc ký là phương pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân
bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và
pha động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ
thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các
chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha
động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ

lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha
tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn
với pha này. Nhờ vậy mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10].
2.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động
và pha tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các
chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi
dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.
Hầu hết các phương pháp sắc lý đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả
của từng phương pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8].
2.3.3. Phân loại quá trình sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động phải là các lưu thể còn pha tĩnh là các chất

ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc
ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất
giữa pha động và pha tĩnh mà người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành nhóm
nhỏ hơn.


13

Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tương tác và sự hình thành sắc ký
mà người ta phân biệt các loại sắc ký như bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9]
Dạng sắc ký

Pha động

Pha tĩnh

Cách bố trí

Cơ chế trao

pha tĩnh

đổi chất

Khí
Khí- hấp phụ

Khí

Rắn

Cột

Hấp phụ

Khí -lỏng

Khí

Lỏng

Cột

Phân bố

Lỏng - rắn

Lỏng

Rắn

Cột

Hấp phụ

Lỏng - lỏng

Lỏng

Lỏng

Cột

Phân bố

Lỏng - nhựa trao đổi

Lỏng

Rắn

Cột

Trao đổi ion

Lớp mỏng

Lỏng

Rắn

Lớp mỏng

Hấp phụ

Rây (sắc ký gel)

Lỏng

Lỏng

Cột

Theo kích thước

Lỏng

phân tử

2.4.. Một số phương pháp sắc ký trong phân tích amino acid
Phân tích amino acid là phương pháp xác định thành phần amino acid cũng như
định lượng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng
sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatographyTLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện
di mao quản (capillary electrophoresis) [15].
2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy)

-

Quá trình phân tách được thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7).

-

Dùng viết chì, vẽ một đường mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh

những dấu nhỏ dọc theo đường vừa kẻ.
-

Dùng pipett hút lượng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa

mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô.
-

Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký).

-

Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ.


14

-

Lấy ra, dùng viết chì kẻ đường đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô.

-

Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24]

-

Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích

còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn.
2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC)
Trong phương pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được gắn vào một giá
mang thường là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn.

Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu được tách rời nhau bằng một
lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có
khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai
hệ dung môi khác nhau [7].
Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23]
-

Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đường mảnh cách mép dưới của tấm

TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đường bút chì vừa được vẽ. Chú ý đánh dấu từng
vết đều nhau và dán nhãn trước để có thể không nhần lẫn khi phát hiện.
-

Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC.

-

Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lượng dung môi để có thể

phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng).


15

-

Cho tấm TLC vào beaker, mẫu được đặt phía dưới.

-

Khi dung môi di chuyển được khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm

mỏng ra dùng viết chì vẽ một đường mảnh ngang với đường dung môi vừa di chuiyển
đến. Để chúng khô hoàn toàn.
-

Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu. Làm

khô. .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng. Đánh dấu từng vết bằng bút
chì ngay ở tâm. Tính giá trị Rf ( retardation factor).
-

Lưu giá trị Rf để tính toán những amino acid chưa biết.

Ngoài ra, amino acid cò được phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát
hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC. Tuy nhiên, đối với
phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thường được sử dụng nhất bởi vì nó
có nhiều ưu điểm hơn như: thời gian ngắn. độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có

thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet).
2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC được ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân
tích đầu tay của các nhà phân tích.
HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào
nhau. Những thành phần này đầu tiên được hòa tan vào trong dung môi và sau đó dưới
tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn
hợp sẽ được phân tách thành những cấu tử của chúng.
Sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự
chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu được nhiều cấu tử
khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được và nó dễ dàng phân tách
số lượng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau.
2.4.3.1. Pha tĩnh
Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau.
Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh sẽ
liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất ít
phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn.


16

Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần được phân tích.
Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thước
lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và được tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thước
phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và được tách rửa sau.
Normal phase (pha bình thường) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của
dung môi pha động .
Reverse Phase (ngược pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân
cực cao hơn.

Ion-Exchange được tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với
những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di
chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột.
2.4.3.2. Pha động
Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha
bình thường, thì dung môi thường là không phân cực còn đối với mô hình ngược pha
thì thì thường sử dụng có sự pha trộn giữa nước và một vài dung môi hữu cơ phân cực
như acetonitrile.
Đối với mô hình size - exclusion, yêu cầu đối với pha động là ngăn cản mẫu
gắn kết trên bề mặt của pha tĩnh.


17

2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC
Bơm: Bơm trong HPLC đuợc xem là một trong những thành phần rất
quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng. Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ
dòng ổn định liên tục gắn liền với injector, cột và detector. Có hai loại bơm cơ bản
-

Bơm áp suất liên tục.

-

Bơm dòng liên tục.
Cột: Hiện nay có rất nhiều loại cột đang được sử dụng. Tuy nhiên tùy

thuộc vào loại mẫu, tính chất của mẫu mà ta có loại cột và kích thước cột khác nhau.
Đối với sắc ký ngược pha thì cột C-18 và Pico-Tag column, 3.9 mm x 15 cm thường
được sử dụng nhất.

Detector: Một số detector thường được sử dụng:
-

Detector Ultraviolet/visible: thường được sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ.

-

Detector chuỗi diode.

-

Detector huỳnh quang.

Và một số detector khác như detector điện hóa học,detector dẫn điện…
Hệ thống dữ liệu. Để chuyển dữ liệu phân tích, detector thường được nối
trực tiếp với một máy vi tính. Khi đó dữ liệu được chuyển thành những peak trên sắc
ký đồ và được tính toán.
2.5. Các bước phân tích amino acid
Phân tích amino acid được thực hiện thông qua các bước sau đây [17].
-

Chuẩn bị mẫu

-

Thủy phân protein thành những amino acid đơn.

-

Tạo dẫn xuất.

-

Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký

-

Phân tích dữ liệu và tính toán.
Trước khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai

trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích.

- Mẫu được đặt trong một tube sạch.
- Tất cả mẫu được làm khô trước khi phân tích.
Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng
tay bám vào mẫu.


18

2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis)
Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải được thủy phân tạo thành
những amino acid đơn.
Thủy phân bằng acid là phương pháp thông thường nhất để thủy phân protein
trước khi tiến hành pnân tích amino acid. Phương pháp thủy phân bằng acid có thể tạo

Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl [17]
ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một
phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid.
-

Trytophan bị phá hủy hoàn toàn

-

Serine và threonine bị phá hủy một phần

-

Methionine có thể bị oxy hóa

-

Cysteine thường được phát hiện như là cystine (nhưng cystine thường

được phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần).
-

Asparagine và glutamine tương ứng bị chuyển thành acid aspartic và

acid glutamic.
Như vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác.

Một số phương pháp thủy phân thường được sử dụng trong HPLC.
Phương pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %)
Phương pháp thường được sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm
phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N
chứa từ 0,1 đến 1 % phenol.
Phương pháp tiến hành:
-

Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu được làm khô để nước

không pha loãng acid).


19

-

Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định.

-

Làm lạnh tube chứa mẫu.

-

Mẫu thường được thủy phân ở 110 C, trong 24h trong chân không hoặc

o

trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy
theo mục đích phân tích.
-

Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa.

-

Mẫu được làm khô trong một tube trước khi thủy phân.

-

Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân.

-

Tube thủy phân này được tiến hành trong chân không để làm bay hơi dung
o

o

dịch thủy phân. Tube thủy phân được gia nhiệt từ 170 C đến 185 C khoảng 12 phút.

-

Sau khi thủy phân tube được làm khô trong chân không để loại bỏ acid

dung dịch thừa [17].
2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17]
Những amino acid sẽ không được phát hiện nếu chúng không được tạo dẫn xuất.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ
thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phương pháp.
Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký

trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát
hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lượng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong
một lần phân tích).
Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng được

ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngược pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi
hỏi lượng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg.
Phương pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn
Phương pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những
phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lượng amino acid.

Sau khi amino acid được phân tách trên sắc ký sẽ được phát hiện thông qua
phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid
thường cho màu tím sẽ được phát hiện ở bước sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino
acid cho màu như là proline thường được phát hiện ở bước sóng 440 nm. Ngoài


20

ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng được sử dụng trong phân tích postcolumn.
Bước sóng phát hiện của phương pháp này thường vào khoảng 348 - 450 nm.
Đối với phương pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thường được sử dụng
là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong
vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC)
và có thể được phát hiện ở bước sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC
thông qua sắc ký ngược pha (reversed-phase HPLC) có thể được sử dụng để phân tích
định lượng amino acid với detector UV.
Với phương pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là
khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tương ứng (response linearity) thu được từ 20 đến 500 pmol.
Để thu được kết quả tốt, lượng mẫu lớn hơn 500 ng trước khi thủy phân là tốt nhất.

Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng
được sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa.
o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột)
Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột)

Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột)

9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột)
7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột)

Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC [10].

2.5.3. Phân tách trên HPLC [17]
Đầu tiên, chuẩn amino acid được phân tách trước với các nồng độ khác nhau để
làm dữ liệu cho công việc tính toán sau này.
Mẫu thường được bơm với thể tích nhất định.


21

Tùy theo phương pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha
động, pha tĩnh, cột cũng như điều chỉnh bước sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi
đó thời gian phát hiện cũng khác nhau.
Nếu là PTC-aa thường được phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký
ngược pha; pha động thường là acetonitrile; bước sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các

aa thường được phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian
thêm để tạo cho đường nền trở lại.
2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10]
2.5.4.1. Định tính
Để phát hiện được các amino acid, phương pháp thông thường là dựa vào thời
gian lưu của chuẩn đã được thực hiện chạy sắc ký trước. sau đó, thời gian lưu của mẫu
được so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tương ứng với từng
diện tích peak để định lượng.
2.5.4.2. Định lượng

Thành phần của từng amino acid được thể hiện bằng phần trăm về số mol (mol
%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn như nếu
protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể cả
Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu được sẽ tạo nên một profile riêng
biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể.
2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngư
Thành phần amino acid trên nấm bào ngư đã được tiến hành phân tích từ rất
lâu, nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời.
.Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm
Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong
nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15].


22

Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus
sp bằng sắc ký giấy tròn (Zakia Bano, 1962)
L: lycine
IL:Isoleucine
Ph Al: Phenylalanine
Glu: Glutamic acid
Thr: Threonine

Ser: Serine
Gly: Glycine
Asp: Aspartic acid
Arg: Agrinine,
Pep: Peptide

Lys:Lysine,

His: Histidine
Cys: Cysteine


23

PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Thời gian, địa điểm thực hiện và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Thời gian thực hiện
Khóa luận được thực hiện từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005.
3.1.2. Địa điểm
Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm . Phòng Hóa Lý, Trung tâm
Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm

.
3.1.3. Vật liệu nghiên cứu
Giống nấm

Nguồn cung cấp

Pleurotus floridanus

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Pleurotus sajor – caju

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Pleurtus abalonus

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Pleurotus pulmonarius

Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc)

Pleurotus flabellatus

Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc)

3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
3.2.1. Hóa chất
HCl 6N

ACN (Acetonitril).

Phenol

Glucose

PITC (phenylisothiocyanate).

Saccharose

Methanol

KH2PO4

Ethanol

MgSO4

Nước khử ion

Sodium acetate

TEA (Triethylamine)

HNO3 đậm đặc

Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid

EDTA


24

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ

3.3.

Thiết bị

Dụng cụ

Tủ cấy vô trùng

Ống nghiệm

Tủ sấy

Đĩa petri Φ 9 cm

Tủ mát

Bình tam giác

Nồi hấp khử trùng

Bình quả lê

Máy HPLC

Pipett 0.1-10 µl

Thiết bị thổi khí trơ

Pipett 10-100 µl

Cột Pico-Tag

Filter Φ 0.20 µm

Phương pháp nhân giống và trồng nấm

3.3.1. Môi trường
Môi trường

Môi trường hạt

Môi trường giá môi

Môi trường giá thể

thạch (PGA)

Cám gạo

Khoai mì

Mùn cưa

Khoai tây

CaCO3

Cám gạo

Cám gạo

Lúa

KH2PO4

KH2PO4

Glucose
Agar

MgSO4

CaCO3

MgSO4


25

3.3.2. Phương pháp
3.2.2.1. Chuẩn bị môi trường PGA
-

Khoai tây bóc vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc.

-

Thêm 20 g agar, cho thêm nước cất để đủ 1 lít, đun tan agar.

-

Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút bông.

-

Hấp khử trùng ở 121 C, 1.2 atm, trong 20 phút.
Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền.

-

5 dòng nấm bào ngư sau khi đem về phòng thí nghiệm, được tiến hành cấy

o

chuyền sang môi trường thạch nghiêng PGA..
3.2.2.2. Chuẩn bị môi trường hạt
-

Lúa được đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO3 (2%) , cám gạo (10%).

-

Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng ở 121 C, 1,2 atm,

o

trong 90 phút.
-

Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng sẽ được cấy sang môi trường hạt.

đem để trong bóng tối. Tùy theo mỗi loài mà thời gian phát triển đầy bình sẽ khác
nhau. Trong quá trình đó, chuẩn bị môi trường giá môi.
3.3.2.3. Chuẩn bị môi trường giá môi
-

Cọng mì được cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thước của túi ny lông,

ngâm khoảng 24 giờ, trộn với một số hóa chất khác như KH2PO4, MgSO4 với tỉ lệ
nhất định ( 2% đối với MgSO4 và 1 % đối với KH2PO4).
o

-

Hấp khử trùng ở 121 C , 1,2 atm trong 90 phút.

-

Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy

sang môi trường giá môi.
3.2.2.4. Chuẩn bị môi trường nuôi trồng
-

Mùn cưa được sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thước lớn.

-

Ngâm trong nước vôi 5% trong 24 giờ

-

Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh.
o

- Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121 C để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp như
lần thứ nhất.